CN103290086A - 具有ace抑制活性的绿豆蛋白肽及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽及其制备方法与应用。本发明通过用水将绿豆蛋白粉配制成绿豆蛋白浆，将pH值调节为3.5～5后加入纤维素酶于45～55℃进行酶解，酶解结束后灭酶、离心分离，水洗去杂；再将pH值调节为8～9，加入碱性蛋白酶于50～60℃进行酶解，酶解结束后灭酶、活性炭吸附，经过粗滤、精滤、纳滤，干燥，得到具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽。本发明提供的制备方法提高了产品的品质和生产效率，节约了能源，操作方便，易于工业化，得到的绿豆蛋白肽的ACE抑制活性IC50为42.8～59.6μg/mL，可广泛用作保健食品、普通食品的原料，尤其可用于制备辅助降血压产品。

Description

具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于农产品副产物高附加值深加工利用技术领域，特别涉及一种具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽及其制备方法与应用。

背景技术

高血压是对人类健康危害极大的一种疾病。统计资料显示，2010年全球高血压患者约10亿，2025年将达到15.6亿。高托普利、哌哚普利、群多普利等）服用方便、作用直接、起效快但副作用大；采用中药类治疗副作用小、作用温和，但起效慢、服用不方便；因此寻找高效、安全的治疗高血压手段已成为关注人类健康的一大重要课题。

现代科学研究表明，以动植物蛋白为原料，通过特定的生物酶解技术及分离纯化技术获得的活性多肽具有良好的降血压功效，这类多肽因为与血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme，简称ACE）亲和力较血管紧张素Ⅰ或舒缓激肽更强，而且也较不易从ACE结合区释放，从而阻碍ACE催化水解血管紧张素Ⅰ成为血管紧张素Ⅱ，以及催化水解舒缓激肽成为失活片段的两种生化反应过程，起降血压作用。利用具有降血压功效的活性多肽食疗具有吸收快、高效、安全性高、无副作用、对正常血压无影响特点，已引起全球学者的广泛关注。其中，日本已利用食源性蛋白质（包括海洋鱼类蛋白、植物豆类蛋白等）制备出具有明确标明“辅助降血压功能”的降血压肽产品并产业化推广，倍受市场欢迎。

我国有十分丰富的植物蛋白资源，利用优质的植物蛋白原料生产制备系列生理活性功效显著的活性肽类，是我国植物蛋白精深加工高附加值利用的一个极具潜力方向。绿豆为我国豆类的一个重要品种，在我国已有两千多年的栽培历史，绿豆中蛋白质含量高达19.5%～33.1%，蛋白质功效比（PER）高（1.87），且氨基酸种类齐全，尤其以赖氨酸含量（6.9g/16gN）较为丰富，接近鸡蛋蛋白质赖氨酸含量（7.2g/16gN）。然而国内目前绿豆加工，侧重于绿豆淀粉的生产加工（生产绿豆粉丝），绿豆蛋白粉作为副产物（绿豆粉丝生产废水提取），主要用于加工牲畜饲料，附加值低，造成优质绿豆蛋白资源浪费。

近年来已有国内外学者研究绿豆蛋白开发生物活性肽并研究其生理活性：如何倩、卢珍华、顾薇、潘自皓、徐娟、李积华等分别研究了碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶水解绿豆蛋白制备多肽工艺；郭健研究发现分子量为195～1000Dal的绿豆多肽具有提高小鼠免疫力和缺氧耐受力的功效；何倩、陆晓明等研究证实绿豆蛋白水解物具有抗氧化活性，且对双歧杆菌具有促生长作用、可促酸奶发酵；另外，部分研究发现绿豆蛋白肽具有显著的ACE抑制活性，Zaelk等采用制备型高效液相色谱对绿豆蛋白酶解产物进行分析，在实验条件下获得了具有ACE抑制活性的肽段，经分析其氨基酸序列为His-His-Leu（HHL），研究表明向人体内注射极低剂量的产物（5mg/kgBW）能显著降低心脏收缩血压61mmHg（P<0.01）；吴建平等从绿豆分离蛋白酶解产物中分离出Asp-Leu-Pro（ALP）和Asp-Gly（AG）两种ACE抑制肽，动物实验证实这二种肽对自发性高血压小鼠有显著降压效果，但对正常鼠无明显影响；龚琴利用绿豆粉丝废水提取绿豆蛋白，再采用Alcalase水解制备出具有降血压功能的ACE抑制肽混合物，并利用膜技术、大孔吸附树脂进一步纯化、70%乙醇洗脱获得ACE抑制活性较高的肽段，ACE抑制率达到91.23%；Guan-Hong Li等采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶水解绿豆蛋白制备ACE抑制活性较高的水解产物，发现碱性蛋白酶水解2h产物ACE抑制活性最高，IC50为0.64mg/mL，老鼠灌胃实验证实自发性高血压小鼠的心脏收缩压有明显的下降。由此可见利用绿豆蛋白粉开发强活性的ACE抑制肽具有良好的可行性。

然而目前绿豆蛋白源ACE抑制肽制备技术都停留在实验室研究阶段，偏重于酶解工艺、产品活性初步探索以及活性肽鉴定研究，部分关键环节技术尚未解决，还未形成工业化规模制备技术，市场上还未有相关产品；另一方面，研究开发出来的产品功效偏低，主要表现在ACE抑制活性IC50远大于100μg/mL，不利于功效显著的终端产品开发。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽的制备方法。该制备方法以绿豆蛋白粉为原料，通过纤维素酶酶解、离心分离去杂提高绿豆蛋白质纯度，再结合碱性蛋白酶酶解、活性炭选择性吸附、三级过滤、干燥制备出具有强ACE抑制活性（IC50为40～60μg/mL）的绿豆蛋白肽，适合工业化生产。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽。

本发明的再一目的在于提供所述的具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽的制备方法，包含如下步骤：

（1）绿豆蛋白粉的分散、溶解：用水将绿豆蛋白粉配制成绿豆蛋白浆，搅拌分散混匀；

（2）纤维素酶酶解、灭酶：将步骤（1）分散混匀好的绿豆蛋白浆液的pH值调节为3.5～5，加入相当于绿豆蛋白粉质量0.1～1%的纤维素酶，在45～55℃条件下恒温搅拌酶解1h～2h后，升温灭酶；

（3）离心分离、水洗去杂：将灭酶后的绿豆蛋白浆冷却至65℃以下，离心分离，取沉淀；加入水将沉淀混匀分散，再离心分离一次取沉淀；

（4）碱性蛋白酶酶解：用水将步骤（3）得到的沉淀搅拌分散为绿豆蛋白浆，保证绿豆蛋白浆中蛋白质的质量百分比为5～15%，调节绿豆蛋白浆的pH值为8～9，加入相当于绿豆蛋白浆中蛋白质质量0.5～3%的碱性蛋白酶于50～60℃恒温搅拌酶解1～4h，酶解结束；

（5）灭酶、活性炭吸附：酶解结束后，调节pH值为6.5～7.0，升温至80～85℃，加入活性炭粉末搅拌混匀，恒温搅拌，实现一步灭酶、活性炭吸附；

（6）粗滤、精滤、纳滤：将灭酶、吸附脱色后的绿豆蛋白浆粗滤，粗滤后的清液再精滤，滤过液再经过纳滤，完成脱盐、去游离氨基酸并浓缩，得到浓缩液；

（7）干燥：将浓缩液进行喷雾干燥，得到具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽。

上述步骤中所述的水优选为去离子水；

步骤（1）中所述的水的温度优选为45～55℃；

步骤（1）中所述的水的用量优选为相当于绿豆蛋白粉质量的6～10倍；

步骤（1）中所述的绿豆蛋白粉为市售的绿豆蛋白粉或绿豆粉丝生产废水提取的绿豆蛋白粉，优选为蛋白质含量≥60%、水分含量≤12%的绿豆蛋白粉；

步骤（1）中所述的搅拌分散混匀及水化的条件优选为2000～3000rpm的剪切速度分散混匀、水化10～20min；

步骤（2）中所述的pH值优选使用浓度为1～4mol/L的盐酸溶液调节pH值；

步骤（2）中所述的pH值优选为4～4.5；

步骤（2）中所述的纤维素酶优选为广州裕立宝生物技术有限公司的B型纤维素酶；

步骤（2）中所述的搅拌酶解的搅拌速度为36rpm；

步骤（2）中所述的升温灭酶是指将酶解液升温至85～100℃保持10～20min；

步骤（3）中所述的离心的条件优选为4000～6000rpm下离心10～20min；

步骤（3）中所述的水的温度优选为50～60℃；

步骤（3）中所述的水的添加量优选为所述沉淀的质量的2～5倍，更优选为3～4倍；

步骤（4）中所述的水的温度为50～60℃；

步骤（4）中所述的pH值优选为使用浓度为1～4mol/L氢氧化钠溶液调至pH值；

步骤（4）中所述的碱性蛋白酶为诺维信（中国）投资有限公司的碱性蛋白酶Alcalase2.4L；

步骤（4）中所述的搅拌酶解的搅拌速度优选为36rpm；

步骤（5）中所述的pH值优选使用浓度为1～2mol/L的盐酸溶液调节pH值；

步骤（5）中所述的活性炭粉末的加入量优选为相当于绿豆蛋白浆质量的0.5～3%，更优选相当于绿豆蛋白浆质量的1.5～2%；

步骤（5）中所述的活性炭粉末优选为200目以上的复合型活性炭；

步骤（5）中所述的搅拌的时间优选为30～60min；

步骤（5）中所述的搅拌的速度优选为36rpm；

步骤（6）中所述的粗滤是指将灭酶、脱色后的绿豆蛋白浆泵入板框式硅藻土过滤机粗滤；

步骤（6）中所述的精滤是指粗滤后的清液再经板框式纸板过滤机（过滤精度0.1μm）精滤，去除活性炭残余细粒和大分子蛋白（肽），得到澄清透明的绿豆蛋白肽透过液；

步骤（6）中所述的纳滤是指精滤透过液经过孔径为1nm的纳滤膜纳滤；

步骤（6）中所述的浓缩液优选为固形物含量为20～40%的浓缩液；

步骤（7）中所述的喷雾干燥，操作参数优选为进口温度为160～170℃，出口温度为70～90℃；

一种具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽，由上述方法制备得到；其IC50为42.8～59.6μg/mL；

所述的具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽可广泛用作保健食品、普通食品的原料，尤其可用于制备辅助降血压产品。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明提供的方法以绿豆蛋白粉（蛋白质含量≥60%、水分含量≤12%）为原料，绿豆蛋白粉中含有一定量的脂肪、淀粉、粗纤维以及色素类物质，需要去除以保证后续制备工艺高效运行和产品品质（包括蛋白质含量、风味、色泽等）。本发明巧妙地选择纤维素酶酶解结合蛋白质酸沉原理离心去除杂质，纤维素酶（B型）是一种含有纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶等的多功能复合酶系，能有效将纤维素、淀粉等物质降解成可溶性糖类，而纤维素酶的最适作用pH值3.5～5.0恰好为绿豆蛋白的等电点附近，便于蛋白沉降，促进离心分离、水洗再离心分离去除非蛋白成分，提高后续酶解底物的蛋白纯度，从而保证产品的高品质。

（2）本发明通过复合型活性炭选择性吸附、结合三级过滤去杂进一步精制提纯目标强ACE抑制活性肽，控制分子量大小，去除其他肽、游离氨基酸和盐，从而提升产品的ACE抑制活性；本发明获得的具有强ACE抑制活性的绿豆蛋白肽IC50远小于100μg/mL，生物活性显著，远远高于国内文献研究报道结果，可以为辅助降血压功能性食品的开发提供优质基料。

（3）本发明中灭酶和活性炭吸附一步完成、以及三级过滤即粗滤、精滤、纳滤联用（在保证了各级过滤的高效性的同时，且实现了浓缩），提高了产品的品质和生产效率，节约了能源，操作方便，易于工业化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

（1）绿豆蛋白粉的分散、溶解：用相当于绿豆蛋白粉10倍质量的45℃去离子水将绿豆蛋白粉（蛋白质含量64.8%、水分含量9.6%，下同）配制为绿豆蛋白浆液，以2000rpm剪切速度将浆液分散混匀20min。

（2）纤维素酶酶解、灭酶：用浓度为3mol/L盐酸溶液将步骤（1）分散混匀的绿豆蛋白浆液的pH值调节至4.0，加入相当于绿豆蛋白粉质量0.5%的纤维素酶（B型，广州裕立宝生物技术有限公司，下同），在45℃条件下恒温搅拌（速度为36rpm）酶解1.5h后，升温至90℃保持15min灭酶。

（3）离心分离、水洗去杂：将步骤（2）灭酶后的绿豆蛋白浆冷却至65℃以下，以4000rpm的速度离心20min，取沉淀。加入相当于沉淀质量3倍的50℃去离子水混匀分散，再离心分离一次取沉淀。

（4）碱性蛋白酶酶解：用50℃去离子水将步骤（3）得到的沉淀搅拌分散为绿豆蛋白浆，保证绿豆蛋白浆中蛋白质的质量百分比为10%，用浓度为4mol/L氢氧化钠溶液的调节绿豆蛋白浆的pH值为8.5，加入相当于绿豆蛋白浆中蛋白质质量3%的碱性蛋白酶（Alcalase2.4L，诺维信（中国）投资有限公司，下同）于50℃恒温搅拌（速度为36rpm）水解1.0h，酶解结束。

（5）灭酶、活性炭吸附：酶解结束后，用浓度为1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.0，升温至80℃，加入相当于绿豆蛋白浆质量1.5%的活性炭粉末（目数是200目，下同）搅拌混匀，恒温搅拌60min，搅拌速度为36rpm，实现一步灭酶、活性炭吸附。

（6）粗滤、精滤、纳滤：将灭酶、脱色后的绿豆蛋白浆泵入板框式硅藻土过滤机粗滤，粗滤后的清液再经板框式纸板过滤机（过滤精度0.1μm）精滤，精滤透过液再经过孔径为1nm的纳滤膜纳滤脱盐、去除游离氨基酸并浓缩至固形物含量为20%。

（7）干燥：将浓缩液泵入喷雾干燥塔，选择进口温度为160℃、出口温度为70℃干燥，即得到绿豆蛋白肽粉成品。

实施例2

（1）绿豆蛋白粉的分散、溶解：用相当于绿豆蛋白粉6倍质量的55℃去离子水将绿豆蛋白粉配制为绿豆蛋白浆液，以3000rpm剪切速度将浆液分散混匀10min。

（2）纤维素酶酶解、灭酶：用浓度为4mol/L盐酸溶液将步骤（1）分散混匀的绿豆蛋白浆液的pH值调节至3.5，加入相当于绿豆蛋白粉质量1%的纤维素酶，在55℃条件下恒温搅拌（速度为36rpm）酶解1h后，升温至85℃保持20min灭酶。

（3）离心分离、水洗去杂：将步骤（2）灭酶后的绿豆蛋白浆冷却至65℃以下，以6000rpm离心10min，取沉淀。加入相当于沉淀质量2倍的55℃去离子水混匀分散，再离心分离一次取沉淀。

（4）碱性蛋白酶酶解：用55℃去离子水将步骤（3）得到的沉淀搅拌分散为绿豆蛋白浆，保证绿豆蛋白浆中蛋白质的质量百分比为15%，用浓度为3mol/L氢氧化钠溶液的调节绿豆蛋白浆的pH值为8.0，加入相当于绿豆蛋白浆中蛋白质质量1.5%的碱性蛋白酶于55℃恒温搅拌（速度为36rpm）水解2.5h，酶解结束。

（5）灭酶、活性炭吸附：酶解结束后，用浓度为2mol/L盐酸溶液调节pH值至6.5，升温至85℃，加入相当于绿豆蛋白浆质量3%的活性炭粉末搅拌混匀，恒温搅拌30min，搅拌速度为36rpm，实现一步灭酶、活性炭吸附。

（6）粗滤、精滤、纳滤：将灭酶、脱色后的绿豆蛋白浆泵入板框式硅藻土过滤机粗滤，粗滤后的清液再经板框式纸板过滤机（过滤精度0.1μm）精滤，精滤透过液再经过孔径为1nm的纳滤膜纳滤脱盐、去除游离氨基酸并浓缩至固形物含量为30%；

（7）干燥：将浓缩液泵入喷雾干燥塔，选择进口温度为170℃、出口温度为90℃干燥，即得到绿豆蛋白肽粉成品。

实施例3

（1）绿豆蛋白粉的分散、溶解：用相当于绿豆蛋白粉8倍质量的50℃去离子水将绿豆蛋白粉配制为绿豆蛋白浆液，以2400rpm剪切速度将浆液分散混匀15min。

（2）纤维素酶酶解、灭酶：用浓度为1mol/L盐酸溶液将步骤（1）分散混匀的绿豆蛋白浆液的pH值调节至4.5，加入相当于绿豆蛋白粉质量0.1%的纤维素酶，在50℃条件下恒温搅拌（速度为36rpm）酶解2h后，升温至100℃保持10min灭酶。

（3）离心分离、水洗去杂：将步骤（2）灭酶后的绿豆蛋白浆冷却至65℃以下，以5000rpm离心15min，取沉淀。加入相当于沉淀质量5倍的60℃去离子水混匀分散，再离心分离一次取沉淀。

（4）碱性蛋白酶酶解：用60℃去离子水将步骤（3）得到的沉淀搅拌分散为绿豆蛋白浆，保证绿豆蛋白浆中蛋白质的质量百分比为5%，用浓度为4mol/L氢氧化钠溶液的调节绿豆蛋白浆的pH值为9.0，加入相当于绿豆蛋白浆中蛋白质质量0.5%的碱性蛋白酶于60℃恒温搅拌（速度为36rpm）水解4h，酶解结束。

（5）灭酶、活性炭吸附：酶解结束后，用浓度为1.5mol/L盐酸溶液调节pH值至6.8，升温至80℃，加入相当于绿豆蛋白浆质量2%的活性炭粉末搅拌混匀，恒温搅拌45min，搅拌速度为36rpm，实现一步灭酶、活性炭吸附。

（6）粗滤、精滤、纳滤：将灭酶、脱色后的绿豆蛋白浆泵入板框式硅藻土过滤机粗滤，粗滤后的清液再经板框式纸板过滤机（过滤精度0.1μm）精滤，精滤透过液再经过孔径为1nm的纳滤膜纳滤脱盐、去除游离氨基酸并浓缩至固形物含量为40%。

（7）干燥：将浓缩液泵入喷雾干燥塔，选择进口温度为160℃、出口温度为90℃干燥，即得到绿豆蛋白肽粉成品。

实施例4

（1）绿豆蛋白粉的分散、溶解：用相当于绿豆蛋白粉7倍质量的55℃去离子水将绿豆蛋白粉配制为绿豆蛋白浆液，以3000rpm剪切速度将浆液分散混匀15min。

（2）纤维素酶酶解、灭酶：用浓度为1mol/L盐酸溶液将步骤（1）分散混匀的绿豆蛋白浆液pH值调节至5.0，加入相当于绿豆蛋白粉质量0.8%的纤维素酶，在50℃条件下恒温搅拌（速度为36rpm）酶解1.5h后，升温至90℃保持15min灭酶。

（3）离心分离、水洗去杂：将灭酶后的绿豆蛋白浆冷却至65℃以下，以4000rpm离心15min，取沉淀。加入相当于沉淀质量4倍的50℃去离子水混匀分散，再离心分离一次取沉淀。

（4）碱性蛋白酶酶解：用55℃去离子水将步骤（3）得到的沉淀搅拌分散为绿豆蛋白浆，保证绿豆蛋白浆中蛋白质的质量百分比为8%，用浓度为2mol/L氢氧化钠溶液的调节绿豆蛋白浆的pH值为8.0，加入相当于绿豆蛋白浆中蛋白质质量2%的碱性蛋白酶于55℃恒温搅拌（速度为36rpm）水解1.5h，酶解结束。

（5）灭酶、活性炭吸附：酶解结束后，用浓度为1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.0，升温至82℃，加入相当于绿豆蛋白浆质量0.5%的活性炭粉末搅拌混匀，恒温搅拌60min，搅拌速度为36rpm，实现一步灭酶、活性炭吸附。

（6）粗滤、精滤、纳滤：将灭酶、脱色后的绿豆蛋白浆泵入板框式硅藻土过滤机粗滤，粗滤后的清液再经板框式纸板过滤机（过滤精度0.1μm）精滤，精滤透过液再经过孔径为1nm的纳滤膜纳滤脱盐、去除游离氨基酸并浓缩至固形物含量为35%。

（7）干燥：将浓缩液泵入喷雾干燥塔，选择进口温度为165℃、出口温度为85℃干燥，即得到绿豆蛋白肽粉成品。

对比例1（除纤维素酶作用pH值调节为5.5外，其他参数与实施例1一致）

（1）绿豆蛋白粉的分散、溶解：同实施例1步骤（1）。

（2）纤维素酶酶解、灭酶：用浓度为3mol/L盐酸溶液将步骤（1）分散混匀的绿豆蛋白浆液的pH值调节至5.5，加入相当于绿豆蛋白粉质量0.5%的纤维素酶，在45℃条件下恒温搅拌（速度为36rpm）酶解1.5h后，升温至90℃保持15min灭酶。

（3）离心分离、水洗去杂：同实施例1步骤（3）。

（4）碱性蛋白酶酶解：同实施例1步骤（4）。

（5）灭酶、活性炭吸附：同实施例1步骤（5）。

（6）粗滤、精滤、纳滤：同实施例1步骤（6）。

（7）干燥：同实施例1步骤（7）。

对比例2（除步骤（5）不添加活性炭吸附外，其他参数与实施例1一致）

（1）绿豆蛋白粉的分散、溶解：同实施例1步骤（1）。

（2）纤维素酶酶解、灭酶：同实施例1步骤（2）。

（3）离心分离、水洗去杂：同实施例1步骤（3）。

（4）碱性蛋白酶酶解：同实施例1步骤（4）。

（5）灭酶：酶解结束后，用浓度为1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.0，升温至80℃，恒温搅拌60min灭酶，搅拌速度为36rpm。

（6）粗滤、精滤、纳滤：同实施例1步骤（6）。

（7）干燥：同实施例1步骤（7）。

效果实施例

采用GB/T22492-2008规定的方法测定实施例1～4以及对比例1～2制得的绿豆蛋白肽粉粗蛋白质含量、肽含量、总蛋白质中分子量≤1000Dal肽含量、灰分含量、水分含量、粗脂肪含量及脲酶活性。

采用杨月欣、王光亚主编的《食用食物营养成分分析手册》（中国轻工业出版社，2002年第一版）提供的游离氨基酸分析方法检测实施例1～6制得的绿豆蛋白肽粉中游离氨基酸质量。

采用吴琼英等的测定方法分析实施例1～4以及对比例1～2制得的绿豆蛋白肽粉的ACE抑制率，方法如下：取稀释成不同浓度酶解液40μL，加入25μLACE（100U/g）溶液于37℃保温10min，再加入40μL马尿酰组氨酰亮氨酸三肽（Hip-His-Leu，HHL）溶液于37℃保温30min，通过加入85μL1.0mol/L HCl终止反应；将反应液于10,000r/min离心20min后进行高效液相色谱测定，用40μL pH8.3（浓度0.05mol/L）的硼酸缓冲液作为空白对照。

色谱条件如下：

色谱柱：ZORBAX-C18柱(4.6×150mm，5μm)；柱温：25℃；检测波长：228nm；进样量：5μL；流动相：超纯水（含0.05%醋酸）：乙腈=75:25（V/V）；流速：0.8mL/min。抑制率计算公式如下：

R（%）=（A-B）/A×100

式中：R—蛋白酶解物对ACE的抑制率，%；A—空白对照组马尿酸的峰面积；B—添加多肽组马尿酸的峰面积。

称取一定质量样品配制成不同浓度溶液，以样品浓度为横坐标，对ACE的抑制率为纵坐标绘制圆滑曲线，从曲线中计算IC50值。

得到的分析结果见表1。

表1实施例1～4以及对比例1～2制得的绿豆蛋白肽粉分析检测结果

由表1可见，采用本发明方法实施例1～4制得的绿豆蛋白肽中蛋白质的质量百分比为96.2%～97.1%，相对分子量小于1000Da肽的质量百分比为93.2%～95.4%，灰分的质量百分比为0.98%～1.28%，游离氨基酸的质量百分比为0.59%～0.71%，产品的指标明显优于GB/T22492-2008一级标准要求。实施例1～4制得的绿豆蛋白肽的ACE抑制活性的IC50值为42.8～59.6μg.mL^-1，远小于100μg.mL^-1，ACE抑制活性强。与实施例1比较，对比例1由于预处理pH值调节为5.5，纤维素酶作用不充分，蛋白酶酶作用底物除杂不彻底，制得的产品中粗蛋白质含量、肽含量、总蛋白质中分子量≤1000Dal肽含量明显降低，水分含量因淀粉、糖类存在升高，外观呈淡黄色，粗蛋白质含量达不到GB/T22492-2008一级标准要求，产品的ACE抑制活性IC50值为67.5μg.mL^-1；对比例2由于未经活性炭选择性吸附，制得的产品主要理化指标，包括粗蛋白质含量、肽含量、总蛋白质中分子量≤1000Dal肽含量、水分含量、灰分含量等均与实施例1产品接近，差异不明显，但产品的ACE抑制活性IC50值为118.8μg.mL^-1，明显大于实施例1（IC50值为42.8μg.mL^-1），可见，活性炭选择性吸附工序大大地提高了产品的生物活性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）绿豆蛋白粉的分散、溶解：用水将绿豆蛋白粉配制成绿豆蛋白浆，搅拌分散混匀；

（2）纤维素酶酶解、灭酶：将步骤（1）分散混匀好的绿豆蛋白浆液的pH值调节为3.5～5，加入相当于绿豆蛋白粉质量0.1～1%的纤维素酶，在45～55℃条件下恒温搅拌酶解1h～2h后，升温灭酶；

（3）离心分离、水洗去杂：将灭酶后的绿豆蛋白浆冷却至65℃以下，离心分离，取沉淀；加入水将沉淀混匀分散，再离心分离一次取沉淀；

（4）碱性蛋白酶酶解：用水将步骤（3）得到的沉淀搅拌分散为绿豆蛋白浆，保证绿豆蛋白浆中蛋白质的质量百分比为5～15%，调节绿豆蛋白浆的pH值为8～9，加入相当于绿豆蛋白浆中蛋白质质量0.5～3%的碱性蛋白酶于50～60℃恒温搅拌酶解1～4h，酶解结束；

（5）灭酶、活性炭吸附：酶解结束后，调节pH值为6.5～7.0，升温至80～85℃，加入活性炭粉末搅拌混匀，恒温搅拌，实现一步灭酶、活性炭吸附；

（6）粗滤、精滤、纳滤：将灭酶、吸附脱色后的绿豆蛋白浆粗滤，粗滤后的清液再精滤，滤过液再经过纳滤，完成脱盐、去游离氨基酸并浓缩，得到浓缩液；

（7）干燥：将浓缩液进行喷雾干燥，得到具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽。

2.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的水的温度为45～55℃；

步骤（1）中所述的水的用量为相当于绿豆蛋白粉质量的6～10倍；

步骤（1）中所述的绿豆蛋白粉为蛋白质含量≥60%、水分含量≤12%的绿豆蛋白粉；

步骤（1）中所述的搅拌分散混匀及水化的条件为2000～3000rpm的剪切速度分散混匀、水化10～20min。

3.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的pH值为使用浓度为1～4mol/L的盐酸溶液调节pH值；

步骤（2）中所述的pH值为4～4.5；

步骤（2）中所述的纤维素酶为广州裕立宝生物技术有限公司的B型纤维素酶；

步骤（2）中所述的搅拌酶解的搅拌速度为36rpm；

步骤（2）中所述的升温灭酶是指将酶解液升温至85～100℃保持10～20min。

4.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽的制备方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的离心的条件为4000～6000rpm下离心10～20min；

步骤（3）中所述的水的温度为50～60℃；

步骤（3）中所述的水的添加量为所述沉淀的质量的2～5倍；

步骤（4）中所述的水的温度为50～60℃；

步骤（4）中所述的pH值为使用浓度为1～4mol/L氢氧化钠溶液调至pH值；

步骤（4）中所述的碱性蛋白酶为诺维信（中国）投资有限公司的碱性蛋白酶Alcalase2.4L；

步骤（4）中所述的搅拌酶解的搅拌速度为36rpm。

5.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽的制备方法，其特征在于：

步骤（5）中所述的pH值为使用浓度为1～2mol/L的盐酸溶液调节pH值；

步骤（5）中所述的活性炭粉末的加入量为相当于绿豆蛋白浆质量的0.5～3%；

步骤（5）中所述的活性炭粉末为200目以上的复合型活性炭；

步骤（5）中所述的搅拌的时间为30～60min；

步骤（5）中所述的搅拌的速度为36rpm。

6.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽的制备方法，其特征在于：

步骤（6）中所述的粗滤是指使用板框式硅藻土过滤机粗滤；

步骤（6）中所述的精滤是指使用板框式纸板过滤机精滤；

步骤（6）中所述的纳滤是指精滤透过液经过孔径为1nm的纳滤膜纳滤；

步骤（6）中所述的浓缩液为固形物含量为20～40%的浓缩液。

7.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤（7）中所述的喷雾干燥的操作参数为进口温度为160～170℃，出口温度为70～90℃。

8.一种具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽，由权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。

9.权利要求8所述的具有ACE抑制活性的绿豆蛋白肽在制备保健食品和/或普通食品中的应用。