CN104480177B

CN104480177B - 一种火麻蛋白ace抑制肽的制备方法

Info

Publication number: CN104480177B
Application number: CN201410848038.4A
Authority: CN
Inventors: 游向荣; 张雅媛; 卫萍; 孙健; 李志春; 李明娟; 杨媚
Original assignee: Institute of Agro Products Processing Science and Technology of Guangxi Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Agro Products Processing Science and Technology of Guangxi Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN104480177A

Abstract

本发明提供一种火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，包括以下几个步骤：步骤A：称取脱脂火麻仁粕，干燥，粉碎，过筛去除杂质，加水至固定料液比，用胶体磨进行匀浆，过筛，调节pH值，超声波辅助提取，恒温碱提蛋白，等电点沉淀，离心除去上清液，沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料液比，用均质机进行均质，过筛，调节pH值，等电点沉淀，离心除去上清液，中和，干燥得到火麻仁分离蛋白；步骤B：将火麻仁分离蛋白加入去离子水，调节pH值，加入混合蛋白酶，恒温酶解，沸水浴灭酶，离心取上清液；步骤C：将火麻仁蛋白酶解液分离纯化，将收集所得火麻仁蛋白ACE抑制肽进行冷冻干燥，即制得。本发明提供的方法操作简单，产物得率高，ACE抑制效果好。

Description

一种火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法

技术领域

本发明属于生物活性肽技术领域，尤其涉及一种火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法。

背景技术

目前，国内对火麻仁的研究和利用主要集中在火麻仁油的提取和利用上，火麻仁油富含亚油酸，α-亚麻酸和油酸和类花生酸，对于恢复人体的免疫系统所引起的慢性疾病和辅助治疗有帮助。在国内，一直以来都是将火麻仁榨油，渣滓用作动物饲料，造成大量的资源浪费。随着对火麻蛋白营养功能的进一步认识，已有企业和科研人员开始利用榨取油脂后的火麻渣滓进行产品加工，但多限制于饮料等产品的研究中。

火麻仁中蛋白质的含量约为 25%，含有 20 种已知氨基酸，其中包括 9 种人体必需氨基酸。火麻仁蛋白质主要含麻仁球蛋白和麻仁白蛋白，火麻仁蛋白中 80％为麻仁球蛋白(esedstin) ，20％约为白蛋白（albumin）。麻仁球蛋白含有酸性亚基和碱性亚基，相对无磷，用火麻仁蛋白进行的体外试验，即用胃蛋白酶水解后接着用胰蛋白酶水解，结果表明麻球蛋白易于消化，其必需氨基酸要比大豆分离蛋白高出很多。火麻仁蛋白所含必需氨基酸足以满足 2-5 岁儿童的生长发育需要。因此麻仁蛋白是一种十分优异的植物蛋白新资源。而且火麻仁所含的麻仁球蛋白和人类血浆的球蛋白极其相似，麻仁球蛋白可作为人体血浆的组成成分。火麻仁蛋白质有相当高含量的精氨酸，是大豆蛋白的约 1.5 倍。同时，有比较高含量的组氨酸，与大豆蛋白和葡萄籽蛋白很接近，精氨酸和组氨酸对儿童期的生长非常重要，同时精氨酸能在体内转化为一氧化氮，具有扩张血管，降低血压，保持血管畅通且有弹性的作用，精氨酸可以治疗高血压、肝昏迷、肝硬化等，西方国家用精氨酸来预防和治疗心血管疾病已经比较成熟，在许多功能性食品中添加了L-精氨酸。因此，如何实现火麻蛋白的工业化生产更是国内外学者的研究热点。

发明内容

目前来说，抑制ACE 成为控制血压升高的有效途径。但是，目前化学ACE 抑制剂副作用大，而生物ACE 抑制剂由于采用生物酶法存在生产条件要求高、生产工艺复杂、设备价格昂贵。

为了解决上技术问题，本发明提供一种火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，包括以下几个步骤：

步骤A：火麻仁蛋白质的提取：称取脱脂火麻仁粕，干燥，粉碎，过筛去除杂质。加水至固定料液比，用胶体磨进行匀浆，过筛，调节 pH 值，超声波辅助提取，恒温碱提蛋白，等电点沉淀，离心除去上清液，沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料液比，用均质机进行均质，过筛，调节 pH 值，等电点沉淀，离心除去上清液，中和，干燥得到火麻仁分离蛋白；

步骤B：火麻仁蛋白肽的定向酶解制备：将火麻仁分离蛋白加入去离子水，调节pH 值，加入混合蛋白酶，恒温酶解，沸水浴灭酶，离心取上清液；

步骤C：火麻仁蛋白ACE抑制肽的纯化制备：将火麻仁蛋白酶解液分离纯化，将收集所得火麻仁蛋白ACE抑制肽进行冷冻干燥，即制得高纯度火麻仁蛋白ACE抑制肽。

优选的，所述步骤A中，超声波辅助处理采用温度 20~30℃，作用功率 120~200W，占空比为 20：20s/s，时间为 40~80 min。

优选的，所述步骤A中，碱提的条件是 pH=8~9.5，提取温度45~55℃，料液比 1：10~20 g/mL，提取时间为40~80min。

优选的，所述步骤A中，离心速度为5000~6000 r/ min，离心时间为10~20 min。

优选的，步骤B中，混合蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，所述混合质量比为1~2：1~3：1~3。

优选的，步骤B中，加酶量为4500~8000U/g，底物质量浓度6~16%，温度为45~55℃，pH=8~9.5，酶解时间为2~4h。

优选的，步骤B中，离心速度为7000~8000r/min，离心时间为5~10 min。

优选的，步骤A中，匀浆后的物料过400目筛，均质后的物料过600目筛；匀浆温度为25℃，胶体磨间隙为在0.1~1mm，匀浆时间为5~10min；均质温度为55~65℃、均质压力为5~30MPa，均质次数为2~3次。

优选的，所述步骤C包括以下几个步骤：

步骤1）火麻水解蛋白肽脱盐采用大孔吸附树脂，制备型层析柱，层析条件为：室温25~30℃，火麻水解蛋白肽上样浓度为50~100mg /mL，上样流速为100~200mL/h，上样结束后用去离子水洗涤层析柱，当电导率降至与去离子水相当时，采用体积分数为体积分数为75%的乙醇进行解吸，收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩蒸去乙醇；

步骤2）采用凝胶过滤层析色谱分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，色谱条件为：色谱柱填料：SephadexG~15凝胶，脱盐火麻水解蛋白肽的上样浓度为100~200mg/mL，缓冲液为pH=8.0~8.5的碳酸氢铵缓冲液溶解，洗脱流速4~8 mL /min，收集洗脱体积40~400 mL的组分，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。

优选的，所述步骤C包括以下几个步骤：

步骤1）火麻水解蛋白肽脱盐采用纳滤膜分离装置，脱盐条件为：操作压力： 0.5~0.8MPa，料液浓度为5~10ug/mL，pH =8~8.5，温度为35℃；

步骤2）采用超滤装置分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，一级超滤采用5KD的膜过滤组件进行超滤，压力0.4~0.5MPa，温度30℃，料液浓度50~80mg/ml，取滤过液进行二级超滤，二级超滤采用1KD的膜过滤组件进行超滤，压力0.5~0.6MPa，温度30℃，取浓缩液，浓缩液为分子量在1KD~5KD范围的多肽，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。

本发明提供的火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法操作简单，制备出的ACE抑制肽具有抗氧化性，易于消化，氨基酸含量高，并具有扩张血管，降低血压，保持血管畅通且有弹性的作用；提升火麻精深加工利用水平，充分利用火麻副产物资源，提高广大农户收益。

附图说明

图1一次性灌胃火麻蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响。

图2注射火麻蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响。

图3连续灌胃火麻蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：

实施例1

1、火麻仁蛋白质的提取：火麻仁蛋白质的提取：称取脱脂火麻仁粕，干燥，粉碎，过筛去除杂质。加水至料液比为1：12g/mL，用胶体磨进行匀浆，匀浆温度为25℃，胶体磨间隙为0.1mm，匀浆时间为5min，匀浆后的物料过600目筛，调节 pH 值为8.5，进行超声波辅助提取，温度 25℃，作用功率 120W，占空比为 20：20s/s，在水浴温度50℃条件下，恒温碱提蛋白60 min，然后用 1 mol /L 的HCl 溶液调至火麻仁蛋白质等电点，充分搅拌后，静止沉淀，让蛋白质充分下沉，以5000 r/ min转速，离心20 min，除去上清液；沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料液比，用均质机均质3次，均质温度为55℃、均质压力为25MPa，过600目筛，调节 pH 值，等电点沉淀，以8000 r/ min转速，离心10 min，除去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀 3次，中和至中性，冷冻干燥得到火麻仁分离蛋白。

2、火麻仁蛋白肽的定向酶解制备：将火麻仁分离蛋白加入去离子水，调节 pH 值为9.0，加入由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比为1：1：1组成的混合蛋白酶，加酶量为7000U/g，底物质量浓度为7%，45℃恒温酶解4h，后用沸水浴10 min终止反应，灭酶后迅速冷却，以转速8000r/min离心分离10 min，收集上清液；

3、火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备：

火麻水解蛋白肽脱盐采用DA201-C大孔吸附树脂，制备型层析柱，层析条件为：室温25℃，火麻水解蛋白肽上样浓度为50mg /mL，上样流速为100mL/h，上样结束后用去离子水洗涤层析柱，当电导率降至与去离子水相当时，采用75%的乙醇进行解吸，收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩蒸去乙醇。

②采用凝胶过滤层析色谱分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，色谱条件为：色谱柱填料：SephadexG-15凝胶，脱盐火麻水解蛋白肽的上样浓度为100mg/mL，缓冲液为pH=8.0的碳酸氢铵缓冲液溶解，洗脱流速4 mL /min，收集洗脱体积40 mL的组分，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。

实施例2

1、火麻仁蛋白质的提取：称取脱脂火麻仁粕，干燥干燥，粉碎，过筛去除杂质。加水至料液比为1：20 g/mL，用胶体磨进行匀浆，匀浆温度为25℃，胶体磨间隙为在1mm，匀浆时间为8min，匀浆后的物料过600目筛，调节 pH 值为8，进行超声波辅助提取，温度 30℃，作用功率 150W，占空比为 20：20s/s，在水浴温度55℃条件下，恒温碱提蛋白80 min，然后用1 mol /L 的HCl 溶液调至火麻仁蛋白质等电点，充分搅拌后，静止沉淀，让蛋白质充分下沉，以6000 r/ min转速，离心15 min，除去上清液；沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料液比，用均质机均质2次，均质温度为55℃、均质压力为30MPa，过600目筛，调节 pH 值，等电点沉淀，以7000 r/ min转速，离心5min，除去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀 5 次，中和至中性， 50 ℃热风烘干得到火麻仁分离蛋白。

2、火麻仁蛋白肽的定向酶解制备：将火麻仁分离蛋白加入去离子水，调节 pH 值为9.5，加入由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比为2：3：3组成的混合蛋白酶，加酶量为4500U/g，底物质量浓度为6%， 55℃恒温酶解3h，后用沸水浴10 min终止反应，灭酶后迅速冷却，以转速8000r/min离心分离5min，收集上清液。

3、火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备：

①火麻水解蛋白肽脱盐采用DA201~C大孔吸附树脂，制备型层析柱，层析条件为：室温28℃，火麻水解蛋白肽上样浓度为80mg /mL，上样流速为150mL/h，上样结束后用去离子水洗涤层析柱，当电导率降至与去离子水相当时，采用体积分数为75%的乙醇进行解吸，收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩蒸去乙醇。

②采用凝胶过滤层析色谱分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，色谱条件为：色谱柱填料：SephadexG~15凝胶，脱盐火麻水解蛋白肽的上样浓度为150mg/mL，缓冲液为pH=8.3的碳酸氢铵缓冲液溶解，洗脱流速6 mL /min，收集洗脱体积200 mL的组分，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。

实施例3

1、火麻仁蛋白质的提取：称取脱脂火麻仁粕，干燥，粉碎，过筛去除杂质。加水至料液比为1：15 g/mL，用胶体磨进行匀浆，匀浆温度为30℃，胶体磨间隙为在0.5mm，匀浆时间为10min，匀浆后的物料过600目筛，调节 pH 值为8，进行超声波辅助提取，温度 20℃，作用功率 200W，占空比为 20：20s/s，在水浴温度45℃条件下，恒温碱提蛋白40 min，然后用 1mol /L的HCl 溶液调至火麻仁蛋白质等电点，充分搅拌后，静止沉淀，让蛋白质充分下沉，以6000 r/ min转速，离心15 min，除去上清液；沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料液比，用均质机均质3次，均质温度为60℃、均质压力为30MPa，过600目筛，调节 pH 值，等电点沉淀，以7500 r/ min转速，离心10 min，除去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀 3次，中和至中性，冷冻干燥得到火麻仁分离蛋白。

2、火麻仁蛋白肽的水解：采用混合蛋白酶的制备火麻仁蛋白肽的工艺条件为：混合蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，混合质量比为 2：2：3，加酶量8000U/g，底物浓度16%，温度55℃，pH=9.5，酶解时间4h，后用沸水浴10 min终止反应，灭酶后迅速冷却，以转速7500r/min离心分离10 min，收集上清液。

3、火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备：

①火麻水解蛋白肽脱盐采用DA201~C大孔吸附树脂，制备型层析柱，层析条件为：室温30℃，火麻水解蛋白肽上样浓度为100mg /mL，上样流速为200mL/h，上样结束后用去离子水洗涤层析柱，当电导率降至与去离子水相当时，采用体积分数为75%的乙醇进行解吸，收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩蒸去乙醇。

②采用凝胶过滤层析色谱分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，色谱条件为：色谱柱填料：SephadexG~15凝胶，脱盐火麻水解蛋白肽的上样浓度为200mg/mL，缓冲液为pH=8.5的碳酸氢铵缓冲液溶解，洗脱流速8 mL /min，收集洗脱体积400 mL的组分，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。

实施例4

与实施例1不同的是：火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备采用如下方式：

火麻水解蛋白肽脱盐采用纳滤膜分离装置，脱盐条件为：纳滤膜 NF400，操作压力：0.5MPa，料液浓度为5ug/mL，pH=8、温度为35℃。采用超滤装置分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，一级超滤采用5KD的膜过滤组件进行超滤，压力0.4MPa，温度30℃，料液浓度50mg/ml，取滤过液进行二级超滤，二级超滤采用1KD的膜过滤组件进行超滤，压力0.5MPa，温度30℃，取浓缩液，浓缩液为分子量在1KD~5KD范围的多肽，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。

实施例5

与实施例2不同的是，火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备采用如下方式：

火麻水解蛋白肽脱盐采用纳滤膜分离装置，脱盐条件为：纳滤膜 NF400，操作压力：0.8MPa，料液浓度为10ug/mL，pH=8.5、温度为35℃。采用超滤装置分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，一级超滤采用5KD的膜过滤组件进行超滤，压力0.5MPa，温度30℃，料液浓度50mg/ml，取滤过液进行二级超滤，二级超滤采用1KD的膜过滤组件进行超滤，压力0.6MPa，温度30℃，取浓缩液，浓缩液为分子量在1KD~5KD范围的多肽，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。

实施例6

与实施例3不同的是，火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备采用如下方式

火麻水解蛋白肽脱盐采用纳滤膜分离装置，脱盐条件为：纳滤膜 NF400，操作压力：0.6MPa，料液浓度为8ug/mL，pH=8.5，温度为35℃。采用超滤装置分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，一级超滤采用5KD的膜过滤组件进行超滤，压力0.5MPa，温度30℃，料液浓度50mg/ml，取滤过液进行二级超滤，二级超滤采用1KD的膜过滤组件进行超滤，压力0.6MPa，温度30℃，取浓缩液，浓缩液为分子量在1KD~5KD范围的多肽，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。

实施例7

性能测试：

一、火麻蛋白ACE抑制肽脱盐率的测定

盐分含量采用灰分法 GB/T 5009.4‐2003 测定

脱盐率=（M₀‐M₁）/M₀×100%

M₁：脱盐后盐分含量（%）

M₀：脱盐前盐分含量（%）

二、火麻蛋白ACE抑制肽短肽得率测定

短肽得率=N₁/N₀×100%

N₀：脱盐前总氮含量，mg;

N₁：脱盐后氮含量，mg；

通过对大孔树脂脱盐及纳滤法脱盐结果进行比较，两种方法对火麻蛋白ACE抑制肽脱盐率和短肽得率的测定结果如表1所示，采用大孔树脂进行脱盐，测定火麻蛋白ACE抑制肽的脱盐率达到 87.43%，短肽得率为 77.38%，采用纳滤膜进行脱盐，测定火麻蛋白ACE抑制肽的脱盐率为66.43%，短肽得率为 89.37%。试验表明大孔树脂的脱盐效果明显比纳滤脱盐效果高，但是短肽的率较纳滤比较少，因此如果需要得到纯度较大含盐量较少的肽选用大孔树脂法脱盐，而对肽纯度要求不高时选用纳滤法脱盐。

表1 不同处理对火麻蛋白ACE抑制肽脱盐率和短肽得率

	脱盐率（%）	短肽得率（%）
			大孔树脂（实施例1）	87.43	77.18
大孔树脂（实施例2）	88.05	78.12
			大孔树脂（实施例3）	87.98	77.90
纳滤膜（实施例4）	66.43	89.37
			纳滤膜（实施例5）	65.98	88.78
纳滤膜（实施例6）	66.30	89.20

三、火麻蛋白ACE抑制肽功能活性鉴定

① 测定本发明体外ACE抑制能力

采用体外检测的方法，以血管紧张素转化酶 ( ACE) 和马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL) 间反应为检测标准，通过反相高效液相色谱(RP~HPLC)检测马尿酸。以马尿酸的生成量判断样品对ACE的抑制作用，同时用缓冲液代替样品溶液做空白对照。

分别用大孔树脂和纳滤膜所分离纯化的火麻蛋白ACE抑制肽进行体外ACE抑制能力实验。

将提取纯化的火麻蛋白肽分别配成0.1mg/mL的液体，取 10μl 溶液样品和 40μlHHL溶液，于 37℃保温 6min，加入 20μl ACE ，37℃下反应 30min 后，加入 85μl 1mol/L的 HCl 溶液终止反应，至室温，过 0.22μm 的滤膜，取 5μl 反应产物进样，通过HPLC 洗脱图谱定量马尿酸生成量，以马尿酸的生成量来判断样品对 ACE 活性的抑制作用，同时做空白对照。

样品的ACE活性抑制率（%）=（空白对照的马尿酸峰值—样品的马尿酸峰值）/空白对照的马尿酸峰值*100

色谱条件为：色谱柱： C18分析用色谱柱(4.6mm × 150mm，5mm) ；流速：1.0ml/min；检测波长：228nm；进样量：5ml；柱温：3 0 ℃；流动相：1 2 % 乙腈( 含 0 . 5 % 乙酸)。

表 2 常见食物源蛋白 ACE 抑制肽的抑制活性

蛋白来源	ACE抑制活性(IC₅₀ ^*，mg/mL)
		火麻	0.032
蛋清蛋白	4.7
		牛乳酪蛋白	0.71
鱼肉蛋白	0.045
		大豆蛋白	1.69
大米蛋白	4.0
		小麦蛋白	2.7
花生蛋白	0.14

*（IC₅₀为ACE抑制率达到50%时的抑制剂质量浓度即为半抑制质量浓度）

结果表明，分别用大孔树脂和纳滤膜所分离纯化的火麻蛋白ACE抑制肽的体外ACE抑制能力相差不大，体外抑制率分别为81.04±0.12%和79.33±0.14%，IC₅₀= 0.032 mg/mL，从表2可以看出，火麻蛋白肽的ACE抑制效果比其他大多数食源性ACE抑制肽的半抑制质量浓度低，说明其体外抑制效果好，这为下游生产成本的降低奠定了基础。

②火麻蛋白ACE抑制肽体内降血压功能实验

采用原发性高血压模型大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats， SHR)为实验动物，25只，雄性，8~10周龄，体重200g左右，收缩压>180mmHg，将SHR大鼠随机分为五组，每笼5只喂养，自由采食引水，环境温度（25±1）℃，相对湿度（55±5）%，SHR大鼠适应环境7d后，开始实验。

a、一次性灌胃给予SHR大鼠火麻水解蛋白ACE抑制肽，大鼠适应环境后，将五组的SHR大鼠分别对应定为I组和II组的空白对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。火麻蛋白ACE抑制肽的低、中、高剂量分别为50、100、500 mg /kg·bw，经灌胃给予SHR大鼠，空白对照组灌胃给予相应剂量的蒸馏水，阳性对照组灌胃给予5mg /kg·bw卡托普利。测定灌胃后0、2、4、6、8h时SHR大鼠的血压。大鼠血压测定方法采用尾动脉脉搏间接测定法测定清醒大鼠的血压和心率。

一次性灌胃火麻蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响从图1可以看出，与空白对照组相比，阳性对照组与火麻蛋白ACE抑制肽不同剂量浓度组的SHR大鼠的血压在灌胃后均有明显下降，在灌胃后2h血压下降值达到最大，然后缓慢回升。由图1可见，各组与空白组相比，血压下降幅度基本相同，但在回升过程中，明显呈现火麻蛋白ACE抑制肽灌胃剂量越大，回升速度越慢，且火麻蛋白ACE抑制肽高剂量组与阳性对照组的回升幅度基本相同。实验结果表明，通过灌胃摄入火麻蛋白ACE抑制肽中、高剂量组，与空白对照组相比，血压水平下降显著（P<0.05）。

b、经静脉注射给予SHR大鼠火麻蛋白ACE抑制肽，采用鼠尾静脉注射给予三组的SHR大鼠5、10和20mg /kg·bw剂量的火麻蛋白ACE抑制肽，测定注射后第0、1、2和4h时SHR大鼠的血压。大鼠血压测定方法采用尾动脉脉搏间接测定法测定清醒大鼠的血压和心率。

静脉注射火麻蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响如图2所示，在尾动脉注射后，与空白对照组相比，火麻蛋白ACE抑制肽不同剂量组的大鼠血压均有明显下降，注射后1h，血压水平已接近最低，2h达到最低值，且随着注射剂量的增大，血压降低的幅度也越大。试验说明火麻蛋白ACE抑制肽可以明显降低血压，且低剂量的火麻蛋白ACE抑制肽即可达到明显的降压效果。

c、连续灌胃给予SHR大鼠火麻蛋白ACE抑制肽，采用连续20d定时灌胃给予四组的SHR大鼠蒸馏水和中剂量的火麻蛋白ACE抑制肽，每天测定灌胃后0h和2h时SHR大鼠的血压。大鼠血压测定方法采用尾动脉脉搏间接测定法测定清醒大鼠的血压和心率。

目前，高血压患者大都是依靠长期服用药物来控制血压水平，这样不可避免会产生一些副作用，因此，寻找更安全可靠的降压方法也是防治高血压研究中的一个重点。我们在一次性灌胃的基础上，对SHR大鼠进行连续灌胃，以考察火麻蛋白ACE抑制肽在长期服用过程中的降压效果及平稳性。

从图3可以看出，与空白对照组相比较，火麻蛋白ACE抑制肽组的SHR大鼠在灌胃2h后，血压水平有明显的下降，血压下降幅度在60mmHg左右，并且在连续灌胃10d后，火麻蛋白ACE抑制肽的SHR大鼠血压开始缓慢下降，与空白对照组的差值也越来越明显，血压下降幅度从0mmHg增加到40mmHg左右。这说明火麻蛋白ACE抑制肽不仅可以降血压，而且可以通过长期服用平稳地控制血压水平。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种火麻蛋白ACE 抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

步骤A ：火麻仁蛋白质的提取：称取脱脂火麻仁粕，干燥，粉碎，过筛去除杂质，加水至固定料液比，用胶体磨进行匀浆，过筛，调节 pH 值，超声波辅助提取，恒温碱提蛋白，等电点沉淀，离心除去上清液，沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料液比，用均质机进行均质，过筛，调节 pH 值，等电点沉淀，离心除去上清液，中和，干燥得到火麻仁分离蛋白；

步骤B ：火麻仁蛋白肽的定向酶解制备：将火麻仁分离蛋白加入去离子水，调节 pH值，加入混合蛋白酶，恒温酶解，沸水浴灭酶，离心取上清液；

步骤C ：火麻仁蛋白ACE 抑制肽的纯化制备：将火麻仁蛋白酶解液分离纯化，将收集所得火麻仁蛋白ACE 抑制肽进行冷冻干燥，即制得高纯度火麻仁蛋白ACE 抑制肽；

步骤A 中，匀浆后的物料过400 目筛，均质后的物料过600 目筛；匀浆温度为25℃，胶体磨间隙为在0.1-1mm，匀浆时间为5-10min ；均质温度为55-65℃、均质压力为5-30MPa，均质次数为2-3 次；

步骤B 中，加酶量为4500-8000U/g，底物质量浓度6-16%，温度为45-55℃，pH=8-9.5，酶解时间为2-4h；混合蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，所述混合质量比为1-2 ：1-3 ：1-3；

所述步骤C 包括以下几个步骤：

步骤1）火麻水解蛋白肽脱盐采用大孔吸附树脂，制备型层析柱，层析条件为：室温25-30℃，火麻水解蛋白肽上样浓度为50-100mg /mL，上样流速为100-200mL/h，上样结束后用去离子水洗涤层析柱，当电导率降至与去离子水相当时，采用75% 的乙醇进行解吸，收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩蒸去乙醇；

步骤2）采用凝胶过滤层析色谱分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，色谱条件为：色谱柱填料：SephadexG-15 凝胶，脱盐火麻水解蛋白肽的上样浓度100-200mg/mL，缓冲液为pH=8.0-8.5 的碳酸氢铵缓冲液溶解，洗脱流速4-8 mL /min，收集洗脱体积40-400 mL 的组分，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE 抑制肽。

2.一种火麻蛋白ACE 抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

所述步骤C 包括以下几个步骤：

步骤1）火麻水解蛋白肽脱盐采用纳滤膜分离装置，脱盐条件为：操作压力：

0.5-0.8MPa，料液浓度为5-10ug/mL，pH =8-8.5、温度为35℃ ；

步骤2）采用超滤装置分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，一级超滤采用5KD 的膜过滤组件进行超滤，压力0.4-0.5MPa，温度30℃，料液浓度50-80mg/ml，取滤过液进行二级超滤，二级超滤采用1KD 的膜过滤组件进行超滤，压力0.5-0.6MPa，温度30℃，取浓缩液，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE 抑制肽。

3.如权利要求1或2 所述的火麻蛋白ACE 抑制肽的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，超声波辅助处理采用温度 20-30℃，作用功率 120-200W，占空比为 20 ：20s/s，时间为40-80 min。

4.如权利要求1 或2所述的火麻蛋白ACE 抑制肽的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，碱提的条件是 pH=8-9.5，提取温度45-55℃，料液比为 1 ：10-20 g/mL，提取时间为40-80min。

5.如权利要求1 或2所述的火麻蛋白ACE 抑制肽的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，离心速度为5000 -6000r/ min，离心时间为 10-20 min。

6.如权利要求1 或2所述的火麻蛋白ACE 抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤B 中，离心速度为7000-8000r/min，离心时间为5-10 min。