CN107119097B - 一种桑叶免疫活性肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于桑叶综合利用技术领域，提供了一种桑叶免疫活性肽及其制备方法。该方法为：以桑叶为原料，通过水提盐沉或碱提酸沉制备桑叶蛋白，再通过中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶6种酶单独酶解或者复合酶解桑叶蛋白制备桑叶免疫活性肽粗品，并采用阴离子柱层析、Sephadex G50、G‑25或G‑15凝胶柱层析及半制备RP‑HPLC对其进行分离纯化，得到活性好，纯度高的免疫肽。此类免疫肽能够促进巨噬细胞RAW264.7分泌NO，白细胞介素IL‑6，肿瘤坏死因子TNF‑α，增强了机体对病原体入侵的抵抗能力。与此时同，此免疫活性肽可以增强RAW264.7胞饮中性红的能力。

Description

一种桑叶免疫活性肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种桑叶活性肽，特别是涉及一种桑叶免疫活性肽及其制备方法。
背景技术
免疫调节是指免疫系统中的免疫细胞与免疫分子之间、以及免疫系统与其他系统之间相互作用，使机体的免疫应答处于最合适的水平，从而维持生物体内生理动态平衡。一旦免疫调节失衡，就会引发病原微生物感染、免疫缺陷病、肿瘤及超敏反应等不良症状。因此寻找具有免疫活性的免疫分子显得尤为重要。近期研究认为，通过诸如免疫肽、免疫多糖等天然活性物质来提高机体免疫调节活性是最有希望替代抗生素治疗的方法。免疫活性肽是指一类能够通过增强机体免疫力，增强巨噬细胞吞噬能力从而提高机体抵御外来病原体感染能力的免疫功能肽。免疫活性肽作为小分子物质，能够完整的被肠道吸收或者在肠道与受体结合来发挥免疫作用，具有活性强、易吸收、稳定性强等独特的优势。目前免疫肽主要来源于动物、植物、微生物。其中植物蛋白免疫肽因具有来源广、成本低、活性高等特点而成为研究热点。目前制备的植物源免疫肽主要有大米肽、米糠肽、绿豆肽等，而叶蛋白免疫肽的研究较少。
桑树属桑科桑属植物，在我国栽培历史悠久。桑叶是桑树的叶子，国家卫生部将其列为药食两用植物。桑叶中含有丰富的蛋白质、生物碱、多糖、黄酮、酚酸等物质，具有较高的营养价值。传统蚕桑产业中桑叶主要用作蚕饲料，易出现过剩、浪费等现象，为了实现资源的最优利用，目前对桑叶中的多种成分，如多糖、酚酸、黄酮、生物碱等进行了提取并进行生理活性的分析。如中国专利CN 102370707 A用乙醇溶液制备桑叶、桑枝提取物，经大孔树脂多次洗脱分离，得到主要成分为DNJ、多糖及黄酮的桑叶/桑枝提取物，并将其用于美白及降血糖研究；中国专利CN 102771862 A用50%~70%的酸性乙醇溶液制备了具抑菌活性的桑叶酚酸提取物；中国专利CN 104274534 A用超临界萃取技术制备了全成分桑叶提取物，对其多糖含量进行了分析。目前的专利及研究主要集中在桑叶中酚类、DNJ的提取及其在降血糖、美白等药理活性中的应用，提取溶剂多为有机溶剂，产物溶解性较低。因此，需要对桑叶中更多的化学成分及生理活性进行研究，以期进一步提高桑叶的综合利用价值。
研究表明，桑叶中蛋白质含量为干基重量的15%~30%，是蛋白含量较高的植物。其氨基酸组成与脱脂大豆粉大体一致，可以用作动物饲料添加剂或食品添加剂。目前有少数文献及专利对桑叶蛋白及桑叶肽的提取优化进行了分析，而对于桑叶免疫活性肽的制备尚无研究。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有桑叶活性成分及免疫肽研究存在的不足之处，提供了一种经济高效的桑叶免疫活性肽及其制备方法，所得桑叶肽具有纯度高、免疫活性高的特点。
本发明的目的通过如下方法实现：
一种桑叶免疫活性肽的制备方法，用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶6种蛋白酶单独酶解或者复合酶解桑叶蛋白，并用DEAESepharose Fast Flow 阴离子柱层析、Sephadex G-50、G-25或G-15凝胶柱层析及RP-HPLC对其进行分离纯化制备，得到桑叶免疫活性肽；
包括以下步骤：
（1）桑叶免疫活性肽粗品制备：新鲜桑叶洗净晾干，粉碎后过筛，得桑叶粉；提取桑叶蛋白后，取桑叶蛋白用水溶解，配制成质量浓度为1%-10 %的溶液， 在95-100℃蛋白变性5 min，冷却后采用加入所述6种蛋白酶中的一种、加入六种酶中的两种或加入六种蛋白酶中的三种进行酶解，酶解后95-100 ℃灭酶活10 min，冷却至室温后，在离心力为5000-10000g条件下离心15-20 min，取上清冷冻干燥得到具有免疫活性的桑叶肽粗品；蛋白酶的总添加量为底物质量的1%-5%；
（2）桑叶免疫活性肽的分离纯化：将（1）中桑叶免疫活性肽粗品用Tris-HCl或者去离子水溶解，并用0.22-0.45 μm的滤膜过滤；取10-30 mL滤液通过DEAE Sepharose FastFlow 阴离子柱层析，用不同浓度的NaCl溶液冲洗柱子，收集组分；100 Da透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解，进行免疫活性测定，将活性最高的组分通过Sephadex G-50、G-25或G-15凝胶柱层析分离，收集分离的组分进行冷冻干燥，测定免疫活性，收集活性高的组分用RP-HPLC进一步分离纯化，所得组分冷冻干燥后测定免疫活性，活性最高的组分即为桑叶免疫活性肽。
上述方法中，步骤（1）桑叶蛋白的提取采用水提盐沉或碱提酸沉法（孙崇臻，等.不同制备方法桑叶蛋白功能性质的比较[J]. 现代食品科技，2015, 31(12), 242-249.）。
上述方法中，步骤（1）中，当选用加入六种蛋白酶中的一种时，蛋白酶的酶解条件为：中性蛋白酶37-45 ℃，pH 6.8 -7.2，碱性蛋白酶45-55℃，pH 7.5-8.5；复合蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解温度45-55 ℃，pH 6.5 -7.5；胰蛋白酶32-40℃，pH7.5-8.5； 6种单独酶解时间均为1-8 h，E/S为1-6%；当选用加入六种酶种蛋白酶中的两种时，酶解条件为：在单独酶解条件下，各自酶解时间控制在1-4h；当选用加入六种酶种蛋白酶中的三种时，三酶复合酶解满足：在单酶水解条件下，各自酶解时间控制在0.5-3 h。
上述方法中，所述Tris-HCl浓度为15-25 mM，pH 为7.2-8.2。
上述方法中，步骤（2）所述过离子柱的溶液浓度为5-30 mg/mL；NaCl洗脱液浓度为0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1 mol/L；洗脱流速1.0-1.5 mL/min，8min/管，每个洗脱浓度接收40管。
上述方法中，步骤（2）所述Sephadex G-50、G-25或G-15凝胶柱层析的溶液浓度为5-30 mg/mL，加样体积1-5 mL，纯水洗脱，洗脱流速0.3-0.8 mL/min，3-6 min/管。
上述方法中，步骤（2）中采用RP-HPLC分离纯化的条件为：使用C18柱，上样浓度0.5-20 mg/mL，上样体积0.02-5 mL；检测波长220 nm；流动相为A：0.05-0.3%的三氟乙酸（TFA），B：含0.05-0.3%TFA的乙腈；洗脱梯度为：单酶酶解产物：0-9-10-30-31-35min，90-90-65-50-90-90%的流动相A；复合酶解产物：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流动相A，流速为0.2-20 mL/min（可在此基础上根据实际情况进行梯度优化）。
上述方法中，所述桑叶肽进行免疫活性分析：包括巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子NO，IL-6，TNF-α的能力及胞饮中性红的能力。
本发明还提供了一种利用上述方法制备的一种具有免疫活性的桑叶肽。
本发明以6种蛋白酶单独酶解或复合酶解制备桑叶免疫活性肽，并用DEAESepharose Fast Flow阴离子柱及Sephadex G-50、G-25或者G-15凝胶柱进行分离纯化，制备工艺简单；纯化过程温和，较好的保持了桑叶肽的免疫活性，克服了目前对桑叶提取物化学成分研究相对单一、制备过程复杂、产物溶解性低的缺陷。同时，桑叶免疫活性肽的制备，扩大了桑叶的应用范围，并提升了其药食两用价值。
本发明制备的桑叶肽具有极强的溶解性及良好的免疫活性，可以作为天然免疫调节剂，很好的用于食品及药品行业。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
1）本发明制备了桑叶免疫活性肽，极大的丰富了桑叶有效成分的研究范围，强化了其应用价值。
2）本发明提供了一种简便可行的桑叶免疫活性肽的制备方法。
3）本发明制备的免疫活性肽具有极强的溶解性、良好的免疫活性。
4）本发明制备过程未涉及任何有机溶剂，操作条件温和，最大程度的保留了桑叶肽的免疫活性，保证了产品的安全性。
5）本发明的制备过程操作简便，成本低，适合工业化生产。
附图说明
图1A为 DEAE Sepharose FF阴离子柱层析图；图1B为各离子组分中性红胞饮率测定结果；
图2A Sephadex G-25凝胶柱层析图；图2B各分离组分中性红胞饮率；
图3为 RP-HPLC液相图谱；
图4A~图4D为桑叶免疫活性肽对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌NO (A)、IL-6 (B)、TNF-α (C) 及胞饮中性红的影响（D）；
图5A~图5D为桑叶免疫活性肽对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α (A)、NO (B)、IL-6 (C)及胞饮中性红的影响（D）。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的描述，但需要说明的是，实施例并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
一种桑叶免疫活性肽的制备方法（中性蛋白酶酶解），包括如下步骤：
（1）桑叶免疫活性肽粗品制备：新鲜桑叶洗净晾干，粉碎后过筛，得桑叶粉；取30 g桑叶粉加600 mL蒸馏水混匀，溶解后超声细胞粉碎15 min，室温提取2 h后离心（8000 g，4℃，20 min），上清液加入固体硫酸铵，达到65%饱和度。离心（离心力8000 g，4℃，20 min）取沉淀，透析脱盐后冷冻干燥得到桑叶蛋白。 取5g桑叶蛋白用水溶解，配制质量浓度为1%的溶液， 95 ℃加热5 min。冷却后调pH 7.0，加入1%的中性蛋白酶（诺维信，Neutrase 0.8L），45 ℃酶解2 h后，95℃灭酶活10 min。冷却至室温，8000 g离心15 min，取上清冷冻干燥，得到桑叶免疫活性肽粗品；
（2）桑叶免疫活性肽的分离纯化：
将（1）中桑叶免疫活性肽粗品用Tris-HCl（20 mM，pH 7.8）水溶解，配制10 mg/mL的溶液，并用0.22 μm的滤膜过滤。取15 mL滤液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，分别用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1 mol/L的NaCl溶液以1.0 mL/min速度冲洗柱子，用自动收集器进行收集（8 min/管）。共得到D1-D7七个组分，将收集组分通过100 Da透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解，进行免疫活性测定（结果见图1A和图1B）。图1 A DEAESepharose FF阴离子柱层析图；图2B为各离子组分中性红胞饮率测定结果。其中a-f: 不同字母代表各组分中性红胞饮率具有显著差异，p<0.05。
由图1A可知，桑叶免疫活性粗肽经过DEAE Sepharose FF阴离子柱分离后得到7个不同的组分。由图1B可知，7个组分的中性红胞饮率均显著优于空白组，说明离子分离后得到的不同组分均有免疫活性，其中D4、D5的免疫活性最高，显著优于其他组分，D3次之。综合考虑产品得率及免疫活性，因此选择得率高活性高的D5进一步纯化。
将组分D5用水配成浓度5mg/mL的溶液，用0.22 μm的滤膜过滤后，取2 mL加入到Sephadex G-25凝胶柱中进行层析分离。流速0.3 mL/min，5 min/管收集样品，220 nm测定洗脱组分吸光值，绘制洗脱曲线（图2A）并测定中性红胞饮率（图2B）。图2A-图2B为Sephadex G-25凝胶柱层析图（A）及各分离组分中性红胞饮率（B）。a-d: 不同字母代表各组分中性红胞饮率具有显著差异，p<0.05。由图2-A可知，D5经过Sephadex G-25凝胶柱分离后，得到S1、S2两个组分。由图2-B得知，S1、S2的中性红胞饮率均显著高于空白组，其中S1的吞噬率最高，且显著优于LPS组。选择S1组分进一步纯化。
选择S1进行RP-HPLC液相纯化。将S1用超纯水配制成浓度为1 mg/mL的溶液，用0.22 μm的滤膜过滤。使用日本岛津液相色谱仪进行分析。将样品溶液注入反相制备柱（300SB-C18，5 μm, 9.4×250 mm）中，以0.05%的TFA（A）及含0.05% TFA的乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱。洗脱梯度：0-9-10-30-31-35min，90-90-65-50-90-90%的流动相A。使用紫外检测器进行检测，检测波长220 nm，流速1 mL/min。由图3可知，S1经过RP-HPLC分离后，在1-10min出现两个溶剂峰，17.954 min得到1个组分，说明制备的桑叶免疫活性肽具有较高纯度。
对本发明实施例制备纯化的桑叶肽进行免疫活性测定：将桑叶免疫肽用DMEM培养基溶解稀释，配制浓度为5~150 μg/mL的溶液，进行小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌NO、IL-6、TNF-α及胞饮中性红的测定，结果如图4所示。图4桑叶免疫活性肽对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌NO (A)、IL-6 (B)、TNF-α (C) 及胞饮中性红的影响（D）。**:代表不同浓度桑叶肽及脂多糖（LPS）与对照组具有极显著差异，p<0.01。
当机体受到病原体感染时，巨噬细胞首先产生吞噬作用，然后通过分泌NO或者产生ROS来杀死病原体。IL-6, TNF-α等细胞因子也会被同时分泌参与炎症反应。这些免疫应答的刺激调节可以增强机体对抗外源病原体的威胁，从而发挥免疫作用。由图4A~图4D可知，经过本发明实施例制备的桑叶免疫活性肽处理后，小鼠巨噬细胞NO（A）、 IL-6 (B)、TNF-α (C)的表达量均显著升高。同时，在5-100 μg/mL的范围内，三个细胞因子的表达量随着浓度的升高而增加。其中，桑叶免疫活性肽对IL-6的激活表达最为显著，经过100 μg/mL活性肽处理后的RAW264.7的IL-6表达水平是阴性对照组的500倍左右（图4-B）。与细胞因子分泌表达结果相似，不同浓度的桑叶活性肽中性红胞饮率均显著优于阴性对照组，具有显著的胞饮效果。综上，本发明实施例制备的桑叶肽具有很强的免疫调节活性，是一种具有较高应用价值的免疫活性肽。
实施例2
一种桑叶免疫活性肽的制备方法（碱性蛋白酶与中性蛋白酶复合酶解），包括如下步骤：
（1）桑叶免疫活性肽粗品制备：新鲜桑叶洗净晾干，粉碎后过筛，得桑叶粉；取30 g桑叶粉加900 mL蒸馏水混匀，溶解后超声细胞粉碎20 min，室温提取2 h后离心（8000 g，4℃，20 min），上清液加入固体硫酸铵，达到65%饱和度。离心（8000 g，4℃，20 min）取沉淀，透析脱盐后冷冻干燥得到桑叶蛋白。 取5 g桑叶蛋白用水溶解，配制质量浓度为5 %的溶液， 95 ℃加热5 min。冷却后调pH 7.2，加入2%的中性蛋白酶（诺维信，Neutrase 0.8L），45℃酶解1 h后，95℃灭酶活15 min。冷却至55 ℃，调pH 8.0，加入1%的碱性蛋白酶（诺维信3701，Alcalase 3.0T）酶解3 h，95℃灭酶活10 min后，8000 g离心15 min，取上清冷冻干燥，得到桑叶免疫活性肽粗品；
（2）桑叶免疫活性肽的分离纯化：
将（1）中桑叶免疫活性肽粗品用水溶解，配制15 mg/mL的溶液，并用0.22 μm的滤膜过滤。取25 mL滤液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，分别用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1 mol/L的NaCl溶液以1.5 mL/min速度冲洗柱子，用自动收集器进行收集（8min/管），将收集组分通过100 Da透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解，进行免疫活性测定。取免疫活性最高的离子组分用水配制浓度10 mg/mL的溶液，用0.22 μm的滤膜过滤后，取1 mL加入到Sephadex G-15凝胶柱中进行层析分离。流速0.5 mL/min，3 min/管收集样品，220 nm测定洗脱组分吸光值及其免疫活性。
选择免疫活性高的凝胶组分进行RP-HPLC液相纯化。用超纯水配制成浓度为10mg/mL的溶液，用0.22 μm的滤膜过滤。使用Waters液相色谱仪进行分析。将样品溶液注入反相制备柱（SunFire Prep C18，5 μm, 19 x 250 mm）中，以0.1%的TFA（A）及含0.1% TFA的乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱。洗脱梯度：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流动相A，使用PAD检测器进行检测，检测波长220 nm，流速10 mL/min。
对实施例2制备纯化的桑叶肽进行免疫活性测定：将桑叶免疫肽用DMEM培养基溶解稀释，配制浓度为5~150 μg/mL的溶液，进行小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌NO、IL-6、TNF-α及胞饮中性红的测定，结果如图5A~图5D所示。图5A~图5D为桑叶免疫活性肽对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α (A)、NO (B)、IL-6 (C)及胞饮中性红的影响（D）。**:代表与对照组存在极显著差异，p<0.01。由图5可知，实施例2制备的桑叶肽在5-150 μg/mL范围内，能够极显著的提高NO、IL-6、TNF-α的表达量，同时显著提高了中性红胞饮率，因此具有较强的免疫活性。
实施例3
一种桑叶免疫活性肽的制备方法（复合蛋白酶、木瓜蛋白酶复合酶解），包括如下步骤：
（1）桑叶免疫活性肽粗品制备：新鲜桑叶洗净晾干，粉碎过筛得桑叶粉；取30 g桑叶粉加500 mL蒸馏水混匀，溶解后超声细胞粉碎15 min，室温提取2 h后离心（8000 g，4℃，20 min），上清液加入固体硫酸铵，达到65%饱和度。8000 g离心20 min，取沉淀，透析脱盐后冷冻干燥得到桑叶蛋白。 取5 g桑叶蛋白用水溶解，配制质量浓度为4 %的溶液， 95 ℃加热5 min。冷却后调pH 7.0，加入2%的复合蛋白酶（丹麦诺维信，Protamex），50 ℃酶解2 h后，95℃灭酶活5 min。冷却至50 ℃，调pH 7.0，加入2%的木瓜蛋白酶（上海阿拉丁，P123425）酶解1 h，95℃灭酶活5 min。冷却后8000 g离心15 min，取上清冷冻干燥，得到桑叶免疫活性肽粗品；
（2）桑叶免疫活性肽的分离纯化：
将（1）中桑叶免疫活性肽粗品用水溶解，配制15 mg/mL的溶液，并用0.22 μm的滤膜过滤。取20 mL滤液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，分别用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1 mol/L的NaCl溶液以1.5 mL/min速度冲洗柱子，用自动收集器进行收集（8min/管），将收集组分通过100 Da透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解，进行免疫活性测定。取免疫活性最高的离子组分用水配制浓度10 mg/mL的溶液，用0.22 μm的滤膜过滤后，取2 mL加入到Sephadex G-25凝胶柱中进行层析分离。流速0.5 mL/min，5 min/管收集样品，220 nm测定洗脱组分吸光值及其免疫活性。
选择免疫活性高的凝胶组分进行RP-HPLC液相纯化。用超纯水配制成浓度为20mg/mL的溶液，用0.22 μm的滤膜过滤。使用Waters液相色谱仪进行分析。将样品溶液注入反相制备柱（SunFire Prep C18，5 μm, 19 x 250 mm）中，以0.1%的TFA（A）及含0.1% TFA的乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱。洗脱梯度：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流动相A，使用PAD检测器进行检测，检测波长220 nm，流速15 mL/min。对分离的组分进行免疫活性测定，得到活性最高的组分即为桑叶免疫活性肽。
实施例4
一种桑叶免疫活性肽的制备方法（复合蛋白酶、胰蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解），包括如下步骤：
（1）桑叶免疫活性肽粗品制备：新鲜桑叶洗净晾干，粉碎过筛得桑叶粉；取30 g桑叶粉加300 mL蒸馏水混匀，溶解后超声细胞粉碎15 min，室温提取2 h后离心（8000 g，4℃，20 min），上清液加入固体硫酸铵，达到65%饱和度。8000 g离心20 min，取沉淀，透析脱盐后冷冻干燥得到桑叶蛋白。 取5 g桑叶蛋白用水溶解，配制质量浓度为3 %的溶液， 95 ℃加热8 min。冷却后调pH 7.5，加入2%的复合蛋白酶（诺维信，Protamex），50 ℃酶解1 h后，95℃灭酶活5 min。冷却至37 ℃，调pH 8.0，加入1%的胰蛋白酶（上海阿拉丁，T105532）酶解1h，95℃灭酶活5 min。冷却至45℃，调pH 7.0，加入1%的风味蛋白酶（诺维信，Flavourzyme500LAPU/g）酶解0.5 h，95℃灭酶活5 min后，8000 g离心15 min，取上清冷冻干燥，得到桑叶免疫活性肽粗品。
（2）桑叶免疫活性肽的分离纯化：
将（1）中桑叶免疫活性肽粗品用水溶解，配制25 mg/mL的溶液，并用0.22 μm的滤膜过滤。取15 mL滤液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱，分别用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1 mol/L的NaCl溶液以1.2 mL/min速度冲洗柱子，用自动收集器进行收集（8min/管），将收集组分通过100 Da透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解，进行免疫活性测定。取免疫活性最高的离子组分用水配制浓度20 mg/mL的溶液，用0.22 μm的滤膜过滤后，取1 mL加入到Sephadex G-25凝胶柱中进行层析分离。流速0.3 mL/min，5 min/管收集样品，220 nm测定洗脱组分吸光值及其免疫活性。
选择免疫活性高的凝胶组分进行RP-HPLC液相纯化。用超纯水配制成浓度为20mg/mL的溶液，用0.22 μm的滤膜过滤。使用Waters液相色谱仪进行分析。将样品溶液注入反相制备柱（SunFire Prep C18，5 μm, 19 x 250 mm）中，以0.05%的TFA（A）及含0.05% TFA的乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱。洗脱梯度：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流动相A，使用PAD检测器进行检测，检测波长220 nm，流速5 mL/min。对分离的组分进行免疫活性测定，得到活性最高的组分即为桑叶免疫活性肽。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种桑叶免疫活性肽的制备方法，其特征在于，用中性蛋白酶单独酶解或，碱性蛋白酶与中性蛋白酶复合酶解，并用DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子柱层析、Sephadex G-50、G-25或G-15凝胶柱层析及RP-HPLC对其进行分离纯化制备，得到桑叶免疫活性肽；
包括以下步骤：
（1）桑叶免疫活性肽粗品制备：新鲜桑叶洗净晾干，粉碎后过筛，得桑叶粉；提取桑叶蛋白后，取桑叶蛋白用水溶解，配制成质量浓度为1%-10 %的溶液， 在95-100℃蛋白变性5min，冷却后采用加入中性蛋白酶单独酶解或，碱性蛋白酶与中性蛋白酶进行酶解，酶解后95-100 ℃灭酶活10 min，冷却至室温后，在离心力为5000-10000g条件下离心15-20 min，取上清冷冻干燥得到具有免疫活性的桑叶肽粗品；蛋白酶的总添加量为底物质量的1%-5%；
（2）桑叶免疫活性肽的分离纯化：将（1）中桑叶免疫活性肽粗品用Tris-HCl或者去离子水溶解，并用0.22-0.45 μm的滤膜过滤；取10-30 mL滤液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱层析，用不同浓度的NaCl溶液冲洗柱子，收集组分；100 Da透析袋透析脱盐，冷冻干燥后用水溶解，进行免疫活性测定，将活性最高的组分通过Sephadex G-50、G-25或G-15凝胶柱层析分离，收集分离的组分进行冷冻干燥，测定免疫活性，收集活性高的组分用RP-HPLC进一步分离纯化，所得组分冷冻干燥后测定免疫活性，活性最高的组分即为桑叶免疫活性肽。
2.根据权利要求1所述桑叶免疫活性肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）桑叶蛋白的提取采用水提盐沉或碱提酸沉法。
3. 根据权利要求1所述桑叶免疫活性肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，当选用中性蛋白酶单独酶解时，条件为：中性蛋白酶37-45 ℃，pH 6.8 -7.2，单独酶解时间均为1-8 h，酶底浓度为1-6%；当选用碱性蛋白酶与中性蛋白酶复合酶解时，酶解条件为：在单独酶解条件下，各自酶解时间控制在1-4h。
4.根据权利要求1所述桑叶免疫活性肽的制备方法，其特征在于，所述Tris-HCl浓度为15-25 mM，pH 为7.2-8.2。
5. 根据权利要求1所述桑叶免疫活性肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述过离子柱的溶液浓度为5-30 mg/mL；NaCl洗脱液浓度为0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1 mol/L；洗脱流速1.0-1.5 mL/min，8min/管，每个洗脱浓度接收40管。
6. 根据权利要求1所述桑叶免疫活性肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述Sephadex G-50、G-25或G-15凝胶柱层析的溶液浓度为5-30 mg/mL，加样体积1-5 mL，纯水洗脱，洗脱流速0.3-0.8 mL/min，3-6 min/管。
7. 根据权利要求1所述桑叶免疫活性肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中采用RP-HPLC分离纯化的条件为：使用C18柱，上样浓度0.5-20 mg/mL，上样体积0.02-5 mL；检测波长220 nm；流动相为A：0.05-0.3%的三氟乙酸（TFA），B：含0.05-0.3%TFA的乙腈；洗脱梯度为：单酶酶解产物：0-9-10-30-31-35min，90-90-65-50-90-90%的流动相A；复合酶解产物：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流动相A，流速为0.2-20 mL/min。
8.根据权利要求1所述桑叶免疫活性肽的制备方法，其特征在于，所述桑叶肽进行免疫活性分析：包括巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子NO，IL-6，TNF-α的能力及胞饮中性红的能力。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法制备的一种具有免疫活性的桑叶肽。
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