CN111748596A - 一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，属于抗氧化肽提取技术领域，包括以下步骤：S1、桑葚制干：将新鲜采摘的桑葚冷冻干燥机内冻干，制得桑葚制干产品，待用；S2、粉碎：将桑葚制干产品置于粉碎机中充分粉碎后过筛，制得桑葚粉末，待用；S3、制备混合液：向桑葚粉末中添加氯化钠溶液，制得混合液，待用；S4、制备桑葚酶解产物：用碱性蛋白酶酶解混合液，待用；S5、分离：利用Sephadex G‑25凝胶色谱进行分离，待用；S6、进一步分离；待用；S7、冷冻干燥，便于从桑葚中有效制备抗氧化肽，具有良好的肝损伤保护作用，为实现桑葚中药现代化和开发新型、高效、安全的健康食品提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及抗氧化肽提取技术领域，更具体地说，涉及一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽。
背景技术
桑葚，又作桑椹，为桑科植物桑树的果穗，又名桑椹子、桑蔗、桑枣、桑果、桑泡儿，乌椹等，味甜汁多，是人们常食的水果之一，桑葚每年4-6月果实成熟时采收，去杂质，晒干或略蒸后晒干食用，也可来泡酒，具体成熟时间各地不一样，南方早一点，北方稍迟一点，成熟的桑葚质油润，酸甜适口，以个大、肉厚、色紫红、糖分足者为佳，其性味甘寒，具有补肝益肾、生津润燥、乌发明目、利尿，保健，消暑等功效。
在正常情况下，机体产生的活性氧自由基ROS能被自身的抗氧化酶系统（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶等）以及内源性抗氧化剂（VE、VC、肌肽、谷胱甘肽等）作用下维持在较低的水平，保护机体不受自由基的伤害，然而，当内源性或外源性刺激促使机体代谢异常而产生大量活性氧自由基，或随着年龄的增长，机体的抗氧化物与氧化剂之间的平衡失常时，就会导致氧化应激，严重的情况会造成氧化损伤，破坏细胞内DNA、蛋白质以及细胞膜，诱导细胞凋亡，加速人体衰老，同时，自由基过多，也会诱发一系列疾病，如老年痴呆症、脑血栓、动脉粥样硬化和癌症等，因此，我们需要寻求外源性抗氧化剂来清除体内过多的自由基，以维持机体的健康，人工合成的抗氧化剂如2,6-二叔羟基对甲酚（BHT）、丁基羟基茴香醚（BHA）、特丁基对苯二酚（TBHQ）和没食子酸（PG）等虽然具有较强的抗氧化作用，但由于其对人体肝、脾、肺有害，且存在潜在的致畸、致癌作用，各国政府纷纷对其强制规定了ADI（每日允许摄入量）值，控制其过量添加，于是人们把目光逐步转向从各种植物和动物组织中提取天然抗氧化剂，抗氧化活性多肽由于低毒、高效等特点，作为食品和机体的抗氧化剂，被认为是人工合成抗氧化剂的理想替代者，抗氧化肽能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生，帮助机体抵御疾病，同时将抗氧化肽作为食品添加剂可以防止含脂肪食品氧化，作为功能因子可用于保健食品及化妆品等的开发，对提高我国农产品深加工的附加值具有重要作用。
目前国内外对桑葚的研究少之又少，对其副产物中富含的蛋白质开发和利用研究较少，对其活性多肽或其药理研究国内外几乎没有报道，因此，有必要充分利用我国十分丰富的桑葚资源，对其进行深入系统研究，为实现桑葚中药现代化和开发新型、高效、安全的健康食品提供科学依据。
发明内容
1．要解决的技术问题
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，它便于从桑葚中有效制备抗氧化肽，具有良好的肝损伤保护作用，为实现桑葚中药现代化和开发新型、高效、安全的健康食品提供科学依据。
2．技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：
一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，包括以下步骤：
S1、桑葚制干：将新鲜采摘的桑葚冷冻干燥机内冻干，制得桑葚制干产品，待用；
S2、粉碎：将桑葚制干产品置于粉碎机中充分粉碎后过筛，制得桑葚粉末，待用；
S3、制备混合液：向桑葚粉末中添加氯化钠溶液，制得混合液，待用；
S4、制备桑葚酶解产物：用碱性蛋白酶酶解混合液，待用；
S5、分离：利用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，待用；
S6、进一步分离：以蒸馏水为洗脱液，流速0.5-0.8mL/min，收集洗脱组分并测定214nm波长处的吸光值，绘制洗脱曲线，收集洗脱峰，将具有抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离，待用；
S7、冷冻干燥：在真空下冷冻干燥，制得抗氧化肽，便于从桑葚中有效制备抗氧化肽，具有良好的肝损伤保护作用，为实现桑葚中药现代化和开发新型、高效、安全的健康食品提供科学依据。
作为本发明的一种优选方案，在步骤S1中，所述冷冻温度为10-15℃，冷冻干燥时间为10-12h。
作为本发明的一种优选方案，在步骤S2中，粉碎后过60目筛。
作为本发明的一种优选方案，在步骤S3中，所述桑葚粉末和氯化钠溶液按照重量份为1:2的比例添加，所述氯化钠溶液的浓度为1.0%。
作为本发明的一种优选方案，在步骤S4中，所述酶解条件为：pH8.0-9.0、酶添加量3500-5000 U/g、底物浓度4%-5%w/v、解酶时间6-8h，沸水浴20-35min灭活，经8000-9000rpm离心20-30min，取上清液冷冻干燥，即为桑葚酶解产物。
作为本发明的一种优选方案，在步骤S5中，所述RP-HPLC的洗脱梯度为65-80min、10%-20% V乙腈，收集保留时间为40min的洗脱峰。
作为本发明的一种优选方案，在步骤S6中，所述真空度为0-1.0MPa，冷冻干燥温度为10-20℃，冷冻干燥时间为18-20h。
3．有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
本方案便于从桑葚中有效制备抗氧化肽，具有良好的肝损伤保护作用，为实现桑葚中药现代化和开发新型、高效、安全的健康食品提供科学依据。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，包括以下步骤：
S1、桑葚制干：将新鲜采摘的桑葚冷冻干燥机内冻干，冷冻温度为10℃，冷冻干燥时间为12h，制得桑葚制干产品，待用；
S2、粉碎：将桑葚制干产品置于粉碎机中充分粉碎后过60目筛，制得桑葚粉末，待用；
S3、制备混合液：向桑葚粉末中添加氯化钠溶液，桑葚粉末和氯化钠溶液按照重量份为1:2的比例添加，氯化钠溶液的浓度为1.0%，制得混合液，待用；
S4、制备桑葚酶解产物：用碱性蛋白酶酶解混合液，酶解条件为：pH8.0、酶添加量3500U/g、底物浓度5%w/v、解酶时间8h，沸水浴35min灭活，经8000rpm离心30min，取上清液冷冻干燥，即为桑葚酶解产物，待用；
S5、分离：利用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，RP-HPLC的洗脱梯度为65min、20% V乙腈，收集保留时间为40min的洗脱峰，待用；
S6、进一步分离：以蒸馏水为洗脱液，流速0.5mL/min，收集洗脱组分并测定214nm波长处的吸光值，绘制洗脱曲线，收集洗脱峰，将具有抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离，待用；
S7、冷冻干燥：在真空度为0-1.0MPa的真空下冷冻干燥，冷冻干燥温度为10℃，冷冻干燥时间为20h，制得抗氧化肽。
实施例2：
一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，包括以下步骤：
S1、桑葚制干：将新鲜采摘的桑葚冷冻干燥机内冻干，冷冻温度为13℃，冷冻干燥时间为11h，制得桑葚制干产品，待用；
S2、粉碎：将桑葚制干产品置于粉碎机中充分粉碎后过60目筛，制得桑葚粉末，待用；
S3、制备混合液：向桑葚粉末中添加氯化钠溶液，桑葚粉末和氯化钠溶液按照重量份为1:2的比例添加，氯化钠溶液的浓度为1.0%，制得混合液，待用；
S4、制备桑葚酶解产物：用碱性蛋白酶酶解混合液，酶解条件为：pH8.5、酶添加量4000U/g、底物浓度4.5%w/v、解酶时间7h，沸水浴30min灭活，经8500rpm离心25min，取上清液冷冻干燥，即为桑葚酶解产物，待用；
S5、分离：利用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，RP-HPLC的洗脱梯度为70min、15% V乙腈，收集保留时间为40min的洗脱峰，待用；
S6、进一步分离：以蒸馏水为洗脱液，流速0.7mL/min，收集洗脱组分并测定214nm波长处的吸光值，绘制洗脱曲线，收集洗脱峰，将具有抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离，待用；
S7、冷冻干燥：在真空度为0-1.0MPa的真空下冷冻干燥，冷冻干燥温度为15℃，冷冻干燥时间为19h，制得抗氧化肽。
实施例3：
一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，包括以下步骤：
S1、桑葚制干：将新鲜采摘的桑葚冷冻干燥机内冻干，冷冻温度为15℃，冷冻干燥时间为10h，制得桑葚制干产品，待用；
S2、粉碎：将桑葚制干产品置于粉碎机中充分粉碎后过60目筛，制得桑葚粉末，待用；
S3、制备混合液：向桑葚粉末中添加氯化钠溶液，桑葚粉末和氯化钠溶液按照重量份为1:2的比例添加，氯化钠溶液的浓度为1.0%，制得混合液，待用；
S4、制备桑葚酶解产物：用碱性蛋白酶酶解混合液，酶解条件为：pH9.0、酶添加量3500U/g、底物浓度4%w/v、解酶时间6h，沸水浴20min灭活，经9000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，即为桑葚酶解产物，待用；
S5、分离：利用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，RP-HPLC的洗脱梯度为80min、10% V乙腈，收集保留时间为40min的洗脱峰，待用；
S6、进一步分离：以蒸馏水为洗脱液，流速0.8mL/min，收集洗脱组分并测定214nm波长处的吸光值，绘制洗脱曲线，收集洗脱峰，将具有抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离，待用；
S7、冷冻干燥：在真空度为0-1.0MPa的真空下冷冻干燥，冷冻干燥温度为20℃，冷冻干燥时间为18h，制得抗氧化肽。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，其特征在于，包括以下步骤：
S1、桑葚制干：将新鲜采摘的桑葚冷冻干燥机内冻干，制得桑葚制干产品，待用；
S2、粉碎：将桑葚制干产品置于粉碎机中充分粉碎后过筛，制得桑葚粉末，待用；
S3、制备混合液：向桑葚粉末中添加氯化钠溶液，制得混合液，待用；
S4、制备桑葚酶解产物：用碱性蛋白酶酶解混合液，待用；
S5、分离：利用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，待用；
S6、进一步分离：以蒸馏水为洗脱液，流速0.5-0.8mL/min，收集洗脱组分并测定214nm波长处的吸光值，绘制洗脱曲线，收集洗脱峰，将具有抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离，待用；
S7、冷冻干燥：在真空下冷冻干燥，制得抗氧化肽。
2.根据权利要求1所述的一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，其特征在于，在步骤S1中，所述冷冻温度为10-15℃，冷冻干燥时间为10-12h。
3.根据权利要求1所述的一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，其特征在于，在步骤S2中，粉碎后过60目筛。
4.根据权利要求1所述的一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，其特征在于，在步骤S3中，所述桑葚粉末和氯化钠溶液按照重量份为1:2的比例添加，所述氯化钠溶液的浓度为1.0%。
5.根据权利要求1所述的一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，其特征在于，在步骤S4中，所述酶解条件为：pH8.0-9.0、酶添加量3500-5000 U/g、底物浓度4%-5%w/v、解酶时间6-8h，沸水浴20-35min灭活，经8000-9000rpm离心20-30min，取上清液冷冻干燥，即为桑葚酶解产物。
6.根据权利要求1所述的一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，其特征在于，在步骤S5中，所述RP-HPLC的洗脱梯度为65-80min、10%-20% V乙腈，收集保留时间为40min的洗脱峰。
7.根据权利要求1所述的一种具有肝损伤保护作用的抗氧化肽，其特征在于，在步骤S7中，所述真空度为0-1.0MPa，冷冻干燥温度为10-20℃，冷冻干燥时间为18-20h。
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