CN115400054B - 一种基于桑资源的美白抗氧化组合物的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于桑资源的美白抗氧化组合物的制备方法和应用。本发明以桑白皮和桑椹为原料，对桑白皮进行特定的超高压、黑曲霉发酵、酸解等工艺处理，对桑椹进行特定的酶解、超声降解和发酵处理，能够有效提取桑白皮和桑椹中具有美白、抗氧化、清除自由基功能的低聚糖成分。以所提取获得的活性低聚糖成分制备成化妆品、护肤品等产品，能够直接应用于人体实现美白、抗氧化作用，且由于活性成分来源于天然产物提取物，安全性更好，适用于肌肤敏感型人群，充分实现了对农作物的高效利用，具有广阔的应用前景。

Description

一种基于桑资源的美白抗氧化组合物的制备方法和应用
技术领域
本发明属于天然产物应用领域，尤其涉及一种基于桑资源的美白抗氧化组合物的制备方法和应用。
背景技术
随着生活水平和审美标准的提高，越来越多的人渴望拥有白皙亮丽的肌肤，因此各种美白产品如雨后春笋般蓬勃发展，其中主要成分为安全性高、无毒副作用的天然美白活性物质的产品成为人们的首选。桑树是我国常见树种，桑白皮、桑椹、桑叶、桑枝在民间均可入药。近年来，除药用价值外，还发现桑树中富含的生物低聚糖、生物多糖、多酚、黄酮等生物活性成分具有很好的皮肤美白功效。
美白要解决的主要问题是黑色素沉积和色斑，其形成原因很复杂，大致分为内部因素和外部因素，内部因素如遗传因素、内分泌失调等，外部因素如紫外线照射、环境污染等，但究其根本，还是由黑色素沉着引起的。酪氨酸酶、多巴色素互变酶、5,6-二羟吲哚-2-羧酸氧化酶是黑色素形成过程中最主要的生物酶，其中酪氨酸酶是该过程的限速酶。与此同时，在该过程中，氧自由基起了引发作用，其存在加快了黑色素形成的速度。因此，抑制酪氨酸酶和清除自由基是当今皮肤美白的两个关键途径。
虽然桑树中富含抑制酪氨酸酶、抗氧化的活性低聚糖成分，能够减少黑色素的含量，但对桑树资源进行简单的粉碎混合，或进行浸提、蒸煮，其活性低聚糖成分难以提取，不能发挥很好地美白、抗氧化等作用。因此，对桑树资源成分进行精炼提取，寻找一种高效提取、效果稳定、有安全保证的桑资源美白、抗氧化组合物显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中采用传统方法对桑树资源进行处理难以有效提取其中活性低聚糖成分的问题，从而提供了一种简单高效的基于桑资源的美白抗氧化组合物的制备方法，所述制备方法以桑白皮和桑椹为原料，通过特定的超高压处理、黑曲霉发酵、酸解、酶解、超声降解等工艺步骤，能够有效提取桑资源中的具有美白、抗氧化功能的活性低聚糖成分。
为达到上述目的，本发明是通过如下手段得以实现的：
本发明第一方面提供了一种基于桑资源的美白抗氧化组合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过筛，随后进行超高压处理，得到桑白皮粉末；
（2）加入适量的水后，接种黑曲霉进行发酵处理，发酵完成后加水稀释至2倍体积；
（3）加入无机酸进行酸解，随后调节pH至中性；
（4）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至大孔吸附树脂柱；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；
（5）取桑椹粉碎过筛后进行水提，将提取液浓缩至1/2体积后，加入乙醇进行醇沉，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（6）将步骤（5）得到的桑椹多糖进行稀释后进行酶解处理；
（7）酶解处理完成后进行超声降解处理；
（8）超声降解处理完成后进行发酵处理；
（9）对步骤（8）中发酵产物进行膜分离，冷冻干燥备用；
（10）将步骤（4）和步骤（9）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
作为优选地，步骤（1）中所述过筛的筛孔目数为10目。
作为优选地，步骤（1）中所述超高压处理具体为：压力100MPa，处理1-10min。
作为优选地，步骤（2）中在发酵前加入水的量为桑白皮粉末质量的10%。
作为优选地，步骤（2）中所述发酵处理的条件为：温度30-35℃，发酵时间1-4d。
作为优选地，步骤（3）中所述酸解具体为：调节溶液pH至3.0，于40-70℃、50rpm条件下振荡酸解1-3h。
作为优选地，步骤（3）所述无机酸选自盐酸、硫酸、硝酸中的一种或多种。
作为优选地，步骤（4）在上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味。
作为优选地，步骤（4）中所述大孔吸附树脂柱选自HPD-100、HPD-500、HP20、SP850和AB-8中的一种或多种。
作为优选地，步骤（5）中所述过筛的筛孔目数为20目。
作为优选地，步骤（5）中所述水提的条件为：温度80℃，时间5h。
作为优选地，步骤（5）中所述醇沉的条件为：2倍体积的95%乙醇醇沉24h。
作为优选地，步骤（6）中所述酶解的条件具体为：先采用果胶酶35-70℃下酶解1-2h，再采用葡聚糖酶30-50℃下酶解10-30min，最后采用甘露聚糖酶35-45℃下酶解1h。
作为优选地，步骤（7）中所述超声降解的条件具体为：超声功率为400W，超声降解时间为10-20min。
作为优选地，步骤（8）中所述发酵的条件具体为：添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于37-43℃下发酵1-3d。
作为优选地，步骤（9）中所述膜分离的条件具体为：溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液。此目的为获得10-30kDa的发酵液。
本发明第二方面提供了根据上述制备方法制备得到的基于桑资源的美白抗氧化组合物。
本发明第三方面提供了上述基于桑资源的美白抗氧化组合物在制备具有美白和/或抗氧化效果的产品中的应用。
作为优选地，所述产品选自化妆品、护肤品中的一种或多种。
作为优选地，所述产品的剂型选自膏霜剂、乳剂、水剂、凝胶剂、油剂、粉剂、冻干制剂、气雾剂中的一种或多种。
作为优选地，所述产品中还含有功能性和/或非功能性辅料。
作为优选地，所述功能性和/或非功能性辅料选自表面活性剂、抗氧化剂、着色剂、抑菌剂、螯合剂、着色剂、保湿剂、防晒剂中的一种后多种。
本发明相对于现有的技术，具有如下有益效果：
本发明以桑白皮和桑椹为原料，对桑白皮进行特定的超高压、黑曲霉发酵、酸解等工艺处理，对桑椹进行特定的酶解、超声降解和发酵处理，能够有效提取桑白皮和桑椹中具有美白、抗氧化、清除自由基功能的低聚糖成分。以所提取获得的活性低聚糖成分制备成化妆品、护肤品等产品，能够直接应用于人体实现美白、抗氧化作用，且由于活性成分来源于天然产物提取物，安全性更好，适用于肌肤敏感型人群，充分实现了对农作物的高效利用，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
实施例1
一种基于桑资源的美白抗氧化组合物，其制备方法包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过10目筛，随后于100MPa压力下超高压处理10min，得到桑白皮粉末；
（2）加入步骤（1）桑白皮粉末质量10%的水后，接种黑曲霉于35℃下发酵1d，发酵完成后加水稀释至2倍体积；
（3）加入盐酸调节溶液pH至3.0，于70℃、50rpm条件下振荡酸解1h，随后调节pH至中性；
（4）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至HPD-100大孔吸附树脂柱，上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；
（5）取桑椹粉碎过20目筛后，于80℃水提5h，将提取液浓缩至1/2体积后，加入2倍体积的95%乙醇醇沉24h，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（6）将步骤（5）得到的桑椹多糖稀释至桑椹多糖的浓度达到2-50mg/mL（利用硫酸-苯酚法测定桑椹多糖浓度），随后采用果胶酶70℃下酶解1h，再采用葡聚糖酶50℃下酶解10min，最后采用甘露聚糖酶45℃下酶解1h；
（7）酶解处理完成后于400W功率下超声降解处理10min；
（8）超声降解处理完成后添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于43℃下发酵1d；
（9）对步骤（8）中发酵产物溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液，获得分子量为10-30kDa的发酵液，冷冻干燥备用；
（10）将步骤（4）和步骤（9）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
实施例2
一种基于桑资源的美白抗氧化组合物，其制备方法包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过10目筛，随后于100MPa压力下超高压处理5min，得到桑白皮粉末；
（2）加入步骤（1）桑白皮粉末质量10%的水后，接种黑曲霉于30℃下发酵4d，发酵完成后加水稀释至2倍体积；
（3）加入盐酸调节溶液pH至3.0，于40℃、50rpm条件下振荡酸解3h，随后调节pH至中性；
（4）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至AB-8大孔吸附树脂柱，上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；
（5）取桑椹粉碎过20目筛后，于80℃水提5h，将提取液浓缩至1/2体积后，加入2倍体积的95%乙醇醇沉24h，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（6）将步骤（5）得到的桑椹多糖稀释至桑椹多糖的浓度达到2-50mg/mL（利用硫酸-苯酚法测定桑椹多糖浓度），随后采用果胶酶35℃下酶解2h，再采用葡聚糖酶30℃下酶解30min，最后采用甘露聚糖酶35℃下酶解1h；
（7）酶解处理完成后于400W功率下超声降解处理20min；
（8）超声降解处理完成后添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于37℃下发酵3d；
（9）对步骤（8）中发酵产物溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液，获得分子量为10-30kDa的发酵液，冷冻干燥备用；
（10）将步骤（4）和步骤（9）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
实施例3
一种基于桑资源的美白抗氧化组合物，其制备方法包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过10目筛，随后于100MPa压力下超高压处理3min，得到桑白皮粉末；
（2）加入步骤（1）桑白皮粉末质量10%的水后，接种黑曲霉于33℃下发酵2d，发酵完成后加水稀释至2倍体积；
（3）加入盐酸调节溶液pH至3.0，于55℃、50rpm条件下振荡酸解2h，随后调节pH至中性；
（4）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至SP850大孔吸附树脂柱，上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；
（5）取桑椹粉碎过20目筛后，于80℃水提5h，将提取液浓缩至1/2体积后，加入2倍体积的95%乙醇醇沉24h，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（6）将步骤（5）得到的桑椹多糖稀释至桑椹多糖的浓度达到2-50mg/mL（利用硫酸-苯酚法测定桑椹多糖浓度），随后采用果胶酶50℃下酶解1.5h，再采用葡聚糖酶40℃下酶解20min，最后采用甘露聚糖酶40℃下酶解1h；
（7）酶解处理完成后于400W功率下超声降解处理15min；
（8）超声降解处理完成后添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于40℃下发酵2d；
（9）对步骤（8）中发酵产物溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液，获得分子量为10-30kDa的发酵液，冷冻干燥备用；
（10）将步骤（4）和步骤（9）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
对比例1
一种基于桑资源的美白抗氧化组合物，其制备方法包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过10目筛，得到桑白皮粉末；
（2）加入步骤（1）桑白皮粉末质量10%的水后，接种黑曲霉于35℃下发酵1d，发酵完成后加水稀释至2倍体积；
（3）加入盐酸调节溶液pH至3.0，于70℃、50rpm条件下振荡酸解1h，随后调节pH至中性；
（4）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至HPD-100大孔吸附树脂柱，上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；
（5）取桑椹粉碎过20目筛后，于80℃水提5h，将提取液浓缩至1/2体积后，加入2倍体积的95%乙醇醇沉24h，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（6）将步骤（5）得到的桑椹多糖稀释至桑椹多糖的浓度达到2-50mg/mL（利用硫酸-苯酚法测定桑椹多糖浓度），随后采用果胶酶70℃下酶解1h，再采用葡聚糖酶50℃下酶解10min，最后采用甘露聚糖酶45℃下酶解1h；
（7）酶解处理完成后于400W功率下超声降解处理10min；
（8）超声降解处理完成后添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于43℃下发酵1d；
（9）对步骤（8）中发酵产物溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液，获得分子量为10-30kDa的发酵液，冷冻干燥备用；
（10）将步骤（4）和步骤（9）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
对比例2
一种基于桑资源的美白抗氧化组合物，其制备方法包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过10目筛，随后于100MPa压力下超高压处理10min，得到桑白皮粉末；
（2）加入适量的水后采用盐酸盐酸调节溶液pH至3.0，于70℃、50rpm条件下振荡酸解1h，随后调节pH至中性；
（3）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至HPD-100大孔吸附树脂柱，上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；
（4）取桑椹粉碎过20目筛后，于80℃水提5h，将提取液浓缩至1/2体积后，加入2倍体积的95%乙醇醇沉24h，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（5）将步骤（4）得到的桑椹多糖稀释至桑椹多糖的浓度达到2-50mg/mL（利用硫酸-苯酚法测定桑椹多糖浓度），随后采用果胶酶70℃下酶解1h，再采用葡聚糖酶50℃下酶解10min，最后采用甘露聚糖酶45℃下酶解1h；
（6）酶解处理完成后于400W功率下超声降解处理10min；
（7）超声降解处理完成后添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于43℃下发酵1d；
（8）对步骤（7）中发酵产物溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液，获得分子量为10-30kDa的发酵液，冷冻干燥备用；
（9）将步骤（3）和步骤（8）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
对比例3
一种基于桑资源的美白抗氧化组合物，其制备方法包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过10目筛，得到桑白皮粉末，加入桑白皮粉末质量10%的水后，接种黑曲霉于35℃下发酵1d，发酵完成后加水稀释至2倍体积；
（2）于100MPa压力下超高压处理10min；
（3）加入盐酸调节溶液pH至3.0，于70℃、50rpm条件下振荡酸解1h，随后调节pH至中性；
（4）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至HPD-100大孔吸附树脂柱，上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；
（5）取桑椹粉碎过20目筛后，于80℃水提5h，将提取液浓缩至1/2体积后，加入2倍体积的95%乙醇醇沉24h，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（6）将步骤（5）得到的桑椹多糖稀释至桑椹多糖的浓度达到2-50mg/mL（利用硫酸-苯酚法测定桑椹多糖浓度），随后采用果胶酶70℃下酶解1h，再采用葡聚糖酶50℃下酶解10min，最后采用甘露聚糖酶45℃下酶解1h；
（7）酶解处理完成后于400W功率下超声降解处理10min；
（8）超声降解处理完成后添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于43℃下发酵1d；
（9）对步骤（8）中发酵产物溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液，获得分子量为10-30kDa的发酵液，冷冻干燥备用；
（10）将步骤（4）和步骤（9）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
对比例4
一种基于桑资源的美白抗氧化组合物，其制备方法包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过10目筛，随后于100MPa压力下超高压处理10min，得到桑白皮粉末；
（2）加入步骤（1）桑白皮粉末质量10%的水后，接种黑曲霉于35℃下发酵1d，发酵完成后加水稀释至2倍体积；
（3）加入盐酸调节溶液pH至3.0，于70℃、50rpm条件下振荡酸解1h，随后调节pH至中性；
（4）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至HPD-100大孔吸附树脂柱，上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；
（5）取桑椹粉碎过20目筛后，于80℃水提5h，将提取液浓缩至1/2体积后，加入2倍体积的95%乙醇醇沉24h，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（6）于400W功率下超声降解处理10min；
（7）超声降解处理完成后添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于43℃下发酵1d；
（8）对步骤（7）中发酵产物溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液，获得分子量为10-30kDa的发酵液，冷冻干燥备用；
（9）将步骤（4）和步骤（8）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
对比例5
一种基于桑资源的美白抗氧化组合物，其制备方法包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过10目筛，随后于100MPa压力下超高压处理10min，得到桑白皮粉末；
（2）加入步骤（1）桑白皮粉末质量10%的水后，接种黑曲霉于35℃下发酵1d，发酵完成后加水稀释至2倍体积；
（3）加入盐酸调节溶液pH至3.0，于70℃、50rpm条件下振荡酸解1h，随后调节pH至中性；
（4）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至HPD-100大孔吸附树脂柱，上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；
（5）取桑椹粉碎过20目筛后，于80℃水提5h，将提取液浓缩至1/2体积后，加入2倍体积的95%乙醇醇沉24h，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（6）将步骤（5）得到的桑椹多糖稀释至桑椹多糖的浓度达到2-50mg/mL（利用硫酸-苯酚法测定桑椹多糖浓度），随后采用果胶酶70℃下酶解1h，再采用葡聚糖酶50℃下酶解10min，最后采用甘露聚糖酶45℃下酶解1h；
（7）酶解处理完成后添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于43℃下发酵1d；
（8）对步骤（7）中发酵产物溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液，获得分子量为10-30kDa的发酵液，冷冻干燥备用；
（9）将步骤（4）和步骤（8）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
对比例6
一种基于桑资源的美白抗氧化组合物，其制备方法包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过10目筛，随后于100MPa压力下超高压处理10min，得到桑白皮粉末；
（2）加入步骤（1）桑白皮粉末质量10%的水后，接种黑曲霉于35℃下发酵1d，发酵完成后加水稀释至2倍体积；
（3）加入盐酸调节溶液pH至3.0，于70℃、50rpm条件下振荡酸解1h，随后调节pH至中性；
（4）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至HPD-100大孔吸附树脂柱，上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；
（5）取桑椹粉碎过20目筛后，于80℃水提5h，将提取液浓缩至1/2体积后，加入2倍体积的95%乙醇醇沉24h，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（6）将步骤（5）得到的桑椹多糖稀释至桑椹多糖的浓度达到2-50mg/mL（利用硫酸-苯酚法测定桑椹多糖浓度），随后采用葡聚糖酶50℃下酶解10min，再采用甘露聚糖酶45℃下酶解1h，最后采用果胶酶70℃下酶解1h；
（7）酶解处理完成后于400W功率下超声降解处理10min；
（8）超声降解处理完成后添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于43℃下发酵1d；
（9）对步骤（8）中发酵产物溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液，获得分子量为10-30kDa的发酵液，冷冻干燥备用；
（10）将步骤（4）和步骤（9）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
验证例1
对实施例及对比例制备获得的美白抗氧化组合物的酪氨酸酶抑制活性进行检测，对酪氨酸酶的抑制率越高，则越能有效阻碍黑色素的生成、美白能力越强。具体包括如下步骤：
（1）称取5.71g K2HPO4，溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容至500mL，充分溶解，再加入KH2PO4，充分搅拌，配制成pH6.8的PBS，备用。
（2）用PBS配制200U/mL的蘑菇酪氨酸酶溶液，置于冰上，备用。称量0.10g左旋多巴于50mL PBS中，充分溶解，配制成10 mmol/L溶液。
（3）先向96孔板中每孔加入100μL 10mmol/L左旋多巴溶液，再向空白对照组中每孔加入100μL蒸馏水，实验组中加入用PBS配置的100μL 10mg/mL提取物溶液，在室温下静置5min，分别设置3个重复。
（4）加入200U/mL酪氨酸酶溶液100μL，立即混匀，放置于37℃的培养箱中培养25min。在475nm处测定各孔的吸光度值。
酪氨酸酶抑制率=（D2-D1+D3）/（D2-D4）×100%
其中：D1为含有左旋多巴、酪氨酸酶、待测样品的体系吸光度值；D2为含有左旋多巴、酪氨酸酶，但不含待测样品的体系吸光度值；D3为含有左旋多巴、待测样品，但不含酪氨酸酶的体系吸光度值；D4为含有左旋多巴，但不含酪氨酸酶、待测样品的体系吸光度。
结果如下表1所示，结果显示，实施例1-3对酪氨酸酶抑制率都高于同等浓度下对比例的抑制率。结果表明利用实施例方法制备的样品能有效阻碍黑色素的生成，美白能力更佳，主要原因在于桑白皮经过超高压处理后细胞壁被破坏，更容易被黑曲霉发酵利用，使桑白皮产生更多美白物质。
表1 实施例1-3及对比例1-6样品酪氨酸酶抑制活性
组别 抑制率（%）
实施例1 75.5
实施例2 73.9
实施例3 74.4
对比例1 60.2
对比例2 52.4
对比例3 58.3
对比例4 61.5
对比例5 57.6
对比例6 55.3
验证例2
当DPPH溶液中加入自由基清除剂时其孤电子被配对，在吸收信号消失或减弱后导致待测溶液的颜色变浅，从而在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线形拟合关系。通过DPPH自由基清除率与浓度关系计算EC50值，EC50值越小，说明组合物具有更强的清除自由基能力、更强的抗氧化能力。因此，通过对DPPH自由基的EC50值进行测定，能够有效反映组合物的抗氧化能力。具体包括如下步骤：
（1）将150μL 10mg/mL的提取物溶液加入到150μL无水乙醇配制0.1mmol/L DPPH溶液中避光 30 min，12000r/min离心5min，测定517nm处吸光度，记为A测定；
（2）以150μL 无水乙醇溶液和150μL 10mg/mL的提取物溶液反应，测吸光度，记为A对照。
（3）以150μL 无水乙醇溶液和150μL无水乙醇配制0.1mmol/L DPPH溶液反应，测吸光度，记为A空白。
按下式计算 DPPH 自由基清除率。
DPPH自由基清除率/%=
Figure DEST_PATH_IMAGE002
检测结果如下表2所示。结果显示，实施例1-3对DPPH自由基的清除能力都显著优于同等浓度下对比例的清除能力，结果表明利用实施例方法制备的样品具有更强的抗氧化能力。主要原因在于桑椹多糖经过酶解后变为桑椹低聚糖，超声处理则有助于进一步细化低聚糖使其分子量更低，更容易被二裂酵母和乳酸菌利用，产生抗氧化能力更好的桑椹低聚糖。
表2 实施例1-3及对比例1-6样品清除DPPH自由基的EC50值
组别 EC50
实施例1 1.89
实施例2 2.01
实施例3 1.96
对比例1 2.86
对比例2 2.75
对比例3 3.02
对比例4 2.97
对比例5 2.88
对比例6 3.31
验证例3
（1）分别以实施例1以及对比例1-6制备得到的美白抗氧化组合物作为活性成分（质量分数为3%）制备润肤霜（建议给出大致的制备方法以及所用到的主要原辅料），并按照QB/T 1857-2013《润肤膏霜》要求检测合格。
（2）招募35名年龄30-50岁有使用润肤霜习惯的女性消费者进行产品感官评价测试，随机分为7组，记为组1-组7，每组5人；
（3）受试者进行半脸测试，要求受试者一边脸使用加入组合物的润肤霜，另一边脸则使用基质润肤霜，受试者坚持早晚使用产品；14天后对产品效果进行评价。
利用广州诺美汇电子科技有限公司销售的摩玑AI智能八光谱皮肤检测仪，通过高清像素获取面部皮肤影像状况，采用多光谱成像技术，检测受试者皮肤斑点淡化程度、均匀白皙度和皮肤整体分数，评分为0-100分。0分表示斑点没有淡化、白皙度没改善、皮肤整体很差；100分表示斑点完全淡化、皮肤完全白皙、皮肤整体很好，分值越高表示效果越好。评价结果如下表3所示，结果显示，采用本发明制备获得的美白抗氧化组合物作为润肤活性成分，能够有效淡化脸部斑点，改善脸部均匀白皙度，使得脸部肌肤状态从整体上得到有效的改观。
表3 组1-7皮肤检测仪检测结果
组别 斑点淡化程度 均匀白皙度 皮肤整体分数
组1 85 78 80
组2 53 50 51
组3 61 57 59
组4 55 46 49
组5 63 52 54
组6 49 56 50
组7 58 49 53
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种基于桑资源的美白抗氧化组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将桑白皮烘干后进行粉碎过10目筛，随后于100MPa压力下超高压处理1-10min，得到桑白皮粉末；
（2）加入步骤（1）桑白皮粉末质量10%的水后，接种黑曲霉于30-35℃下发酵1-4d，发酵完成后加水稀释至2倍体积；
（3）加入无机酸调节溶液pH至3.0，于40-70℃、50rpm条件下振荡酸解1-3h，随后调节pH至中性；所述无机酸选自盐酸、硫酸、硝酸中的一种或多种；
（4）加入无水乙醇至无水乙醇浓度为50%，随后上样至大孔吸附树脂柱，上样前预先对大孔吸附树脂柱采用95%乙醇浸泡24h后装柱，用去离子水洗脱至滴出液无乙醇味；采用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩、冷冻干燥备用；所述大孔吸附树脂柱选自HPD-100、HPD-500、HP20、SP850和AB-8中的一种或多种；
（5）取桑椹粉碎过20目筛后，于80℃水提5h，将提取液浓缩至1/2体积后，加入2倍体积的95%乙醇醇沉24h，回收乙醇后收集沉淀得到桑椹多糖；
（6）将步骤（5）得到的桑椹多糖稀释至桑椹多糖的浓度达到2-50mg/mL，随后采用果胶酶35-70℃下酶解1-2h，再采用葡聚糖酶30-50℃下酶解10-30min，最后采用甘露聚糖酶35-45℃下酶解1h；
（7）酶解处理完成后于400W功率下超声降解处理10-20min；
（8）超声降解处理完成后添加蛋白胨后接种二裂酵母和乳酸菌，于37-43℃下发酵1-3d；
（9）对步骤（8）中发酵产物溶液先通过截留分子量为30kDa超滤膜分离，去除大分子物质，取流出液；然后再通过截留分子量为10kDa超滤膜分离，取截留液，获得分子量为10-30kDa的发酵液，冷冻干燥备用；
（10）将步骤（4）和步骤（9）中冷冻干燥产物混合均匀，即得。
2.根据权利要求1所述制备方法制备得到的基于桑资源的美白抗氧化组合物。
3.根据权利要求1所述制备方法制备得到的基于桑资源的美白抗氧化组合物在制备具有美白和/或抗氧化效果的产品中的应用。
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