CN103194493A

CN103194493A - 一种微生物转化制备氧化白藜芦醇的方法

Info

Publication number: CN103194493A
Application number: CN2013101474053A
Authority: CN
Inventors: 李顺祥; 虢小翊; 周晋
Original assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Current assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2013-04-25
Publication date: 2013-07-10

Abstract

本发明提供一种利用微生物方法转化制备氧化白藜芦醇的方法，将粉碎桑枝作为转化底物投入发酵培养溶液中培养12~48小时，将得到的转化液用质量百分比浓度为60%~80%的甲醇或者乙醇溶液进行超声提取，再静止或离心处理去除下层杂质沉淀，上清液回收溶剂，即得。此方法产物得率高，反应条件温和，安全无毒且成本低，操作简单易于生产。

Description

一种微生物转化制备氧化白藜芦醇的方法

技术领域

本发明涉及微生物转化技术领域，特别是一种利用黑曲霉（Aspergillus niger）转化技术制备氧化白藜芦醇的安全、高效、快速的方法。

背景技术

氧化白藜芦醇（Oxyresveratrol）是羟基化的白藜芦醇结构类似物，较早的由北海道大学的S.Mongolsuk, Alexander Robertson, R.Towers等人在滇菠萝蜜中发现，而后在桑科植物中，百合科以及麻藤科植物中也陆续出现了它的身影。虽然相较于白藜芦醇它的自然资源显得十分有限，但是它卓越的药用医疗、食品保健价值好似一笔巨大的宝藏，促使大量研究者们的挤上探索这个宝藏的伟大航路。

随后在1998年以及2007年等研究报告中发现氧化白藜芦醇是络氨酸酶的抑制剂，可作为高效的美白化妆品添加剂。2003年以及2011年，研究者们通过动物实验发现氧化白藜芦醇表现出比熟知的抗氧化剂衍生物以及抗坏血酸更有效的DNA保护作用，具备十分优良的抗氧化以及抗衰老作用（抗自由基），表明氧化白藜芦醇可作为抗衰老剂和核黄素稳定剂潜在利用价值。

2004年、2006年以及2008年等研究中又发现氧化白藜芦醇卓越的神经保护作用，或可开发成治疗帕金森综合症的药物以及预防老年痴呆以及中风等此类病症发生的保健食品。2011年朱拉隆功大学通过小鼠实验研究证明当运用氧化白藜芦醇作为乳液主要的基础成分时，可以治疗皮肤单纯疱疹病毒感染。氧化白藜芦醇的生物活性远不止这些，如近年来华工理工大学就以氧化白藜芦醇具备有效治疗及预防糖尿病及其并发症的用途向国家知识产权局申请了一项发明专利，除此之外，氧化白藜芦醇还具有抗癌、护肝、抗炎等诸多有利于人类健康的药用效果。

氧化白藜芦醇（Oxyresveratrol）比桑皮苷A(mulberroside A)多两个酚羟基，是它的桑皮苷A的苷元。QIUE报道，桑皮苷A 通过实验小鼠代谢后生成的氧化白藜芦醇，生物活性更强。同时，Jeong-Ha Kim等在专利(Application#：20060216253，Class：424062000（USPTO））中报道，从桑白皮（桑树根根皮）中提取分离桑皮苷A时，所得到的最终产物中检测到了少量氧化白藜芦醇。目前获得氧化白藜芦醇的主要方法主要是用乙醇浸提桑白皮，再用硅胶、凝胶、聚酰胺等反复柱层析。这些方法过程繁琐，得率纯度偏低，更重要的是它至提取分离得到了桑树中已经存在的少量氧化白藜芦醇，其含量较低。而桑白皮中的桑皮苷A含量远远高于氧化白藜芦醇，造成了很大的生物能源浪费。西南大学徐立等人在专利（CN101591680）题名为氧化白藜芦醇的提取方法中利用直接酶对桑皮（桑枝）提取，继而对高含量的桑皮苷A进行了完全转化，大大增加了其含量。但由于酶的价格昂贵、且不易获得等缺陷，造成实际生产中的诸多不便。若通过安全易得的微生物方法转化桑皮苷A,不但可以简单、高效的快速提高提取物的收率，并且成本大大的降低，目前并无相关研究报道。

发明的优点在于可大大提高植物中氧化白藜芦醇的得率，转化率为70~98%。相对于传统的化学法或从植物中直接提取的方法具有以下优点：1、有害物质含量低，安全无毒副作用；2、可进行大规模的应用，不受季节环境等影响；3、生产操作简便，产品得率高；4、成本低，反应条件温和，环境友好。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用微生物方法转化制备氧化白藜芦醇的方法。主要通过微生物与桑枝粉末共同发酵方法将桑枝中高含量的桑皮苷A彻底转化为氧化白藜芦醇，从而提高氧化白藜芦醇的得率。该微生物是黑曲霉菌（Aspergillus niger）。

本发明制备氧化白藜芦醇的微生物转化方法，包括：

(1)、将黑曲霉菌（Aspergillus niger）,进行常规培养活化，活化后的菌株做为生物催化剂；活化所用的斜面培养基为：马铃薯（PDA）斜面培养基：马铃薯 20%，葡萄糖2%，琼脂粉1.5%~2%，pH自然。121℃高压湿热灭菌，20~30分钟，灭菌后冷却，制成斜面、接种黑曲霉进行活化。28℃培养3~5天。

（2）、取鲜桑枝或桑根的皮，粉碎至20~40目，作为生物转化底物，再将其添入发酵培养溶液；发酵培养的培养基为：桑枝粉末1-2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.4%、硫酸铵0.4%。pH值为3~6。

（3）、将（1）收集的菌体制成菌悬液，加入含（2）的底物的发酵溶液中并在一定条件下进行转化反应，生成氧化白藜芦醇；发酵培养条件为：250ml三角瓶装液量 50~100ml，培养温度为 30~45℃，摇床转速为75~180r/min，接种量为：1%~3%，培养12~48小时。

（4）、将（3）的转化液，用质量百分比浓度为60%~80%的甲醇或者乙醇溶液进行超声提取10~60分钟，再静止或离心处理去除下层杂质，上清液回收溶剂，得到氧化白藜芦醇粗品。

（5）、根据氧化白藜芦醇光不稳定性的特征，发酵过程中采取必要的避光的措施，减少氧化白藜芦醇的损失。最优发酵培养条件为：250ml的三角瓶装液量 50ml、培养温度为45℃，摇床转速为150r/min，接种量为3%，转化时间为18.5小时。在此方法下能有效的提高桑枝氧化白藜芦醇的得率，其桑皮苷A 转化率达到95%以上。

所得的转化产物用高效液相法测定，其液相条件为：色谱柱：Hypersil BDS C₁₈柱（4.6mm×200mm，5μm）；流速：1ml/min；柱温为40℃；流动相：1%甲酸水-乙腈，梯度洗脱程序为：0-20min，乙腈:甲酸水~5%:95%，20-35min,乙腈:甲酸水—5%:95%～20%:80% ；检测波长：320nm；进样量：20μL。

具体实施方式

实施例1

将新鲜采取的桑枝利用中药粉碎机打粉过20目筛得到过筛粉末。

斜面培养：培养基为100ml，马铃薯 20g，葡萄糖2g，琼脂粉2g，pH6，121℃湿热灭菌20分钟，灭菌后冷却接种，菌种为黑曲霉（Aspergillus niger），28℃培养4天，作为斜面培养基活化菌种。

种子培养和发酵：培养基为枝粉末 1-2%、可溶性淀粉 2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.4%、硫酸铵0.4%。pH值为6.0，装液量为250ml三角瓶装液量100ml，121℃湿热灭菌，作为发酵培养液。灭菌后冷却接种斜面种子制成的菌悬液，接种量为1%，75rpm/min，30℃作为发酵条件。

转化液用60%甲醇超声提取40分钟后，离心去除沉淀，上清液过有机微孔滤膜后进HPLC,高效液相法在25小时时测得此次氧化白藜芦醇的得率为4.9μg/ml，算出最高转化率为48%。

实施例2

斜面培养：培养基为100ml，马铃薯 20g，葡萄糖2g，琼脂粉2g，pH6，121℃湿热灭菌20分钟，灭菌后冷却接种，菌种为黑曲霉（Aspergillus niger），28℃培养5天，作为斜面培养基活化菌种。

种子培养和发酵：培养基为枝粉末 1-2%、可溶性淀粉 2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.4%、硫酸铵0.4%。pH值为5.0，装液量为250ml三角瓶装液量100ml，121℃湿热灭菌，作为发酵培养液。灭菌后冷却接种斜面种子制成的菌悬液，接种量为1%，180rpm/min，40℃作为发酵条件。

转化液用80%甲醇超声提取30分钟后，离心去除沉淀，上清液过有机微孔滤膜后进HPLC,高效液相法在28小时时测得此次氧化白藜芦醇的得率为6.8μg/ml，算出最高转化率为66%

实施例3

种子培养和发酵：培养基为枝粉末 1-2%、可溶性淀粉 2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.4%、硫酸铵0.4%。pH值为4.0，装液量为250ml三角瓶装液量50ml，121℃湿热灭菌，作为发酵培养液。灭菌后冷却接种斜面种子制成的菌悬液，接种量为1%，180rpm/min，35℃作为发酵条件。

整个过程发酵过程中遮光处理，提取过程中也尽量避光。

转化液用60%甲醇超声提取40分钟后，离心去除沉淀，上清液过有机微孔滤膜后进HPLC,高效液相法在22.5小时时测得此次氧化白藜芦醇的得率为8.4μg/ml，算出最高转化率为82%

实施例4

种子培养和发酵：培养基为枝粉末 1-2%、可溶性淀粉 2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.4%、硫酸铵0.4%。pH值为3.0，装液量为250ml三角瓶装液量50ml，121℃湿热灭菌，作为发酵培养液。灭菌后冷却接种斜面种子制成的菌悬液，接种量为3%，180rpm/min，45℃作为发酵条件。

整个过程发酵过程中遮光处理，提取过程中也尽量避光。

转化液用60%甲醇超声提取30分钟后，离心去除沉淀，上清液过有机微孔滤膜后进HPLC,高效液相法在18.5小时时测得此次氧化白藜芦醇的得率为10μg/ml，算出最高转化率为96%.

Claims

1.一种微生物转化制备氧化白藜芦醇的方法，其特征包括：

（1）将黑曲霉菌株SW-3301进行常规培养活化，活化后的菌株做为生物催化剂；

（2）取鲜桑枝或桑根的皮，粉碎至20~40目，作为生物转化底物，再将其添入发酵培养溶液；

（3）将（1）收集的菌体制成菌悬液，加入到步骤（2）含底物的发酵液中并在一定条件下进行转化反应，生成氧化白藜芦醇；

（4）将步骤（3）的转化液，用质量百分比浓度为60%~80%的甲醇或者乙醇溶液进行超声提取后，再静止去除下层杂质，得到的上清液蒸发回收溶剂，得到氧化白藜芦醇粗品。

2.如权利要求1所述的一种微生物转化制备氧化白藜芦醇的方法，其特征在于步骤（2）中发酵培养的培养基为：桑枝粉末1-2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸镁0.4%、硫酸铵0.4%，pH值为3~6。

3.如据权利要求1所述的一种微生物转化制备氧化白藜芦醇的方法，其特征在于步骤（3）的发酵培养条件为：250ml三角瓶装液量 50~100ml，培养温度为 30~45℃，摇床转速为75~180r/min，接种量为：1%~3%，培养12~48小时。

4.如据权利要求1所述的一种微生物转化制备氧化白藜芦醇的方法，其特征在于步骤（3）的最优发酵培养条件为：250ml的三角瓶装液量 50ml、培养温度为45℃，摇床转速为150r/min，接种量为3%，转化时间为18.5小时。

5.如据权利要求1所述的一种微生物转化制备氧化白藜芦醇的方法，其特征在于根据氧化白藜芦醇光不稳定性的特征，发酵过程中采取避光的措施，减少氧化白藜芦醇的损失。

6.如据权利要求1所述的一种微生物转化制备氧化白藜芦醇的方法，其特征在于使用该方法能有效的提高桑枝氧化白藜芦醇的得率，其桑皮苷A 转化率可达到95%以上。