CN108865916B - 用于将白藜芦醇转化为ε-葡萄素的泛菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于将白藜芦醇转化为ε‑葡萄素的泛菌及其应用，该泛菌的保藏编号为CGMCC No.13605。本发明还提供了基于该泛菌制备ε‑葡萄素的方法。本发明提供的泛菌与传统的转化方法相比，得率高，不存在副产物，并且对环境没有污染；本发明的菌株泛菌(Pantoea sp)B2，CGMCC No.13605，具有高产性状稳定的特点，该菌株经过20代的传代，性能保持稳定。

Description

用于将白藜芦醇转化为ε-葡萄素的泛菌及其用途
技术领域
本发明属于微生物转化技术领域，涉及一种用于将白藜芦醇转化为白藜芦醇二聚体ε-葡萄素(ε-viniferin)的泛菌及其用途。
背景技术
已知的是，喝葡萄酒对于身体有益，有研究表明是，这是因为葡萄酒中含有抗氧化剂白藜芦醇。但近年研究显示，有些葡萄酒中不含白藜芦醇，却含有白藜芦醇二聚体。白藜芦醇二聚体是葡萄在生长过程中受到灰葡萄孢霉侵染时，分泌的抗毒素中含有的物质。白藜芦醇二聚体又称为葡萄素，有多种结构式类型，如ε-viniferin(结构式如式Ⅰ所示)和δ-viniferin等，主要存在于葡萄中，白藜芦醇二聚体是白藜芦醇被4-羟基芪过氧化物酶氧化形成。其中研究报道ε-葡萄素(ε-viniferin)在抗氧化、抗菌等方面的生物活性比白藜芦醇更强。因此，ε-葡萄素可能具有更强的保护心血管和抗癌的潜在活性。
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近几年来，国外对ε-葡萄素的功能活性研究较多，已有相关的葡萄藤提取物产品上市，但是由于ε-葡萄素在葡萄中的含量较少，并且提取分离较为困难，上市产品中芪化物含量30-50％，其中ε-葡萄素含量仅为10-20％。同时，国内对ε-葡萄素的研究较少，研究方法集中于通过对葡萄藤提取、纯化、精制得到主要产品为葡萄素和/或三聚体芪化物；但由于葡萄素和三聚体芪化物有多种结构式，所以其产品应该是多种葡萄素的复合物和多种三聚体芪化物的复合物。而目前ε-葡萄素的生物合成和化学合成方法，在不同程度上均存在着缺陷：得率低、副产物较多、有一定的污染等。至于如何获得高纯度 (纯度＞98％)ε-葡萄素，至今国内外还未有相关制备和/或提取方法的相关研究报道。
植物内生菌(Endophyte)是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。普遍存在于高等植物中，木本植物、草本植物、单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌。1993年，Strobel等(Science,1993, 260(5105):2142216)首次从短叶红豆杉植物中分离出一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌，证明内生菌具有合成与宿主植物相同或相似的活性成分的功能。这一发现为解决某些药用化合物的紧缺提供了新的思路。
然而，现有技术中并没有直接利用内生菌将白藜芦醇转化为ε-葡萄素 (ε-viniferin)的相关报道。
发明内容
基于此，本发明的目的是为了满足当前对ε-葡萄素的大量需求，提供一株用于将白藜芦醇转化为ε-葡萄素的泛菌，本发明还提供了基于该泛菌制备ε-葡萄素的方法，本发明的方法有助于ε-葡萄素的扩大生产，以满足当前市场对ε-葡萄素的需求，进而为ε-葡萄素的临床深入研究提供物质基础。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种用于将白藜芦醇转化为ε-葡萄素的泛菌，该泛菌的保藏编号为 CGMCCNo.13605。
这种泛菌的分类命名为泛菌(Pantoea sp)B2，目前该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13605，保藏日期为2017年1月11日。
本发明所述的菌株是通过对分离自玫瑰香葡萄藤(Vitis vinifera L)的内生细菌进行分离、纯化、检测，从而获得的一株能够将白藜芦醇转化为ε- 葡萄素(ε-viniferin)的菌株B2。
对该菌株的16S rRNA基因进行测序及比对分析，其与泛菌属(Pantoea) 同源相似性最高，其中，与Pantoea vagans最高同源性为89％，与Pantoea sp. strain P32最高同源性为99％。
根据《常见细菌鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》等微生物分类鉴定准则及多相分类鉴定的结果，确定B2菌株为细菌类泛菌属一新种，命名为泛菌(Pantoea sp.)B2，确定该菌建议的分类命名为Pantoea sp.。
该泛菌B2具有下述性质：
1、菌落形态学特征：
将本发明的泛菌菌株B2于28℃下，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养生长，3天后，得到直径约为3～10mm的黄色圆状菌体，表面平滑，蜡状，有光泽，周围光滑，边缘整齐，无分泌物。
2、菌株形态学特征：
泛菌B2在油镜下成白色单个或成对棒状存在，其长度约为0.6～1.2μm ×1.8～2.9μm，属于泛菌属。
3、生理与生化特性：
泛菌B2最适生长温度为28℃，并且在pH为7.0的条件下生长较好。
4、营养特征：
泛菌B2的生长与繁殖对营养物质无特殊要求，在常见的细菌培养基及PDA、察氏等培养基上均可以生长。
可采用斜面传代法、冷冻干燥法、甘油管等常规微生物保藏技术与方法进行保藏及存活性检测。
例如，常用的牛肉膏蛋白胨培养基中牛肉膏为泛菌B2提供了生长所需的碳源、磷酸盐以及维生素；蛋白胨主要为泛菌B2提供氮源和维生素；培养基中的NaCl则为泛菌B2生长所需的无机盐。
5、泛菌B2平皿背面特征：
泛菌B2平皿背面也呈现黄色，培养基颜色未见加深。
本发明还提供了上述泛菌B2在制备ε-葡萄素中的用途。
本发明从玫瑰香葡萄藤(Vitis vinifera L)的新鲜葡萄枝中获得该泛菌 B2。
本发明还提供了一种将白藜芦醇转化为ε-葡萄素的方法，该方法包括采用上述泛菌进行转化。
优选地，所述方法包括以下步骤：
1)制备牛肉膏蛋白胨液体培养基和固体培养基：
2)制备泛菌发酵液：
将纯化后的泛菌制备为5×103～105CFU/ml的菌悬液，将菌悬液加入到液体培养基中制得发酵液，其中菌悬液与液体培养基的体积比为1：50～200；
3)白藜芦醇的转化；
加入白藜芦醇溶液，使得发酵液中白藜芦醇的浓度为0.01～0.2mg/ml，在25～37℃下，恒温振荡器上培养3～6天；
4)ε-葡萄素(ε-viniferin)的萃取；
将发酵后的发酵液用等体积的乙酸乙酯或正丁醇萃取，将萃取后的乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到浸膏，即得。
优选地，在步骤1)中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中包含以下组分：
2～10g/L的牛肉膏、5～20g/L的蛋白胨和0.5-10g/L的NaCl；
其制备方法如下：分别称取0.2～1g牛肉膏、0.5～2g蛋白胨、0.05～ 1gNaCl，充分溶解于100ml的去离子水中，即得牛肉膏蛋白胨液体培养基；
将溶解后的培养基装于250ml的锥形瓶中，封口，于1.06kg/cm2压力下 121℃湿热灭菌30min；
在每100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入2.5-5g琼脂，加热充分溶解，即得牛肉膏蛋白胨固体培养基。
将溶解后的培养基装于250ml的锥形瓶中，将装好的培养基封口，于 1.06kg/cm2压力下121℃湿热灭菌30min。灭菌后将培养基适量倾倒于平皿中，放凉凝固以用来分离并纯化培养泛菌B2。固体培养基主要用于菌种的保藏和传代。液体培养基灭菌后放凉以用来培养泛菌B2并对白藜芦醇进行转化。
优选地，在步骤2)中，所述菌悬液的浓度为104CFU/ml；
优选地，在步骤2)中，所述菌悬液与液体培养基的体积比为1:100；
优选地，在步骤2)中，将所述发酵液置于恒温振荡器上，在25～37℃培养1～4天；
优选地，在步骤2)中，所述恒温振荡器的转速为50～300rpm/min，更优选地为100～200rpm/min，进一步优选地为160rpm/min；
优选地，在步骤2)中，所述培养温度为26～30℃，更优选地为28℃；
优选地，在步骤2)中，培养时间为1天；
优选地，在步骤3)中，所述白藜芦醇的浓度为0.1mg/ml；
优选地，在步骤3)中，所述恒温振荡器的转速为50～300rpm/min，更优选地为100～200rpm/min，进一步优选地为160rpm/min；
优选地，在步骤3)中，所述培养温度为26～30℃，更优选地为28℃；
优选地，在步骤3)中，所述培养时间为5天；
优选地，所述方法还包括将得到的产物用甲醇复溶，并进行HPTLC检测和HPLC-MS分析的步骤。
与现有技术相比，本发明以下的有益效果：
1.与传统的转化方法相比，本发明的微生物转化法得率高，ε-葡萄素(ε-viniferin)的产率不低于24.3％；
2.本发明的方法为微生物转化法，对环境没有污染；
3.本发明的泛菌B2(CGMCC No.13605)，具有高产性状稳定的特点，该菌株经过20代的传代，性能保持稳定。
4.本发明的泛菌B2(CGMCC No.13605)能够定向转化白藜芦醇产生ε-葡萄素，这是一种制备ε-葡萄素(ε-viniferin)的新方法；
5.使用本发明的泛菌B2(CGMCC No.13605)生产ε-葡萄素 (ε-viniferin)，生产成本低，经济效益十分可观。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明的泛菌B2形态学图片，从图1中可以得知，本发明的菌株为直径约3～10mm的黄色圆状菌体，表面平滑，蜡状，有光泽，周围光滑，边缘整齐，无分泌物；
图2为本发明的泛菌B2的显微镜图片，从图2中得知，本发明的菌株为棒状；
图3为本发明的泛菌B2转化产物的HPTLC检测；其中，左侧为紫外灯下的视图，右侧图为自然光下的视图；
1号为白藜芦醇对照品，2号为ε-葡萄素(ε-viniferin)对照品，3号为在本发明的泛菌B2中加入白藜芦醇培养后的提取液，4号为未加入白藜芦醇的培养液。
图4为本发明的泛菌B2转化的HPLC图。
生物材料的保藏
泛菌(Pantoea sp)B2已经于2017年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No.13605。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所涵盖的本发明的范围。
实施例1使用本发明的泛菌B2菌株制备ε-葡萄素
以从实验室分离得到的泛菌B2菌株为出发菌株，采用以下方法制备ε- 葡萄素：
1)牛肉膏蛋白胨培养基的配制：
将牛肉膏、蛋白胨、NaCl分别称取0.3g、1g、0.5g，充分溶解于100ml 的去离子水中，即得牛肉膏蛋白胨液体培养基。溶解后的培养基装于250ml 的锥形瓶中，将装好的培养基封口，于1.06kg/cm2压力下121℃湿热灭菌 30min。灭菌后放凉以用来培养制作发酵液并对白藜芦醇进行转化。在每 100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入3g琼脂，加热充分溶解，即得牛肉膏蛋白胨固体培养基。溶解后的培养基装于250ml的锥形瓶中，将装好的培养基封口，于1.06kg/cm2压力下121℃湿热灭菌30min。灭菌后将培养基适量倾倒于平皿中，放凉凝固以用来分离并纯化培养泛菌B2。
2)泛菌B2的培养；
将纯化后的菌体制成5×103CFU/ml的菌悬液，将菌悬液加入到液体培养基中，其中菌悬液与液体培养基的体积比为1：100，置于恒温振荡器上，恒温振荡器转速为160rpm/min，28℃培养1天；
3)白藜芦醇的转化；
加入白藜芦醇溶液，使得发酵液中含白藜芦醇的浓度为0.1mg/ml，继续培养5天；
4)ε-葡萄素的萃取；
发酵后的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，将萃取后的乙酸乙酯层旋干，得到转化产物浸膏；
5)ε-葡萄素的HPTLC检测和HPLC-MS分析；
将得到的转化产物浸膏用甲醇复溶，并进行HPTLC检测和HPLC-MS 分析。
HPTLC：选取merck公司生产的GF254高效薄层板，在石油醚-乙酸乙酯(1:1v/v)展开，检测结果首先在254nm下观察斑点情况，然后再用5％硫酸乙醇溶液显色，105℃加热三分钟，观察薄层斑点情况，结果如图3所示， 1号为白藜芦醇对照品，2号为ε-葡萄素(ε-viniferin)对照品，3号为泛菌 B2发酵液中加入白藜芦醇培养后的提取液，4号为未加入白藜芦醇的培养液。通过254nm紫外下观察并结合显色后斑点，均显示在泛菌B2发酵液中加入白藜芦醇后，发酵液发生了转化，白藜芦醇减少了，而生成了ε-葡萄素 (ε-viniferin)。
该结果又通过HPLC-MS再次进行了验证。
仪器型号；安捷伦1200HPLC；
色谱柱：Diamonsil II C18column(250mm×4.6mm,5μm，迪马科技)；
柱温：25℃。
流动相：0.1％醋酸水溶液(v/v，A)-甲醇(B)；
梯度洗脱程序:0～5min，20％→30％B；5～15min，30％→30％B；15～ 18min，30％→37％B；18～29min，37％→37％B；29～35min，37％→50％ B；35～57min，50％→50％B；57～57.1min，100％→100％B；57.1～60min， 100％→100％。
流速：1ml·min-1。
进样量：20μL。
流动相采用分流方式，分流比设为1∶4。
TOF-MS实验条件：ESI离子源，正负离子分别进行全扫描，扫描质量范围m/z 50～1200；干燥气体积流量6L/min，干燥气温度180℃，雾化气压80kPa。毛细管电压：正离子模式4.5kV、负离子模式2.6kV，碎裂电压 200V。选择甲酸钠溶液为内标矫正。
结果如图4显示，加入白藜芦醇的菌种培养液中经过5天的转化培养，发现培养液中不仅有残留的白藜芦醇，同时在ε-葡萄素(ε-viniferin)相同的时间出现了ε-葡萄素(ε-viniferin)的样品峰，说明其能够转化白藜芦醇生成ε-葡萄素(ε-viniferin)。
结果显示，HPTLC中转化菌株中含有ε-葡萄素，其比移值为0.55，与ε- 葡萄素标准品相同；HPLC中转化菌株在保留时间41.0min处有一个峰，与ε-葡萄素标准品保留时间相同；从HPLC-MS中可以看到转化菌株与ε-葡萄素有相同的裂解碎片，且有ε-葡萄素m/z477.1286[M+Na]+，455.1477[M+H-H2O]+,437.1355[M+H]+，369.1042[M+Na-108]+的裂解碎片；
以此证明从葡萄中分离得到的内生细菌菌株B2可以将白藜芦醇转化为白藜芦醇二聚体ε-葡萄素(ε-viniferin)。
菌株B2转化白藜芦醇得到ε-葡萄素过程中白藜芦醇的产率为26.1％。
实施例2使用本发明的泛菌B2菌株制备ε-葡萄素
以从实验室分离得到的菌株为出发菌株，采用以下方法制备ε-葡萄素：
1)牛肉膏蛋白胨培养基的配制：
将牛肉膏、蛋白胨、NaCl分别称取0.3g、1g、0.5g，充分溶解于100ml 的去离子水中，即得牛肉膏蛋白胨液体培养基。溶解后的培养基装于250ml 的锥形瓶中，将装好的培养基封口，于1.06kg/cm2压力下121℃湿热灭菌30min。灭菌后放凉以用来培养制作发酵液并对白藜芦醇进行转化。在每 100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入3g琼脂，加热充分溶解，即得牛肉膏蛋白胨固体培养基。溶解后的培养基装于250ml的锥形瓶中，将装好的培养基封口，于1.06kg/cm2压力下121℃湿热灭菌30min。灭菌后将培养基适量倾倒于平皿中，放凉凝固以用来分离并纯化培养泛菌B2。
2)泛菌B2培养；
将纯化后的菌体制成5×105CFU/ml的菌悬液，将菌悬液加入到液体培养基中，其中菌悬液与液体培养基的体积比为1：200，置于恒温振荡器上，恒温振荡器转速为50rpm/min，25℃培养4天；
3)白藜芦醇的转化；
加入白藜芦醇溶液，使得发酵液中含白藜芦醇的浓度为0.1mg/ml，继续培养5天；
4)ε-葡萄素的萃取；
发酵后的发酵液用等量的乙酸乙酯萃取，将萃取后的乙酸乙酯层旋干，得到转化产物浸膏；
将得到的转化产物浸膏用甲醇复溶，并进行HPTLC检测和HPLC-MS 分析。
结果显示，HPTLC中转化菌株中含有ε-葡萄素，其比移值为0.55，与ε- 葡萄素标准品相同；HPLC中转化菌株在保留时间41.0min处有一个峰，与ε-葡萄素标准品保留时间相同；从HPLC-MS中可以看到转化菌株与ε-葡萄素有相同的裂解碎片，且有ε-葡萄素m/z477.1286[M+Na]+，455.1477[M+H-H2O]+,437.1355[M+H]+，369.1042[M+Na-108]+的裂解碎片；
以此证明从葡萄中分离得到的内生细菌菌株B2可以将白藜芦醇转化为ε-葡萄素。
菌株B2转化白藜芦醇得到ε-葡萄素过程中白藜芦醇的产率为28.3％。
实施例3使用本发明的泛菌B2菌株制备ε-葡萄素
以从实验室分离得到的菌株为出发菌株，采用以下方法制备ε-葡萄素：
1)牛肉膏蛋白胨培养基的配制：
将牛肉膏、蛋白胨、NaCl分别称取0.3g、1g、0.5g，充分溶解于100ml 的去离子水中，即得牛肉膏蛋白胨液体培养基。溶解后的培养基装于250ml 的锥形瓶中，将装好的培养基封口，于1.06kg/cm2压力下121℃湿热灭菌 30min。灭菌后放凉以用来培养制作发酵液并对白藜芦醇进行转化。在每 100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入3g琼脂，加热充分溶解，即得牛肉膏蛋白胨固体培养基。溶解后的培养基装于250ml的锥形瓶中，将装好的培养基封口，于1.06kg/cm2压力下121℃湿热灭菌30min。灭菌后将培养基适量倾倒于平皿中，放凉凝固以用来分离并纯化培养泛菌B2。
2)泛菌B2培养；
将纯化后的菌体制成5×104CFU/ml的菌悬液，将菌悬液加入到液体培养基中，其中菌悬液与液体培养基的体积比为1：50，置于恒温振荡器上，恒温振荡器转速为300rpm/min，28℃培养1天；
3)白藜芦醇的转化；
加入白藜芦醇溶液，使得发酵液中含白藜芦醇的浓度为0.2mg/ml，继续培养6天；
4)ε-葡萄素的萃取；
发酵后的发酵液用等量的正丁醇萃取，将萃取后的乙酸乙酯层旋干，得到转化产物浸膏；
将得到的转化产物浸膏用甲醇复溶，并进行HPTLC检测和HPLC-MS 分析。
结果显示，HPTLC中转化菌株中含有ε-葡萄素，其比移值为0.55，与ε- 葡萄素标准品相同；HPLC中转化菌株在保留时间41.0min处有一个峰，与ε-葡萄素标准品保留时间相同；从HPLC-MS中可以看到转化菌株与ε-葡萄素有相同的裂解碎片，且有ε-葡萄素m/z477.1286[M+Na]+，455.1477[M+H-H2O]+,437.1355[M+H]+，369.1042[M+Na- 108]+的裂解碎片；以此证明从葡萄中分离得到的内生细菌菌株B2可以将白藜芦醇转化为ε-葡萄素。
菌株B2转化白藜芦醇得到ε-葡萄素过程中白藜芦醇的产率为24.7％。

Claims (23)

1.一种用于将白藜芦醇转化为ε-葡萄素的泛菌(Pantoea sp.)，该泛菌的保藏编号为CGMCC No.13605。
2.如权利要求1所述的泛菌在制备ε-葡萄素中的用途。
3.一种将白藜芦醇转化为ε-葡萄素的方法，其特征在于，所述方法包括采用如权利要求1所述的泛菌进行转化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)制备牛肉膏蛋白胨液体培养基和固体培养基：
2)制备泛菌发酵液：
将纯化后的泛菌制备为5×103～105CFU/ml的菌悬液，将菌悬液加入到液体培养基中制得发酵液，其中菌悬液与液体培养基的体积比为1：50～200；
3)白藜芦醇的转化；
加入白藜芦醇溶液，使得发酵液中白藜芦醇的浓度为0.01～0.2mg/ml，在25～37℃下，恒温振荡器上培养3～6天；
4)ε-葡萄素的萃取；
将发酵后的发酵液用等体积的乙酸乙酯或正丁醇萃取，将萃取后的乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到浸膏，即得。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中包含以下组分：
2～10g/L的牛肉膏、5～20g/L的蛋白胨和0.5-10g/L的NaCl。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述牛肉膏蛋白胨固体培养基中包含以下组分：
2～10g/L的牛肉膏、5～20g/L的蛋白胨、0.5-10g/L的NaCl和25～50g/L的琼脂。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述菌悬液的浓度为104CFU/ml。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述菌悬液与液体培养基的体积比为1:100。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，将所述发酵液置于恒温振荡器上，在25～37℃培养1～4天。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述恒温振荡器的转速为50～300rpm。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述恒温振荡器的转速为100～200rpm。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述恒温振荡器的转速为160rpm。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，在26～30℃培养。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，在28℃培养。
15.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，培养1天。
16.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述白藜芦醇的浓度为0.1mg/ml。
17.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述恒温振荡器的转速为50～300rpm。
18.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述恒温振荡器的转速为100～200rpm。
19.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述恒温振荡器的转速为160rpm。
20.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，在26～30℃下培养。
21.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，在28℃下培养。
22.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，培养5天。
23.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将得到的产物用甲醇复溶，并进行HPTLC检测和HPLC-MS分析的步骤。
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