CN104887615A - 一种制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微藻生物技术领域，特别公开了一种制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法。该方法通过对发菜细胞进行紫外辐射处理，低盐胁迫处理，处理后发菜细胞重新在BG-11培养基中培养15天，发菜细胞内MAA含量显著提高，最后再对MAAs粗品进行提取。本发明工艺简单，生产效率高，生产获得的发菜细胞中类菌胞素氨基酸，经分离纯化后可以用作抗氧化和防紫外辐射的化妆品原料或者抗氧化药物原料。

Description

一种制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法
（一）     技术领域
    本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一种制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法。
（二）     背景技术
发菜是生长在我国西北部和北部干旱地区的一种陆生性经济蓝藻，具有很高的经济和药用价值。由于其生长环境恶劣，常年接受高强度紫外辐射和当地盐碱性土壤的高碱高盐环境胁迫，发菜细胞在进化过程中形成了一套完整的抵抗不良环境保护机制。生长过程中形成紫外吸收物质类菌胞素氨基酸就是发菜细胞抵制紫外损伤的有效途径。
类菌胞素氨基酸（MAAs）是一类无色的，水溶性的低分子量物质。从结构上看，MAAs是一类环己烯酮或以环己烯酮为骨架与氨基酸、氨基醇等含氮物质共价结合形成的一类化合物，平均分子量300Da左右，能够吸收310-360nm波长的紫外辐射，有些研究表明含有高浓度MAAs的细胞比不含或含量很少的细胞在抵抗紫外辐射的能力上高大约25%。在N.commune中，MAAs在光保护中有重要作用，因为它位于细胞外的多糖层，与低聚糖共价连接，而多数蓝细菌的MAAs是位于胞内的。除了作为遮光剂，MAAs还起到抗氧化的作用，MAAs的前体是一种比抗坏血酸更强的抗氧化剂。
我们在研究中发现发菜细胞中MAAs含量与环境因素相关，从发菜细胞中提取MAAs具有很好的抗氧化活性。
（三）     发明内容
    本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种工艺简单、生产效率高、产品含量高的制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法，以发菜单体细胞为初始培养细胞菌株，包括如下步骤：
（1）将培养至对数期的光合自养发菜细胞置于90mm培养皿中，垂直放置在紫外灯管下，通过调节灯管和培养皿的距离控制紫外辐射强度在1-6W/m2，处理时间为24-48h，紫外辐射处理后细胞作为种子液备用；
（2）将步骤（1）中得到的种子液重新接种到含有NaCl的BG-11培养基中，培养2d，离心收集细胞，作为种子液备用；
（3）将步骤（2）中获得的种子液接种到含有碳源的BG-11培养基中，培养15-20天，发菜细胞进行混合营养高密度生长，收获发菜细胞；
（4）将步骤（3）收获的发菜细胞培养液离心，收集发菜细胞，用微波方法破碎细胞，细胞破碎液加入甲醇溶液，水浴保温提取2h，离心，收集上清液，在0-4℃条件下放置24h，然后用滤纸过滤，收集滤液，滤液进行旋转蒸发，蒸发温度为40-50℃，浓缩后加入水和氯仿混合物，去除色素，离心收集水相，真空冷冻干燥后制得粗品。
本发明的更优技术方案为：
步骤（2）中，BG-11培养基中NaCl的质量浓度为50-100 mmol/L。
步骤（4）中，微波破碎细胞时，微波功率为300-500W，处理时间为90s每次，反复进行4次，加入细胞破碎液的甲醇溶液与培养液的体积比为1:1-1.5；水浴保温温度为40-50℃；水和氯仿的质量比为2-3:7-8。
采用本发明的工艺技术，发菜细胞中类菌胞素氨基酸含量得到显著提高，达到80-100mg/g。
本发明工艺简单，生产效率高，生产获得的发菜细胞中类菌胞素氨基酸，经分离纯化后可以用作抗氧化和防紫外辐射的化妆品原料或者抗氧化药物原料。
（四）     具体实施方式
实施例1：一种制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法
以发菜单体细胞为初始培养细胞菌株，包括如下步骤：
（1）发菜单体细胞的紫外辐射处理：将培养至对数期的光合自养发菜细胞置于90mm培养皿中，垂直放置在紫外灯管下，通过调节灯管和培养皿的距离控制紫外辐射强度在1W/m2，处理时间为24-48h，紫外辐射处理后细胞作为种子液备用；
（2）发菜单体细胞的低盐胁迫处理：将步骤（1）中得到的种子液重新接种到含有NaCl（质量浓度为50 mmol/L）的BG-11培养基中，培养2d，离心收集细胞，作为种子液备用；
（3）将步骤（2）中获得的种子液接种到含有碳源的BG-11培养基中，三角瓶光照培养箱震荡培养15天，培养基初始pH控制为9.0，培养基温度室温，转速100-200r/min，发菜细胞进行混合营养高密度生长，收获发菜细胞；
（4）将步骤（3）收获的发菜细胞培养液离心，收集发菜细胞，用微波方法破碎细胞，细胞破碎液加入甲醇溶液，水浴保温提取2h，离心，收集上清液，在0-4℃条件下放置24h，然后用滤纸过滤，收集滤液，滤液进行旋转蒸发，蒸发温度为40-50℃，浓缩后加入水和氯仿混合物，去除色素，离心收集水相，真空冷冻干燥后制得粗品，产量为89.07mg/L。
实施例2：一种制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法
以发菜单体细胞为初始培养细胞菌株，包括如下步骤：
（1）发菜单体细胞的紫外辐射处理：将培养至对数期的光合自养发菜细胞置于90mm培养皿中，垂直放置在紫外灯管下，通过调节灯管和培养皿的距离控制紫外辐射强度在5W/m2，处理时间为48h，紫外辐射处理后细胞作为种子液备用；
（2）发菜单体细胞的低盐胁迫处理：将步骤（1）中得到的种子液重新接种到含有NaCl（质量浓度为100 mmol/L）的BG-11培养基中，培养2d，离心收集细胞，作为种子液备用；
（3）将步骤（2）中获得的种子液接种到含有碳源的BG-11培养基中，20L光照反应器中培养15天，培养基初始pH控制为9.0，培养基温度控制25-30℃，转速200-300r/min，发菜细胞进行混合营养高密度生长，收获发菜细胞；
（4）将步骤（3）收获的发菜细胞培养液离心，收集发菜细胞，用微波方法破碎细胞，细胞破碎液加入甲醇溶液，水浴保温提取2h，离心，收集上清液，在0-4℃条件下放置24h，然后用滤纸过滤，收集滤液，滤液进行旋转蒸发，蒸发温度为40-50℃，浓缩后加入水和氯仿混合物，去除色素，离心收集水相，真空冷冻干燥后制得粗品，产量为100.13mg/L。

Claims (5)

1.一种制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法，以发菜单体细胞为初始培养细胞菌株，其特征为，包括如下步骤：（1）将培养至对数期的光合自养发菜细胞置于90mm培养皿中，垂直放置在紫外灯管下，通过调节灯管和培养皿的距离控制紫外辐射强度在1-6W/m2，处理时间为24-48h，紫外辐射处理后细胞作为种子液备用；（2）将步骤（1）中得到的种子液重新接种到含有NaCl的BG-11培养基中，培养2d，离心收集细胞，作为种子液备用；（3）将步骤（2）中获得的种子液接种到含有碳源的BG-11培养基中，培养15-20天，发菜细胞进行混合营养高密度生长，收获发菜细胞；（4）将步骤（3）收获的发菜细胞培养液离心，收集发菜细胞，用微波方法破碎细胞，细胞破碎液加入甲醇溶液，水浴保温提取2h，离心，收集上清液，在0-4℃条件下放置24h，然后用滤纸过滤，收集滤液，滤液进行旋转蒸发，蒸发温度为40-50℃，浓缩后加入水和氯仿混合物，去除色素，离心收集水相，真空冷冻干燥后制得粗品。
2.根据权利要求1所述的制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于：步骤（2）中，BG-11培养基中NaCl的质量浓度为50-100 mmol/L。
3.根据权利要求1所述的制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于：步骤（4）中，微波破碎细胞时，微波功率为300-500W，处理时间为90s每次，反复进行4次，加入细胞破碎液的甲醇溶液与培养液的体积比为1:1-1.5。
4.根据权利要求1所述的制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于：步骤（4）中，水浴保温温度为40-50℃。
5.根据权利要求1所述的制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于：步骤（4）中，水和氯仿的质量比为2-3:7-8。
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