CN114901631B - 类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine以及从海藻中提取Porphyra-334和Shinorine的方法 - Google Patents

类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine以及从海藻中提取Porphyra-334和Shinorine的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供类菌胞素氨基酸Porphyra‑334和Shinorine以及从海藻中提取Porphyra‑334和Shinorine的方法，所述的方法包括以下步骤：浸提、絮凝、过滤、层析、Porphyra‑334浓缩、Shinorine浓缩。上述技术方案可得到纯度可达到97％以上的Porphyra‑334晶体和95％以上的Shinorine晶体。该技术方案能有效去除海藻中杂质，收率比传统的离子交换树脂高20‑30％，工艺废水较少，可用于大规模工业化生产。整个工艺连续便捷，操作时间快速。

Description

类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine以及从海藻中提 取Porphyra-334和Shinorine的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine以及从海藻中提取Porphyra-334和Shinorine的方法。
背景技术
近年来，由于臭氧层破环现象严重，到达地球表面的紫外线日渐增加，过量的紫外线照射会加速皮肤的光老化，给人类皮肤健康造成严重威胁。而能够到达地球表面的紫外线主要为中波段(280-320nm)和长波段(320-400nm)区域，因此，国内外抵抗紫外线而研发的防晒类化妆品多针对于对抗中波段(UVB区)和长波段(UVA区)紫外线。研究发现，中波段紫外线透射能力强，作用效果快，可在短时间内破坏皮肤细胞内的核酸及蛋白，导致皮肤出现红肿、晒斑、炎症等现象。因此，对中波段紫外线的防护已成为防晒产品开发的重点。然而，长波段(UVA区)虽然相对中波段作用效果缓慢，但该波段紫外线能够直接到达皮肤的真皮层，致使血管损伤及其周围炎症细胞的侵袭，导致皮肤色素沉积，经长期积累，导致皮肤不可逆性衰老。
目前，市面上开发生产的防晒化妆品多存在作用效果单一、预防波段阈值较窄的特点，而针对于全波段的紫外防护产品又存在化学防护剂添加量超标。所以，针对于不同波段紫外线对皮肤损伤的特点，研发针对于紫外全波段、天然植物中提取UV防护剂已成为研究的重点。
类菌胞素氨基酸(mycosporine-like amino acids，MAAs)是一类以环己烯酮为基本骨架，与多种类型氨基酸通过缩合作用而形成的水溶性活性物质。在自然界中，类菌胞素氨基酸广泛分布于水生生物中，尤其在红藻纲藻类中含量丰富，如条斑紫菜中的类菌胞素氨基酸含量高达干藻重量的9.065％。目前，从自然界中提取、分离并鉴定类菌胞素氨基酸类成分共29种。近年来，针对类菌胞素氨基酸的来源、分布、提取与纯化方法、分析检测方法、生物活性及其在化妆品领域应用等方面所进行的研究一直是研究热点。一方面是因为水生生物资源丰富，尤其是红藻的养殖资源充足，为类菌胞素氨基酸的研究提供了充沛的原料来源；另一方面，类菌胞素氨基酸活性独特，在紫外线防护方面展现出罕见的活性优势，在化妆品领域的成功应用将带来巨大的经济价值。尽管类菌胞素氨基酸是一类具有高附加值的活性物质，但因其水溶性强，提取分离获得高纯度类菌胞素氨基酸较为困难，使得类菌胞素氨基酸的广泛应用受到了限制。
目前国内专门对类菌胞素氨基酸的提取和纯化成单组份的研究涉及很少，并且纯度不高。国内外研究MAAs的文献较多，但是如何快速有效的得到MAAs以及其中的单组分，以便提供更多的原料成分，进行深入的药理研究，只有实验室研发的高效液相色谱法小量制备单组分研究，未见到工业放大生产的工艺，对于工业化需求量大，需要大量制备产品工艺。而且目前在提纯过程中普遍使用的离子交换树脂吸附法，会产生大量废水，生产过程对环境的影响较大。
在论文《类菌胞素氨基酸(MAAs)Porphyra-334的提取及其新功能研究》和专利：一种紫菜类菌胞素氨基酸Porphyra-334的制备方法(申请号201210114628.5)使用了常规的离子交换树脂方法，而MAAs是属于易氧化的极性水溶性化合物，稳定性相对较差，离子交换法局部强酸碱条件对产品的稳定和收率均很难做到很好的规模化生产。
发明内容
为此，需要提供一种适合工业化生产、操作简单的，收率较高，得到Porphyra-334和Shinorine的纯度较高的方法。
本发明的第一方面，发明人提供了一种从海藻中提取类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine的方法，所述的方法包括步骤：
浸提：将海藻洗净沥干后进行粉碎，然后将粉碎后的海藻在浓度为0.5-10.5％的氯化钠溶液中浸泡1-2h后捞出，得到首次浸提液；将捞出的海藻碎渣再用浓度60-80％的乙醇溶液中浸泡2-3h后捞出，得到二次浸提液；将所述首次浸提液和二次浸提液进行混合，得到混合浸提液；所述粉碎后的海藻、氯化钠溶液、乙醇溶液的质量比为1:8-15:5-15；
絮凝：在混合浸提液中加入壳聚糖，搅拌均匀，进行50-70分钟絮凝后，固液分离，得到除杂后浸提液；所述混合浸提液与所述壳聚糖的质量比为：10000:3-10；
过滤：将所述除杂后浸提液用超滤膜进行过滤，得到过滤液；所述过滤液用纳滤膜进行浓缩，得到5％-10％过滤液体积的浓缩液；
层析：将浓缩液上样ODS混合层析柱进行层析，洗脱液冲洗，HPLC跟踪监测，分别得到Porphyra-334纯化液和Shinorine纯化液；所述洗脱液为有机溶剂和pH为3.5-4.5缓冲溶液配置而成，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈以及丙酮中的一种或多种；
Porphyra-334浓缩：将所述Porphyra-334纯化液进行膜浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Porphyra-334浓缩物，将含Porphyra-334浓缩物加入3-8倍体积的丙酮，加热至45-55℃后，停止加热，降温结晶，降温至4℃，析出白色固体，将白色固体在45-55℃加热干燥，得到Porphyra-334无定型结晶物；
Shinorine浓缩：将所述Shinorine纯化液进行膜浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Shinorine浓缩物，将含Shinorine浓缩物加入3-8倍体积的乙醇或丙酮，加热至45-55℃后，停止加热，降温结晶，降温至4℃，析出白色固体，将白色固体45-55℃加热干燥，得到Shinorine无定型结晶物。
本发明的第二个方面，发明人提供了类菌胞素氨基酸Porphyra-334，所述类菌胞素氨基酸Porphyra-334根据本发明第一方面所述的方法进行制备。
本发明的第三个方面，发明人提供了类菌胞素氨基酸Shinorine，其特征在于，所述类菌胞素氨基酸Shinorine根据本发明第一方面所述的方法进行制备。
区别于现有技术，上述技术方案采用了通过对红藻门海藻进行浸提，膜过滤、ODS混合柱层析、浓缩和结晶，可得到纯度可达到97％以上的Porphyra-334晶体和95％以上的Shinorine晶体。该技术方案能有效去除海藻中杂质，收率比传统的离子交换树脂高20-30％，工艺废水较少，可用于大规模工业化生产。整个工艺连续便捷，操作时间快速，不同于常规的减压加热浓缩会对产品稳定性造成影响，氧化产生色素造成品质影响干扰，对产品的质量起到保障作用。通过壳聚糖吸附去除大多数的金属离子和杂蛋白以及杂多糖成分，通过混合层析能有效解决去除小分子糖在普通层析柱上因极性MAAs差距小不好分离去除的缺点，从而使得MAAs中的Shinorine和Porphyra-334能有效纯化得到高纯度的单组份。
附图说明
图1为实施例1红毛菜浸提液的HPLC检测图A，Kromasil 100-5C18柱条件，RTShinorine＝3.8min，RT Porphyra-334＝5.7min。
图2为实施例1红毛菜浸提液的HPLC检测图B，Agilent ZORBAX SB-C18柱条件，RTShinorine＝3.7min，RT Porphyra-334＝4.5min。
图3为实施例1红毛菜混合浸提液NMR-H谱图。
图4为实施例1红毛菜混合浸提液NMR-C谱图。
图5为实施例1红毛菜混合浸提液NMR-DEPT谱图。
图6为实施例1红毛菜浓缩液经过层析后得到的洗脱液HPLC检测图(HPLC跟踪监测，跟踪样品1)，Kromasil 100-5C18柱条件，RT Porphyra-334＝5.8min。
图7为实施例1Porphyra-334无定型结晶物的HPLC图，Agilent ZORBAX SB-C18柱条件，RTPorphyra-334＝4.5min。
图8为实施例1Shinorine无定型结晶物的HPLC图，Agilent ZORBAX SB-C18柱条件。
图9为实施例1的Porphyra-334无定型结晶物的NMR-H谱图。
图10为实施例1的Porphyra-334无定型结晶物的NMR-C谱图。
图11为实施例1的Porphyra-334无定型结晶物的NMR-DEPT谱图。
图12为实施例1的Porphyra-334无定型结晶物的200倍显微镜图。
图13为实施例1的Shinorine无定型结晶物的200倍显微镜图。
图14为实施例2中条斑紫菜混合浸提液HPLC检测图，Kromasil 100-5C18柱条件。
图15为实施例3中坛紫菜混合浸提液HPLC检测图，Agilent ZORBAX SB-C18柱条件。
图16为实施例3中坛紫菜混合浸提液经过壳聚糖絮凝现象图。
图17为实施例4中龙须菜混合浸提液HPLC检测图，Agilent ZORBAX SB-C18柱条件。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
红藻门海藻，绝大多数为多细胞体、极少数为单细胞体的藻类；其藻体为紫红、玫瑰红、暗红等色。红藻门海藻绝大部分生长于海洋中，分布广，种类多，据统计约有558属、3740余种。红藻门包括：红毛菜Bangia atropurpurea，坛紫菜Pyropia haitanensis，条斑紫菜Pyropia yezoensis，圆紫菜Pyropia suborbiculata，绉紫菜Pyropia crispata，长紫菜Pyropia dentata，海萝Gloiopeltis furcata，鹿角海萝Gloiopeltis tenax，海头红Plocamium telfariae，皱波角叉菜Chondrus crispus，日本角叉菜Chondrus nipponicus，异色角叉菜Chondrus verrucosus，三叉仙菜Ceramium kondoi，圆锥仙菜Ceramiumpaniculatum，凝菜Campylaephora crassa，蜈蚣菜Grateloupia filicina，石花菜Gelidium amansii，大石花菜Gelidium pacificum，细毛石花菜Gelidium crinale，异形石花菜Gelidium vagum，鹿角沙菜Hypnea cervicornis，异枝江蓠Gracilariabailiniae，真江蓠Gracilaria vermiculophylla，脆江蓠Gracilaria chouae，细基江蓠Gracilariatenuistipitata，细基江蓠繁枝变种Gracilaria tenuistipitata var.liui，扁江蓠Gracilaria textorii，芋根江蓠Gracilaria blodgettii，帚状江蓠Gracilaria edulis，缢红江蓠Gracilaria Salicornia，智利江蓠Gracilaria chilensis，刺边江蓠Gracilariaspinulosa，龙须菜Gracilaria lemaneiformis。
本发明的第一方面，一种从海藻中提取类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine的方法，所述的方法包括步骤：
浸提：将海藻洗净沥干后进行粉碎，然后将粉碎后的海藻在浓度为0.5-10.5％的氯化钠溶液中浸泡1-2h后捞出，得到首次浸提液；将捞出的海藻碎渣再用浓度60-80％的乙醇溶液中浸泡2-3h后捞出，得到二次浸提液；将所述首次浸提液和二次浸提液进行混合，得到混合浸提液；所述粉碎后的海藻、氯化钠溶液、乙醇溶液的质量比为1:8-15:5-15；
絮凝：在混合浸提液中加入壳聚糖，搅拌均匀，进行50-70分钟絮凝后，固液分离，得到除杂后浸提液；所述混合浸提液与所述壳聚糖的质量比为：10000:3-10；
过滤：将所述除杂后浸提液用超滤膜进行过滤，得到过滤液；所述过滤液用纳滤膜进行浓缩，得到5％-10％过滤液体积的浓缩液；
层析：将浓缩液上样ODS混合层析柱进行层析，洗脱液冲洗，HPLC跟踪监测，分别得到Porphyra-334纯化液和Shinorine纯化液；所述洗脱液为有机溶剂和pH为3.5-4.5缓冲溶液配置而成，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈以及丙酮中的一种或多种；
Porphyra-334浓缩：将所述Porphyra-334纯化液进行膜浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Porphyra-334浓缩物，将含Porphyra-334浓缩物加入3-8倍体积的丙酮，加热至45-55℃后，停止加热，降温结晶，降温至4℃，析出白色固体，将白色固体在45-55℃加热干燥，得到Porphyra-334无定型结晶物；
Shinorine浓缩：将所述Shinorine纯化液进行膜浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Shinorine浓缩物，将含Shinorine浓缩物加入3-8倍体积的乙醇或丙酮，加热至45-55℃后，停止加热，降温结晶，降温至4℃，析出白色固体，将白色固体45-55℃加热干燥，得到Shinorine无定型结晶物。
该技术方案能有效去除海藻中杂质，收率比传统的离子交换树脂高20-30％，工艺废水较少，可用于大规模工业化生产。整个工艺连续便捷，操作时间快速，不同于常规的减压加热浓缩会对产品稳定性造成影响，氧化产生色素造成品质影响干扰，对产品的质量起到保障作用。通过壳聚糖吸附去除大多数的金属离子和杂蛋白以及杂多糖成分，通过混合层析能有效解决去除小分子糖在普通层析柱上因极性MAAs差距小不好分离去除的缺点，从而使得MAAs中的Shinorine和Porphyra-334能有效纯化得到高纯度的单组份。
进一步地，所述海藻为红藻门海藻。
进一步地，所述过滤步骤，所述过滤步骤，所述超滤膜为聚醚砜材质，孔隙选择性2500Dal。
进一步地，所述层析步骤，所述混合层析柱的包括上部和下部，所述上部层析填料为硅胶，所述下部填料为十八烷基硅烷键合硅胶。
上部填料为硅胶可有效分离去除色素和有效的杂质，同时可以起到保护ODS材料使用寿命，硅胶材料一般使用5批次纯化左右就已经吸附很多色素杂质，同时柱效变差---洗脱液颜色加深。可以采取相反方向从ODS材料部分的层析柱底部逆向进80-90％乙醇洗脱液，进行活化洗脱层析柱，ODS层填料与硅胶层之间的筛板可以避免ODS材料上浮，直接冲洗掉硅胶层填料，使用时新的批次只需要新装填上部的硅胶层部分，这样可以避免色素从硅胶层洗到ODS层上，减少洗脱液用量，延长ODS填料层的使用寿命。
同时，用硅胶和ODS结合使用的方式在常规天然产物的分离纯化很少这么操作，发明人经过长期的实验后，结合Shinorine和Porphyra-334产品的特性，通过工艺开发和创新发现，本方案的层析方法会比传统的离子交换树脂层析+凝胶层析(实验室规模)操作上来的方便，快速，同时收率提高，而且废水量可以少50％以上，此外生产上使用的有机溶剂部分可以通过回收进行套用处理，废水可生化性好，而传统的离子交换树脂含有较高盐度，废水可生化较差，并且对于复杂的天然产物纯化使用过程中离子交换树脂的使用寿命有限，产生的固体废弃物较多。
进一步地，所述层析步骤，所述混合层析柱的上部与下部的高度比为4-5:5-6，所述混合层析柱的径高比为1:5-10。
进一步地，所述层析步骤，所述有机溶剂为甲醇。有机溶剂的优势顺序是甲醇＞乙醇＞异丙醇＞乙腈＞丙酮。用甲醇2-6％洗脱效果最好；
进一步地，所述缓冲溶液为浓度为0.05-0.1mol/L的乙酸铵缓冲溶液，乙酸调节乙酸铵缓冲溶液的pH为3.5-4.5。
缓冲液也可以用乙酸钠，磷酸+磷酸二氢钠缓冲体系，或者直接用乙酸调节的酸水，但实验表明以上缓冲条件，对于杂质的分离度不好，同时色素容易直接跟出，颜色比较深，会影响产物的纯度。而浓度为0.05-0.1mol/L，pH为3.5-4.5的乙酸铵缓冲溶液的洗脱效果最好，对杂质的分离度高，产物的纯度高。
进一步地，所述Porphyra-334浓缩步骤和Shinorine浓缩步骤，浓缩膜采用孔隙选择性300Dal的聚醚砜材质的纳滤膜。
采用纳滤膜可去除了海水中的氯化钠等无机盐成分。
进一步地，所述Porphyra-334浓缩和Shinorine浓缩步骤中，在4-10小时内，温度由45-55℃降低到4℃。液体的类菌胞素氨基酸容易发生氧化，色素加深，其在碱性环境不稳定，在酸性环境下相对稳定。从类菌胞素氨基酸结构，以及得到纯品的Shinorine和Porphyra-334组分进行的稳定性实验发现，在温度较高的环境放置，产品色素加深，成分发生不稳定的氧化，因此结晶过程的温度均控制在55℃以下。
本实施方式中，液相色谱条件HPLC-UV：检测波长：334nm；
色谱柱：Kromasil 100-5C18，5μm，4.6*250mm，流动相：0.1％乙酸水，流速0.8ml/min，柱温40℃；
Agilent ZORBAX SB-C18，5μm，4.6*250mm，流动相：30ml甲醇+970ml0.1％乙酸水，流速0.8ml/min，柱温40℃；
NMR条件：BRUKER 400M，氘水。
其中：实施例1材料红毛菜中Porphyra-334和Shinorine的含量分别占MAAs比例为：88.3％和10.0％；MAAs占提取物中的比例约5.5％。
在实施例2材料条斑紫菜中Porphyra-334和Shinorine的含量分别占MAAs比例为：63.1％和36.3％。MAAs占总提取物中的比例约4.9％。
以上材料采用《类菌胞素氨基酸(MAAs)Porphyra-334的提取及其新功能研究》提取方法(步骤为：取10g样品经过液氮冷冻粉碎前处理，然后在真空冷冻干燥机中进行干燥，计算失重，然后研磨成微细粉末状样品待测，测定的时候称量，用定量液体经过超声溶解后过滤去除固体，检测时过0.2um尼龙滤膜过滤，HPLC检测，计算)，紫外334nm检测下HPLC测定的含量比例。
实施例1：红毛菜中提取类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine
浸提：将从海水中捞起的红毛菜用干净海水洗净泥沙，沥干后进行粉碎，将粉碎后的红毛菜在8倍重量的5％氯化钠溶液中浸泡1h后捞出，得到首次浸提液；将捞出的碎渣用10倍重量的70％乙醇溶液浸泡3h后捞出，得到二次浸提液；将所述首次浸提液和二次浸提液进行混合，得到混合浸提液。
在浸提过程中，可以去除杂质、不溶物。用氯化钠进行浸提可以得到40％以上有效物质，经过第二次乙醇浸泡提起可以得到总量50％左右的有效成分。该浸提方式同时可以有效阻止多糖类和胶质类杂质的提取，在第二次浸提时混合了提取液，醇提取液还会沉淀去除一部分溶解在水相中的多糖和胶质类。
图1为实施例1红毛菜浸提液的HPLC检测图A，Kromasil 100-5C18柱条件，RTShinorine＝3.7min，RT Porphyra-334＝4.5min。MAAs两个主要物质Shinorine和Porphyra-334在紫外HPLC条件下的纯度示意图，由图可知，其中Shinorine占MAAs的7.0％，Porphyra-334占MAAs的89.8％。
图2为实施例1红毛菜浸提液的HPLC检测图B，Agilent ZORBAX SB-C18柱条件，RTShinorine＝3.8min，RT Porphyra-334＝5.7min。MAAs两个主要物质Shinorine和Porphyra-334在紫外不同色谱分析HPLC条件下的纯度示意图，由图可知，其中Shinorine占MAAs的14.2％，Porphyra-334占MAAs的75.0％。
图3为实施例1红毛菜混合浸提液NMR-H谱图。
图4为实施例1红毛菜混合浸提液NMR-C谱图。
图5为实施例1红毛菜混合浸提液NMR-DEPT谱图。
由图3-图5可知，混合浸提液中含有MAAs特征峰，也表明核磁峰较杂，含有糖类等干扰杂质。
絮凝：在混合浸提液中加入壳聚糖，搅拌均匀，进行60分钟絮凝后，固液分离，得到除杂后浸提液；所述混合浸提液与所述壳聚糖的质量比为10000:5；
混合浸提液中的含有的大分子蛋白质类、多糖和色素等物质在该过程中会被絮凝，去除。
过滤：将所述混合浸提液用2500Dal聚醚砜材质超滤膜进行过滤，得到过滤液；所述过滤液用300Dal聚醚砜材质纳滤膜进行浓缩，得到5％-10％过滤液体积的浓缩液；超滤膜去除2500Dal以上的大分子部分，纳滤膜可去除了海水中的氯化钠等无机盐成分。
层析：将浓缩液上样ODS混合层析柱进行层析，洗脱液冲洗，HPLC跟踪监测，分别得到Porphyra-334纯化液和Shinorine纯化液；所述洗脱液为5％甲醇和95％的pH为3.5-4.5的乙酸铵缓冲溶液(0.08mol/L)配置而成。所述混合层析柱的包括上部和下部，上部层析填料为硅胶，所述下部填料为十八烷基硅烷键合硅胶，上部与下部的高度比为5:5，所述混合层析柱的径高比为1:8。
图6为实施1红毛菜浓缩液经过层析后得到的洗脱液HPLC检测图(HPLC跟踪监测，跟踪样品1)，Kromasil 100-5C18柱条件，RT Porphyra-334＝5.8min，由图可知Porphyra-334的HPLC纯度为97％。
Porphyra-334浓缩：将Porphyra-334纯化液用300Dal的纳滤膜进行浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Porphyra-334浓缩物，将含Porphyra-334浓缩物一边加热一边搅拌加入5倍体积的丙酮，加热至50℃后，停止加热，继续搅拌并降温结晶，在8小时内降温至4℃，析出白色固体，固液分离得到固体，将白色固体45-55℃加热干燥，得到Porphyra-334无定型结晶物。
图7为实施例1Porphyra-334无定型结晶物的HPLC图，Agilent ZORBAX SB-C18柱条件，RTPorphyra-334＝4.5min，由图可知Porphyra-334的HPLC纯度为98.7％。
图9为实施例1的Porphyra-334无定型结晶物的NMR-H谱图。
图10为实施例1的Porphyra-334无定型结晶物的NMR-C谱图。
图11为实施例1的Porphyra-334无定型结晶物的NMR-DEPT谱图。
由图9-图11可见，Porphyra-334的MAAs特有结构特征峰，证明所得无定型晶体为Porphyra-334。
图12为实施例1的Porphyra-334无定型结晶物的200倍显微镜图，由图可以看出结晶成无定形状态，在显微镜观察过程中放置潮湿环境就易吸潮溶解。
Shinorine浓缩：将Shinorine纯化液用300Dal的纳滤膜进行浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Shinorine浓缩物，将含Shinorine浓缩物一边加热一边搅拌加入5倍体积的丙酮，加热至50℃后，停止加热，继续搅拌并降温结晶，在10小时内降温至4℃，析出白色固体，固液分离得到固体，将白色固体45-55℃加热干燥，得到Shinorine无定型结晶物。
图8为实施例1的Shinorine无定型结晶物的HPLC图，Agilent ZORBAX SB-C18柱条件，RT Shinorine＝3.6min，由图可知Shinorine的HPLC纯度为95.0％。
图13为实施例1的Shinorine无定型结晶物的200倍显微镜图，由图可以看出Shinorine结晶成无定形状态，在显微镜观察过程中放置潮湿环境就易吸潮溶解。
经过实施例1的方案提取一次纯化，纯度97％以上Porphyra-334的收率为81％，纯度为95％以上的Shinorine的收率为92％。
实施例2条斑紫菜中提取类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine
浸提：将从海水中捞起的条斑紫菜海水洗净泥沙沥干后进行粉碎，将粉碎后的条斑紫菜在浓度为3％的氯化钠溶液中浸泡2h后捞出，得到首次浸提液；将捞出的条斑紫菜碎渣再用浓度60％的乙醇溶液中浸泡2-3h后捞出，得到二次浸提液；将所述首次浸提液和二次浸提液进行混合，得到混合浸提液；所述粉碎后的条斑紫菜、氯化钠溶液、乙醇溶液的质量比为1:10:10。
图14为实施例2中条斑紫菜混合浸提液HPLC检测图，Kromasil 100-5C18柱条件，由图可知，RTShinorine＝4.1min，RT Porphyra-334＝5.9min。MAAs两个主要物质Shinorine和Porphyra-334在紫外HPLC条件下的纯度示意图，其中Shinorine占MAAs的36.6％，Porphyra-334占MAAs的61.1％。
絮凝：在混合浸提液中加入壳聚糖，搅拌均匀，进行50分钟絮凝后，固液分离，得到除杂后浸提液；所述混合浸提液与所述壳聚糖的质量比为10000:3；
过滤：将所述混合浸提液用2500Dal聚醚砜材质超滤膜进行过滤，得到过滤液；所述过滤液用300Dal聚醚砜材质纳滤膜进行浓缩，得到5％-10％过滤液体积的浓缩液；
层析：将浓缩液上样ODS混合层析柱进行层析，洗脱液冲洗，HPLC跟踪监测，分别得到Porphyra-334纯化液和Shinorine纯化液；所述洗脱液为6％甲醇和94％的0.1mol/L乙酸铵缓冲溶液(乙酸调节乙酸铵缓冲溶液的pH为3.5-4.5)配置而成。所述混合层析柱的包括上部和下部，上部层析填料为硅胶，所述下部填料为十八烷基硅烷键合硅胶，上部与下部的高度比为4:6，所述混合层析柱的径高比为1:10。
Porphyra-334浓缩：将Porphyra-334纯化液用300Dal的纳滤膜进行浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Porphyra-334浓缩物，将含Porphyra-334浓缩物一边加热一边搅拌加入3倍体积的丙酮，加热至45℃后，停止加热，继续搅拌并降温结晶，在12小时内降温至4℃，析出白色固体，固液分离得到固体，将白色固体45-55℃加热干燥，得到Porphyra-334无定型结晶物；
Shinorine浓缩：将Shinorine纯化液用300Dal的纳滤膜进行浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Shinorine浓缩物，将含Shinorine浓缩物一边加热一边搅拌加入8倍体积的丙酮，加热至55℃后，停止加热，继续搅拌并降温结晶，在4小时内降温至4℃，析出白色固体，固液分离得到固体，将白色固体45-55℃加热干燥，得到Shinorine无定型结晶物。
实施例3坛紫菜中提取类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine
浸提：将从海水中捞起的坛紫菜海水洗净泥沙沥干后进行粉碎，将粉碎后的坛紫菜在浓度为10.5％的氯化钠溶液中浸泡1h后捞出，得到首次浸提液；将捞出的海藻碎渣再用浓度80％的乙醇溶液中浸泡2h后捞出，得到二次浸提液；将所述首次浸提液和二次浸提液进行混合，得到混合浸提液；所述粉碎后的海藻、氯化钠溶液、乙醇溶液的质量比为1:8:15。
图15为实施例3中坛紫菜混合浸提液HPLC检测图，Agilent ZORBAX SB-C18柱条件，由图可知，RTShinorine＝3.6min，RTPorphyra-334＝4.5min。MAAs两个主要物质Shinorine和Porphyra-334在紫外HPLC条件下的纯度示意图，其中Shinorine占MAAs的33.9％，Porphyra-334占MAAs的63.9％。
絮凝：在混合浸提液中加入壳聚糖，搅拌均匀，进行70分钟絮凝后，固液分离，得到除杂后浸提液；所述混合浸提液与所述壳聚糖的质量比为：10000:3；
过滤：将所述混合浸提液用2500Dal聚醚砜材质超滤膜进行过滤，得到过滤液；所述过滤液用300Dal聚醚砜材质纳滤膜进行浓缩，得到5％-10％过滤液体积的浓缩液；
图16为实施例3中坛紫菜混合浸提液进行壳聚糖絮凝的现象，由图中可以看到蛋白质类和色素等物质被絮凝的现象，液体呈现清澈趋势。
层析：将浓缩液上样ODS混合层析柱进行层析，洗脱液冲洗，HPLC跟踪监测，分别得到Porphyra-334纯化液和Shinorine纯化液；所述洗脱液为5％的乙醇、3％丙酮和92％的pH为3.5-4.5浓度为0.05mol/L的乙酸铵缓冲溶液配制而成。
Porphyra-334浓缩：将Porphyra-334纯化液用300Dal的纳滤膜进行浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Porphyra-334浓缩物，将含Porphyra-334浓缩物一边加热一边搅拌加入5倍体积的丙酮，加热至55℃后，停止加热，继续搅拌并降温结晶，降温至4℃，析出白色固体，固液分离得到固体，将白色固体45-55℃加热干燥，得到Porphyra-334无定型结晶物；
Shinorine浓缩：将Shinorine纯化液用300Dal的纳滤膜进行浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Shinorine浓缩物，将含Shinorine浓缩物一边加热一边搅拌加入3倍体积的丙酮，加热至45℃后，停止加热，继续搅拌并降温结晶，降温至4℃，析出白色固体，固液分离得到固体，将白色固体45-55℃加热干燥，得到Shinorine无定型结晶物。
实施例4龙须菜中提取类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine
浸提：将从海水中捞起的龙须菜海水洗净泥沙沥干后进行粉碎，粉碎为宽度为1-5mm的碎渣，然后将粉碎后的龙须菜在浓度为0.5％的氯化钠溶液中浸泡2h后捞出，得到首次浸提液；将捞出的龙须菜碎渣再用浓度60％的乙醇溶液中浸泡3h后捞出，得到二次浸提液；将所述首次浸提液和二次浸提液进行混合，得到混合浸提液；所述粉碎后的龙须菜、氯化钠溶液、乙醇溶液的质量比为1:10:15；
图17为实施例4中龙须菜混合浸提液HPLC检测图，Agilent ZORBAX SB-C18柱条件，由图可知，RTShinorine＝3.6min，RT Porphyra-334＝4.4min。MAAs主要物质Shinorine在紫外HPLC条件下的纯度示意图，其中Shinorine占MAAs的63.0％。
絮凝：在混合浸提液中加入壳聚糖，搅拌均匀，进行70分钟絮凝后，固液分离，得到除杂后浸提液；所述混合浸提液与所述壳聚糖的质量比为10000:3；
过滤：将所述混合浸提液用2500Dal聚醚砜材质超滤膜进行过滤，得到过滤液；所述过滤液用300Dal聚醚砜材质纳滤膜进行浓缩，得到5％-10％过滤液体积的浓缩液；
层析：将浓缩液上样ODS混合层析柱进行层析，洗脱液冲洗，HPLC跟踪监测，分别得到Shinorine纯化液；所述洗脱液为3％异丙醇、5％乙腈和92％pH为3.5的乙酸铵缓冲溶液配置而成。所述混合层析柱的包括上部和下部，上部层析填料为硅胶，所述下部填料为十八烷基硅烷键合硅胶，上部与下部的高度比为4:5，所述混合层析柱的径高比为1:5。
Shinorine浓缩：将Shinorine纯化液用300Dal的纳滤膜进行浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Shinorine浓缩物，将含Shinorine浓缩物一边加热一边搅拌加入3-8倍体积的乙醇或丙酮，加热至45-55℃后，停止加热，继续搅拌并降温结晶，在4小时内降温至4℃，析出白色固体，固液分离得到固体，将白色固体45-55℃加热干燥，得到Shinorine无定型结晶物。
综上，经过本技术提取纯化操作，通过浸提、凝絮、过滤去除了大部分的杂质，过滤后得到浓缩液中所含MAAs占原料红藻总MAAs的90-94％，Porphyra-334和Shinorine的纯化得率分别为75％-81％和86％-92％。
目前，文献报道从海藻提取成分常常用干制品，有很多稳定性不好的成分如本案中的类菌胞素氨基酸会在晒制和烘干过程中存在降解的过程，同时产生结构类似的副产物杂质，本案结合实际工作经验选取了新鲜的海藻作为原材料能保障最佳的产品品质和产物收率，同时也不需要经过一些现有技术进行的脱脂操作，减少生产工艺步骤和成本，并且经过提取后的藻渣，进行后期的琼脂等大分子多糖制品的生产制备对其产品质量和品质不会产生影响，能够对海藻资源进行充分的加工和利用。
当然本发明并不排除在干制品经过水复泡后的红藻类材料进行提取MAAs和分离纯化的技术应用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (3)

1.一种从海藻中提取类菌胞素氨基酸Porphyra-334和Shinorine的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
浸提：将海藻洗净沥干后进行粉碎，然后将粉碎后的海藻在浓度为0.5-10.5％的氯化钠溶液中浸泡1-2h后捞出，得到首次浸提液；将捞出的海藻碎渣再用浓度60-80％的乙醇溶液中浸泡2-3h后捞出，得到二次浸提液；将所述首次浸提液和二次浸提液进行混合，得到混合浸提液；所述粉碎后的海藻、氯化钠溶液、乙醇溶液的质量比为1:8-15:5-15；
絮凝：在混合浸提液中加入壳聚糖，搅拌均匀，进行50-70分钟絮凝后，固液分离，得到除杂后浸提液；所述混合浸提液与所述壳聚糖的质量比为：10000:3-10；
过滤：将所述除杂后浸提液用超滤膜进行过滤，得到过滤液，所述超滤膜为聚醚砜材质，孔隙选择性2500Dal；所述过滤液用300Dal聚醚砜材质纳滤膜进行浓缩，得到5％-10％过滤液体积的浓缩液；
层析：将浓缩液上样ODS混合层析柱进行层析，洗脱液冲洗，HPLC跟踪监测，分别得到Porphyra-334纯化液和Shinorine纯化液，所述混合层析柱包括上部和下部，所述上部层析填料为硅胶，所述下部填料为十八烷基硅烷键合硅胶，上部与下部的高度比为4-5:5-6，所述混合层析柱的径高比为1:5-10；所述洗脱液为有机溶剂和浓度为0.05-0.1mol/L，pH为3.5-4.5的乙酸铵缓冲溶液配置而成，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈以及丙酮中的一种或多种；
Porphyra-334浓缩：将所述Porphyra-334纯化液采用孔隙选择性300Dal的聚醚砜材质的纳滤膜进行膜浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Porphyra-334浓缩物，将含Porphyra-334浓缩物加入3-8倍体积的丙酮，加热至45-55℃后，停止加热，降温结晶，降温至4℃，析出白色固体，将白色固体在45-55℃加热干燥，得到Porphyra-334无定型结晶物；
Shinorine浓缩：将所述Shinorine纯化液采用孔隙选择性300Dal的聚醚砜材质的纳滤膜进行膜浓缩，所得的浓缩物进行水洗，得到含Shinorine浓缩物，将含Shinorine浓缩物加入3-8倍体积的乙醇或丙酮，加热至45-55℃后，停止加热，降温结晶，降温至4℃，析出白色固体，将白色固体45-55℃加热干燥，得到Shinorine无定型结晶物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述海藻为红藻门海藻。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述层析步骤，所述有机溶剂为甲醇，所述甲醇在洗脱液中的质量百分比为2-6％。
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