CN108484438A - 一种从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法包括以下的步骤：S1：将紫菜粉末与pH值为2的水溶液按重量比为1∶8混合，然后在温度为45℃的条件下，提取2小时；S2：将步骤S1的提取液进行离心，取上层清液，加入乙醇溶液进行沉淀，在温度为‑20‑0℃的条件下，冷冻2‑10小时；S3：将步骤S2的冷冻液进行离心，取上层清液，除去乙醇，冷冻干燥，得到类菌胞素氨基酸。本发明所提供的从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法，步骤简单，通过该方法所获得的类菌胞素氨基酸溶液的类菌胞素氨基酸含量高，而且该方法成本低、适合工业化生产。本发明所提取的类菌胞素氨基酸在弱酸、日光直射、暗室、低温及室温等条件下具有良好的稳定性。

Description

一种从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，主要涉及一种从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法。

背景技术

紫外线的天然来源是太阳光，阳光中紫外线是波长为200-400nm的电磁波，对人类而言，适量的紫外线照射可以灭菌消毒、增强人的体质，但过量的紫外辐射会对人体产生危害。根据波长的大小，紫外线可分为三个区段，即短波紫外线(UVC，200-280nm)、中波紫外线(UVB，280-310nm)和长波紫外线(UVA，315-400nm)。大量研究表明280-310nm的UVB和315-400nm的UVA辐射不仅能穿透自然水体到达20米的深度，严重威胁到南极地区的植物的生活，对地球气候，生态环境特别是人类健康的影响也很大。长时间的太阳光紫外线辐射能使皮肤灼伤，出现红肿、水泡、炎症和皮肤过早老化等症状，当紫外线达皮肤真皮甚至更深处时会损害皮肤的DNA和蛋白质，最后导致色素斑、黑斑、老人斑及皱纹等。严重的还会导致皮肤肿瘤和皮肤癌的发生。由此可见，UVB和UVA对人体的伤害是不容忽视的。因此，抗紫外线辐射物质研究日益受到人们广泛的关注。

目前使用的抗紫外线物质主要分为物理性和化学性两大类，物理性抗紫外剂是通过散射作用减少紫外线对皮肤的伤害，如高岭土和氧化锌等，使用这种防晒剂不仅具有用量大、防晒效果差等缺点，还容易堵塞毛孔。化学性抗紫外剂主要是通过人工合成的方法得到，主要包括二苯酮类化合物、肉桂酸酯类、水杨酸酯类等。这些化合物应用在化妆品中也有着不尽人意的缺点，它们一般对皮肤具有刺激性、易引起皮肤过敏、用量较大、某些种类吸收剂还会因吸收紫外线能量而产生对人体有害的小分子物质，存在致癌风险。而天然抗紫外线物质可吸收照射至真皮层中的紫外线，以保护真皮层中的胶原和弹性蛋白，具有无毒无刺激等优点，还具备清除氧自由基的功效，延缓皮肤衰老。

类菌胞素氨基酸(Mycosporine-Like Amino Acids)最初是由Leach于1965年在真菌中首先发现，此后相继在多种水生生物中发现。类菌胞素氨基酸是以环己烯酮为基本骨架，与不同类型氨基酸通过胺缩合作用形成的一大类小分子、水溶性化合物。由于共轭双键和侧链上不同活性基团的影响，在310-360nm的紫外光区具有强的吸收能力。类菌胞素氨基酸吸收紫外光后，会以热的形式散发，而不分解产生新的化学物质。因此，类菌胞素氨基酸是天然且安全无害的防辐射剂。

紫菜除了具有种类多，价格低廉、容易获得等优点外，还含有一些天然抗紫外线活性物质类菌孢素氨基酸。经研究发现，紫菜中含具有抗紫外线辐射的类菌孢素氨基酸的种类是Porphyra-334和Shionrine。Porphyra-334和Shionrine都不产生自由基和荧光，它们不仅能有效地吸收紫外光辐射，还能将吸收的能量散发掉而不传递给敏感的生物分子，且不能形成造成氧胁迫的活性氧分子。

目前，从紫菜中制备类菌胞素氨基酸主要有两种方法，一种是通过极性溶液提取之后采用高效液相色谱法制备，一种是采用甲醇溶液提取后，经过简单纯化后，再使用硅胶柱进行纯化，这两种方法得率低，产量很少，都不能应用于大量的制备类菌胞素氨基酸。

发明内容

为了克服现有技术中的不足，本发明提供一种从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法。该方法所获得的类菌胞素氨基酸溶液的类菌胞素氨基酸含量高，而且该方法成本低、适合工业化生产。

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

一种从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法包括以下的步骤：

S1：将紫菜粉末与pH值为2的水溶液按重量比为1∶8混合，然后在温度为45℃的条件下，提取2小时；

S2：将步骤S1的提取液进行离心，取上层清液，加入乙醇溶液进行沉淀，在温度为-20-0℃的条件下，冷冻2-10小时；

S3：将步骤S2的冷冻液进行离心，取上层清液，除去乙醇，干燥冷冻，得到类菌胞素氨基酸。

优选的，所述紫菜粉末的制备方法包括以下步骤：将紫菜用搅拌机粉碎后，经20-60目筛过筛，制得紫菜粉末。

优选的，所述步骤S2包括将步骤S1的提取液进行离心，取上层清液，加入乙醇溶液，至混合液中乙醇的质量浓度为80％，进行沉淀，在温度为-20℃的条件下，冷冻2小时，使蛋白质，核酸及其他大分子变性沉淀。

优选的，所述步骤S3包括将步骤S2的冷冻液进行离心，取上层清液，在旋转蒸发器蒸发，除去乙醇，干燥冷冻，得到类菌胞素氨基酸。

优选的，一种从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法还包括以下步骤：

S4：纯化类菌胞素氨基酸

取步骤S3制得的类菌胞素氨基酸，加入水溶解，并用45μm无机膜过滤。

本发明的有益效果：

1、本发明所提供的从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法，步骤简单，通过该方法所获得的类菌胞素氨基酸溶液的类菌胞素氨基酸含量高，而且该方法成本低、适合工业化生产；

2、本发明所提取的类菌胞素氨基酸在弱酸、日光直射、暗室、低温及室温等条件下具有良好的稳定性。

附图说明

图1是本发明实施例1所提取的类菌胞素氨基酸溶液的紫外扫描图谱；

图2是本发明实施例1所提取的类菌胞素氨基酸溶液的总离子流图(TIC)；

图3是图2中峰1含有的化合物A的一级质谱图；

图4是图2中峰1含有的化合物A的二级质谱图；

图5是图2中峰2含有的化合物B的一级质谱图；

图6是图2中峰2含有的化合物B的二级质谱图；

图7是不同pH值对类菌胞素氨基酸稳定性的影响效果图；

图8是不同光照条件对类菌胞素氨基酸稳定性的影响效果图；

图9是不同温度对类菌胞素氨基酸稳定性的影响效果图。

具体实施方式

下面通过具体较佳实施例结合效果试验例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。

实施例1

一种从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法包括以下的步骤：

S1：将紫菜用搅拌机粉碎后，经20-60目筛过筛，制得紫菜粉末；再将紫菜粉末与pH值为2的水溶液按重量比为1∶8混合，然后在温度为45℃的条件下，提取2小时；

S2：将步骤S1的提取液进行离心，取上层清液，加入乙醇溶液，至混合液中乙醇的质量浓度为80％，进行沉淀，在温度为-20℃的条件下，冷冻2小时；

S3：将步骤S2的冷冻液进行离心，取上层清液，在旋转蒸发器蒸发，除去乙醇，干燥冷冻，得到类菌胞素氨基酸。

实施例2

一种从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法包括以下的步骤：

S1：将紫菜用搅拌机粉碎后，经20-60目筛过筛，制得紫菜粉末；再将紫菜粉末与pH值为2的水溶液按重量比为1∶8混合，然后在温度为45℃的条件下，提取2小时；

S2：将步骤S1的提取液进行离心，取上层清液，加入乙醇溶液，至混合液中乙醇的质量浓度为80％，进行沉淀，在温度为0℃的条件下，冷冻10小时；

S3：将步骤S2的冷冻液进行离心，取上层清液，在旋转蒸发器蒸发，除去乙醇，干燥冷冻，得到类菌胞素氨基酸；

S4：纯化类菌胞素氨基酸

取步骤S3制得的类菌胞素氨基酸，加入水溶解，并用45μm无机膜过滤。

效果试验例1

类菌胞素氨基酸的种类及其含量的测定

试验方法：

1、取实施例1所提取的类菌胞素氨基酸的水溶液，采用紫外可见分光光度计测定其在200-780nm波长的吸光值，确定其最大紫外吸收波长。试验结果见图1。

2、取实施例1所提取的类菌胞素氨基酸的水溶液通过液相色谱-质谱联用仪分析，确定类菌胞素氨基酸的种类及类菌胞素氨基酸的含量。液相色谱的条件为：色谱柱：ODS-C18柱(5μm，250×4mm I.D)；流动相：10％甲醇+90％乙酸溶液(乙酸浓度0.2％)；流速1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：1μl。试验结果见表1及图2-6。

表1类菌胞素氨基酸溶液液相色谱-质谱试验结果

(注：表1的具体数据对应图2。)

从图1可以看出，实施例1所提取的类菌胞素氨基酸的紫外吸收最大吸收波长λ_max＝334nm。已知类菌胞素氨基酸中Shionrine和Porphyra-334两者的最大吸收波长λ_max＝334nm，由此可推断实施例1所提取的类菌胞素氨基酸的种类为Shionrine和Porphyra-334。

从图4可以看出，峰1含有的化合物A对应的分子离子峰[M+H]⁺为347，其二级质谱和已知的Porphyra-334二级质谱完全一致。因此，结合前面所述的紫外可见光光谱的信息，可确定化合物A结构为Porphyra-334。

从图6可以看出，峰2含有的化合物B对应的分子离子峰[M+H]⁺为333，化合物B的分子量比化合物A少14，结合图5(化合物B的一级质谱图)和已知的Shinorine一级质谱、二级质谱，可确定化合物B的结构为Shinorine。

从表1和图2可以看出，实施例1所提取的类菌胞素氨基酸的中Porphyra-334和Shinorine对应的出峰时间分别为4.326min和6.095min，各峰对应的百分含量分别为19.529％和19.911％。

效果试验例2

类菌胞素氨基酸稳定性的测定

分别测定不同pH值、光照、温度对类菌胞素氨基酸稳定性的影响。

1、pH值对类菌胞素氨基酸稳定性的影响：

测试pH值4.0-9.0对类菌胞素氨基酸稳定性的影响

试验方法：配置0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液，在精密pH计下，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液和磷酸调节配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的系列缓冲溶液。往不同pH值的缓冲溶液中加入实施例1所提取的类菌胞素氨基酸使其含量为0.05％，分别测试各溶液在波长为334nm处的吸光度。试验结果见表2和图7。

表2 pH值对类菌胞素氨基酸稳定性的影响

从表2及图7可以看出，实施例1所提取的类菌胞素氨基酸在微酸(pH值为5.5-6.0)的环境下具有较好的稳定性。随着酸性或碱性的增强，稳定性有下降的趋势。

2、光照对类菌胞素氨基酸稳定性的影响：

测试紫外灯照射、室内自然光和避光三个条件光照对类菌胞素氨基酸稳定性的影响

试验方法：取实施例1所提取的类菌胞素氨基酸配制成含量为0.05％的类菌胞素氨基酸溶液500mL，平行分为三组，一组置于紫外灯箱中照射，一组置于室内避免阳光直射，一组置于暗室，每隔1h分别取样测试其在波长为334nm处吸光度。试验结果见表3和图8。

表3光照对类菌胞素氨基酸稳定性的影响

从表3及图8可以看出，实施例1所提取的类菌胞素氨基酸在自然光照射10h吸光度略微下降，吸光度为0.883；在暗室保存10h后吸光度为9.05。说明本发明所提取的类菌胞素氨基酸在自然光和暗室中均均有较好的稳定性。而紫外灯直射对类菌胞素氨基酸有明显的破坏作用。

3、温度对类菌胞素氨基酸稳定性的影响：

测试三个不同温度(-20℃、25℃、48℃)对类菌胞素氨基酸稳定性的影响

试验方法：配制含0.2％卡松的防腐剂水溶液，再向配置好的防腐剂水溶液中实施例1所提取的类菌胞素氨基酸使其含量为0.05％，平均分成三份，分别放置温度为-20℃、25℃、48℃条件下保存2个月，每隔一段时间分别取样测试在波长为334nm处吸光度。试验结果见表4和图9。

表4温度对类菌胞素氨基酸稳定性的影响

从表4及图9可以看出，实施例1所提取的类菌胞素氨基酸在低温(-20℃)下保存吸光度基本不变，在常温下保存56d吸光度下降了9.4％，在48℃下保存56d吸光度下降了28.3％。说明本发明提取的类菌胞素氨基酸在低温或室温条件下具有较好的稳定，随着温度的升高，稳定性会逐渐下降。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种从紫菜中提取类菌胞素氨基酸的方法，其特征在于，包括以下的步骤：

S1：将紫菜粉末与pH值为2的水溶液按重量比为1∶8混合，然后在温度为45℃的条件下，提取2小时；

S2：将步骤S1的提取液进行离心，取上层清液，加入乙醇溶液进行沉淀，在温度为-20-0℃的条件下，冷冻2-10小时；

S3：将步骤S2的冷冻液进行离心，取上层清液，除去乙醇，干燥冷冻，得到类菌胞素氨基酸。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述紫菜粉末的制备方法包括以下步骤：将紫菜用搅拌机粉碎后，经20-60目筛过筛，制得紫菜粉末。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2包括将步骤S1的提取液进行离心，取上层清液，加入乙醇溶液，至混合液中乙醇的质量浓度为80％，进行沉淀，在温度为-20℃的条件下，冷冻2小时。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S3包括将步骤S2的冷冻液进行离心，取上层清液，在旋转蒸发器蒸发，除去乙醇，干燥冷冻，得到类菌胞素氨基酸。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：

S4：纯化类菌胞素氨基酸

取步骤S3制得的类菌胞素氨基酸，加入水溶解，并用45μm无机膜过滤。