CN115286531A - 一种石花菜中类菌孢素氨基酸porphyra-334的分离纯化方法 - Google Patents
一种石花菜中类菌孢素氨基酸porphyra-334的分离纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种石花菜中类菌孢素氨基酸porphyra‑334的分离纯化方法，目前国内外尚无该MAA标准品的供应。基于此，本发明专利研究石花菜中porphyra‑334的分离纯化，不仅能填补国内外相应领域的研究空白，而且将为大型海藻源MAA的开发提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于海洋生化工程领域，具体涉及大型海藻中一种类菌孢素氨基酸porphyra-334的分离纯化。
背景技术
石花菜(Gelidium amansii)分布广泛，是一种世界性的大型红藻。我国沿海石花菜资源丰富，北起辽东半岛，南到台湾沿海。石花菜具有良好的降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化等作用，在生物制品领域有着良好的应用前景。目前，国内外对于石花菜的研究主要集中在其提取物药理作用和化学组成等方面，发现石花菜中存在多糖、多酚、黄酮和其它等活性物质。然而，对石花菜活性物质的研究并不深入，很多活性物质的结构尚未被明确，这极大限制了石花菜的高价值利用和开发。
类菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acids)是一类小分子、水溶性化合物，在310-360nm紫外光区具有强的吸收特性，其骨架为氨基环己烯酮或氨基环己烯胺的环状结构，通过连接不同种类的氨基酸缩合而成。目前已鉴定结构的MAAs有20多种，例如，asterina-330、mycosporine-glycine、 porphyra-334和shinorine等。报道指出，很多大型海藻都能产生一种或几种 MAAs。在刺状鱼栖苔(Acanthophora specifera)、麒麟菜(Eucheuma cottonii) 和江蓠(Gracilaria chilensi)等多种大型海藻中都发现了MAAs。前期研究中，我们发现石花菜也存在MAAs，且MAAs提取物中porphyra-334含量较高。porphyra-334是已被证明具有抗氧化、抗紫外辐射和保湿等多种生理活性的一种MAA，然而，目前国内外尚无该MAA标准品的供应。基于此，本发明专利研究石花菜中porphyra-334的分离纯化，不仅能填补国内外相应领域的研究空白，而且将为大型海藻源MAA的开发提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石花菜中类菌孢素氨基酸porphyra-334的分离纯化方法，本发明不仅能填补国内外相应领域的研究空白，而且将为大型海藻源MAA的开发提供技术支撑。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种石花菜中类菌孢素氨基酸porphyra-334的分离纯化方法，所述方法包括如下步骤：
(1)石花菜干粉末加入到15％甲醇水溶液中(固液比1:10)，30℃下浸提30min，重复浸提2次，合并浸提液。浸提液减压蒸发后，冷冻离心10min，获得上清液。上清液于-20℃下加入氯仿水溶液(氯仿/蒸馏水＝25/75，v/v) 沉淀4h，4℃离心10min，保留上清液。沉淀用蒸馏水清洗3次，此洗涤液与上述获得的上清液合并，再次减压蒸发蒸干，制备到MAAs提取物；
(2)MAAs提取物用蒸馏水溶解后，将pH调整为3.0，加载于硅胶柱层析上，以乙醇/水(21:3)为洗脱剂，洗脱3倍柱体积。减压蒸干，得到组分F1。将组分F1重新溶解于15％甲醇水溶液中，进行MAAs检测，在硅胶板上呈现了黄色斑点；
(3)采用Dowex50W×8阳离子交换柱层析，依次以0.1M氯化钠、0.2M 氯化钠、0.4M氯化钠和0.6M氯化钠为洗脱剂，对组分F1浓缩液进行分离。每种洗脱剂洗脱3倍柱体积后，换用下一种洗脱剂。在洗脱剂为0.1M氯化钠、 0.2M氯化钠和0.4M氯化钠时，依次得到分离组分F11、F12和F13。MAAs 检测时，仅分离组分F12呈现了黄色斑点。将该分离组分减压浓缩、透析，减压蒸干，得到馏分G；
(4)将该馏分G溶解于15％甲醇水溶液中，采用Sephadex LH-20凝胶柱层析进行纯化，以15％甲醇水溶液为洗脱溶剂，洗脱3倍柱体积。洗脱溶液减压蒸干后，得到样品G1。经高效液相色谱检测，样品G1主要洗脱峰的停留时间为6.72min。结构鉴定表明，样品G1是porphyra-334。
附图说明
图1为组分F1的MAAs检测结果；
图2为组分F1的Dowex50W×8阳离子交换柱层析分离；
图3为样品G1的高效液相色谱图；
图4为石花菜中porphyra-334的分离纯化流程。
具体实施方式
将石花菜干粉末加入到15％甲醇水溶液中(固液比1:10)，30℃下浸提30 min，重复浸提2次，浸提液合并。浸提液60℃下减压蒸发后，冷冻离心10min，获得上清液。上清液于-20℃下加入氯仿水溶液(氯仿/蒸馏水＝25/75，v/v) 沉淀4h，4℃离心10min，保留上清液。沉淀用蒸馏水清洗3次，此洗涤液与上述获得的上清液合并，60℃下减压蒸干，制备到MAAs提取物。MAAs提取物用蒸馏水溶解，配制浓度为5g/L。将此MAAs水溶液pH调整为3.0后，加载于硅胶柱层析上，以乙醇/水(21:3)为洗脱剂。洗脱3倍柱体积，得到组分F1。减压浓缩后，组分F1进行MAAs检测。将组分F1浓缩液点样在硅胶G 板上，展开剂为乙醇/水(7:3，v/v)。展开结束后，吹干G板，喷洒碘化秘钾试剂(7.3g碘化铋钾，冰醋酸10mL，蒸馏水60mL)，静置后，呈现黄色或橙色斑点为porphyra-334的阳性反应。组分F1在硅胶板上呈现了黄色斑点。在此基础上，采用Dowex50W×8阳离子交换柱层析，对组分F1进行分离。依次以0.1M氯化钠、0.2M氯化钠、0.4M氯化钠和0.6M氯化钠为洗脱剂，每种洗脱剂洗脱3倍柱体积后，换用下一种洗脱剂。在洗脱剂为0.1M氯化钠、 0.2M氯化钠和0.4M氯化钠时，依次得到分离组分F11、F12和F13。减压浓缩后，将此3个分离组分进行MAAs检测。结果表明，仅分离组分F12呈现了黄色斑点。将该分离组分于室温、搅拌下透析24h后(每隔6h换水1次)，减压蒸干，得到馏分G。将该馏分G溶解于15％甲醇水溶液中，以15％甲醇水溶液为洗脱剂，采用SephadexLH-20凝胶柱层析进行纯化，洗脱3倍柱体积，减压蒸干后，得到样品G1。结构鉴定表明，样品G1是porphyra-334。
实施例1
将石花菜1000g干粉末加入到10L 15％甲醇水溶液中(固液比1:10)， 30℃下浸提30min，重复浸提2次，浸提液合并。浸提液60℃下减压蒸发后，冷冻离心10min，获得上清液。上清液于-20℃下加入氯仿水溶液(氯仿 /蒸馏水＝25:75，v/v)沉淀4h，4℃离心10min，保留上清液。沉淀用蒸馏水清洗3次，此洗涤液与上述获得的上清液合并，60℃下减压蒸干，制备到 MAAs提取物86.43g。MAAs提取物用蒸馏水溶解，配制浓度为5g/L。将此MAAs 水溶液pH调整为3.0后，加载于硅胶柱层析上(5.0cm×40cm，200-300目)，以乙醇/水(21:3)为洗脱剂，洗脱3倍柱体积。60℃下减压蒸干，得到7.85 g组分F1。将组分F1重新溶解于15％甲醇水溶液中，点样在硅胶G板上，展开剂为乙醇/水(7:3，v/v)。展开结束后，吹干G板，喷洒碘化秘钾试剂(7.3g 碘化铋钾，冰醋酸10mL，蒸馏水60mL)，静置后，呈现黄色或橙色斑点为porphyra-334的阳性反应。组分F1在硅胶板上呈现了黄色斑点。在此基础上，采用Dowex50W×8阳离子交换柱层析(3.0cm×30cm，200-300目)，对组分 F1进行分离。依次以0.1M氯化钠、0.2M氯化钠、0.4M氯化钠和0.6M氯化钠为洗脱剂，每种洗脱剂洗脱3倍柱体积后，换用下一种洗脱剂。在洗脱剂为0.1M氯化钠、0.2M氯化钠和0.4M氯化钠时，依次得到分离组分F11、F12和F13。减压浓缩后，将此3个分离组分进行MAAs检测。结果表明，仅分离组分F12呈现了黄色斑点。将该分离组分于室温、搅拌下透析24h后(每隔6h换水1次)，减压蒸干，得到0.861g馏分G。将该馏分G溶解于15％甲醇水溶液中，以15％甲醇水溶液为洗脱剂，采用Sephadex LH-20凝胶柱层析(2.0 cm×20cm)进行纯化，洗脱3倍柱体积，减压蒸干后，得到11.7mg样品G1。经高效液相色谱检测，样品G1主要洗脱峰的停留时间为6.70min(归一化含量超过85％)。结构鉴定表明，样品G1是porphyra-334。
实施例2
将石花菜2000g干粉末加入到20L 15％甲醇水溶液中(固液比1:10)， 30℃下浸提30min，重复浸提2次，浸提液合并。浸提液60℃下减压蒸发后，冷冻离心10min，获得上清液。上清液于-20℃下加入氯仿水溶液(氯仿 /蒸馏水＝25:75，v/v)沉淀4h，4℃离心10min，保留上清液。沉淀用蒸馏水清洗3次，此洗涤液与上述获得的上清液合并，60℃下减压蒸干，制备到 MAAs提取物190.8g。MAAs提取物用蒸馏水溶解，配制浓度为5g/L。将此MAAs 水溶液pH调整为3.0后，加载于硅胶柱层析上(5.0cm×40cm，200-300目)，以乙醇/水(21:3)为洗脱剂，洗脱3倍柱体积。60℃下减压蒸干，得到17.85 g组分F1。将组分F1重新溶解于15％甲醇水溶液中，点样在硅胶G板上，展开剂为乙醇/水(7:3，v/v)。展开结束后，吹干G板，喷洒碘化秘钾试剂(7.3g 碘化铋钾，冰醋酸10mL，蒸馏水60mL)，静置后，呈现黄色或橙色斑点为porphyra-334的阳性反应。组分F1在硅胶板上呈现了黄色斑点。在此基础上，采用Dowex50W×8阳离子交换柱层析(3.0cm×30cm，200-300目)，对组分 F1进行分离。依次以0.1M氯化钠、0.2M氯化钠、0.4M氯化钠和0.6M氯化钠为洗脱剂，每种洗脱剂洗脱3倍柱体积后，换用下一种洗脱剂。在洗脱剂为0.1M氯化钠、0.2M氯化钠和0.4M氯化钠时，依次得到分离组分F11、F12和F13。减压浓缩后，将此3个分离组分进行MAAs检测。结果表明，仅分离组分F12呈现了黄色斑点。将该分离组分于室温、搅拌下透析24h后(每隔6h换水1次)，减压蒸干，得到1.044g馏分G。将该馏分G溶解于15％甲醇水溶液中，以15％甲醇水溶液为洗脱剂，采用Sephadex LH-20凝胶柱层析(2.0 cm×20cm)进行纯化，洗脱3倍柱体积，减压蒸干后，得到21.5mg样品G1。经高效液相色谱检测，样品G1主要洗脱峰的停留时间为6.72min(归一化含量超过85％)。结构鉴定表明，样品G1是porphyra-334。
实施例3
将石花菜5000g干粉末加入到50L 15％甲醇水溶液中(固液比1:10)， 30℃下浸提30min，重复浸提2次，浸提液合并。浸提液60℃下减压蒸发后，冷冻离心10min，获得上清液。上清液于-20℃下加入氯仿水溶液(氯仿 /蒸馏水＝25:75，v/v)沉淀4h，4℃离心10min，保留上清液。沉淀用蒸馏水清洗3次，此洗涤液与上述获得的上清液合并，60℃下减压蒸干，制备到 MAAs提取物487.3g。MAAs提取物用蒸馏水溶解，配制浓度为5g/L。将此MAAs 水溶液pH调整为3.0后，加载于硅胶柱层析上(5.0cm×40cm，200-300目)，以乙醇/水(21:3)为洗脱剂，洗脱3倍柱体积。60℃下减压蒸干，得到45.37 g组分F1。将组分F1重新溶解于15％甲醇水溶液中，点样在硅胶G板上，展开剂为乙醇/水(7:3，v/v)。展开结束后，吹干G板，喷洒碘化秘钾试剂(7.3g 碘化铋钾，冰醋酸10mL，蒸馏水60mL)，静置后，呈现黄色或橙色斑点为porphyra-334的阳性反应。组分F1在硅胶板上呈现了黄色斑点。在此基础上，采用Dowex50W×8阳离子交换柱层析(3.0cm×30cm，200-300目)，对组分 F1进行分离。依次以0.1M氯化钠、0.2M氯化钠、0.4M氯化钠和0.6M氯化钠为洗脱剂，每种洗脱剂洗脱3倍柱体积后，换用下一种洗脱剂。在洗脱剂为0.1M氯化钠、0.2M氯化钠和0.4M氯化钠时，依次得到分离组分F11、F12和F13。减压浓缩后，将此3个分离组分进行MAAs检测。结果表明，仅分离组分F12呈现了黄色斑点。将该分离组分于室温、搅拌下透析24h后(每隔6h换水1次)，减压蒸干，得到2.755g馏分G。将该馏分G溶解于15％甲醇水溶液中，以15％甲醇水溶液为洗脱剂，采用Sephadex LH-20凝胶柱层析(2.0 cm×20cm)进行纯化，洗脱3倍柱体积，减压蒸干后，得到46.3mg样品G1。经高效液相色谱检测，样品G1主要洗脱峰的停留时间为6.74min(归一化含量超过85％)。结构鉴定表明，样品G1是porphyra-334。
Claims (2)
1.一种石花菜中类菌孢素氨基酸porphyra-334的分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)石花菜干粉末加入到15％甲醇水溶液中(固液比1:10)，30℃下浸提30min，重复浸提2次，合并浸提液；浸提液减压蒸发后，冷冻离心10min，获得上清液；上清液于-20℃下加入氯仿水溶液沉淀4h，4℃离心10min，保留上清液，沉淀用蒸馏水清洗3次，此洗涤液与上述获得的上清液合并，再次减压蒸发蒸干，制备到MAAs提取物；
(2)MAAs提取物用蒸馏水溶解后，将pH调整为3.0，加载于硅胶柱层析上，以乙醇/水为洗脱剂洗脱；减压蒸干，得到组分F1；将组分F1重新溶解于15％甲醇水溶液中，进行MAAs检测，在硅胶板上呈现了黄色斑点；
(3)采用Dowex50W×8阳离子交换柱层析，依次以0.1M氯化钠、0.2M氯化钠、0.4M氯化钠和0.6M氯化钠为洗脱剂，对组分F1浓缩液进行分离；在洗脱剂为0.1M氯化钠、0.2M氯化钠和0.4M氯化钠时，依次得到分离组分F11、F12和F13。MAAs检测时，仅分离组分F12呈现了黄色斑点；将该分离组分减压浓缩、透析，减压蒸干，得到馏分G；
(4)将该馏分G溶解于15％甲醇水溶液中，采用Sephadex LH-20凝胶柱层析进行纯化，以15％甲醇水溶液为洗脱溶剂，洗脱3倍柱体积。洗脱溶液减压蒸干后，得到样品G1porphyra-334。
2.根据权利要求1所述的一种石花菜中类菌孢素氨基酸porphyra-334的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤1中氯仿水溶液为氯仿与蒸馏水的体积比为25：75。
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