CN112321742A - 一种云芝胞外多糖的分离纯化及其结构表征 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种云芝胞外多糖的制备方法，包括云芝多糖的提取、分离纯化及其结构表征。以云芝菌丝体培养液为原料，经过水提醇沉，脱色等一系列提取步骤；再经过DEAE‑52纤维素阴离子交换柱和超滤进一分离纯化得到一种新的云芝胞外多糖；最后使用HPLC、红外光谱、核磁共振氢谱对上述得到的云芝胞外多糖进行结构表征。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种云芝胞外多糖的制备方法，包括云芝多糖的提取、分离纯化及其结构表征。
背景技术
云芝，又称为采绒革盖菌、千层蘑、彩云革盖菌等，属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，多孔菌目，多孔菌科，栓菌属。云芝是一种大型腐生药用真菌，在我国主要生长在东北林区。现收录于《中国药典》一部中，功效为健脾利湿，清热解毒，用于湿热黄疸，胁痛，纳差，倦怠乏力。
云芝中含有多种化学成分，如多糖、多糖肽、蛋白质、氨基酸、脂肪、无机盐和生物碱等成分，还有各种酶类物质。云芝一种重要的活性成分为云芝多糖，按其在云芝细胞中的位置可分为胞内多糖和胞外多糖。胞内多糖一般为含蛋白质的糖肽，胞外多糖一般为不含肽的葡聚糖。
按照提取原料不同，云芝多糖主要分为三类：一是从云芝子实体中提取的多糖；二是经云芝深层发酵菌丝体中提取分离获得云芝多糖或云芝多糖肽；三是云芝菌株在菌丝体内积累多糖的同时向培养液中分泌的胞外多糖。目前云芝多糖的研究侧重于子实体多糖和发酵菌丝体多糖的结构和药理药效研究，但已有研究表明，以云芝菌丝体培养液为原料提取的云芝胞外多糖的药理活性同样值得深入研究，如抗肿瘤、治疗肝病、提高机体免疫能力等作用，对于临床用药治疗意义重大，具有广泛的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于以云芝菌丝体培养液冻干粉为原料，提取、分离纯化得到一种新的云芝胞外多糖，并对其进行结构表征。
为了实现上述发明，本发明提供以下技术方案：
本发明的一种云芝胞外多糖的提取方法，包括以下的步骤：
(1)本发明的提取原料为云芝菌丝体培养液冻干粉，由云芝菌丝体培养液经终浓度为60％-90％的乙醇醇沉得到沉淀再经喷雾干燥制备得到。
(2)水提：称量云芝菌丝体培养液冻干粉，按质量比1∶12-1∶18加入蒸馏水，于50℃-80℃下浸提过滤2-3次，然后合并浸提液并浓缩至原体积的1/3-1/5。
(3)脱色：用终浓度为1％-6％过氧化氢将上述浓缩提取液室温下搅拌脱色2h-4h。
(4)醇沉：上述脱色完成的溶液，用终浓度为60％-80％的乙醇醇沉得到沉淀，沉淀用蒸馏水复溶，再次离心得到水复溶的上清液。
(5)二次醇沉：将上述上清液，二次用终浓度为60％-80％的乙醇醇沉，离心得到沉淀。
(6)透析：沉淀用0.4mol/L-0.8mol/L硝酸钠溶液溶解，溶解后置入截流分子量为3500Da的透析袋中，透析24h-48h。
(7)冻干：将透析袋中的溶液取出，旋蒸浓缩后真空冷冻干燥24h-48h得到云芝胞外粗多糖。
本发明的一种云芝胞外多糖的分离纯化方法，包括以下的步骤：
(1)DEAE-52纤维素阴离子交换柱纯化：上述提取的云芝胞外粗多糖用DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5mL/min-2mL/min，收集洗脱液，然后浓缩、真空冷冻干燥，得到蒸馏水洗脱的组分。
(2)超滤：将上述洗脱冻干样品用0.4mol/L-0.8mol/L硝酸钠溶液溶解，使用截流分子量为3500Da的超滤管，以5000rpm的转速离心超滤15-60min，超滤上层补加蒸馏水，重复上诉超滤操作2-6次，收集超滤上层的样品，真空冷冻干燥得到云芝胞外多糖样品。
本发明的一种云芝胞外多糖的结构表征方法，包括以下的步骤：
(1)使用HPLC、红外光谱、核磁共振氢谱对上述得到的云芝胞外多糖样品进行结构表征。
附图说明
图1：是本发明中DEAE-52纤维素阴离子交换柱洗脱曲线图。
图2：是本发明中云芝胞外多糖的高效凝胶渗透色谱图。
图3：是本发明中云芝胞外多糖的单糖组成分析图。
图4：是本发明中云芝胞外多糖的红外光谱图。
图5：是本发明中云芝胞外多糖的核磁共振氢普图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明得到一种新的云芝胞外多糖，主要技术步骤包括云芝胞外多糖的提取、分离纯化及结构表征三部分内容。从云芝菌丝体培养液冻干粉出发，经过水提醇沉、脱色、冻干等步骤，得到云芝胞外多糖粗品；粗品经过DEAE-52纤维素阴离子交换柱洗脱及超滤等步骤分离纯化，得到云芝胞外多糖；最后使用HPLC、红外光谱、核磁共振氢谱对云芝胞外多糖进行结构表征。
实施例1：
本发明的一种云芝胞外多糖的提取方法，包括以下的步骤：
(1)本发明的提取原料为云芝菌丝体培养液冻干粉，由云芝菌丝体培养液经终浓度为60％-90％的乙醇醇沉得到沉淀再经喷雾干燥制备得到。
(2)称取步骤(1)制备的云芝胞外多糖原料80g置入2L圆底烧瓶中，加入15倍体积蒸馏水，置入水浴锅中，65℃条件下搅拌浸提3h；用布氏漏斗趁热过滤，收集滤液；滤渣再加入15倍体积蒸馏水重复上述操作浸提一遍；合并两次收集的滤液，滤液再用布氏漏斗过滤一遍；将得到的上述滤液浓缩旋蒸至体积为600mL。
(3)用氨水将上述提取浓缩液的pH调至8.5，边搅拌边缓慢滴加30％过氧化氢溶液，至过氧化氢终浓度为3％；滴加完成后再用氨水调节溶液pH至8.5，室温下搅拌脱色3h；脱色完成以后用浓盐酸将溶液pH调节至7.0。
(4)上述脱色完成的溶液，边搅拌边缓慢加入95％工业酒精，至乙醇终浓度为60％-90％，4℃静置过夜；上述醇沉溶液倒入离心杯中，配平；离心机转速8000rpm，离心10min，取沉淀；沉淀中加入600mL蒸馏水，于60℃下搅拌溶解3h后，离心取上清液。
(5)将上述上清液，二次用终浓度为60％-90％的乙醇醇沉，离心得到沉淀。
(6)沉淀用0.4mol/L-0.8mol/L硝酸钠溶液溶解，溶解后置入截流分子量为3500Da的透析袋中；透析袋置入5L烧杯中，烧杯中装入0.4mol/L-0.8mol/L硝酸钠溶液，透析24h，再换蒸馏水流水透析24h。
(7)将透析袋中的溶液取出，旋蒸浓缩后真空冷冻干燥24h得到云芝胞外粗多糖。
本发明的一种云芝胞外多糖的分离纯化方法，包括以下的步骤：
(1)称取200mg云芝胞外粗多糖，用10mL蒸馏水溶解，水系0.45μm的滤头过滤；将上述滤液加入平衡好的DEAE-52纤维素阴离子交换柱中，用蒸馏水为流动相，洗脱速度1mL/min，5mL/管，共收集100管，通过苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法进行跟踪显色检测(见图1)，收集含糖显色液，然后浓缩、真空冷冻干燥，得到蒸馏水洗脱的组分；
(2)将上述洗脱冻干样品40mg用4mL 0.4mol/L-0.8mol/L硝酸钠溶液溶解，经水系0.45μm的滤头过滤；加入截流分子量为3500Da的超滤管中，配平，5000rpm离心超滤30min，将超滤下层溶液取出，超滤上层补加1mL蒸馏水，5000rpm离心超滤30min，重复超滤操作5次，收集超滤上层的样品，真空冷冻干燥得到云芝胞外多糖样品。
本发明的一种云芝胞外多糖的结构表征方法，包括以下的步骤：
(1)分子量的测定：称取上述云芝胞外多糖样品5mg，用1mL蒸馏水溶解，经水系0.45μm的滤头过滤，采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)进行分子量的测定，测定结果为得到一个峰形对称的单峰，分子量为19kD(见图2)；其中分子量测定的色谱条件如下：
(2)单糖组成分析：
(2.1)称取上述云芝胞外多糖样品10mg，加2mL双蒸水溶解使终浓度为5mg/mL，用移液枪准确吸取1mL多糖溶液至安瓿瓶，再加入1-2mL浓度为1-4mol/L三氟乙酸，用酒精喷灯进行密封。将安瓿瓶置于油浴锅中，100℃条件下反应2h，取出，将反应液放在室温条件下，待其冷却到室温。将瓶内所有溶液转移入圆底烧瓶中，加入甲醇，用旋蒸仪浓缩，在体积为上次一半时继续加甲醇，直至最后将甲醇蒸干，然后将装有样品的圆底烧瓶放入烘箱内，55℃-70℃，烘4-6h使其完全干燥。
(2.2)待样品完全烘干，用移液枪向盛有样品的圆底烧瓶加入双蒸水，反复吹打使其完全溶解，精确吸取15-40μL溶解液加入4mL的离心管，再加入30μL的NaOH溶液(0.8mol/L)，涡旋混匀30s，加入甲醇配制的PMP溶液(0.6mol/L)，涡旋30s，将EP管置于水浴锅中，50℃恒温反应80min，反应毕取出，待冷却至室温，向EP管中加入60μL的盐酸溶液(提前配制浓度为0.6mol/L)，再加850μL双蒸水，反复吹打混合均匀，加入氯仿溶液，涡旋混匀离心分离5min，去除氯仿层，将上述操作重复两次，吸弃有机层，用0.45μm滤膜进行过滤，以备用。
(2.3)单糖组成分析：将(2.2)得到的样品用高效液相色谱法(HPLC)进行分析，通过与标准品比对，得到的单糖组成结果为云芝胞外多糖由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖及岩藻糖六种单糖组成(见图3)；其中单糖组成分析色谱条件如下：
(3)红外光谱分析：红外光谱常用来分析多糖结构，可以将不同的糖区分开，其原理是通过检测多糖中基团的伸缩振动从而达到鉴别各种官能团、单糖类型及糖苷键；称取云芝胞外多糖和溴化钾粉末，将其置于研钵中，用研磨棒研磨至均匀，压片，立即上机分析得到红外光谱图(见图4)。
(4)核磁共振波普分析：多糖结构中糖苷键构型的确定常用核磁共振1H NMR进行分析；用D2O溶解样品云芝胞外多糖，用核磁共振仪进行分析得到核磁共振氢谱图(见图5)；检测条件如下：303K，1H NMR 500.13MHz，延迟时间2s。
Claims (4)
1.一种云芝胞外多糖的分离纯化及其结构表征，主要包括云芝胞外多糖的提取、分离纯化及结构表征三部分内容。从云芝菌丝体培养液冻干粉出发，经过水提醇沉、脱色、冻干等步骤，得到云芝胞外多糖粗品；粗品经过DEAE-52纤维素阴离子交换柱洗脱及超滤等步骤分离纯化，得到云芝胞外多糖；最后使用HPLC、红外光谱、核磁共振氢谱对云芝胞外多糖进行结构表征。
2.根据权利要求1所述一种云芝胞外多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)水提：以云芝菌丝体培养液冻干粉为原料，按质量比1∶12-1∶18加入蒸馏水，于50℃-80℃下浸提过滤2-3次，然后合并浸提液并浓缩至原体积的1/3-1/5；
(2)脱色：用浓度为1％-6％过氧化氢将上述浓缩提取液室温下搅拌脱色2h-4h；
(3)醇沉：上述脱色完成的溶液，用终浓度为60％-80％的乙醇醇沉得到沉淀；
(4)水复溶：沉淀用蒸馏水复溶，再次离心得到水复溶的上清液；
(5)二次醇沉：将上述上清液，二次用终浓度为60％-80％的乙醇醇沉，离心得到沉淀；
(6)透析：沉淀用0.4mol/L-0.8mol/L硝酸钠溶液溶解，溶解后置入截流分子量为3500Da的透析袋中，透析24h-48h；
(7)冻干：将透析袋中的溶液取出，旋蒸浓缩后真空冷冻干燥24h-48h得到云芝胞外粗多糖。
3.根据权利要求1所述一种云芝胞外多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括以下的步骤：
(1)DEA-52纤维素阴离子交换柱纯化：上述提取的云芝胞外粗多糖用DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5mL/min-2mL/min，收集洗脱液，然后浓缩、真空冷冻干燥，得到蒸馏水洗脱的组分；
(2)超滤：将上述洗脱冻干样品用0.4mol/L-0.8mol/L硝酸钠溶液溶解，使用截流分子量为3500Da的超滤管，以5000rpm的转速离心超滤15-60min，超滤上层补加蒸馏水，重复上诉超滤操作2-6次，收集超滤上层的样品，真空冷冻干燥得到云芝胞外多糖样品。
4.根据权利要求1所述一种云芝胞外多糖的结构表征方法，其特征在于，包括以下的步骤：
(1)使用HPGPC进行分子量表征；
(2)使用HPLC进行单糖组成表征；
(3)使用红外光谱进行官能团表征；
(4)使用核磁共振氢谱进行结构表征。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114805626A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-07-29 | 湖南中药谷集团研究院有限公司 | 一种抗癌活性多糖及其制备和在制备抗癌药物中的应用 |
| CN115232752A (zh) * | 2022-05-19 | 2022-10-25 | 江苏神华药业有限公司 | 一种用于制备云芝菌丝体的深层液态发酵法及其应用 |
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2020
- 2020-12-01 CN CN202011384238.0A patent/CN112321742A/zh active Pending
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