CN111892663B - 一种猴头菌多糖及其制备方法及其用途 - Google Patents

一种猴头菌多糖及其制备方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猴头菌多糖的制备方法。属于制药领域，国际专利号分类为C08B 38/60。一种猴头菌多糖精品，它们是由深层液体发酵得到的猴头菌菌丝体粉碎后过筛，经超声辅助提取，乙醇沉淀，4℃过夜，离心弃上清，将沉淀溶解于水，Sevag法去蛋白。上清浓缩后，乙醇沉淀，离心去上清，干燥后得猴头菌多糖粗品。猴头菌多糖粗品经离子交换层析和凝胶过滤层析纯化后得一种猴头菌多糖精品HP。本发明将得到的猴头菌多糖应用于制备治疗消化性溃疡、修复胃粘膜损伤的药物上。

Description

一种猴头菌多糖及其制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种猴头菌多糖的制备方法，用于制备治疗消化性溃疡、修复胃粘膜损伤的药物。属于生物领域，国际专利分号分类为C08B 37/60。
背景技术
猴头菌[Hericiumerinaceus(Rull ex F.)Pers.]属担子菌门、层菌纲、多孔菌目、猴头菇科、猴头菇属，为非常珍贵药食同源的蕈菌之一，它除了味道鲜美、营养丰富外，还具有降血糖、抗氧化和抗衰老、促进周围神经再生，抑制肿瘤细胞生长、增强免疫调节能力等功效，尤其对治疗胃溃疡及胃肠癌有显著作用。
猴头菌富含多种营养物质和药用成分，其中多糖为其主要药用成分，具有抗氧化、抗肿瘤、修复胃粘膜损伤、降血糖等功效，目前对猴头菌多糖的研究大都是从子实体中提取得到，从菌丝体中分离纯化多糖并分析其结构和功能，这方面的研究较少。与传统的固体基质人工栽培猴头菌子实体技术相比，液体深层发酵猴头菌菌丝体不仅占地少、周期短、产量高，还可以进行规模化生产，保证产品的稳定性。并且，通过培养基和发酵参数的调整，可以改变猴头菌菌丝体多糖的生物合成途径，得到新的多糖，开发多糖的更多新用途。本发明通过解决猴头菌菌丝体多糖制备的技术性难题，获得一种均一的猴头菌多糖，可用于制备治疗消化性溃疡、修复胃粘膜损伤的药物。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种从猴头菌菌丝体中分离纯化得到猴头菌多糖纯品HP的方法。
一种猴头菌多糖，所述的猴头菌多糖为含D-葡萄吡喃环的多糖，含D-葡萄吡喃环的多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖以摩尔比0.05-0.08：0.01-0.04：0.1-0.4：0.005-0.02：0.01-0.05：0.2-0.6：0.08-0.25：0.01-0.04组成，所述的猴头菌多糖HP的分子量为3000-3800Da。
作为优选方案，本发明所述的猴头菌多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖以摩尔比0.062：0.023：0.267：0.010：0.025： 0.453：0.137：0.023组成，所述的猴头菌多糖HP的分子量大约3319Da。
所述的获得猴头菌多糖精品HP的方法，包括如下步骤：
(1)取猴头菌菌丝体粉碎后，加入70-90℃热水，超声分散后冷却至室温离心，取上清液，浓缩后加入无水乙醇，2-8℃冰箱静置过夜，离心，弃上清，将沉淀溶于水，Sevag法去蛋白，取上清液浓缩，加无水乙醇，2-8℃冰箱静置过夜，离心，弃上清，沉淀烘干，得猴头菌多糖粗品；其多糖含量占总固体重量的60％以上。
(2)猴头菌多糖粗品溶解于水，上阴离子交换柱，NaCl水溶液洗脱，分部收集，采用硫酸-蒽酮法检测各管洗脱液中多糖含量，收集主峰，浓缩后乙醇沉淀，2-8℃放置，离心去上清，真空冷冻干燥；
(3)将干燥后的样品溶于去离子水，上Sephacryl S-200凝胶过滤层析柱，去离子水洗脱，分部收集，硫酸-蒽酮法检测，收集主峰，浓缩后冷冻干燥制得猴头菌多糖精品，其多糖含量占总固体的95％以上。
猴头菌菌丝体粉碎后加入70-90℃热水，液固体积质量比为5-20：1(mL/g)。
超声功率为50-300W、超声处理6-40min。
步骤(1)、(2)、中所述的离心转速为3000-4000rpm。
步骤(2)中所述的阴离子交换树脂为二乙胺基乙基纤维素DEAE-52，或二乙胺基乙基萄聚糖凝胶，具体为DEAE Sephadex A-25或DEAE Sephadex A-50，或二乙胺基乙基琼脂糖凝胶DEAE Sepharose。
步骤(2)中所述的NaCl水溶液为0.5-1.5mol/L的NaCl水溶液。
本发明的目的之二是提供一种均一的猴头菌多糖在制备用于治疗消化性溃疡、与炎症相关的疾病药物中的应用。将上述方法制备得到的猴头菌多糖应用于胃粘膜损伤小鼠中，具有一定的作用，因此可应用于制备治疗消化性溃疡、与炎症相关疾病的药物。
附图说明
图1为猴头菌多糖精品HP紫外—可见光扫描光谱。
图2为猴头菌多糖精品HP红外光谱。
图3为猴头菌多糖精品HP减少乙醇所致小鼠胃粘膜面积的作用。
图4为猴头菌多糖精品HP抑制乙醇所致小鼠胃粘膜损伤面积的效率。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。说明书及实施例中采用的化学试剂、层析柱等，如无特殊说明均按常规实验条件下进行操作，或按供应商提供的说明进行操作。
实施例1：猴头菌多糖粗品的制备方法
猴头菌菌丝体采用液体深层发酵所得，产量达12g/L以上，烘干、粉碎、过筛。取猴头菌菌丝体干粉100g，按液固比15：1(mL/g)加入90℃热水，200W超声功率处理10min，共处理3次，冷却至室温后3 500rpm离心15min，取上清液，浓缩至总体积的1/10，向浓缩液中缓缓加入无水乙醇，至乙醇终浓度为80％，4℃冰箱静置过夜，3 500rpm离心15min。将沉淀溶解于去离子水中，Sevag法去除蛋白质，上清加入乙醇沉淀，将沉淀真空冷冻干燥后得到本发明的猴头菌多糖粗品。猴头菌多糖粗品中多糖含量占60％-70％。。
实施例2：均一猴头菌多糖HP的制备方法
取猴头菌多糖粗品1000mg，去离子水充分溶解，上样至已平衡好的DEAE SephadexA-25离子交换层析柱中，规格为(2.6×30cm)，平衡液为去离子水，用1mol/L的NaCl水溶液以 1.5mL/min的流速洗脱，3min/管分部收集，采用硫酸-蒽酮法检测各管洗脱液中多糖含量，以收集管号为横坐标，吸光值为纵坐标绘制多糖洗脱曲线，根据洗脱曲线合并相同组分。离子交换柱分离所得猴头菌多糖盐洗组分上Sephacryl S-200分子筛层析，去离子水洗脱。柱规格为(1.0×100cm)，分部收集，硫酸-蒽酮法跟踪检测，合并相同组分。冷冻干燥，得到猴头菌多糖精品(代号：HP)。猴头菌多糖精品中多糖含量占98.5％。
在图1中，通过对HP进行紫外－可见光(200-700nm)全波长扫描，证明猴头菌多糖精品纯度较高，基本无蛋白质、核酸和其它杂质。
在图2中：HP在3600～3200cm-1出现一种宽峰，是O-H的伸缩振动，存在分子间和分子内氢键。在2962.45cm-1的峰是糖类C-H伸缩振动。1654.33cm-1的峰是醛基的C＝O的伸缩振动，1547.22是羰基的伸缩振动，1401.35cm-1和1239.42cm-1分别是羧基的C-O的伸缩振动和O-H的变角振动，1078.15cm-1是醚键(C-O-C)的吸收峰，919.63cm-1是β-D-葡萄吡喃糖环的吸收峰，875.16cm-1是D-葡萄吡喃糖环C-O-C的骨架振动，788.48cm-1是D-葡萄吡喃糖环的对称伸缩振动，说明HP含有D-葡萄吡喃糖。
实施例3：针对实施例2，口服猴头菇多糖HP抑制小鼠胃粘膜损伤的作用将6周龄雄性昆明小鼠60只，随机分为空白组、模型组、阳性对照雷尼替丁组、猴头菌多糖HP低、中、高剂量组，每组10只。空白组和模型组给予等体积蒸馏水，阳性对照组灌胃雷尼替丁50mg/kg，低、中、高剂量组分别灌胃猴头菌多糖HP 100mg/kg、200mg/kg和 400mg/kg，动物每天灌胃给药1次，连续10d。末次给药前小鼠禁食12h，自由饮水，于末次给药1h后，除空白组外，动物灌胃无水乙醇0.2mL/只，空白组灌胃等积体的蒸馏水，同时禁水。1h后处死动物，取出全胃，剪开胃壁，生理盐水冲净，拍照，测量溃疡面积。
在图3中：猴头菌多糖HP在100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg剂量下均能降低显著降低乙醇诱导致小鼠胃粘膜损伤面积，说明猴头菇多糖具有降低消化性溃疡面积的作用。
在图4中：猴头菌多糖HP在100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg剂量下均能显著提高乙醇所致小鼠胃粘膜损伤面积比例的抑制率，说明猴头菇多糖具有治疗消化性溃疡的作用。
实施例4：理化性质测定
1.多糖含量测定
采用硫酸-蒽酮法，在620nm处，分光光度法测定总多糖含量，以葡萄糖(C6H12O6)计猴头菌多糖粗品含量为65.86％，猴头菌多糖(HP)含量为99.63％。
2.紫外光谱分析
样品以蒸馏水溶解，置于200～400nm紫外全波长扫描。如图1所示，HP在260、280nm处无吸收，说明其不含蛋白质和核酸。
3.单糖组成分析
称取HP干粉2mg，加入1mL 2mol/L三氟乙酸水解90min，旋转蒸发仪蒸干，再加入2mL甲醇，蒸干，按此方法反复处理2次。用2mL双蒸水将已水解的残基溶解，向其中加入60mg硼氢化钠还原8h，然后加入冰乙酸中和过量的硼氢化钠，浓缩，加入甲醇3mL 以除去水分和反应副产物硼酸，反复处理3次，浓缩，110℃烘干以充分除去水分。向以上干燥样品中加入1mL乙酸酐乙酰化，100℃反应1h后冷却，向其中加入3mL甲苯，旋转蒸发仪蒸干，反复操作4～5次，以除去多余的乙酸酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解，加入少量蒸馏水充分振荡，除去水相，重复操作4次后用无水硫酸钠干燥氯仿层，完全除去残留水相，最后定容至10mL用于GC-MS分析。结果见表1：猴头菌多糖HP由具体由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖以摩尔比 0.062：0.023：0.267：0.010：0.025：0.453：0.137：0.023组成。
表1猴头菌多糖HP单糖组成气相色谱分析
Figure RE-GDA0002694877470000041
Figure RE-GDA0002694877470000051
4.分子量测定
以Shodex SUGAR KS-805(8.0mm×300mm)为高效液相色谱柱，采用示差折光检测器。色谱条件为：流动相为蒸馏水，流速为1.0mL/min；样品浓度为1.5mg/mL，进样量20μ L。依次以右旋糖酐标准品绘制保留时间与各分子量参数关系标准曲线，再测样品的保留时间，根据标准曲线求得样品的分子量。结果表明：猴头菌多糖HP的分子量大约3319Da。

Claims (7)

1.猴头菌多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取猴头菌菌丝体粉碎后，加入70-90℃热水，超声分散后冷却至室温离心，取上清液，浓缩后加入无水乙醇，2-8℃冰箱静置过夜，离心，弃上清，将沉淀溶于水，Sevag法去蛋白，取上清液浓缩，加无水乙醇，2-8℃冰箱静置过夜，离心，弃上清，沉淀烘干，得猴头菌多糖粗品；
（2）猴头菌多糖粗品溶解于水，上阴离子交换柱，NaCl水溶液洗脱，分部收集，采用硫酸-蒽酮法检测各管洗脱液中多糖含量，收集主峰，浓缩后乙醇沉淀，2-8℃放置，离心去上清，真空冷冻干燥，所述的阴离子交换柱内的阴离子交换树脂为DEAE Sephadex A-25或DEAE Sephadex A-50，或二乙胺基乙基琼脂糖凝胶DEAE Sepharose；所述的NaCl水溶液的浓度为0.5-1.5mol/L，洗脱流速为1.5 mL/min；
（3）将干燥后的样品溶于去离子水，上Sephacryl S-200凝胶过滤层析柱，去离子水洗脱，分部收集，硫酸-蒽酮法检测，收集主峰，浓缩后冷冻干燥制得猴头菌多糖，猴头菌多糖为含D-葡萄吡喃环的多糖，含D-葡萄吡喃环的多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖以摩尔比0.05-0.08：0.01-0.04：0.1-0.4：0.005-0.02：0.01-0.05：0.2-0.6：0.08-0.25：0.01-0.04组成，所述的猴头菌多糖HP的分子量为3000-3800Da。
2.根据权利要求1所述的猴头菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，液固体积质量比为5-20：1（mL/g）。
3.根据权利要求1所述的猴头菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，超声功率为50-300 W、超声处理6-40 min。
4.根据权利要求1所述的猴头菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）、（2）、中所述的离心转速为3000-4000rpm。
5.根据权利要求1所述的猴头菌多糖的制备方法，其特征在于，所述的含D-葡萄吡喃环的多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖以摩尔比0.062：0.023：0.267：0.010：0.025：0.453：0. 137：0.023组成，所述的猴头菌多糖HP的分子量为3 319 Da。
6.权利要求1-5任一项所述制备得到的猴头菌多糖在制备治疗消化性溃疡的药物中的应用。
7.权利要求1-5任一项所述制备得到的猴头菌多糖在制备治疗修复胃粘膜损伤的药物中的应用。
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