CN113651900B

CN113651900B - 一种具有调节血脂功能的灰树花纯化多糖及制备方法

Info

Publication number: CN113651900B
Application number: CN202111178636.1A
Authority: CN
Inventors: 王迪; 姜雪; 郝洁; 李兰洲; 李玉; 朱晏锋; 刘子剑
Original assignee: Jilin University; Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin University; Jilin Agricultural University
Priority date: 2021-10-10
Filing date: 2021-10-10
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2041-10-10
Also published as: CN113651900A

Abstract

本发明提供一种具有调节血脂功能的灰树花纯化多糖及制备方法，分子量为4000‑6000kDa，由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖三种单糖组成，其摩尔比（mol%）为（98.00‑99.90）:（0.20‑0.10）:（0.15‑0.05），为一种新的多糖物质，具有调节血脂功能，能够改善血脂相关生化指标，可以用于制备治疗肥胖及调控血脂功能的药品及保健品。

Description

一种具有调节血脂功能的灰树花纯化多糖及制备方法

技术领域

本发明公开一种具有调节血脂功能的灰树花多糖，具有治疗肥胖及降血脂功效，同时还提供了一种防治肥胖的灰树花多糖的制备方法，属于医药技术领域。

背景技术

随着社会经济的稳步发展和人们生活水平的不断提高，由高脂肪高胆固醇饮食引发的高脂血症严重威胁着人类健康，且发病率逐年增加。高脂血症的脂质代谢异常会引发脂质过氧化，进而形成脂质过氧化物，引起内皮细胞损伤等一系列病变，诱发动脉粥样硬化、冠心病和高血压等心脑血管疾病，全球死亡率中高脂血症及其并发症占比达50%。

目前对于高脂血症的治疗策略，主要是降低致动脉粥样硬化的脂蛋白水平或升高有潜在心脏保护作用的高密度脂蛋白的水平。临床常用的他汀类、烟酸类、贝特类等调脂西药有一定的治疗功效，但会产生横纹肌溶解、刺激胃肠道、引发肝酶异常等较严重的毒副作用。因此，从天然产物中寻找降血脂的活性成分被认为是开发安全有效的降血脂药物的一种思路。蘑菇多糖具有很好地降血脂作用，其安全无害，毒副作用小，对高血脂症人群具有良好功效，越来越多的科研人员致力于利用蘑菇多糖开发安全、经济、有效的降血脂天然药物。

发明内容

针对以上不足，本发明的目的在于提供一种具有调控血脂功能的灰树花多糖的制备与纯化方法，以灰树花子实体为原料，以调节血脂功效为评价标准，通过提取、分离纯化得到一种新的灰树花子实体纯化多糖，对其进行结构表征，并对降血脂活性进行探究。

本发明提供一种具有调节血脂功效的灰树花多糖，其特征在于：

分子量为4000-6000kDa，由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖三种单糖组成，其摩尔比（mol%）为（98.00-99.90）:（0.20-0.10）:（0.15-0.05）。

以神经保护活性为评价标准，更优的灰树花纯化多糖，分子量为4188.9 kDa，由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其摩尔比（mol%）为99.73:0.17:0.10，结构可表示为：以→3)-β-D-Glcp(1→[4)-α-D-Glcp(1→]n4-β-D-Glcp(1→4)-α-D-Glcp(1→循环为主链，在→4-β-D-Glcp(1→的六号位存在→3)-β-D-Glcp(1→[4)-α-D-Glcp(1→]n支链的大分子多糖结构，端基为β-D-Glcp(1→。

本发明提供一种具有调节血脂功能及治疗肥胖的灰树花多糖的制备方法，步骤如下：

第一步：灰树花子实体经乙醇脱脂，干燥后进行粉碎，过筛，加入去离子水进行加热水提，离心后取上清进行浓缩，Sevag法去蛋白，4℃过夜醇沉，收集沉淀后冻干即获得灰树花粗多糖GFP；

第二步：步骤（1）中获得的灰树花粗多糖GFP使用去离子水进行溶解，过膜，通过离子交换层析柱后使用氯化钠溶液进行洗脱，苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，经过透析、冻干后通过凝胶过滤层析纯化，以氯化钠溶液为洗脱液进行洗脱，收集主峰，经过透析、冻干即得灰树花子实体纯化多糖（GFPA）。多糖产率大于90%。

本发明所述的一种调控血脂功能的灰树花多糖的制备方法，包括以下步骤：

1）灰树花经子实体经乙醇浸泡12-36小时进行脱脂。收集残渣于50℃烘箱内干燥至恒重后，超微粉碎成粉末，过100-150目筛；

2）按料液比1:30-1:50加入去离子水，搅拌均匀后浸泡20-50分钟，于70-90℃恒温水浴中提取1.5-2.5小时；

3）冷却至室温后离心取上清，旋转蒸发浓缩至1/10-1/5体积，Sevag法去蛋白；

4）取上清液浓缩，使用50-90%（v/v）乙醇进行沉淀，4℃过夜，收集沉淀，进行冻干，即获得灰树花粗多糖，称为GFP；

5）将灰树花粗多糖用去离子水溶解，通过快流速二乙胺基乙基琼脂糖凝胶（DEAESepharose Fast Flow），以氯化钠溶液洗脱，浓度为0.05-0.5 mol/L，流速为0.1-2.0 mL/min，分别收集溶液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/8-1/5体积，4℃透析过夜，进行冻干；

6）将通过DEAE凝胶柱获得的灰树花多糖冻干粉末溶于去离子水，通过HiLoad 16/600 Superdex 200制备级色谱柱进行进一步纯化，以氯化钠溶液洗脱，浓度为0.1-0.2mol/L，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/8-1/5体积，4℃透析过夜，进行冻干即获得灰树花纯化多糖（GFPA）。

本发明所述的调控血脂功能的灰树花多糖在制备治疗肥胖药物中的用途。

本发明所述的调控血脂功能的灰树花多糖在制备具有调节血脂功能药物中的用途。

一种药物制剂以本发明所述的调控血脂功能的灰树花多糖为活性成分，同时含有一种或多种药学上可接受的载体物质和/或辅剂。

本发明的积极效果在于；

提供一种具有降血脂活性的灰树花纯化多糖，为一种新的多糖物质，具有调节血脂功能，能够改善血脂相关生化指标，可以用于制备治疗肥胖及调控血脂功能的药品及保健品。

附图说明

图1：灰树花粗多糖DEAE Sepharose Fast Flow 洗脱曲线；

图2：灰树花纯化多糖HiLoad 16/600 Superdex 200洗脱曲线；

图3：灰树花纯化多糖紫外扫描光谱图；

图4：灰树花纯化多糖红外光谱图；

图5：灰树花纯化多糖的单糖组分分析图；

图6：灰树花纯化多糖分子构型分析图；

图7：灰树花纯化多糖NMR的¹H谱图；

图8：灰树花纯化多糖NMR的¹³C谱图；

图9：灰树花纯化多糖扫描电镜图；

图10：小鼠三种脂肪组织HE染色结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。说明书及实施例中采用的化学试剂、层析柱等，如无特殊说明均按常规实验条件下进行操作，或按供应商提供的说明进行操作。

本发明中得到一种新的灰树花纯化多糖，以灰树花子实体为原料，通过脱脂、水提、醇沉、浓缩、冻干等步骤，获得灰树花粗多糖；粗多糖经过离子交换层析及凝胶过滤层析及冻干后获得灰树花纯化多糖，通过使用紫外光谱、HPLC、红外光谱、凝胶渗透色谱、GC-MS、核磁共振以及扫描电镜对灰树花多糖进行结构表征。通过动物实验考察其治疗肥胖及调控血脂功能的作用。

实施例1：

本实施例为一种灰树花粗多糖的制备：

1、灰树花经子实体经乙醇浸泡12小时进行脱脂。收集残渣于50℃烘箱内干燥至恒重后，超微粉碎成粉末，过150目筛；

2、按料液比1:30加入去离子水，搅拌均匀后浸泡20分钟，于80℃恒温水浴中提取1.5小时；

3、冷却至室温后离心取上清，旋转蒸发浓缩至1/10体积，Sevag法去蛋白；

4、取上清液浓缩，使用60%（v/v）乙醇进行沉淀，4℃过夜，收集沉淀，进行冻干，即获得灰树花粗多糖（GFP-1）。

实施例2：

本实施例为一种灰树花粗多糖的制备：

1、灰树花经子实体经乙醇浸泡24小时进行脱脂。收集残渣于50℃烘箱内干燥至恒重后，超微粉碎成粉末，过150目筛；

2、按料液比1:40加入去离子水，搅拌均匀后浸泡40分钟，于80℃恒温水浴中提取2小时；

3、冷却至室温后离心取上清，旋转蒸发浓缩至1/6体积，Sevag法去蛋白；

4、取上清液浓缩，使用80%（v/v）乙醇进行沉淀，4℃过夜，收集沉淀，进行冻干，即获得灰树花粗多糖（GFP-2）。

实施例3 ：

本实施例为一种灰树花纯化多糖的制备：

（1）将实例1中获得的灰树花粗多糖用去离子水溶解，通过快流速二乙胺基乙基琼脂糖凝胶（DEAE Sepharose Fast Flow），以氯化钠溶液洗脱，浓度为0.3 mol/L，流速为0.1mL/min，分别收集溶液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/6体积，4℃透析过夜，进行冻干；

（2）将通过DEAE凝胶柱获得的灰树花多糖冻干粉末溶于去离子水，通过HiLoad16/600 Superdex 200制备级色谱柱进行进一步纯化，以氯化钠溶液洗脱，浓度为0.1 mol/L，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/6体积，4℃透析过夜，进行冻干即获得灰树花纯化多糖（GFPA-1）。

实施例4：

本实施例为一种灰树花纯化多糖的制备：

（1）将实例2中获得的灰树花粗多糖用去离子水溶解，通过快流速二乙胺基乙基琼脂糖凝胶（DEAE Sepharose Fast Flow），以氯化钠溶液洗脱，浓度为0.1 mol/L，流速为0.1mL/min，分别收集溶液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/6体积，4℃透析过夜，进行冻干；

（2）将通过DEAE凝胶柱获得的灰树花多糖冻干粉末溶于去离子水，通过HiLoad16/600 Superdex 200制备级色谱柱进行进一步纯化，以氯化钠溶液洗脱，浓度为0.15mol/L，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/6体积，4℃透析过夜，进行冻干即获得灰树花纯化多糖（GFPA-2）。

实施例5：

本实施例为一种灰树花纯化多糖的制备：

（1）将实例2中获得的灰树花粗多糖用去离子水溶解，通过快流速二乙胺基乙基琼脂糖凝胶（DEAE Sepharose Fast Flow），以氯化钠溶液洗脱，浓度为0.5 mol/L，流速为0.1mL/min，分别收集溶液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/6体积，4℃透析过夜，进行冻干；

（2）将通过DEAE凝胶柱获得的灰树花多糖冻干粉末溶于去离子水，通过HiLoad16/600 Superdex 200制备级色谱柱进行进一步纯化，以氯化钠溶液洗脱，浓度为0.2 mol/L，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/6体积，4℃透析过夜，进行冻干即获得灰树花纯化多糖（GFPA-3）。

测试例1：灰树花多糖得率及纯度检测

（1）试验材料

实施例3-5获得的灰树花多糖。

（2）试验方法

使用苯酚-硫酸法测试多糖含量，按浓度梯度配置葡萄糖标曲溶液，分别称取各实施例中50mg多糖样本，用2mL蒸馏水溶解，然后加入6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，摇匀静置30分钟，于490nm检测各组吸光度值，通过各浓度梯度葡萄糖溶液读数结果绘制标曲，计算各实施例多糖纯度及得率，计算公式分别为：

多糖得率=灰树花多糖质量/灰树花菌粉总质量×100%

多糖纯度=灰树花多糖质量/样本称量质量×100%

（3）试验结果

结果见表1，实施例1和2多糖得率均超过20%，其中实施例2多糖提取效果更好。实施例4灰树花多糖得率为6.45%，高于实施例3和实施例5，实施例3-5所获得的多糖纯度都达到了90%以上。

表1 灰树花多糖得率和纯度结果比较

测试例2：灰树花多糖结构特征分析

（1）试验材料

实施例4获得的灰树花多糖。

（2）试验方法及结果

紫外及红外光谱分析:

紫外：适量蒸馏水溶解实施例4中获得的灰树花多糖，置于200～800 nm全波长扫描。紫外光谱分析结果如图3所示，实施例4获得的灰树花多糖在260、280nm处无吸收峰，说明该多糖中不含蛋白质和核酸。

红外：将实施例4获得的灰树花多糖冻干粉与在100℃高温微波条件下烘干的溴化钾（质量比1:200）混合压片，进行红外光谱扫描。扫描结果如图4所示，吸收带在3600-3200cm^-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：3362.01cm^-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2930.36cm^-1附近处的吸收峰归属于C-H伸缩振动。在1643.69cm^-1附近出吸收峰，归属于C=O伸缩振动。在1416.41cm^-1处有一个吸收峰，归属于C-O伸缩振动。在1022.63cm^-1处有吸收峰，归属于O-H变角振动。

单糖组分分析：准确称取灰树花多糖20.0 mg，用5 mol/L的硫酸溶解，105℃条件下密闭水解6 h。冷却后用碳酸钡将pH调整为7.0。离心取上清液用0.22 µm滤膜过滤。通过高效液相色谱（HPLC）/蒸发光散射检测器（ELSD）进行分析。采用LC-10ATVP HPLC系统联合Alltech 2000ES 蒸发光检测器，色谱柱使用PrevailTM ES糖柱（250×4.6 mm），流动相为80%乙腈，流速1.0 mL / min，柱温35℃，漂移管温度82℃，载气量2.1 L/min，进样量20 µl。结果如图5所示，灰树花多糖主要由三种单糖组成，其种类及摩尔比为：葡萄糖（Glc）：半乳糖（Gal）：岩藻糖（Fuc）=99.73：0.17：0.10。

分子量和均一性分析：配备凝胶排阻色谱柱（Ohpak SB-805 HQ，300×8mm）、差分检测器（Optilab T-rEX）和激光的凝胶色谱-微分-多角度激光光散射系统光散射检测器（DAWN HELEOS 2）用于评估灰树花的均匀性和分子量。检测条件为：流动相为0.1 M NaNO3，进样量为100 μL，流速为0.4 mL / min，柱温箱温度为45 ℃。通过结果分析可得实施例4获得的灰树花多糖具有均匀的单峰，表明其均一性好，分子量为4188.9 kDa，结果如图6，Rg对Mw（RMS）构象图显示该多糖的分子构型为不规则卷曲，表明存在分支。

甲基化及乙酰化分析：为了确定多糖的键合结构，进行甲基化和乙酰化反应。制备的样品通过气相色谱-质谱仪 (GC-MS)进行分析。通过其典型的保留时间和电子撞击曲线来确定衍生物类型。步骤如下：甲基化反应：整个反应均在20℃，N₂保护下进行。分别取10mg干燥的灰树花多糖及其糖酸还原产物加入到圆底烧瓶中，加2mL DMSO超声溶解后加入30mg干燥的NaOH粉末反应3h，沿壁缓慢滴加1mL CH₃I，避光超声反应2h，保持实验在冰水浴下进行，反应结束时加3mL水终止反应，等比例加入CHCI₃萃取，收集有机相，重复3次，干燥后重复甲基化至IR扫描图谱中没有羟基峰。后续反应：向甲基化后的样品中加4mL 2mol/L的TFA，于110℃下水解5h，水解后加入4mL甲醇旋干除去多余的TFA，重复3次，再加0.5mL蒸馏水溶解；取0.2mL水解液，加30mg NaBH₄室温下反应3h，反应过程中间断性震荡，结束后滴加25％冰乙酸，直至无气泡产生，加2mL甲醇旋干，重复3次；向还原产物中加1.5mL乙酸，于100℃下反应1h后，加2mL甲苯旋干，重复3次以除去多余的乙酸酐；向乙酰化产物中各加2mL氯仿和水，振荡，静置，收集下层有机相，用lmL水洗涤3次，再加少量无水硫酸钠除水，待GC-MS分析。

色谱系统采用安捷伦气相色谱系统（Agilent 7890A）。质谱系统采用美国安捷伦公司的四极质谱检测系统（Agilent 5977B），配有电子碰撞离子源（EI）和MassHunter工作站。色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30m×250pm×0.25umD)；载气：He；加热器温度：250℃：程序升温条件为：初始温度140℃/min升至200℃，保持5min，再以8℃/min升至240℃：分流比：50∶1；进样量：5μl。使用EI，以全扫描模式检测分析物，质量扫描范围（m / z）：30-600。根据现有数据库对甲基化多糖的特征片段进行比较确认键合方法。

根据保留时间和复杂碳水化合物研究中心（CCRC）光谱数据库中部分甲基化糖醇乙酸酯（PMAA）的标准数据，灰树花多糖主要由7个糖苷片段组成（表2）。非还原末端 (t-Glc(p))和分支糖残基(1,3,4-Glc(p)，1,2,4-Glc(p)，1,3,6-Glc(p)和1,4,6-Glc(p)) 的摩尔比分别达到14.524%和15.017%，表明可能存在分支残基。

表2 实施例4获得的灰树花多糖的甲基化分析结果

核磁共振（NMR）分析：取适量实施例4中获得的灰树花多糖，溶于0.5ml D₂O中，使用Bruker Avance AV600 NMR光谱仪进行NMR分析。图7、8分别为灰树花多糖核磁共振¹H谱图和¹³C谱图。氢谱信号主要集中在1.5~6.5ppm之间。δ3.2-4.0ppm为糖环质子信号，主要端基质子峰δ5.13、5.6、5.7、4.56、4.42的信号峰集中分布在4.3~5.5ppm区域内（图7）。碳谱分析在13C NMR(500MHz, D2O)（图8）中进行：核磁碳谱信号主要集中在55-110ppm之间。通过观察碳谱可以看到，主要异头碳信号峰δ98.71、76.24、71.85、70.27、59.88。结合碳氢相关谱(HMBC)、碳氢相关谱（HMQC）、氢-氢相关谱（H-H COSY）、氢-氢相关谱（H-H NOESY）推测灰树花多糖的连接方式（表3），结构可表示为：以→3)-β-D-Glcp(1→[4)-α-D-Glcp(1→]n4-β-D-Glcp(1→4)-α-D-Glcp(1→循环为主链，在→4-β-D-Glcp(1→的六号位存在→3)-β-D-Glcp(1→[4)-α-D-Glcp(1→]n支链的大分子多糖结构，端基为β-D-Glcp(1→。

表3 实施例5中获得的灰树花多糖的1H和13C NMR化学位移信息

扫面电镜分析：为了观察多糖的微观结构和形态特征，对实施例4中获得的灰树花多糖进行扫描电镜分析（图9）。在聚集状态下，观察到具有不均匀表面的不规则分支网络结构，表明多糖无定形结构。多糖表面厚薄不均，出现波峰和凹陷，可能是多糖的分枝结构造成的。

测试例3：灰树花纯化多糖治疗肥胖及调控血脂功能活性研究

（1）试验材料

药物：生理盐水、实施例4获得的灰树花纯化多糖。

（2）试验方法

小鼠分组及给药：准备50只健康8周龄雄性C57BL/6J小鼠，饲养温度23±1℃，相对湿度55±5%，10只小鼠正常饲料喂养，作为对照组（灌胃给予10 mL/kg生理盐水）。40只小鼠采用高脂饲料喂养建立DIO小鼠模型。DIO小鼠随机分成4组，每组10只，分别作为模型组（灌胃给予10 mL/kg生理盐水）、给药组（灌胃给予实施例4获得的灰树花纯化多糖50 mg/kg和100 mg/kg）、阳性对照组（灌胃给予辛伐他汀3 mg/kg）。连续给药8周。

样本的制备方法：末次给药后，各组小鼠禁食、不禁水4 h后摘眼球取血，室温静置30 min，3000 r/min离心10 min，取上清，置于-80℃冰箱保存待用。随后将实验动物处死、迅速分离小鼠eWAT、iWAT和rWAT三种脂肪，-80℃冰箱保存，备用。

血清脂代谢相关因子检测：根据ELISA试剂盒提供说明书进行测试，检测小鼠血清中胆固醇（TC），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。

组织病理学观察：脂肪和肝脏标本在4%多聚甲醛中固定，4℃保存。常规石蜡包埋、切片，采用HE染色，通过光学显微镜观察，进行病理分析。

（3）试验结果

对血清脂代谢标志物的影响：

脂代谢紊乱是诱发高脂血症的关键原因，血清中的TG，TC，HDL-C，LDL-C的含量可在一定程度反映机体脂肪代谢状况，可作为监测血脂变化的重要指标。研究表明高脂血症会导致TC、TG、LDL-C水平升高，而HDL-C水平降低。各组对DIO小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影响结果如表4所示。与空白组相比，模型组组小鼠血清中LDL-C、TC和TG水平明显升高，HDL-C水平明显降低。和阳性对照结果类似，实施例4获得的灰树花纯化多糖能够有效改善上述因子的水平，具有显著的降血脂活性。

表4 实施例4获得灰树花纯化多糖对血清脂代谢标志物水平的影响

对DIO小鼠脂肪病理学的影响：

肥胖会引起小鼠脂肪组织中出现大量体积较大的白色空泡，脂滴数量和体积均显著增加，脂肪浸润度高。各组对小鼠三种脂肪组织的影响如图10所示：与模型组相比，实施例4获得灰树花纯化多糖能使脂滴数量和体积明显下降，改善高脂饮食造成的脂肪组织脂质积累，减少脂质浸润，效果与阳性对照结果相似。进一步说明其具有更好的降血脂效果。

Claims

1.一种具有调节血脂功能的灰树花纯化多糖，其特征在于：

分子量为4188.9 kDa，由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，其摩尔比（mol%）为99.73:0.17:0.10，结构为：

以→3)-β-D-Glcp(1→[4)-α-D-Glcp(1→]n4-β-D-Glcp(1→4)-α-D-Glcp(1→循环为主链，在→4-β-D-Glcp(1→的六号位存在→3)-β-D-Glcp(1→[4)-α-D-Glcp(1→]n支链的大分子多糖结构，端基为β-D-Glcp(1→。

2.如权利要求1所述的一种调控血脂功能的灰树花纯化多糖的制备方法，包括以下步骤：

1）灰树花经子实体经乙醇浸泡24小时进行脱脂；收集残渣于50℃烘箱内干燥至恒重后，超微粉碎成粉末，过150目筛；

2）按料液比1:40加入去离子水，搅拌均匀后浸泡40分钟，于80℃恒温水浴中提取2小时；

3）冷却至室温后离心取上清，旋转蒸发浓缩至1/6体积，Sevag法去蛋白；

4）取上清液浓缩，使用80%（v/v）乙醇进行沉淀，4℃过夜，收集沉淀，进行冻干，即获得灰树花粗多糖，称为GFP；

5）将灰树花粗多糖用去离子水溶解，通过快流速二乙胺基乙基琼脂糖凝胶，以氯化钠溶液洗脱，浓度为0.1mol/L，流速为0.1mL/min，分别收集溶液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/6体积，4℃透析过夜，进行冻干；

6）将通过DEAE凝胶柱获得的灰树花多糖冻干粉末溶于去离子水，通过HiLoad 16/600Superdex 200制备级色谱柱进行进一步纯化，以氯化钠溶液洗脱，浓度为0.15mol/L，分管收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，收集主峰，旋转蒸发浓缩至1/6体积，4℃透析过夜，进行冻干即得。

3.如权利要求1所述的调控血脂功能的灰树花纯化多糖在制备治疗肥胖药物中的用途。

4.如权利要求1所述的调控血脂功能的灰树花纯化多糖在制备具有调节血脂功能药物中的用途。