CN115572333B - 提取红汁乳菇多糖类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种提取红汁乳菇多糖类化合物的方法，涉及活性物质提取领域。该方法：将红汁乳菇子实体依次进行冻干、粉碎、脱脂、水提取、除蛋白、醇沉和树脂吸附得到红汁乳菇精多糖混合物；向红汁乳菇精多糖混合物内逐滴加入无水乙醇进行醇沉纯化，并逐步收集沉淀物，得到红汁乳菇多糖‑10/40/60/80活性成分；将所述红汁乳菇多糖‑10/40/60/80活性成分分别进行液相色谱制备，然后透析、后处理得到红汁乳菇多糖LHP‑1、红汁乳菇多糖LHP‑2、红汁乳菇多糖LHP‑3、红汁乳菇多糖LHP‑4、红汁乳菇多糖LHP‑5。本申请提供的提取红汁乳菇多糖类化合物的方法，首次从红汁乳菇子实体中提取得到5种多糖类化合物。

Description

提取红汁乳菇多糖类化合物的方法
技术领域
本申请涉及活性物质提取领域，尤其涉及一种提取红汁乳菇多糖类化合物的方法。
背景技术
红汁乳菇(Lactarius hatsudake Tanaka)隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、红菇科、乳菇属，主要分布在东亚地区。其营养丰富，是一种可食用和药用的珍贵食用菌。
据研究表明，红汁乳菇中含有大量的有效成分，例如氨基酸、维生素和糖类。
从红汁乳菇中分离出新的有效成分并对其进行研究，对于深度开发红汁乳菇具有十分重要的意义。
发明内容
本申请的目的在于提供一种提取红汁乳菇多糖类化合物的方法，以解决上述问题。
为实现以上目的，本申请采用以下技术方案：
一种提取红汁乳菇多糖类化合物的方法，包括：
将红汁乳菇子实体依次进行冻干、粉碎、脱脂、水提取、除蛋白、醇沉和树脂吸附得到红汁乳菇精多糖混合物；
向所述红汁乳菇精多糖混合物内逐滴加入无水乙醇进行醇沉纯化，并逐步收集乙醇体积浓度为10％、40％、60％、80％的沉淀物，得到红汁乳菇多糖-10/40/60/80活性成分；
将所述红汁乳菇多糖-10/40/60/80活性成分分别进行液相色谱制备，然后透析、后处理得到红汁乳菇多糖LHP-1、红汁乳菇多糖LHP-2、红汁乳菇多糖LHP-3、红汁乳菇多糖LHP-4、红汁乳菇多糖LHP-5；
所述液相色谱制备的条件包括：进样量1mL，色谱柱为SUGAR-BRT-102凝胶色谱柱，柱温35℃，柱长28cm，流速1.3mL/min，流动相为0.2mol/L氯化钠水溶液；
所述红汁乳菇多糖LHP-1的结构式为：
Figure GDA0003942367090000011
所述红汁乳菇多糖LHP-2的结构式为：
Figure GDA0003942367090000021
所述红汁乳菇多糖LHP-3的结构式为：
Figure GDA0003942367090000022
所述红汁乳菇多糖LHP-4的结构式为：
Figure GDA0003942367090000023
所述红汁乳菇多糖LHP-5的结构式为：
Figure GDA0003942367090000024
优选地，所述的方法满足以下条件中的至少一个：
a.所述冻干的温度为-80℃，时间为2-3d；
b.所述粉碎得到的颗粒物的粒径小于等于60目；
c.所述脱脂包括：使用无水乙醇反复浸泡所述粉碎得到的颗粒物，固液分离后收集固体物，干燥后再次粉碎，过60目筛得到预处理红汁乳菇冻干粉；
d.所述水提取包括：将所述脱脂后的固体物和水混合，在85℃-100℃条件下处理3h，固液分离后将固体物重复进行前述操作，合并液体得到粗多糖水溶液，浓缩得到浓缩粗多糖水溶液。
优选地，所述除蛋白包括：将所述水提取得到的溶液用木瓜蛋白酶和sevage试剂进行处理，液体放入8000-14000Da透析袋于4℃静置2-3天，期间2h换一次水，透析后浓缩得到除蛋白浓缩液。
优选地，所述醇沉包括：向所述除蛋白得到的溶液中逐滴加入4倍体积的乙醇，静置、离心得到多糖沉淀物，加水复溶后减压浓缩，冻干得到红汁乳菇次多糖。
优选地，所述树脂吸附包括：将所述醇沉得到的固体物溶于水中，然后加入活化后的JK008大孔树脂，搅拌吸附6-12h，固液分离后液体离心去除不溶物，减压蒸馏、二次醇沉、冻干得到所述红汁乳菇精多糖混合物。
优选地，进行所述醇沉纯化的过程中，每一浓度梯度滴加结束后在4℃条件下静置12h，离心得到所述沉淀物。
优选地，所述沉淀物加水复溶后减压浓缩、冻干得到所述红汁乳菇多糖-10/40/60/80活性成分。
优选地，进行所述液相色谱制备之前还包括：
将所述红汁乳菇多糖-10/40/60/80活性成分分别以水混合，60℃水浴30min，随后涡旋，过0.45μm水膜，得到相应样品。
优选地，所述透析包括：使用7000Da透析袋透析2d。
优选地，所述后处理包括：将所述透析之后得到的多糖溶液进行旋蒸、冻干，得到相应的化合物。
与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请提供的提取红汁乳菇多糖类化合物的方法，以红汁乳菇子实体为原料，进行冻干(除水分)、粉碎(提高提取率)、预处理(除去色素、小分子物质等杂质)、水提取(得到水溶性粗多糖)、除蛋白、醇沉(除去色素、小分子物质等杂质)和树脂吸附(除杂)得到红汁乳菇精多糖混合物，然后进行醇沉纯化得到4个部分的活性成分，最后进行液相色谱制备(依据分子量分级，得到单一组分)、透析(除盐)、后处理得到目标化合物。
本申请使用该方法首次从红汁乳菇子实体中提取得到红汁乳菇多糖LHP-1、红汁乳菇多糖LHP-2、红汁乳菇多糖LHP-3、红汁乳菇多糖LHP-4、红汁乳菇多糖LHP-5，前述化合物具有很好的抗肿瘤作用。
从红汁乳菇冻干粉得到红汁乳菇多糖混合物的得率为4.7％，纯度为85-91％；最终得到的LHP1/2/3/4/5的得率分别为：0.13％，1.41％，0.24％，0.564％，0.17％。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。
图1为实施例1进行液相制备的曲线；
图2为分子量测试曲线；
图3为红汁乳菇多糖LHP-1的扫描电子显微镜照片；
图4为红汁乳菇多糖LHP-2的扫描电子显微镜照片；
图5为红汁乳菇多糖LHP-3的扫描电子显微镜照片；
图6为红汁乳菇多糖LHP-4的扫描电子显微镜照片；
图7为红汁乳菇多糖LHP-5的扫描电子显微镜照片；
图8为红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5的红外光谱图；
图9为标准品洗脱曲线；
图10为红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5样品扫描曲线；
图11为红汁乳菇多糖LHP-1的1H NMR谱图；
图12为红汁乳菇多糖LHP-1的13C NMR谱图；
图13为红汁乳菇多糖LHP-1的1H 1H COSY谱图；
图14为红汁乳菇多糖LHP-1的HMBC谱图；
图15为红汁乳菇多糖LHP-1的HSQC谱图；
图16为红汁乳菇多糖LHP-2的1H NMR谱图；
图17为红汁乳菇多糖LHP-2的13C NMR谱图；
图18为红汁乳菇多糖LHP-2的1H 1H COSY谱图；
图19为红汁乳菇多糖LHP-2的HMBC谱图；
图20为红汁乳菇多糖LHP-2的HSQC谱图；
图21为红汁乳菇多糖LHP-3的1H NMR谱图；
图22为红汁乳菇多糖LHP-3的13C NMR谱图；
图23为红汁乳菇多糖LHP-3的1H 1H COSY谱图；
图24为红汁乳菇多糖LHP-3的HMBC谱图；
图25为红汁乳菇多糖LHP-3的HSQC谱图；
图26为红汁乳菇多糖LHP-4的1H NMR谱图；
图27为红汁乳菇多糖LHP-4的13C NMR谱图；
图28为红汁乳菇多糖LHP-4的1H 1H COSY谱图；
图29为红汁乳菇多糖LHP-4的HMBC谱图；
图30为红汁乳菇多糖LHP-4的HSQC谱图；
图31为红汁乳菇多糖LHP-5的1H NMR谱图；
图32为红汁乳菇多糖LHP-5的13C NMR谱图；
图33为红汁乳菇多糖LHP-5的1H 1H COSY谱图；
图34为红汁乳菇多糖LHP-5的HMBC谱图；
图35为红汁乳菇多糖LHP-5的HSQC谱图；
图36为红汁乳菇多糖混合物抑制HepG2荷瘤小鼠肿瘤增长实验小鼠肿瘤体积变化照片；
图37为红汁乳菇多糖混合物抑制HepG2荷瘤小鼠肿瘤增长实验小鼠脏器照片；
图38为细胞存活率柱状图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。
实施例1
本实施例提供一种提取红汁乳菇多糖类化合物的方法，具体包括以下步骤：
(1)红汁乳菇多糖混合物的制备：
冻干：取红汁乳菇子实体擦净、去蒂，于冻干机干燥2天。
粉碎：取冻干的红汁乳菇子实体粉碎，过60目筛，得到红汁乳菇冻干粉。
脱脂：取300g红汁乳菇粉于5000mL烧杯中，加入3000mL无水乙醇，室温下静置12h，抽滤，上清液60℃减压浓缩回收乙醇，滤饼继续重复此操作共3次，最后收集滤饼，冷风烘干，烘干后的滤饼用粉碎机粉碎，过60目筛，得到预处理红汁乳菇冻干粉。
水提：取300g预处理红汁乳菇冻干粉于反应釜，加入6000mL超纯水，于85℃条件下水浴搅拌3h，将混合液先用纱布过滤分离滤渣和水溶液，得到的水溶液进一步5000rap离心15min，收集滤渣重复上述操作，收集两次上清液合并为粗多糖水溶液，减压浓缩至1500mL。
除蛋白：将浓缩后粗多糖水溶液中，加入3g木瓜蛋白酶，60℃下反应1h，反应结束后，将温度上升到100℃灭活10min，10000rap离心20min除去蛋白质，收集上清液，加入1/4体积的sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，磁力搅拌反应20min后10000rap离心20min，取上层水相，除去中间蛋白质沉淀以及下层有机相，此操作重复5次直到无蛋白质沉淀。多糖水溶液于60℃减压浓缩除去有机相反复加水旋蒸，直到体系无有机，收集的上清液放入14000Da透析袋于4℃静置2天，期间2h换一次水，透析后的溶液减压浓缩至600mL。
醇沉：将上述水提浓缩液加入4倍体积的乙醇，用分液漏斗调速至逐滴落下，同时利用磁力搅拌保证每滴乙醇均匀散落到整个溶液体系，于4℃条件下静置12h，10000rap离心10min，将多糖沉淀物加水复溶，60℃减压浓缩除去乙醇，浓缩液冻干得红汁乳菇次多糖。
树脂吸附：取30mg红汁乳菇次多糖溶于3000mL超纯水，加入500g活化好的JK008大孔树脂，搅拌吸附6h，用纱布过滤分离树脂和多糖水溶液，10000rap离心20min除去不溶物，60℃减压浓缩、醇沉、冻干，得到红汁乳菇多糖混合物。
(2)红汁乳菇多糖-1/2/3/4/5的制备：
醇沉纯化：取1g红汁乳菇多糖混合物溶于200mL超纯水，逐滴加入无水乙醇至体系为10％浓度，于4℃静置12h，离心得到红汁乳菇多糖-10沉淀，收集上清液继续加入无水乙醇至体系为40％浓度，于4℃静置12h，离心得到红汁乳菇多糖-40沉淀，收集上清液继续加入无水乙醇至体系为60％浓度，于4℃静置12h，离心得到红汁乳菇多糖-60沉淀，收集上清液继续加入无水乙醇至体系为80％浓度，于4℃静置12h，离心得到红汁乳菇多糖-80沉淀。多糖复溶，减压浓缩，冻干得到红汁乳菇多糖-10/40/60/80活性成分。
制备液相纯化：取100mg红汁乳菇多糖-10/40/60/80活性成分于5mL EP管中，加入2mL超纯水，于60℃水浴30min，随后涡旋，过0.45水膜，进样量1mL，色谱柱为SUGAR-BRT-102凝胶色谱柱，检测器：岛津RID-10A示差折光检测器，流动相为0.2mol/L氯化钠水溶液，流速1.3mL/min，将收集的洗脱组分利用7000Da透析袋透析2天，透析完后的多糖溶液旋蒸、冻干得到红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5，结果如图1所示(5个化合物对应的时间依次分别为12.28、13.78、18.22、38.419、43.89min)。
为了进一步说明所得多糖化合物的结构，对红汁乳菇多糖-LHP-1/2/3/4/5的结构表征，具体如下：
(1)分子量分析：将1mg红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5与葡聚糖标准品配成0.1mg/mL溶液，采用凝胶色谱仪进行分析对红汁乳菇精多糖LHP和LHP-1/2/3/4/5的分子量进行测试。实验结果如图2，红汁乳菇多糖-LHP-1/2/3/4/5的重均分子量分别为712kDa、515kDa、303kDa、20kDa、7kDa。
(2)扫描电镜：将红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5固定在带有导电胶的铝板上，使用离子溅射涂布机在真空下喷金。通过扫描电子显微镜分析每个样品的表面形态，结果如图3、图4、图5、图6、图7所示(分别依次对应红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5)。
(3)红外光谱：取1mg红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5冻干样品，以与100mg KBr固体混合均匀，研磨成粉末，然后将粉末压入1mm厚的圆盘中压成透明压片，使用傅里叶变换红外光谱仪在4000-400cm1的频率范围内扫描，如图8所示。
(4)单糖组成：称一定量样品(2mg左右)于1.5mL EP管中，配置4mg/mL的样品溶液。取200μL样品溶液于具塞试管中，加入400μL 4M的三氟乙酸溶液混匀，于110℃油浴条件下水解2h，随后氮吹吹干，再加入400μL乙醇使其溶解。取单糖样品加超纯水配成1mg/mL溶液，备用。取上述溶液(单糖溶液或多糖水解液)100μL于2mL EP管中，分别加入100μL 0.3M的NaOH溶液和0.5M的PMP-甲醇溶液，混匀后于70℃条件下反应30min，冷却后再加入0.3M的HCl溶液，补水至1mL，再加入1mL三氯甲烷将PMP萃取出来，重复三次。将上层溶液过膜备用。
LHPLC条件：色谱柱：Sepax Bio-C18，4.6×250mm，5μm，检测器：RID-10A示差折光检测器，波长250nm，流动相：0.05M甲酸铵溶液和乙腈，比例为83：17；流速1mL/min。
标品顺序依次为甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖得到的洗脱曲线如图9，样品扫描图如图10所示。
(5)红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5甲基化分析：
称量多糖样品(2-3mg)置于玻璃反应瓶中，加入1mL无水DMSO，快速加入甲基化试剂A液，封闭，在超声作用下溶解，再加入甲基化试剂B液。在磁力搅拌水浴30℃反应60min反应。最后将2mL超纯水加入到上述混合物中终止甲基化反应。
取甲基化后的多糖，加入1mL的2M三氟乙酸(TFA)水解90min，旋转蒸发仪蒸干。残基加入2mL双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，101℃烘箱烘干，然后加入1mL乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却。然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。
将乙酰化后的产物用3mL CH2Cl2溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。CH2Cl2层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，放入液相小瓶。分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品；
GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30m*0.25mm*0.25μm；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。结果如表1、表2、表3、表4、表5。
表1 LHP-1纯化组分多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析
Figure GDA0003942367090000061
Figure GDA0003942367090000071
表2 LHP-2纯化组分多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析
RT Methylated sugar Mass fragments(m/z) Molar ratio Type of linkage
17.959 2,3,4-Me3-Fucp 43,59,72,89,101,115,117,131,175 0.007 Fucp-(1→
23.889 2,3,4,6-Me4-Glcp 43,71,87,101,117,129,145,161,205 0.056 Glcp-(1→
29.1 2,3,6-Me3-Galp 43,87,99,101,113,117,129,131,161,173,233 0.014 →4)-Galp-(1→
30.404 2,3,6-Me3-Glcp 43,87,99,101,113,117,129,131,161,173,233 0.790 →4)-Glcp-(1→
33.619 2,6-Me2-Glcp 43,87,97,117,159,185 0.046 →3,4)-Glcp-(1→
36.661 2,3-Me2-Glcp 43,71,85,87,99,101,117,127,159,161,201 0.081 →4,6)-Glcp-(1→
40.815 2-Me1-Glcp 43,58,87,97,117,139 0.006 →3,4,6)-Glcp-(1→
表3 LHP-3纯化组分多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析
Figure GDA0003942367090000072
表4 LHP-4纯化组分多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析
RT Methylated sugar Mass fragments(m/z) Molar ratio Type of linkage
17.622 2,3,5-Me3-Xylp 43,71,87,101,117,129,145,161 0.010 Xylp-(1→
17.993 2,3,4-Me3-Fucp 43,59,72,89,101,115,117,131,175 0.245 Fucp-(1→
21.41 2,4-Me2-Xylp 43,58,85,99,101,117,127,159,173 0.006 →3)-Xylp-(1→
21.705 2,3-Me2-Xylp 43,71,87,99,101,117,129,161,189 0.002 →4)-Xylp-(1→
23.699 2,3,4,6-Me4-Glcp 43,71,87,101,117,129,145,161,205 0.035 Glcp-(1→
24.667 2,3,4,6-Me4-Galp 43,71,87,101,117,129,145,161,205 0.005 Galp-(1→
28.708 2,4,6-Me3-Glcp 43,87,99,101,117,129,161,173,233 0.013 →3)-Glcp-(1→
29.351 2,3,6-Me3-Glcp 43,87,99,101,113,117,129,131,161,173,233 0.031 →4)-Glcp-(1→
30.62 2,3,4-Me3-Glcp 43,87,99,101,117,129,161,189,233 0.035 →6-Glcp-(1→
32.78 2,3,4-Me3-Galp 43,87,99,101,117,129,161,189,233 0.262 →6)-Galp-(1→
33.334 2,6-Me2-Glcp 43,87,97,117,159,185 0.003 →3,4)-Glcp-(1→
36.226 2,3-Me2-Glcp 43,71,85,87,99,101,117,127,159,161,201 0.006 →4,6)-Glcp-(1→
36.699 2,4-Me2-Galp 43,87,117,129,159,189,233 0.010 →3,6)-Galp-(1→
38.702 3,4–Me2-Manp 43,87,99,129,189 0.337 →2,6)-Manp-(1→
40.686 2-Me1-Galp 43,87,97,117,139,159,173,233 0.001 →3,4,6)-Galp-(1→
表5 LHP-5纯化组分多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析
Figure GDA0003942367090000081
Figure GDA0003942367090000091
(6)核磁共振分析：取30mg红汁乳菇多糖/2/3/4/5溶于1mL重水中，放入5mL的试管。将溶液移入核磁管，采用脉冲傅里叶变换谱仪，对样品进行扫描。得到的LHP-1的1HNMR、13C NMR、1H 1H COSY、HMBC、HSQC谱图见图11、图12、图13、图14、图15；LHP-2的谱图见图16、图17、图18、图19、图20；LHP-3的谱图见图21、图22、图23、图24、图25；LHP-4的谱图见图26、图27、图28、图29、图30；LHP-5的谱图见图31、图32、图33、图34、图35。由图可知，红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5的各个糖残基的13C、1H的化学位移如表6、表7、表8、表9、表10所示，与甲基化结构符合。
表6红汁乳菇多糖LHP-1糖残基的13C、1H的化学位移
Figure GDA0003942367090000092
表7红汁乳菇多糖LHP-2糖残基的13C、1H的化学位移
Figure GDA0003942367090000093
表8红汁乳菇多糖LHP-3糖残基的13C、1H的化学位移
Figure GDA0003942367090000101
表9红汁乳菇多糖LHP-4糖残基的13C、1H的化学位移
Figure GDA0003942367090000102
表10红汁乳菇多糖LHP-5糖残基的13C、1H的化学位移
Figure GDA0003942367090000103
Figure GDA0003942367090000111
经过以上对红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5的结构表征，解析如下：
LHP-1组分的1H和13C NMR谱图，在异头质子(4.3-5.2ppm)和异头碳(90-110ppm)区域有6个主峰，结合甲基化和单糖组成结果，将信号强较的5.32/99.72、4.93/100.11和5.04/98.47分别归属于→4)-α-Glcp-(1→、→4,6)-α-Glcp-(1→和→α-Fucp-(1→，剩下的弱信号将4.93/98.02、5.28/100.11和5.15/91.87归属于→6)-α-Galp-(1→、α-Glcp-(1→和→3,4,6)-α-Glcp-(1→。再依据HSQC和13C找出对应质子的共振峰。HMBC图所示，交叉峰5.32/71.07和3.50/99.72说明→4)-α-Glcp-(1→的H-1和C-4以及C-1的H-4有偶联关系，交叉峰3.61/99.72说明→4)-α-Glcp-(1→的C-1和→4,6)-α-Glcp-(1→的H4有偶联关系，作为此组分的主链。除此之外，交叉峰5.04/71.06说明→α-Fucp-(1→的H-1和→4,6)-α-Glcp-(1→的C-6有偶联关系。交叉峰4.93/70.43和4.93/71.06说明→6)-α-Galp-(1→的H1和→4,6)-α-Glcp-(1→和→6)-α-Galp-(1→的C-6偶联。
综合上述结果，红汁乳菇多糖LHP-1的结构式为：
Figure GDA0003942367090000112
LHP-2组分的1H和13C NMR谱图，在异头质子(4.3-5.2ppm)和异头碳(90-110ppm)区域有6个主峰，结合甲基化和单糖组成结果，将信号强较的5.32/101.07、5.29/101.45和4.90/100.03分别归属于→4)-α-Glcp-(1→、Glcp-(1→和→4,6)-α-Glcp-(1→，剩下的弱信号将5.15/93.35、5.15/93.35和4.57/97.28归属于→3,4)-α-Glcp-(1→、→3,4,6)-α-Glcp-(1→和→4)-β-Galp-(1→。再依据HSQC和13C找出对应质子的共振峰。HMBC图谱交叉峰5.32/73.02、5.32/76.60、5.32/72.02、5.32/78.35说明→4)-α-Glcp-(1→的H-1和→4)-α-Glcp-(1→、→4,6)-α-Glcp-(1→、→3,4)-α-Glcp-(1→的C-4以及→3,4,6)-α-Glcp-(1→的C-3偶联，交叉峰5.29/72.01表明Glcp-(1→的H-1和→4,6)-α-Glcp-(1→的C-6偶联，交叉峰4.57/76.33表明→4)-β-Galp-(1→的H-1和→3,4)-α-Glcp-(1→的C-3偶联。
综合上述结果，红汁乳菇多糖LHP-2的结构式为：
Figure GDA0003942367090000121
LHP-3组分的1H和13C NMR谱图，在异头质子(4.3-5.2ppm)和异头碳(90-110ppm)区域有6个主峰，结合甲基化和单糖组成结果，将信号强较的4.89/99.39、4.89/101.50和5.00/99.783分别归属于→6)-α-Galp-(1→、→2,6)-α-Manp-(1→和→α-Fucp-(1→，剩下的弱信号将5.29/101.05、4.84/101.05和5.27/101.26归属于→4)-α-Glcp-(1→、→3)-α-Glcp-(1→和α-Glcp-(1→。再依据HSQC和13C找出对应质子的共振峰。HMBC图谱交叉峰4.89/71.14、4.89/78.36说明→6)-α-Galp-(1→的H-1和→6)-α-Galp-(1→的C-6以及→2,6)-α-Manp-(1→的C-6偶联，交叉峰5.00/70.36表明→α-Fucp-(1→的H-1和→2,6)-α-Manp-(1→的C-2偶联，交叉峰4.84/70.36表明→3)-α-Glcp-(1→的H-1和→2,6)-α-Manp-(1→的C-2偶联。
综合上述结果，红汁乳菇多糖LHP-3的结构式为：
Figure GDA0003942367090000122
LHP-4组分的1H和13C NMR谱图，在异头质子(4.3-5.2ppm)和异头碳(90-110ppm)区域有7个主峰，结合甲基化和单糖组成结果，将信号强较的4.88/99.34、4.88/101.4和4.99/100.10分别归属于→6)-α-Galp-(1→、→2,6)-α-Manp-(1→和α-Fucp-(1→，剩下的弱信号将5.27/101.01、4.82/101.00、5.24/101.13和4.41/104.41归属于→4)-α-Glcp-(1→、→3)-α-Glcp-(1→、α-Glcp-(1→和→6)-β-Glcp-(1→。再依据HSQC和13C找出对应质子的共振峰。HMBC图谱交叉峰4.88/78.28、4.88/71.27说明→6)-α-Galp-(1→的H-1和→6)-α-Galp-(1→的C-6以及→2,6)-α-Manp-(1→的C-6偶联，交叉峰4.89/78.28表明α-Fucp-(1→的H-1和→2,6)-α-Manp-(1→的C-2偶联，交叉峰3.86/101.01、3.86/100.00、3.86/101.03表明→2,6)-α-Manp-(1→的H-2和→4)-α-Glcp-(1→、→3)-α-Glcp-(1→和α-Glcp-(1→的C-1偶联，交叉峰3.38/104.41说明→4)-α-Glcp-(1→的H-4和→6)-β-Glcp-(1→的C-1偶联。
综合上述结果，红汁乳菇多糖LHP-4的结构式为：
Figure GDA0003942367090000123
LHP-5组分的1H和13C NMR谱图，在异头质子(4.3-5.2ppm)和异头碳(90-110ppm)区域有8个主峰，结合甲基化和单糖组成结果，将信号强较的4.62/104.15、4.44/104和5.15/93.11分别归属于→3)-α-Glcp-(1→、→6)-β-Glcp-(1→和→3，6)-β-Glcp-(1→，剩下的弱信号将4.92/99.23、4.92/101.3和5.26/101.63、5.31/100.89和5.03/99.58归属于→2,6)-α-Manp-(1→、→6)-α-Galp-(1→、α-Glcp-(1→、→4)-α-Glcp-(1→和α-Fucp-(1→。再依据HSQC和13C找出对应质子的共振峰。HMBC图谱交叉峰4.62/85.23说明→3)-α-Glcp-(1→的H-1和→3)-α-Glcp-(1→以及→3，6)-β-Glcp-(1→的C-3偶联，交叉峰3.36/100.40和3.67/100.40表明→6)-β-Glcp-(1→的C-1和→3，6)-β-Glcp-(1→以及→2,6)-α-Manp-(1→的H-6偶联，交叉峰5.03/71.38和4.92/71.38说明→2,6)-α-Manp-(1→的C-2和→6)-α-Galp-(1→以及Fucp-(1→的H-1相连。
综合上述结果，红汁乳菇多糖LHP-5的结构式为：
Figure GDA0003942367090000131
为了研究所得到的红汁乳菇多糖混合物和红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5的相关作用，特进行如下试验：
1.红汁乳菇多糖混合物LHP抑制HepG2荷瘤小鼠肿瘤增长实验
选取雄性BALB/C裸鼠(4～5周龄)(SPF级)，维持在标准条件下(25±2℃，60±5％的湿度，12h光/暗循环)，自由获得食物和水。小鼠适应一周后开始造模。液氮中取出HepG2细胞冻存管，迅速置于37℃水浴并轻轻摇动，使迅速完全解冻。超净台内用75％酒精擦拭冻存管外表面，无菌操作，除去封口膜，打开管盖，吸管吸出细胞悬液，置于15mL BD离心管中，补加生理盐水至10mL左右，吸管轻轻吹打均匀悬浮细胞，800r/min离心10min，弃上清。再重复上述洗涤过程两次，适量生理盐水均匀悬浮细胞，计数，每只小鼠注射1×107个/只，0.2mL/只无菌条件下接种于小鼠腹腔内，至肿瘤体积至100mm3，则造模成功。实验分为3组，模型组灌胃生理盐水，多糖干预组(剂量分别为250、500mg/kg)，每组5只小鼠。实验前称取每只小鼠体重，实验期间正常饮食并测量体重和肿瘤体积，如表11、图36，与对照组相比，肿瘤体积明显减小。实验组灌胃对应剂量多糖样品，17天后解剖，摘取肝脏、脾脏、胸腺、结肠等脏器如表12、图37，与对照组相比，肝脏病理情况减少，脾腺减小。
表11多糖对HepG2荷瘤小鼠肿瘤体积的影响(x±s，n＝5)
Figure GDA0003942367090000132
注：与模型对照组比较，*P≤0.05，**P≤0.01。
表12多糖对HepG2荷瘤小鼠肿瘤肿瘤、肝脏、脾脏脏体比的影响
组别 瘤体比(％) 肝体比(％) 脾体比(％)
模型对照组 3.123±0.887 6.541±0.630 0.879±0.083
多糖干预低剂量组 2.398±0.892 6.382±0.541 0.629±0.221*
多糖干预高剂量组 1.298±0.854* 6.670±0.170 0.715±0.044
注：与模型对照组比较，*P≤0.05；x±s，n＝5。
2.红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5抑制癌细胞增长实验
红汁乳菇精多糖LHP和LHP-1/2/3/4/5对HepG2细胞的实验过程：
细胞增殖实验：将HepG2细胞复苏后，置于含有10％PBS的DMEM/1640培养基中培养，并置于37℃、5％CO2条件的培养箱中。当HepG2细胞长满细胞培养皿底部时，加入1mL胰酶，细胞消化完成后吸去胰酶，向培养基中加入培基后，吹打，使用血球计数板计数，并按70～80％左右吸出原培养基，向96孔板中分别加入100μL含红汁乳菇多糖LHP-1/2/3/4/5浓度为0、25、50、100、200、400μg/mL的DMEM培养基，37℃孵育24h。再向各孔加入10μL的MTS试剂，孵育30min。使用酶标仪测490nm处的吸光度。计算细胞存活率，结果如图38所示(图内每组柱状图中从左至右依次为LHP-1/2/3/4/5)。
实施例2
与实施例1不同的是，水提温度为90℃，除蛋白过程中透析时间为3天，JK008大孔树脂吸附时间为10h。
实施例3
与实施例1不同的是，水提温度为100℃，JK008大孔树脂吸附时间为12h。
对比例1
多糖纯化部分，树脂选择JK008，纯度为85～90％，前期使用树脂D941得到的纯度仅73％。
乙醇分级时，多糖的浓度为5mg/mL，浓度过高，10％部分为坚硬胶状，无法分离。
对比例2
与实施例1不同的是，步骤(2)中醇沉纯化时，仅使用40％、60％和80％无水乙醇体系进行。
在该体系下，由于缺少10％浓度的处理，40％组分呈胶状，且凝胶色谱柱配合液相扫描图为多峰的复杂物，无法像实施例1的40％组分峰形单一，最后无法得到LHP-2组分。
对比例3
与实施例1不同的是，步骤(2)中醇沉纯化时，仅使用30％、40％、50％、60％和70％无水乙醇体系进行。
在该体系下，发现30％组分几乎占精多糖的80-90％，且组成复杂，均一性差，导致后面的4个组分量极少，整个多糖分离效果差，无法进行下一步分制备液相离。
分析醇沉体系可以发现，10％、40％、60％、80％体系的建立对于5个目标化合物的分离至关重要，同时也极大程度的影响着他们的纯度。其中，10％浓度无水乙醇的使用，是后续40％、60％、80％醇沉产物能够有效分离的关键。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种提取红汁乳菇多糖类化合物的方法，其特征在于，包括：
将红汁乳菇子实体依次进行冻干、粉碎、脱脂、水提取、除蛋白、醇沉和树脂吸附得到红汁乳菇精多糖混合物；所述树脂吸附包括：将所述醇沉得到的固体物溶于水中，然后加入活化后的JK008大孔树脂，搅拌吸附6-12 h，固液分离后液体离心去除不溶物，减压蒸馏、二次醇沉、冻干得到所述红汁乳菇精多糖混合物；
向所述红汁乳菇精多糖混合物内逐滴加入无水乙醇进行醇沉纯化，并逐步收集乙醇体积浓度为10%、40%、60%、80%的沉淀物，得到红汁乳菇多糖-10/40/60/80活性成分；所述红汁乳菇精多糖混合物的浓度小于5mg/ml；
将所述红汁乳菇多糖-10/40/60/80活性成分分别进行液相色谱制备，然后透析、后处理得到红汁乳菇多糖LHP-1、红汁乳菇多糖LHP-2、红汁乳菇多糖LHP-3、红汁乳菇多糖LHP-4、红汁乳菇多糖LHP-5；
所述液相色谱制备的条件包括：进样量1 mL，色谱柱为SUGAR-BRT-102凝胶色谱柱，柱温35℃，柱长28cm，流速1.3 mL/min，流动相为0.2 mol/L氯化钠水溶液；
所述红汁乳菇多糖LHP-1的结构式为：
Figure QLYQS_1
；
所述红汁乳菇多糖LHP-2的结构式为：
Figure QLYQS_2
；
所述红汁乳菇多糖LHP-3的结构式为：
Figure QLYQS_3
；
所述红汁乳菇多糖LHP-4的结构式为：
Figure QLYQS_4
；
所述红汁乳菇多糖LHP-5的结构式为：
Figure QLYQS_5
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，满足以下条件中的至少一个：
a.所述冻干的温度为-80℃，时间为2-3 d；
b.所述粉碎得到的颗粒物的粒径小于等于60目；
c.所述脱脂包括：使用无水乙醇反复浸泡所述粉碎得到的颗粒物，固液分离后收集固体物，干燥后再次粉碎，过60目筛得到预处理红汁乳菇冻干粉；
d.所述水提取包括：将所述脱脂后的固体物和水混合，在85℃-100℃条件下处理3 h，固液分离后将固体物重复进行前述操作，合并液体得到粗多糖水溶液，浓缩得到浓缩粗多糖水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述除蛋白包括：将所述水提取得到的溶液用木瓜蛋白酶和sevage试剂进行处理，液体放入8000-14000 Da透析袋于4℃静置2-3天，期间2 h换一次水，透析后浓缩得到除蛋白浓缩液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇沉包括：向所述除蛋白得到的溶液中逐滴加入4倍体积的乙醇，静置、离心得到多糖沉淀物，加水复溶后减压浓缩，冻干得到红汁乳菇次多糖。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述醇沉纯化的过程中，每一浓度梯度滴加结束后在4℃条件下静置12 h，离心得到所述沉淀物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述沉淀物加水复溶后减压浓缩、冻干得到所述红汁乳菇多糖-10/40/60/80活性成分。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述液相色谱制备之前还包括：
将所述红汁乳菇多糖-10/40/60/80活性成分分别以水混合，60℃水浴30 min，随后涡旋，过0.45 μm水膜，得到相应样品。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透析包括：使用7000 Da透析袋透析2d。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述后处理包括：将所述透析之后得到的多糖溶液进行旋蒸、冻干，得到相应的化合物。
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