CN113105567A - 一种蝉拟青霉甘露聚糖及其制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蝉拟青霉甘露聚糖及其制备和用途。该蝉拟青霉甘露聚糖由重量百分含量为99％以上的多糖组成；多糖的组成为甘露糖；多糖的结构以(1→2)连接的α‑甘露糖残基为主链，且每9个(1→2)连接的α‑甘露糖残基组成一个重复单元；每个重复单元中有5个α‑甘露糖残基的O‑6位上分别被支链取代。该蝉拟青霉甘露聚糖的制备包括：由蝉拟青霉菌在添加有由黄精、无花果和重楼三者组成的中药复合水提液的培养基中深层发酵所得菌丝体经热水提取、酶‑Sevage法去蛋白、透析袋分离和凝胶过滤层析纯化，真空冷冻干燥分离纯化得到蝉拟青霉甘露聚糖。该蝉拟青霉甘露聚糖具有显著的免疫增强作用，可作为免疫调节剂或用于制备免疫调节剂。

Description

一种蝉拟青霉甘露聚糖及其制备和用途

技术领域

本发明涉及真菌胞内多糖领域，具体涉及一种蝉拟青霉甘露聚糖及其制备和用途，属于高分子和分子生物学领域。

背景技术

蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae Miq.Samson)又名雌蝉花，是从蝉花子实体中有丝分裂出的孢子真菌。该真菌资源含有核苷类、多糖、多壳球菌素、蛋白、虫草酸、生物碱、氨基酸以及微量元素等多种成分。经研究表明，蝉拟青霉中的一些生物活性物质具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、保护肾脏、降血糖、降血脂等功能，在这些成分中活性多糖越来越受到人们的广泛关注，但蝉拟青霉中的多糖种类繁多，很多不具备生物活性，发现并提取出具有生物活性的多糖、进一步研究其高级结构、生物活性是多糖领域的研究重点。

越来越多的研究表明多糖生物功能的发挥是由其高级结构特征决定的，其高级结构(二级及三级结构)与生物功能的发挥更为密切，多糖的生物活性还与其分子量、分子链构象(Conformation)紧密相关，了解真菌次生代谢产物多糖分子的构象，更有助于阐明添加物对生物发酵途径的影响，更有利于其生物活性作用机制的阐释。

发明内容

本发明的目的是提供一种确定化学结构特征的蝉拟青霉甘露聚糖，该多糖是蝉拟青霉发酵过程生成的新的次生代谢产物，具有显著的免疫调节活性，具有良好的应用价值。

本发明的另一目的是提供所述蝉拟青霉甘露聚糖的制备方法，具有操作简单、易于控制的优点，适于推广应用。

本发明还提供了所述蝉拟青霉甘露聚糖的用途，该多糖具有显著的免疫调节活性，可作为免疫调节剂直接使用，也可用于制备免疫调节剂。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种蝉拟青霉甘露聚糖，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述多糖的组成为甘露糖(Man)；多糖的结构以(1→2)连接的α-甘露糖残基为主链，且每9个(1→2)连接的α-甘露糖残基组成一个重复单元；每个重复单元中有4个α-甘露糖残基的O-6位上分别被支链一取代，余下的5个α-甘露糖残基中有1个α-甘露糖残基的O-6位上被支链二取代；所述支链一是(1→3)连接的α-甘露糖残基和端基α-甘露糖；所述支链二是(1→6)连接的α-甘露糖残基和端基α-甘露糖。

可选的，所述甘露糖为α-D-甘露糖。所述α-甘露糖残基为α-D-甘露糖残基。

所述多糖的重复单元的结构有多种不同的变化组合，O-6位被支链一、支链二取代的α-甘露糖残基可以是重复单元中的任意5个α-甘露糖残基，所述支链一和支链二的排列顺序为任意顺序。这些多种不同的变化组合均具有免疫调节活性；例如可具有如结构式Ⅰ所示结构的重复单元：

式Ⅰ中，Manp为吡喃型甘露糖；n为重复单元的数量，可由重均分子量确定。

可选的，所述蝉拟青霉甘露聚糖的重均分子量为65KDa-95KDa，KDa为千道尔顿。

所述蝉拟青霉甘露聚糖是由蝉拟青霉菌在添加有由黄精、无花果和重楼三者组成的中药复合水提液的培养基中深层发酵、提取分离得到，是由黄精、无花果和重楼三者组成的中药复合水提液刺激蝉拟青霉发酵过程生成的新的次生代谢产物，该多糖具有显著的免疫调节活性，具有良好的应用价值。所述提取分离包括：经热水提取、酶-Sevage法去蛋白、透析袋分离和凝胶过滤层析纯化，真空冷冻干燥分离纯化。

具体技术方案如下：

一种蝉拟青霉甘露聚糖的制备方法，包括步骤：

(1)将由黄精、无花果和重楼组成的中药材经水溶液提取，得到中药复合水提液；该中药复合水提液能够刺激蝉拟青霉发酵过程生成新的次生代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖，该多糖具有生物活性。

(2)将步骤(1)中的中药复合水提液加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基；

添加有经黄精、无花果和重楼提取得到的中药复合水提液的蝉拟青霉发酵培养基可保证蝉拟青霉发酵过程生成新的次生代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖，该多糖具有生物活性。

(3)深层发酵：将蝉拟青霉菌种接入步骤(2)中的蝉拟青霉发酵培养基中，在18℃-26℃静置培养6天-12天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体；

(4)提取：将步骤(3)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎，加入水形成料液，70℃-90℃提取，离心，所得提取液浓缩，得到的浓缩液用蛋白酶酶解，灭酶后离心除去变性蛋白和酶，所得上清液经醇沉得到沉淀即蝉拟青霉菌丝体粗多糖；

(5)透析：将步骤(4)中的蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液用孔径为1000Da-5000Da的透析袋在去离子水中透析，收集透析后的蝉拟青霉菌丝体粗多糖，真空冷冻干燥得蝉拟青霉菌丝体多糖；

(6)纯化：将步骤(5)中的蝉拟青霉菌丝体多糖的水溶液经氯代环氧丙烷交联的葡聚糖凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状蝉拟青霉甘露聚糖，命名为PCMN。

本发明进行蝉拟青霉液体深层发酵时，没有直接将中药材加入发酵基础培养基中，而是采用先将中药材制备为中药复合水提液，再将中药复合水提液加入到发酵基础培养基中制成含中药提取物的培养基，这样有助于提高蝉拟青霉生物量和次生代谢产物的含量，同时促进代谢产物活性提高。

步骤(1)中，黄精、无花果和重楼三者组成的中药复合水提液能够刺激蝉拟青霉发酵过程生成的新的次生代谢产物：蝉拟青霉甘露聚糖。

优选地，所述中药材的组成为：黄精10重量份-50重量份、无花果10重量份-50重量份和重楼10重量份-40重量份；该用量范围既节约资源又能保证目标产物蝉拟青霉甘露聚糖的可观产量。

所述中药复合水提液的制备可采用本领域常规的水提法，优选采用以下方法：按所述量称取中药材，粉碎(优选过60目-100目的粉末)，加占中药材总重量2倍-10倍量水浸泡0.5h-1h，然后加热煎熬，保持温和的沸腾状态20min-60min，过滤收集提取液，得到中药复合水提液；也可重复提取1次-3次，合并滤液，得到中药复合水提液，节约资源。

步骤(2)中，优选地，所述蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有以生药材量计为1g-2g的中药复合水提液。

优选地，将步骤(1)中的中药复合水提液、黄精皂苷和吐温20加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基。黄精皂苷和吐温20的加入能够辅助中药复合水提液刺激发酵过程生成次生代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖，有助于提高蝉拟青霉甘露聚糖产物的含量，同时促进代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖活性提高。

优选地，所述蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有以生药材量计为1g-2g的中药复合水提液、0.1g-0.5g的黄精皂苷及0.1g-0.3g的吐温20。

所述黄精皂苷可采用市售产品，也可以采用现有方法制备；如可采用赵丽蓉等人在《Box-Benhken响应面法优化微波提取黄精总皂苷的条件》一文中记载的黄精皂苷制备方法进行制备(赵丽蓉等.Box-Benhken响应面法优化微波提取黄精总皂苷的条件.中国现代中药，2018，20(8)：1010-1015)；具体可采用以下制备方法：将黄精药材粉碎(优选粉碎过4号筛)，以质量百分浓度为50％的乙醇水溶液为提取剂，料液质量比为1:16，微波提取时间为40秒-50秒，微波功率为390w-450w，制得黄精皂苷。

优选地，所述蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有的发酵基础培养基组分：葡萄糖10g-20g、酵母粉5g-10g、蛋白胨3g-9g、蝉蛹粉0.2g-1.0g、KH₂PO₄ 0.5g-1.2g和MgSO₄.7H₂O0.1g-0.8g。

所述培养基中一般还含有余量的无菌水。

步骤(3)中，所述蝉拟青霉菌种可采用任意一种蝉拟青霉菌种，可采用市售产品。例如蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson CGMCC No.3453，该菌株已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏。

优选地，所述蝉拟青霉菌种的接种量为5％-10％，重量百分比。所述接种量指接入的菌种重量与培养基重量之比的百分数。

步骤(4)中，所述蛋白酶选用木瓜蛋白酶。所述蛋白酶的重量为步骤(4)浓缩液重量的3％-5％。

所述用蛋白酶酶解的条件优选为：50℃-55℃水浴2h-2.5h。

本发明灭酶的条件采用本领域的常规条件，例如可在100℃-105℃下灭酶15min-20min。

所述醇沉采用乙醇水溶液。具体为在上清液中加入乙醇水溶液，混匀，沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀。

所述乙醇水溶液的用量优选为上清液体积的2倍-3倍。所述乙醇水溶液的体积百分浓度优选为67％-75％。所述沉淀过夜的温度优选为2℃-5℃。

优选地，70℃-90℃提取2小时，提取效果最佳。

步骤(5)中，在去离子水中透析的时间优选为60h-120h。

步骤(6)中，所述蝉拟青霉菌丝体多糖的水溶液的浓度为5mg/mL-20mg/mL，流速为0.5ml/min-1.2ml/min。

所述凝胶过滤层析的条件为：洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1；流速0.3ml/min-0.5ml/min。

所述的磷酸盐缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法，例如可参照《中国药典》。

所述氯代环氧丙烷交联的葡聚糖凝胶选用市售产品，如市售的氯代环氧丙烷交联的葡聚糖凝胶Sephadex G100等。

所述蝉拟青霉甘露聚糖具有显著的免疫增强作用，能够促进小鼠巨噬细胞株RAW264.7中一氧化氮(NO)和细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的释放，可用于促进小鼠巨噬细胞株RAW264.7增殖、促进小鼠巨噬细胞株RAW264.7中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的释放，对小鼠巨噬细胞RAW264.7具有免疫调节活性；并能通过激活NF-κB信号通路达到免疫调节的作用；可作为免疫调节剂直接使用，也可用于制备免疫调节剂，用于功能食品、保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。

黄精，为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根茎。按形状不同，习称“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”。一般春、秋二季采挖，除去须根，洗净，置沸水中略烫或蒸至透心，干燥。具有补气养阴，健脾，润肺，益肾之功效。常用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴。

无花果，为桑科植物无花果Ficus carica L.的果实。一般7-10月果实呈绿色时，分批采摘；或拾取落地的未成熟果实，鲜果用开水烫后，晒干或烘干。具有清热生津，健脾开胃，解毒消肿之功效。主治咽喉肿痛，燥咳声嘶，乳汁稀少，肠热便秘，食欲不振，消化不良，泄泻，痢疾，痈肿，癣疾。

重楼，为百合科重楼属植物华重楼Paris polyphylla Smith var.chinenisi(Franch)Hara、云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var,chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎。一般秋季采挖，除去须根，洗净，晒干。其味苦，性微寒；有小毒。有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊之功效，常用于疔疮痈肿，咽喉肿痛，蛇虫咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐。

蝉蛹，一般指蚱蝉的幼虫，可食用。民间也泛指破茧的昆虫类，如金丝蛹等蚕蛹类。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次获得一种具有生物活性的蝉拟青霉甘露聚糖，经检测其多糖重量百分含量在99％以上，经单糖组成鉴定发现该多糖是由甘露糖组成，是多糖类；分子量检测其重均分子量为65KDa-95KDa；核磁共振图谱显示其为α构型，并确定其糖苷键连接方式，多糖的结构以(1→2)连接的α-甘露糖残基为主链，且每9个(1→2)连接的α-甘露糖残基组成一个重复单元，每个重复单元中有4个α-甘露糖残基的O-6位上分别被支链一取代，余下的5个α-甘露糖残基中有1个α-甘露糖残基的O-6位上被支链二取代；所述支链一是(1→3)连接的α-甘露糖残基和端基α-甘露糖；所述支链二是(1→6)连接的α-甘露糖残基和端基α-甘露糖。该蝉拟青霉甘露聚糖为刺激蝉拟青霉发酵过程而生成的新的次生代谢产物。

本发明蝉拟青霉甘露聚糖是由蝉拟青霉菌在添加有由黄精、无花果和重楼三者组成的中药复合水提液的培养基中深层发酵、提取分离得到，是由黄精、无花果和重楼三者组成的中药复合水提液刺激蝉拟青霉发酵过程生成的新的次生代谢产物。该方法操作简便，易于控制，能够获得具有较高有序性、结构明确的大分子，为深入研究其高级结构与功能关系提供研究价值。利用本发明方法制备的蝉拟青霉甘露聚糖，不影响其天然结构和活性，且该方法对设备要求较低、成本低，利于工业生产上大规模的推广、开发和使用。本发明对纯化后多糖进行组分分析、结构鉴定及免疫功能研究，发现本发明多糖有较强的免疫调节活性，是潜在的免疫增强物质。

本发明蝉拟青霉甘露聚糖具有显著的免疫增强作用，能够促进小鼠巨噬细胞株RAW264.7中NO和细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的释放，可用于促进小鼠巨噬细胞株RAW264.7增殖、促进小鼠巨噬细胞株RAW264.7中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的释放，对小鼠巨噬细胞RAW264.7具有免疫调节活性，可直接作为免疫调节剂使用，也可用于制备用于制备免疫调节剂例如将蝉拟青霉甘露聚糖与适量的辅料等一起制备免疫调节剂，用于功能食品、保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。本发明蝉拟青霉甘露聚糖能通过激活NF-κB信号通路达到免疫调节的作用。

附图说明

图1为本发明蝉拟青霉菌丝体粗多糖经氯代环氧丙烷交联的葡聚糖凝胶SephadexG100纯化洗脱液在490nm的吸光度曲线；其中，纵坐标Absorbance at 490nm为在490nm的吸光度，横坐标Tube numbers为管数；

图2a为乙酰衍生化后各种单糖标准品溶液的GC图谱，为对照图谱；图2b为乙酰衍生化后PCMN的GC图谱，为样品图谱；其中，纵坐标Abundance为响应值，横坐标Retentiontime(min)为保留时间(分钟)，Rham为鼠李糖，Rib为核糖，Fuc为岩藻糖，Ara为阿拉伯糖，Xyl为木糖，Man为甘露糖，Glc为葡萄糖，Gal为半乳糖。

图3为本发明PCMN的激光光散射图；其中，纵坐标Relative Scale为相对比例，横坐标time(min)为时间(分钟)。

图4为本发明PCMN的¹H-NMR图谱(A)与¹³C-NMR图谱(B)；

图5为本发明PCMN的¹H/¹³C HMQC图谱(A)与¹H/¹³C HMBC图谱(B)；

图6为本发明PCMN对小鼠巨噬细胞株RAW264.7中NO释放量的影响图；其中，control为阴性对照，LPS为阳性对照，横坐标sample dosage为样品剂量(μg/mL)。

图7A至图7D依次为本发明PCMN对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8释放量的影响图；其中，control为阴性对照，LPS为阳性对照，横坐标sampledosage为样品剂量(μg/mL)。

具体实施方式

以下结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。

蝉拟青霉菌种，购自金寨嘉德中药材有限公司。黄精皂苷，购自南京春秋生物工程有限公司。

实施例1

(1)称取1g复合中药材(已粉碎，过60目)，复合中药材的组成按重量份数计算：黄精10份、无花果50份和重楼40份；加占复合中药材重量10倍量水浸泡0.5h，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态煎熬60min，过滤收集提取液。重复提取2次，滤液合并后置于50mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液。

(2)将步骤(1)中的中药复合水提液、黄精皂苷和吐温20加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基；

蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有：葡萄糖10g、酵母粉10g、蛋白胨3g、蝉蛹粉0.2g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.1g，以生药材量计为1g的中药复合水提液(即50mL以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液)、0.1g黄精皂苷及0.3g吐温20，余量为无菌水。

(3)深层发酵：将蝉拟青霉菌种接入步骤(2)中的蝉拟青霉发酵培养基中，接种量5％，在18℃条件下静置培养12天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体。

(4)提取：将步骤(3)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎，加入蒸馏水形成料液，70℃提取2小时，离心，所得提取液浓缩，得到的浓缩液用占浓缩液重量的3％量的木瓜蛋白酶在50℃水浴2.5h酶解，100℃灭酶20min并离心除去变性蛋白和酶，在所得上清液中加入占上清液体积2倍量、体积百分浓度67％的乙醇水溶液，搅拌混匀，2℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀即蝉拟青霉菌丝体粗多糖；

(5)透析：将步骤(4)中的蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子水溶解得到蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液，用孔径为1000Da的透析袋在去离子水中透析60h，收集透析后的蝉拟青霉菌丝体粗多糖，真空冷冻干燥得蝉拟青霉菌丝体多糖；

(6)纯化：将步骤(5)中的蝉拟青霉菌丝体多糖用去离子水溶解得到浓度为10mg/mL的蝉拟青霉菌丝体多糖水溶液，流速为1ml/min经氯代环氧丙烷交联的葡聚糖凝胶Sephadex G100过滤层析分离纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，流速0.3ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析(孔径为3000Da)和冻干得到白色疏松絮状均一的蝉拟青霉甘露聚糖，命名为PCMN。

实施例2

(1)称取1g复合中药材(已粉碎，过60目)，复合中药材的组成按重量份数计算：黄精50份、无花果10份和重楼40份；加占复合中药材重量10倍量水浸泡1h，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态煎熬20min，过滤收集提取液。重复提取3次，滤液合并后置于50mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液。

(2)将步骤(1)中的中药复合水提液、黄精皂苷和吐温20加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基；

蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有：葡萄糖20g、酵母粉5g、蛋白胨5g、蝉蛹粉1g、KH₂PO₄ 1.2g、MgSO₄.7H₂O 0.8g，以生药材量计为1g的中药复合水提液(即50mL以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液)、0.5g黄精皂苷及0.1g吐温20，余量为无菌水。

(3)深层发酵：将蝉拟青霉菌种接入步骤(2)中的蝉拟青霉发酵培养基中，接种量10％，在26℃条件下静置培养6天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体。

(4)提取：将步骤(3)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎，加入蒸馏水形成料液，90℃提取2小时，离心，所得提取液浓缩，得到的浓缩液用占浓缩液重量的5％量的木瓜蛋白酶在55℃水浴2h酶解，105℃灭酶15min并离心除去变性蛋白和酶，在所得上清液中加入占上清液体积3倍量、体积百分浓度75％的乙醇水溶液，搅拌混匀，5℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀即蝉拟青霉菌丝体粗多糖；

(5)透析：将步骤(4)中的蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子水溶解得到蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液，用孔径为5000Da的透析袋在去离子水中透析120h，收集透析后的蝉拟青霉菌丝体粗多糖，真空冷冻干燥得蝉拟青霉菌丝体多糖；

(6)纯化：将步骤(5)中的蝉拟青霉菌丝体多糖用去离子水溶解得到浓度为5mg/mL的蝉拟青霉菌丝体多糖水溶液，流速为1.2ml/min经氯代环氧丙烷交联的葡聚糖凝胶Sephadex G100过滤层析分离纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析(孔径为5000Da)和冻干得到白色疏松絮状均一的蝉拟青霉甘露聚糖，命名为PCMN。

实施例3

(1)称取2g复合中药材(已粉碎，过100目)，复合中药材的组成按重量份数计算：黄精40份、无花果50份和重楼10份；加占复合中药材重量5倍量水浸泡0.8h，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态煎熬40min，过滤收集提取液。重复提取1次，滤液合并后置于50mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为40mg/mL的中药复合水提液。

(2)将步骤(1)中的中药复合水提液、黄精皂苷和吐温20加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基；

蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有：葡萄糖15g、酵母粉8g、蛋白胨9g、蝉蛹粉0.6g、KH₂PO₄ 0.8g、MgSO₄.7H₂O 0.4g，以生药材量计为1g的中药复合水提液(即50mL以生药材量计浓度为40mg/mL的中药复合水提液)、0.3g黄精皂苷及0.2g吐温20，余量为无菌水。

(3)深层发酵：将蝉拟青霉菌种接入步骤(2)中的蝉拟青霉发酵培养基中，接种量8％，在20℃条件下静置培养12天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体。

(4)提取：将步骤(3)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎，加入蒸馏水形成料液，85℃提取2小时，离心，所得提取液浓缩，得到的浓缩液用占浓缩液重量的5％量的木瓜蛋白酶在55℃水浴2h酶解，105℃灭酶15min并离心除去变性蛋白和酶，在所得上清液中加入占上清液体积3倍量、体积百分浓度75％的乙醇水溶液，搅拌混匀，5℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀即蝉拟青霉菌丝体粗多糖；

(5)透析：将步骤(4)中的蝉拟青霉菌丝体粗多糖用去离子水溶解得到蝉拟青霉菌丝体粗多糖水溶液，用孔径为3000Da的透析袋在去离子水中透析100h，收集透析后的蝉拟青霉菌丝体粗多糖，真空冷冻干燥得蝉拟青霉菌丝体多糖；

(6)纯化：将步骤(5)中的蝉拟青霉菌丝体多糖用去离子水溶解得到浓度为20mg/mL的蝉拟青霉菌丝体多糖水溶液，流速为0.5ml/min经氯代环氧丙烷交联的葡聚糖凝胶Sephadex G100过滤层析分离纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为3:1)，流速0.4ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析(孔径为4000Da)和冻干得到白色疏松絮状均一的蝉拟青霉甘露聚糖，命名为PCMN。

实施例4

除了将步骤(2)调整为“将步骤(1)中的中药复合水提液加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基；蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有：葡萄糖10g、酵母粉10g、蛋白胨3g、蝉蛹粉0.2g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.1g和以生药材量计为1g的中药复合水提液(即50mL以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液)，余量为无菌水。”之外，其余操作同实施例1，得到蝉拟青霉甘露聚糖，命名为PCMN。

实施例1中蝉拟青霉甘露聚糖较该实施例4中蝉拟青霉甘露聚糖的含量提高了60％，相同浓度下免疫活性提高了40％；可见，本发明中黄精皂苷和吐温20的加入能够辅助中药复合水提液刺激发酵过程生成次生代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖，有助于提高蝉拟青霉甘露聚糖产物的含量，同时促进代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖活性提高。

对比例1

除了将步骤(1)和步骤(2)调整为“蝉拟青霉发酵培养基中不添加中药复合水提液、黄精皂苷和吐温20，直接使用基础培养基组分；蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有：葡萄糖10g、酵母粉10g、蛋白胨3g、蝉蛹粉0.2g、KH₂PO₄ 0.5g和MgSO₄.7H₂O 0.1g，余量为无菌水。”之外，其余操作同实施例1，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，检测结果显示没有富含多糖的洗脱液。表明，添加有经黄精、无花果和重楼三种共同提取得到的中药复合水提液的蝉拟青霉发酵培养基可保证蝉拟青霉发酵过程生成新的次生代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖。

对比例2

除了将步骤(1)和步骤(2)调整为“(1)称取1g中药材(已粉碎，过60目)，中药材的组成按重量份数计算：黄精50份和无花果50份；加占中药材重量10倍量水浸泡0.5h，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态煎熬60min，过滤收集提取液。重复提取2次，滤液合并后置于50mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为20mg/mL的中药水提液。

(2)将步骤(1)中的中药水提液、黄精皂苷和吐温20加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基；

蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有：葡萄糖10g、酵母粉10g、蛋白胨3g、蝉蛹粉0.2g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.1g，以生药材量计为1g的中药水提液(即50mL以生药材量计浓度为20mg/mL的中药水提液)、0.1g黄精皂苷及0.3g吐温20，余量为无菌水。”之外，其余操作同实施例1，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，检测结果显示没有富含多糖的洗脱液。表明，添加有经黄精、无花果和重楼三种共同提取得到的中药复合水提液的蝉拟青霉发酵培养基可保证蝉拟青霉发酵过程生成新的次生代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖。

对比例3

除了“中药材的组成按重量份数计算：黄精50份和重楼50份”之外，其余操作同对比例2，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，检测结果显示没有富含多糖的洗脱液。表明，添加有经黄精、无花果和重楼三种共同提取得到的中药复合水提液的蝉拟青霉发酵培养基可保证蝉拟青霉发酵过程生成新的次生代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖。

对比例4

除了“中药材的组成按重量份数计算：无花果50份和重楼50份”之外，其余操作同对比例2，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，检测结果显示没有富含多糖的洗脱液。表明，添加有经黄精、无花果和重楼三种共同提取得到的中药复合水提液的蝉拟青霉发酵培养基可保证蝉拟青霉发酵过程生成新的次生代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖。

对比例5

除了将步骤(1)和步骤(2)调整为“蝉拟青霉发酵培养基中不添加中药复合水提液，使用添加了黄精皂苷和吐温20的基础培养基组分；蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有：葡萄糖10g、酵母粉10g、蛋白胨3g、蝉蛹粉0.2g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.1g、0.1g黄精皂苷及0.3g吐温20，余量为无菌水。”之外，其余操作同实施例1，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，检测结果显示没有富含多糖的洗脱液。表明，添加有经黄精、无花果和重楼三种共同提取得到的中药复合水提液的蝉拟青霉发酵培养基可保证蝉拟青霉发酵过程生成新的次生代谢产物蝉拟青霉甘露聚糖。

下面是对PCMN结构鉴定或性能分析的实施例：

实施例5：理化性质组分及分子量检测

将实施例1或实施例4制得的蝉拟青霉菌丝体甘露聚糖PCMN，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.4％。从图3看出，检测到90°光散射LS信号、示差检测器RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品PCMN的保留时间主要分布在20min-28min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明PCMN是均一的多糖。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。该蝉拟青霉菌丝体甘露聚糖PCMN的Mw/Mn的比值为1.064，比较接近1，表明PCMN是一个低分散、分子量较为均一的多糖组分，其分子量Mw＝8.6×10⁴Da。

将实施例2制得的蝉拟青霉菌丝体甘露聚糖PCMN，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.2％。其激光光散射图与图3相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品PCMN的保留时间主要分布在20min-28min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明PCMN是均一的多糖。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。该蝉拟青霉菌丝体甘露聚糖PCMN的Mw/Mn的比值为1.033，比较接近1，表明PCMN是一个低分散、分子量较为均一的多糖组分，其分子量Mw＝6.5×10⁴Da。

将实施例3制得的蝉拟青霉菌丝体甘露聚糖PCMN，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.6％。其激光光散射图与图3相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品PCMN的保留时间主要分布在20min-28min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明PCMN是均一的多糖。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。该蝉拟青霉菌丝体甘露聚糖PCMN的Mw/Mn的比值为1.019，比较接近1，表明PCMN是一个低分散、分子量较为均一的多糖组分，其分子量Mw＝9.5×10⁴Da。

实施例6：单糖组成

实施例1、实施例2、实施例3或者实施例4制得的蝉拟青霉菌丝体甘露聚糖PCMN3mg，加入1mL 4mol·L^-1三氟乙酸(TFA)水溶液中，并置于梨形烧瓶中，在120℃下水解6小时。冷却至室温后，加入1mL甲醇，并通过在60℃下真空离心浓缩至干燥，重复“冷却至室温后，加入1mL甲醇，并通过在60℃下真空离心浓缩至干燥”步骤3次以除去残留的TFA，进行衍生化。将各个旋转干燥的标准品和样品开口置于干燥器中，其中含有五氧化二磷的培养皿添加到干燥器的底部。将干燥器密封，抽真空并干燥过夜；向干燥的制品中分别加入1ml盐酸羟胺溶液，密封并充分摇动，并在真空烘箱中在90℃下氧化30分钟；冷却至室温后，加入0.2ml 1-甲基咪唑和1ml乙酸酐并充分摇动以充分混合。将其密封并置于90℃的真空烘箱中30分钟；冷却至室温形成乙酰化衍生物。向乙酰化衍生物中加入1ml氯仿和1ml水，充分震荡；静置几分钟以分层并除去上层水相；氯仿层中加入1毫升水，充分摇匀，静置，除去水相，反复5次。向所得氯仿层中加入适量的无水硫酸钠以除去水。用针头注射器吸出氯仿层，通过0.45μm有机过滤膜，并置于进样瓶中进行GC检测。

GC色谱条件：色谱分析条件HP-Innowax毛细管柱(250μm×30m)，液膜厚0.20μm，柱温为190℃，汽化室温度为280℃，分流比为10:1，FID检测器，检测温度250℃，进样量1μL，载气为氦气，气体流速1mL/min。

如图2，对应各种单糖标准品，实施例1PCMN包括重量百分含量99％以上的多糖，多糖部分的单糖是由甘露糖组成；说明PCMN是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。

对应各种单糖标准品，实施例2PCMN包括重量百分含量99％以上的多糖，多糖部分的单糖是由甘露糖组成；说明PCMN是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。

对应各种单糖标准品，实施例3PCMN包括重量百分含量99％以上的多糖，多糖部分的单糖是由甘露糖组成；说明PCMN是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。

对应各种单糖标准品，实施例4PCMN包括重量百分含量99％以上的多糖，多糖部分的单糖是由甘露糖组成；说明PCMN是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。

实施例7：甲基化分析

取2mg实施例1、实施例2、实施例3或者实施例4制得的蝉拟青霉菌丝体甘露聚糖PCMN样品溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中，通氮气密封，超声片刻助溶，然后按照Ciucanu,etal.方法进行甲基化制备(Ciucanu,L.,&Kerek,F..A simple and repid method forpermethylation of carbohydrates.Carbohydrate Research,131,209-217)。

PCMN经过三次甲基化后，再经酸水解、还原，乙酰化制备成部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析(见表1)。由表1可知：甘露糖残基包括(1→2)连接的甘露糖残基(1,2-linked Manp)、(1→3)连接的甘露糖残基(1,3-linked Manp)、(1→6)连接的甘露糖残基(1,6-linked Manp)、(1→2,6)连接的甘露糖残基(1,2,6-linked Manp)和端基甘露糖(1-linked Manp)五种方式连接，它们的摩尔比为4.15:4.31:1.06:5.42:5.76。通过比较PCMN的甲基化结果发现，该多糖中(1→2)糖苷键连接的甘露糖含量最高，其次是(1→3)糖苷键连接的甘露糖和端基甘露糖，而(1→6)糖苷键连接的甘露糖含量较少，表明多糖的主链是以(1→2)糖苷键连接的甘露糖，O-6位支链主要由D-Manp-(1→和→3)-D-Manp-(1→组成，还含有少量由D-Manp-(1→和→6)-D-Manp-(1→组成的支链。

表1 PCMN甲基化分析

实施例8：核磁共振

取60mg实施例1、实施例2、实施例3或者实施例4制得的蝉拟青霉菌丝体甘露聚糖PCMN溶于1ml氘水中，瑞士Bruker-AVIII500M进行600MHz NMR扫描。

根据PCMN的¹H-NMR图谱(见图4A)、¹³C-NMR图谱(见图4B)结合HMQC图谱(见图5A)，检测到5个峰可用于分析。在¹H-NMR谱中，PCMN的异头质子区(δ5.06-5.31ppm)主要有5个异头氢信号(见图4A)，按低场到高场分别为δ5.31、δ5.16、δ5.11、δ5.07和δ5.06ppm，分别命名为糖残基A、B、C、D、E，分别与¹³C-NMR谱中异头碳区的碳信号(图4B)，δ103.44、δ105.09、δ101.11、δ105.09和δ105.09ppm逐一对应。从各个糖残基异头氢的化学位移可以判断异头碳的构型(δ>5.00ppm为α-型，δ<5.00ppm为β-型)，所有Manp的异头氢的化学位移均处于相对低场(δ>5.00)，为α-构型。糖残基A-E的¹H-NMR、¹³C-NMR谱化学位移经结合¹H-¹H COSY、TCOSY、HMQC和HMBC谱归属完毕(见表2)。

通过NMR数据比对发现(见表2)，残基A归属于(1→2)-α-D-Manp残基，C-1/H-1(δ103.44/5.31ppm)，C-2/H-2(δ81.25/4.13ppm)发生取代，化学位移向低场移动。残基E归属于(1→3)-α-D-Manp残基，C-1/H-1(δ105.09/5.06ppm)，C-3/H-3(δ80.78/3.97ppm)发生取代，化学位移向低场移动。残基D为(1→)-α-D-Manp残基，因为它们的仅有C-1位发生取代，向低场移动δ105.09ppm。残基B的C-6化学位移为δ65.55ppm，表明其C-6位被取代，表明它为(1→6)-α-D-Manp残基。而残基C，C-2/H-2(δ78.7/4.04ppm)和C-6/H-6(δ65.55/4.03ppm)，均发生化学位移向低场移动，表明它即为(1→2,6)-α-D-Manp残基。

表2PCMN糖残基的化学位移全归属

通过HMBC谱(图5B)可以推断出多糖PCMN糖残基之间的连接方式。在HMBC谱中，残基A的H-1(δ5.31ppm)与残基A的C-2(δ81.25ppm)存在交叉峰，表明残基A的自身连接为→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→。残基D的H-1(δ5.07ppm)与残基E的C-2(δ72.54ppm)存在交叉峰，表明残基D部分链接到残基E的末端。残基C的H-6(δ4.03ppm)与残基E的C-1(δ105.09ppm)有相关点，残基C的C-6(δ65.55ppm)与残基E的H-1(δ5.06ppm)有相关点，则表明残基C与残基E的连接为→3)-α-D-Manp-(1→2,6)-α-D-Manp-(1→。残基B的H-1(δ5.16ppm)与残基C的C-6(δ65.55ppm)关联，表明残基B的H-1与主链的C-6连接。残基D的H-1(δ5.07ppm)与残基E的C-3(δ80.78ppm)有相关点，表明残基D连接在由(1→3)-α-D-Manp残基组成的支链的末端。残基D的H-1(δ5.07ppm)与残基B的C-6(δ65.55ppm)相关，表明(1→)-α-D-Glcp残基与(1→6)-α-D-Manp残基组成的支链的末端相连。上述结果与甲基化分析的结果相符。

综合实施例5-实施例8的分析结果，证实了PCMN由重量百分含量为99％以上的多糖组成；该多糖的组成为甘露糖；多糖的结构以(1→2)连接的α-甘露糖残基为主链，且每9个(1→2)连接的α-甘露糖残基组成一个重复单元；每个重复单元中有4个α-甘露糖残基的O-6位上分别被支链一取代，余下的5个α-甘露糖残基中有1个α-甘露糖残基的O-6位上被支链二取代；支链一是(1→3)连接的α-甘露糖残基和端基α-甘露糖；支链二是(1→6)连接的α-甘露糖残基和端基α-甘露糖。甘露糖为α-D-甘露糖。α-甘露糖残基为α-D-甘露糖残基。该多糖的重复单元的结构有多种不同的变化组合，O-6位被支链一、支链二取代的α-甘露糖残基可以是重复单元中的任意5个α-甘露糖残基，支链一和支链二的排列顺序为任意顺序。具体重复单元可以是结构式Ⅰ所示的一种重复单元，也可以是五条支链按其它排列顺序排列的重复单元。

实施例9：对PCMN的免疫活性评价

将实施例1、实施例2或实施例3中制备得到的蝉拟青霉菌丝体甘露聚糖PCMN对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7进行作用，检测PCMN对RAW264.7释放NO及细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)的影响。

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞以DMEM完全培养液(含20μg/mL多粘菌素B(PMB)，10％胎牛血清，1％双抗，％为重量百分比)于37℃，5％(体积百分比)CO₂细胞培养箱中培养，第4～6代指数生长期细胞用于实验。

于96孔板中，每孔加入RAW264.7细胞悬液(3×10⁵个/ml，细胞计数板计数，确定细胞存活率在95％以上)100μl，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱孵育2h，弃去各孔中培养液，加入新鲜DMEM完全培养液100μl/孔(阳性对照脂多糖(LPS)刺激孔加不含PMB的DMEM完全培养液)，继续培养24h。吸去培养基上清，然后分别加入DMEM完全培养液、LPS稀释液(1μg/mL)或不同浓度的PCMN稀释液(12.5、25、50、100、200μg/mL)各200μL，重复5孔。37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h，将细胞上清液100μL转移至新的96孔细胞培养板，每孔加入格里斯氏试剂A液(Griess A)和格里斯氏试剂B液(Griess B)的混合试剂(1：1，体积比)100μL，暗处避光反应20min，于540nm处测定OD值，三组平行试验取平均值，检测结果见图6。

于24孔细胞培养板中，每孔加入RAW264.7细胞悬液(2.0×10⁵个/mL，细胞计数板计数，确定细胞存活率在95％以上)500μL，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养2h，弃去各孔中培养液，加入新鲜DMEM完全培养液500μL/孔(阳性对照LPS刺激孔加不含PMB的DMEM完全培养液)，继续培养24h。吸去培养基上清，然后分别加入DMEM完全培养液、LPS稀释液(1μg/mL)或不同浓度的PCMN稀释液(12.5、25、50、100、200μg/mL)各500μL，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h。收集细胞上清液，依小鼠细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8ELISA检测试剂盒说明测定并计算各细胞因子含量，检测结果见图7A、图7B、图7C和图7D。

RAW264.7细胞中NO的释放量与细胞的增殖成正比，如图6所示，与阴性对照组相比，浓度为12.5、25、50、100、200μg/mL的PCMN均可显著促进RAW264.7细胞中NO的释放(P＜0.05)，显著促进RAW264.7细胞的增殖(P＜0.05)，在100μg/mL时促进作用就已达到高值，浓度增加至200μg/mL时促进效果与100μg/mL时相差不大，当PCMN浓度提高至200μg/mL时显著促进RAW264.7细胞的增殖且对RAW264.7细胞无细胞毒性。所以，确定100μg/mL的作用浓度为PCMN的最适作用浓度，为后续实验提供依据。

检测PCMN是否能促进RAW264.7细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，结果如图7A、图7B、图7C和图7D所示，与阴性对照组相比，在实验质量浓度范围内，PCMN均能够明显刺激RAW264.7细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8(P＜0.05)，具有剂量依赖性。各实验质量浓度的PCMN均能够刺激RAW264.7分泌肿瘤坏死因子TNF-α，与对照组相比具有极显著差异，与白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)结果不同的是，肿瘤坏死因子TNF-α的分泌量呈现先升高后略微下降的趋势，在PCMN为100μg/mL时达到最高值，为1431pg/mL，仅略低于阳性对照；IL-1β、IL-6、IL-8的分泌量呈现随PCMN浓度变大而持续升高的趋势。综上所述，PCMN对小鼠巨噬细胞RAW264.7具有免疫调节活性，可直接作为免疫调节剂或者用于制备免疫调节剂例如将PCMN与适量的辅料等一起制备免疫调节剂。

本发明对蝉拟青霉甘露聚糖PCMN的高级结构进行了表征，发现具备该结构特征的蝉拟青霉甘露聚糖具有免疫调节活性，其免疫调节活性与其特定的结构特征具有密切的联系。本发明所述制备方法中参数的变化并不影响蝉拟青霉甘露聚糖PCMN的制备，因此本发明制备方法范围内中任意参数的组合均可实现蝉拟青霉甘露聚糖PCMN的制备。在此不再一一列举。

Claims (10)

1.一种蝉拟青霉甘露聚糖，其特征在于，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述多糖的组成为甘露糖；多糖的结构以(1→2)连接的α-甘露糖残基为主链，且每9个(1→2)连接的α-甘露糖残基组成一个重复单元；每个重复单元中有4个α-甘露糖残基的O-6位上分别被支链一取代，余下的5个α-甘露糖残基中有1个α-甘露糖残基的O-6位上被支链二取代；所述支链一是(1→3)连接的α-甘露糖残基和端基α-甘露糖；所述支链二是(1→6)连接的α-甘露糖残基和端基α-甘露糖。

2.根据权利要求1所述的蝉拟青霉甘露聚糖，其特征在于，所述甘露糖为α-D-甘露糖；所述α-甘露糖残基为α-D-甘露糖残基。

3.根据权利要求1所述的蝉拟青霉甘露聚糖，其特征在于，所述支链一和支链二的排列顺序为任意顺序。

4.根据权利要求1所述的蝉拟青霉甘露聚糖，其特征在于，所述蝉拟青霉甘露聚糖的重均分子量为65KDa-95KDa。

5.根据权利要求1-4任一项所述的蝉拟青霉甘露聚糖的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(1)将由黄精、无花果和重楼组成的中药材经水溶液提取，得到中药复合水提液；

(2)将步骤(1)中的中药复合水提液加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基；

(3)深层发酵：将蝉拟青霉菌种接入步骤(2)中的蝉拟青霉发酵培养基中，在18℃-26℃静置培养6天-12天，得到蝉拟青霉发酵菌丝体；

(4)提取：将步骤(3)中的蝉拟青霉发酵菌丝体粉碎，加入水形成料液，70℃-90℃提取，离心，所得提取液浓缩，得到的浓缩液用蛋白酶酶解，灭酶后离心除去变性蛋白和酶，所得上清液经醇沉得到沉淀即蝉拟青霉菌丝体粗多糖；

(5)透析：将步骤(4)中的蝉拟青霉菌丝体粗多糖的水溶液用孔径为1000Da-5000Da的透析袋在去离子水中透析，收集透析后的蝉拟青霉菌丝体粗多糖，真空冷冻干燥得蝉拟青霉菌丝体多糖；

(6)纯化：将步骤(5)中的蝉拟青霉菌丝体多糖的水溶液经氯代环氧丙烷交联的葡聚糖凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状蝉拟青霉甘露聚糖。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述中药材的组成为：黄精10重量份-50重量份、无花果10重量份-50重量份和重楼10重量份-40重量份。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有以生药材量计为1g-2g的中药复合水提液。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将步骤(1)中的中药复合水提液、黄精皂苷和吐温20加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有以生药材量计为1g-2g的中药复合水提液、0.1g-0.5g的黄精皂苷及0.1g-0.3g的吐温20。

10.根据权利要求1-4任一项所述的蝉拟青霉甘露聚糖在作为免疫调节剂中的应用或者在制备免疫调节剂中的应用。

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