CN110128559B - 一种具有免疫调节的火参果果皮多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有免疫调节的火参果果皮多糖的制备方法及其应用，其制备方法包括以下步骤：火参果果皮粉末加水进行提取，取上清，重复提取，得到火参果果皮总的多糖的粗提液；浓缩后加入无水乙醇，静置，收集沉淀；溶解沉淀后采用Sevag法去除蛋白质；透析除小分子杂质；使用DEAE‑52纤维柱纯化；使用G‑100凝胶层析柱纯化。本发明建立了一种火参果果皮多糖提取工艺，其工艺方法操作简单，使用方便、合理、稳定、可量化，具有重要的应用价值。通过该方法提取到的火参果果皮多糖经体外免疫调节活性评价，显示其在免疫调节活性方面的显著作用，是一种具有良好免疫调节作用的天然多糖，具有重要的开发和应用价值。

Description

一种具有免疫调节的火参果果皮多糖的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及食品科学技术领域，更具体地，涉及一种具有免疫调节的火参果果皮多糖的制备方法及其应用。

背景技术

多糖是极性大分子化合物。一般从动物、植物、微生物、海藻中提取。到目前为止，已有近万种多糖类化合物被提取出来。许多实验都证明多糖与感染、肿瘤、炎症及一些自身免疫性疾病有密切关系。因此对多糖的研究与开发已越来越引起人们的广泛关注。多糖类药物生物活性的研究是多糖类研究中最活跃亦是进展最快的领域。近年来多种不同来源的多糖均被发现在免疫系统中起十分关键的作用。多糖的提取一般包括脱脂、酶水解、热水浸提、酒精沉淀和干燥粉碎等步骤，根据提取对象的特性来调整各项工艺的参数，但至今还未见有火参果果皮多糖提取方法的相关报道。

火参果(Cucumis metuliferus)，又名刺角瓜、非洲角黄瓜，是一种传统的食用植物，为葫芦科甜瓜属一年生蔓性草本植物。原产于非洲南部卡拉哈里沙漠地区，常见于博茨瓦纳、纳米比亚、南非和斯威士兰，现在新西兰、美国、澳大利亚、智利、德国、津巴布韦等国家均有栽培。火参果适应性较强，在适于黄瓜、西葫芦种植的地方均能较好生长。2010年从非洲引入我国，在我国目前刺角瓜种植主要分布在广东、广西、湖南、湖北、江西、江苏、浙江等省份。果实上有突出的刺，长约10厘米，成熟时变成黄色，肉质细腻多籽，像黄瓜一样呈凝胶状，口味清甜，吃过后嘴里会有轻微的余香。此外，民间相传这种植物能够有效地对抗糖尿病，高血压，溃疡，疟疾和病毒感染等的多种疾病，但至今还未见有关火参果果皮与免疫系统有关生物活性的报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种具有免疫调节的火参果果皮多糖的制备方法及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种火参果果皮多糖的制备方法。

本发明的第二个目的是提供任一所述制备方法制备得到的火参果果皮多糖。

本发明的第三个目的是提供所述火参果果皮多糖在制备功能性食品中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种功能性食品。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种火参果果皮多糖的制备方法，包括以下步骤：

S1.火参果果皮粉末加水进行提取，离心取上清，重复提取，合并上清液，得到火参果果皮总的多糖的粗提液；

S2.火参果果皮总的多糖的粗提液浓缩后加入无水乙醇，静置，收集沉淀；

S3.溶解沉淀后采用Sevag法去除蛋白质；

S4.透析除小分子杂质；

S5.使用DEAE-52纤维柱纯化；

S6.使用G-100凝胶层析柱纯化。

优选地，步骤S1中，火参果果皮粉末为新鲜成熟的火参果果皮经过清洗、晾干、烘干、粉碎、过筛后得到。

更优选地，步骤S1中，烘干条件为45～60℃，24～72h。

进一步优选地，步骤S1中，烘干条件为50℃，48h。

更优选地，步骤S1中，火参果果皮粉末规格为过筛。

进一步优选地，步骤S1中，火参果果皮粉末规格为50目。

优选地，步骤S1中，火参果果皮干粉料液比1：10～1：35。

更优选地，步骤S1中，火参果果皮干粉料液比1：20～1：30。

进一步优选地，步骤S1中，火参果果皮干粉料液比1：30。

优选地，步骤S1中，提取时间为0.5～3.5h。

更优选地，步骤S1中，提取时间为1～3h。

进一步优选地，步骤S1中，提取时间为2h。

优选地，步骤S1中，提取温度为50～80℃。

更优选地，步骤S1中，提取温度为40～85℃。

进一步优选地，步骤S1中，提取温度为70℃

优选地，步骤S1中，重复提取1～3次。

更优选地，步骤S1中，重复提取3次。

优选地，步骤S1中，8000～12000r/min离心10～30min。

更优选地，步骤S1中，12000r/min离心20min。

优选地，步骤S2中，经旋转蒸发浓缩。

更优选地，步骤S2中，浓缩至原体积的1/(5～10)，加入2～4倍体积的无水乙醇，低温沉析多糖。

进一步优选地，步骤S2中，浓缩至原体积的1/10，加入3倍体积的无水乙醇，低温沉析多糖。

优选地，步骤S2中，所述低温沉析多糖为4℃静置过夜。

优选地，步骤S2中，8000～12000r/min离心10～30min。

更优选地，步骤S2中，12000r/min离心20min。

优选地，步骤S3中，步骤S2的沉淀的水溶液与Sevag溶液混匀，固液分离，收集上层水溶液，去除沉淀，重复上述操作，除有机溶剂，冷冻干燥。

更优选地，步骤S3中，步骤S2的沉淀的水溶液与Sevag溶液的体积比为3～ 5：1。

进一步优选地，步骤S3中，步骤S2的沉淀的水溶液与Sevag溶液的体积比为4：1。

更优选地，步骤S3中，步骤S2的沉淀的水溶液为步骤S2的沉淀与水的质量比为1：5～15。

进一步优选地，步骤S3中，步骤S2的沉淀的水溶液为步骤S2的沉淀与水的质量比为1：10。

优选地，步骤S3中，重复1～5次。

更优选地，步骤S3中，重复3次。

优选地，步骤S2中，8000～12000r/min离心10～30min固液分离。

更优选地，步骤S2中，12000r/min离心20min固液分离。

优选地，步骤S3中，真空旋转蒸发去除有机溶剂。

更优选地，步骤S3中，Sevag溶液为体积比4：1的氯仿与正丁醇。

优选地，步骤S4中，步骤S3产物的水溶液用蒸馏水进行透析，冷冻干燥。

更优选地，步骤S4中，步骤S3产物的水溶液为步骤S3产物与水的质量比为1：2～7。

进一步优选地，步骤S4中，步骤S3产物的水溶液为步骤S3产物与水的质量比为1：5。

更优选地，步骤S4中，透析袋的规格为3～8kDa。

进一步优选地，步骤S4中，透析袋的规格为5kDa。

更优选地，步骤S4中，透析24～72h，每4～8h换一次透析液。

进一步优选地，步骤S4中，透析72h，每6h换一次透析液。

优选地，步骤S5中，步骤S4产物的水溶液加入DEAE-52纤维柱中，用1～ 3倍柱体积的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液依次进行洗脱，收集0.3和/或0.4mol/L NaCl浓度的洗脱液，浓缩，冷冻干燥。

更优选地，步骤S5中，洗脱速度1～3mL/min。

进一步优选地，步骤S5中，洗脱速度2mL/min。

更优选地，步骤S5中，用2倍柱体积的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L 的NaCl溶液依次进行洗脱，收集0.2、0.3和/或、0.4mol/L NaCl浓度的洗脱液。

进一步优选地，步骤S5中，用2倍柱体积的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L 的NaCl溶液依次进行洗脱，收集0.3和0.4mol/L NaCl浓度的洗脱液。

进一步优选地，步骤S5中，用2倍柱体积的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L 的NaCl溶液依次进行洗脱，收集0.3mol/L NaCl浓度的洗脱液。

更优选地，步骤S5中，步骤S4产物的水溶液为步骤S4产物与水的质量比为1：8～20。

进一步优选地，步骤S5中，步骤S4产物的水溶液为步骤S4产物与水的质量比为1：15。

更优选地，步骤S5中，浓缩至总体积的1/(5～15)。

进一步优选地，步骤S5中，浓缩至总体积的1/10。

优选地，步骤S6中，步骤S5产物的水溶液加入G-100凝胶层析柱中，用1～ 3倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，收集，浓缩，冷冻干燥。

更优选地，步骤S6中，步骤S5产物的水溶液加入G-100凝胶层析柱中，用2倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，收集，浓缩，冷冻干燥。

更优选地，步骤S6中，洗脱速度0.1～1mL/min。

进一步优选地，步骤S6中，洗脱速度0.5mL/min。

更优选地，步骤S6中，步骤S5产物的水溶液为步骤S5产物与水的质量比为1：1～10。

进一步优选地，步骤S6中，步骤S5产物的水溶液为步骤S5产物与水的质量比为1：5。

最优选地，一种火参果果皮多糖的制备方法，包括以下步骤：

S1.火参果果皮粉末加水料液比1：30，70℃进行提取2h，离心取上清，重复提取3次，2000r/min离心20min，合并上清液，得到火参果果皮总的多糖的粗提液，火参果果皮粉末为新鲜成熟的火参果果皮经过清洗、晾干、50℃， 48h烘干、粉碎、50目过筛后得到；

S2.火参果果皮总的多糖的粗提液经旋转蒸发浓缩至原体积的1/10，加入3 倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜，12000r/min离心20min，收集沉淀；

S3.溶解沉淀后采用Sevag法去除蛋白质：步骤S2的沉淀的水溶液与Sevag 溶液体积比为4：1混匀，12000r/min离心20min固液分离，收集上层水溶液，去除沉淀，重复上述操作3次，真空旋转蒸发除有机溶剂，冷冻干燥，步骤S2 的沉淀的水溶液为步骤S2的沉淀与水的质量比为1：10，Sevag溶液为体积比4： 1的氯仿与正丁醇；

S4.透析除小分子杂质：步骤S3产物的水溶液用蒸馏水进行透析，透析袋的规格为5kDa，透析72h，每6h换一次透析液，冷冻干燥，步骤S3产物的水溶液为步骤S3产物与水的质量比为1：5；

S5.使用DEAE-52纤维柱纯化：骤S4产物的水溶液加入DEAE-52纤维柱中，用2倍柱体积的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液依次进行洗脱，洗脱速度2mL/min，收集0.3和0.4mol/L NaCl浓度的洗脱液，浓缩至总体积的1/10，冷冻干燥，步骤S4产物的水溶液为步骤S4产物与水的质量比为1： 15；

S6.使用G-100凝胶层析柱纯化：步骤S5产物的水溶液加入G-100凝胶层析柱中，用2倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，洗脱速度0.5mL/min，收集，浓缩，冷冻干燥，步骤S5产物的水溶液为步骤S5产物与水的质量比为1：5。

同时，本发明还要求保护以上制备方法制备得到的火参果果皮多糖。

进一步，本发明要求保护所述火参果果皮多糖在制备功能性食品中的应用。

发明要求还保护所述一种功能性食品，含有所述火参果果皮多糖。

优选地，所述功能性食品为提高免疫调节能力的功能性食品。

更优选地，所述提高免疫调节能力为提高巨噬细胞的增殖能力、促进巨噬细胞的分泌NO、促进巨噬细胞的分泌IL-6或促进巨噬细胞的分泌TNF-α中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明建立了一种火参果果皮多糖提取工艺，其工艺方法操作简单，使用方便、合理、稳定、可量化，具有重要的应用价值。通过该方法提取到的火参果果皮多糖经体外免疫调节活性评价，显示其在免疫调节活性方面的显著作用，是一种具有良好免疫调节作用的天然多糖，具有重要的开发和应用价值。

附图说明

图1为本发明技术路线。

图2为DEAE-52纤维柱洗脱图。

图3为葡萄糖标准曲线。

图4为提取温度对火参果果皮多糖得率的影响。

图5为提取时间对火参果果皮多糖得率的影响。

图6为料液比对火参果果皮多糖得率的影响。

图7为CMPP-3对RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响。

图8为CMPP-4对RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响。

图9为CMPP-3对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6的影响。

图10为CMPP-4对RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6的影响。

图11为CMPP-3对RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α的影响。

图12为CMPP-4对RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α的影响。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1火参果果皮多糖的提取及含量的测定

一、火参果果皮多糖的提取

提取流程见图1。

1、火参果果皮多糖粗提液

取新鲜成熟的火参果果皮，清洗并自然晾干表面水分后，将果皮置于烘箱中烘干，粉碎，过筛；将干后得到的火参果果皮干粉按料液比1:30的比例加入蒸馏水，在70℃的水浴中浸提2h。在12000r/min的条件下离心20min后，取上清。离心后的沉淀按照此方法，加入蒸馏水重复提取三次后，合并上清液即为火参果果皮总的多糖的粗提液。

2、火参果果皮多糖的纯化

将火参果果皮总的多糖的粗提液经旋转蒸发浓缩至原体积的1/10后加入4 倍体积的无水乙醇，放入4℃冰箱静置(低温沉析多糖)过夜后取出，在12000 r/min的条件下离心20min，收集沉淀。将沉淀复溶后，依次除蛋白和除小分子杂质，冻干制得粗多糖(CMPP)。将粗多糖依次经过DEAE-52纤维柱和G-100 凝胶柱分离纯化，制得组分多糖CMPP-3、CMPP-4。具体步骤如下：

(1)、除蛋白

将收集到的粗多糖按重量比1：10加蒸馏水复溶混合，按照4:1(v/v)的比例与Sevag溶液(由氯仿与正丁醇按照4:1(v/v)的比例混合而成)均匀混合，在12000r/min的条件下离心20min，变性的蛋白质位于水层与有机溶剂层交界处，取上层多糖水溶液。重复上述操作三次后，真空旋转蒸发掉其中的有机溶剂后，冷冻干燥，即得除蛋白的火参果果皮粗多糖。

(2)、除小分子杂质

将除蛋白的火参果果皮粗多糖按重量比1：5加蒸馏水复溶混合加入到透析袋(5kDa)中，置于蒸馏水中透析72h(每6h换一次透析液)后，冷冻干燥所得白色粉末，即为火参果果皮粗多糖CMPP。

(3)、分离组分多糖

将上一步得到的粗多糖按重量比1：15加蒸馏水复溶后缓慢加入DEAE-52 纤维柱中，用2倍柱体积的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液依次进行洗脱，洗脱速度2mL/min，10ml/管，洗脱图见图2。用苯酚硫酸法检测含糖的管数，分别收集0.3、0.4mol/L NaCl浓度的洗脱液。分别浓缩至总体积的 1/10后，冷冻干燥。

再分别按重量比5:1加蒸馏水复溶以上产物，之后缓慢加入G-100凝胶层析柱，用2倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，洗脱速度0.5mL/min，5ml/管。用苯酚硫酸法检测糖含糖的管数，分别收集糖分集中的组分，冷冻干燥，即为火参果果皮粗多糖CMPP-3(0.3mol/L NaCl浓度的洗脱液经G-100凝胶层析)和CMPP-4 (0.4mol/L NaCl浓度的洗脱液经G-100凝胶层析)。

二、火参果果皮多糖的含量的测定

多糖含量测定方法：用苯酚硫酸法测定不同浓度葡萄糖的吸光度来制定浓度 -吸光度标准曲线，再将火参果果皮多糖样品配成一定浓度的溶液按标准曲线项下操作测其吸光度，代入浓度-吸光度标准曲线方程经计算得到所得多糖含量。

标准曲线的制备：准确称量4mg标准葡萄糖于100mL容量瓶中，加入蒸馏水混匀定容，得到葡萄糖标准溶液。准确吸取葡萄糖标准溶液至洁净的试管中，体积呈一定的梯度逐步递增，分别为0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mL，再加入蒸馏水至2mL体积，同时使用2mL蒸馏水作空白对照。随后向每支试管中分别加入1.0mL 6％的苯酚，5.0mL的浓硫酸。将混合液摇匀，放置20min，测定溶液在490nm下的吸光值，得回归方程y＝0.6431x+0.1169(r²＝0.9941)。结果表明，在0.0～1.8μg/mL的浓度范围内具有良好的线性关系(图3)。

实施例2温度对火参果果皮多糖提取量的影响

一、实验方法

在提取时间为2h，料液比为1：20(0.05g/mL)固定不变，其余实验操作统一的条件下(同实施例1)，分别探究火参果果皮多糖提取量在提取温度为40、 50、60、70、80℃时的变化情况。

二、实验结果

如图4所示，当提取温度为60℃时火参果果皮多糖的提取量高于提取温度为40、50、70、80℃时的多糖提取量。因此，在该提取条件中，60℃为火参果果皮多糖提取的最佳温度。

实施例3时间对火参果果皮多糖提取量的影响

一、实验方法

在投料比为1：20(0.05g/mL)、提取温度为70℃固定不变，，探究不同提取时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3h)对火参果果皮多糖提取量的影响。

二、实验结果

如图5所示，由图可知，提取时间为2.5h的火参果果皮多糖提取量高于提取时间为0.5、1、1.5、2、2.5、3h时的多糖提取量。因此，在该提取条件中， 2.5h为火参果果皮多糖提取的最佳时间。

实施例4料液比对火参果果皮多糖提取量的影响

一、实验方法

在提取时间为2h，提取温度为70℃的条件下，其余实验操作统一的条件下(同实施例1)，分别探究在1：10、1：15、1：20、1：25、1：30(g/mL) 的料液比下，火参果果皮多糖提取量的变化。

二、实验结果

如图6所示，由图可知，当料液比为1：25g/mL时火参果果皮多糖的提取量高于料液比为1：10、1：15、1：20、1：30(g/mL)时的多糖提取量。因此，在该提取条件中，1：25g/mL为火参果果皮多糖提取的最佳料液比。

实施例5正交实验

一、实验方法

在单因素实验的基础上，使用正交试验方法进一步优化火参果果皮多糖提取的最佳投料比，最佳提取时间和最佳提取温度。根据正交试验原理设计实验：选取温度(A)、时间(B)、料液比(C)三个因素为自变量，以提取得到的火参果果皮多糖含量(Y)为因变量。试验因素与水平设计见表1，运用相应的数据分析软件，进行正交试验分析，计算得到火参果果皮多糖的最佳提取工艺条件。最后在正交试验分析法得到的火参果果皮多糖的最佳提取工艺条件下，提取火参果果皮多糖。通过3次平行验证实验，测定多糖提取量，验证所采取的分析方法的可靠性。

c为样品稀释液中多糖的浓度(mg/mL)，n为稀释倍数，V为样品稀释液体积(mL)，m为火参果果皮粉末质量(mg)。

表1试验因素与水平设计：

二、实验结果

表2正交试验结果及直观分析：

表3方差分析：

从表2分析可知，不同因素对火参果果皮多糖的提取效果影响程度不同。从表2中极差的结果可清晰地看出其影响的主次顺序依次为温度>液料比>时间；从表3方差分析中的F比也可以知道影响顺序为温度>液料比>时间，与正交试验结果及直观分析表中的结果一致，说明温度对火参果果皮多糖的提取有比较大的影响，时间对火参果果皮的多糖提取效果影响不大。因此从正交试验结果及直观分析表中可得最佳提取工艺组合为A3B1C3，最佳提取工艺参数为温度70℃，时间2h，液料比30，在此条件下多糖得率为16.54％。

实施例6火参果果皮多糖体外免疫调节活性评价

一、RAW264.7巨噬细胞的培养和传代

在含有10％胎牛血清和1％双抗的DEME的完全培养基中培养RAW264.7 巨噬细胞，与37℃、5％CO₂培养箱进行贴壁培养。

二、CMPP-3、CMPP-4对RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响

当多糖作用于RAW264.7巨噬细胞时，可诱导多种细胞免疫应答反应的发生，通过促进细胞当增殖和产生细胞因子的方式实现免疫调节作用。其中，NO 是生物体内的活性物质，而NO的释放量是判断巨噬细胞免疫调节活性是否增强的重要指标。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的主要成分，对宿主具有毒性，具有诱导细胞产生免疫应答反应的作用，常用作免疫调节活性评价的阳性对照。采用亚硝酸盐试剂盒(Griess法)测定各处理组RAW264.7巨噬细胞分泌NO含量。

1、实验方法

将处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞以5×10⁵个/mL接种于24孔细胞培养板，每孔加入500μL细胞培养基。培养24h后，细胞贴壁，更换细胞培养基。空白对照组加入培养基1mL；各浓度梯度处理组分别加入含有火参果果皮组分多糖的培养基1mL(CMPP-3：0.625、2.5、10、40μg/ml，CMPP-4： 6.25、12.5、25、50μg/ml)；LPS组加入含LPS(1μg/mL)的培养基1mL，每组4个重复孔，于37℃、5％CO₂培养箱继续培养24h后，每孔吸出50μL上层培养基，按照试剂盒说明书测定各组细胞上清液中NO的含量，在于酶标仪上测定540nm处的吸光度。

2、实验结果

结果如图7所示，在0.625～40μg/mL浓度范围内，CMPP-3能显著促进巨噬细胞分泌NO，且呈剂量依赖性。当CMPP-3浓度达到40μg/mL时，NO的释放量约为空白对照组的4倍；如图8所示，在6.25～50μg/mL浓度范围内， CMPP-4能显著促进巨噬细胞分泌NO，且呈剂量依赖性。当CMPP-4浓度达到 50μg/mL时，NO的释放量约为空白对照组的3倍。

三、CMPP-3、CMPP-4对RAW264.7巨噬细胞分泌细胞因子IL-6和TNF- α的影响

巨噬细胞受到多糖的刺激，可以分泌细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(IL)等，这些因子能在一定程度上调控机体的免疫功能，并在免疫应答反应中发挥重要作用。

1、实验方法

将处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞以1×10⁵个/mL接种于24孔细胞培养板，每孔加入500μL细胞培养基。培养24h后，细胞贴壁，更换细胞培养基。空白对照组加入培养基1mL；各浓度梯度处理组分别加入含有火参果果皮组分多糖的培养基1mL(CMPP-3：0.625、2.5、10、40μg/ml，CMPP-4： 6.25、12.5、25、50μg/ml)；LPS组加入含LPS(1μg/mL)的培养基1mL，每组4个重复孔，于37℃、5％CO2培养箱继续培养。24后取细胞培养上清液，采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定IL-6和TNF-α的含量。具体操作方法参照IL-6和TNF-α试剂盒说明书进行，于450nm处测定吸光度值。

2、实验结果

结果如图9所示，在0.625～40μg/mL浓度范围内，CMPP-3能显著促进巨噬细胞分泌IL-6，且呈剂量依赖性。当CMPP-3浓度达到40μg/mL时，IL-6 的分泌量约为空白对照组的28倍；如图10所示，在6.25～50μg/mL浓度范围内，CMPP-4能显著促进巨噬细胞分泌IL-6，且呈剂量依赖性。当CMPP-4浓度达到50μg/mL时，IL-6的释放量约为空白对照组的10倍。

结果如图11所示，在0.625～40μg/mL浓度范围内，CMPP-3能显著促进巨噬细胞分泌TNF-α，且呈剂量依赖性。当CMPP-3浓度达到40μg/mL时， IL-6的分泌量约为空白对照组的15倍；如图12所示，在6.25～50μg/mL浓度范围内，CMPP-4能显著促进巨噬细胞分泌IL-6，且呈剂量依赖性。当CMPP-4 浓度达到50μg/mL时，IL-6的释放量约为空白对照组的9倍。

Claims (5)

1.一种火参果果皮多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.火参果果皮粉末加水进行提取，取上清，重复提取，合并上清液，得到火参果果皮总的多糖的粗提液，其中火参果果皮干粉料液比1：10～1：35，提取温度为50～80℃，提取时间为0.5～3.5，重复提取1～3次；

S2.火参果果皮总的多糖的粗提液浓缩后加入无水乙醇，静置，收集沉淀；

S3.溶解沉淀后采用Sevag法去除蛋白质；

S4.透析除小分子杂质；

S5.使用DEAE-52纤维柱纯化，步骤S4产物的水溶液加入DEAE-52纤维柱中，用1～3倍柱体积的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液依次进行洗脱，收集0.3和/或0.4mol/LNaCl浓度的洗脱液，浓缩干燥；

S6.使用G-100凝胶层析柱纯化：步骤S5产物的水溶液加入G-100凝胶层析柱中，用1～3倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，收集，浓缩干燥。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，浓缩至原体积的1/(5～10)，加入2～4倍体积的无水乙醇，低温沉析多糖。

3.权利要求1到2任一所述制备方法制备得到的火参果果皮多糖。

4.权利要求3所述火参果果皮多糖在制备功能性食品中的应用。

5.一种功能性食品，其特征在于，含有权利要求3所述火参果果皮多糖。

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