CN108892732A - 具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法及其应用，制备方法包括如下步骤(1)制备金昌枣脱脂粉末；(2)对金昌枣脱脂粉末进行水提，得水提浓缩液；(3)除去水提浓缩液中的蛋白，得脱蛋白浓缩液；(4)采用醇沉法从脱蛋白浓缩液中制备金昌枣粗多糖；(5)分离得到具有免疫调节功能的金昌枣粗多糖。本发明制备的金昌枣多糖具有促进巨噬细胞的吞噬作用、增加巨噬细胞的一氧化氮的产生量、以及促进小鼠脾淋巴细胞的增殖等免疫调节功能。

Description

具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及天然高分子及金昌枣深加工技术领域。具体地说是一种具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法及其应用。
背景技术
红枣是我国传统中药中“药食同源”的优良补品，具有广泛的应用范围和悠久的药用历史，其保健作用家喻户晓你。红枣多糖是红枣中重要的天然活性成分，具有明显的免疫活性和促进淋巴细胞的增殖功能，对抗氧化性、抗衰老具有重要的作用，并且还有补气生血、改善肠道、抗疲劳的作用。因此，我们有必要对红枣多糖资源进行深入研究并合理利用，其提取方法已经成为红枣多糖研究的焦点之一，也是开发利用红枣多糖的首要问题。
中国专利文献CN103335971A，公开了一种碱液浸提后进行超声技术提取红枣多糖的方法，通过以下方法制备得到：将红枣洗净、烘干、去皮去核、粉碎、研磨至粉末状，称干重；将处理好的红枣粉末，进行石油醚脱脂，风干；再将红枣进行碱液浸提稀释后离心，得到上清液；将上清液进行粗过滤，得到红枣多糖粗提取液，再将其超声提取，所得的红枣粗提取液定容于250 mL容量瓶，放置于不同温度的水槽中提取一定时间；取1mL红枣粗提取稀释液，加入6％苯酚溶液1mL，浓硫酸2mL，摇匀，冷却，于490nm波长中测吸光度A。
但是现有技术这些关于多糖的提取均关注多糖的纯度和提取率，并没有关于具有特定生物功能的多糖的提取研究。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有促进巨噬细胞的吞噬作用、增加巨噬细胞的一氧化氮的产生量、以及促进小鼠脾淋巴细胞的增殖等免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，包括如下步骤
(1)制备金昌枣脱脂粉末；
(2)对金昌枣脱脂粉末进行水提，得水提浓缩液；
(3)除去水提浓缩液中的蛋白，得脱蛋白浓缩液；
(4)采用醇沉法从脱蛋白浓缩液中制备金昌枣粗多糖；
(5)分离得到具有免疫调节功能的金昌枣粗多糖。
上述具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，在步骤(1)中：将新鲜金昌枣去核、烘干、粉碎，得金昌枣粉；随后向金昌枣粉中加入5-15 倍金昌枣粉质量的70-75wt％乙醇，充分搅拌，静置1天以上，弃上层乙醇溶液，重复操作3次或3次以上，最后将乙醇挥干，得金昌枣脱脂粉末。
上述具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，在步骤(2)中：向金昌枣脱脂粉末中加水，金昌枣脱脂粉末与水的料液比为1:5-15g/mL， 75-85℃提取1h以上，重复操作3次或3次以上，合并水提液，50-70℃减压浓缩，得水提浓缩液。
上述具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，在步骤(3)中：向水提浓缩液中加入2-5倍水提浓缩液体积的Sevage试剂，所述的Sevage试剂为氯仿和正丁醇按照体积比为氯仿:正丁醇＝2-5:1组成的混合物，振荡，离心，取上清，重复操作；随后50-70℃减压浓缩除去有机试剂，得脱蛋白浓缩液。
上述具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，在步骤(4)中：向脱蛋白浓缩液中加入2-5倍脱蛋白浓缩液体积的90-95wt％乙醇，4℃下静置，充分沉淀多糖，离心，收集沉淀物；将沉淀物溶解于蒸馏水中，使用分子截留量8000Da透析袋流水透析，浓缩，冷冻干燥得金昌枣粗多糖。
上述具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，在步骤(5)中：取金昌枣粗多糖，配置成浓度为35-45mg/mL的溶液，每次上样量为50mL，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为0.8-1.2mL/min，硫酸-苯酚法跟踪检测；；合并0.05mol/L的NaCl溶液洗脱组分，得洗脱液一，然后洗脱液一经浓缩、透析、冷冻干燥得多糖JCS-1；合并0.1mol/L的NaCl溶液洗脱组分，得洗脱液二，然后洗脱液二经浓缩、透析、冷冻干燥得多糖 JCS-2。
具有免疫调节功能的金昌枣多糖的应用，利用上述方法制备的金昌枣多糖制备免疫调节剂，用于促进巨噬细胞的吞噬作用、增加巨噬细胞的一氧化氮的产生量、或者促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
1、本发明首次从金昌枣中分离出两种多糖，分别测定其平均相对分子量，分析其单糖组成并确定其具体的活性用途。
2、金昌枣多糖JCS-1和金昌枣多糖JCS-2，经HPGPC测定，JCS-1和 JCS-2的平均相对分子量分别为71.75kDa和357.39kDa。经HPLC分析， JCS-1主要由半乳糖醛酸和阿拉伯糖组成，摩尔比为39.04:1.39，还发现痕量的半乳糖、鼠李糖。金昌枣多糖JCS-2主要由半乳糖醛酸、甘露糖和鼠李糖组成，摩尔比为19.87:2.07:1.77，还发现痕量的阿拉伯糖和半乳糖。
3、金昌枣多糖JCS-1和JCS-2都可显著促进巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力，JCS-1和JCS-2在10、50、100μg/mL浓度范围内，与对照组相比都有极显著性差异(P<0.01)，并且在高浓度时JCS-2促进巨噬细胞 RAW264.7吞噬中性红的能力明显强于JCS-1。另外金昌枣多糖JCS-1和JCS-2 都可显著刺激巨噬细胞RAW264.7产生NO，在测试浓度范围内，与对照组相比都有极显著性差异(P<0.001)。在低浓度范围中JCS-1促进巨噬细胞RAW264.7产生NO的能力明显强于JCS-2。JCS-1和JCS-2都能够明显协同 LPS促进B细胞增值。但是在测试浓度范围内JCS-1不能协同ConA刺激T 细胞的增值，JCS-2仅在浓度为100μg/mL时才表现出显著的促进T细胞增值作用，说明这两种金昌枣多糖可以选择性地促进B细胞的增殖。。
附图说明
图1：金昌枣多糖的提取流程图。
图2：金昌枣多糖JCS-1的HPGPC测定的结果。
图3：金昌枣多糖JCS-2的HPGPC测定的结果。
图4：金昌枣多糖JCS-1和JCS-2的单糖组成。
图5：金昌枣多糖紫外光图谱。
图6：金昌枣多糖红外光图谱。
图7：金昌枣多糖JCS-1和JCS-2扫描电子显微镜图(A中从左至右放大倍数依次为1K、10K、20K；B中从左至右放大倍数依次为1K、10K、20K)。
图8：金昌枣多糖JCS-1和JCS-2对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的影响。
图9：金昌枣多糖JCS-1和JCS-2对巨噬细胞RAW264.7产生NO的影响。
图10：金昌枣多糖JCS-1对小鼠脾淋巴细胞增值的作用。
图11：金昌枣多糖JCS-2对小鼠脾淋巴细胞增值的作用。
具体实施方式
第一部分免疫调节功能的金昌枣多糖的制备
实施例1金昌枣多糖JCS-1的制备
(1)制备金昌枣脱脂粉末：将新鲜金昌枣去核、烘干、粉碎，得金昌枣粉；随后向金昌枣粉中加入10倍金昌枣粉质量的70wt％乙醇，充分搅拌，静置2天，弃上层乙醇溶液，重复操作3次，最后将乙醇挥干，得金昌枣脱脂粉末；
(2)对金昌枣脱脂粉末进行水提，得水提浓缩液：向金昌枣脱脂粉末中加水，金昌枣脱脂粉末与水的料液比为1:10g/mL，80℃提取3h，重复操作3次，合并水提液，60℃减压浓缩，得水提浓缩液。
(3)除去水提浓缩液中的蛋白，得脱蛋白浓缩液：采用Sevage法除蛋白，向水提浓缩液中加入4倍水提浓缩液体积的Sevage试剂，所述的Sevage 试剂为氯仿和正丁醇按照体积比为氯仿:正丁醇＝3:1组成的混合物，振荡 30min，4000rpm离心20min，取上清，重复操作5次；随后60℃减压浓缩除去有机试剂，得脱蛋白浓缩液。
(4)采用醇沉法从脱蛋白浓缩液中制备金昌枣粗多糖：向脱蛋白浓缩液中加入4倍脱蛋白浓缩液体积的95wt％乙醇，4℃下静置12h充分沉淀多糖，5000rpm、4℃离心15min，收集沉淀物；将沉淀物溶解于蒸馏水中，使用分子截留量8000Da透析袋流水透析48h，浓缩，冷冻干燥得金昌枣粗多糖。
(5)分离得到具有免疫调节功能的金昌枣粗多糖：取金昌枣粗多糖2g，配置成浓度为40mg/mL的溶液，上样量为50mL，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl 溶液洗脱，流速为1mL/min，硫酸-苯酚法跟踪检测，合并0.05mol/L的NaCl 溶液洗脱组分，然后洗脱液经浓缩、透析、冷冻干燥得多糖JCS-1。
实施例2金昌枣多糖JCS-2的制备
(1)制备金昌枣脱脂粉末：将新鲜金昌枣去核、烘干、粉碎，得金昌枣粉；随后向金昌枣粉中加入10倍金昌枣粉质量的70wt％乙醇，充分搅拌，静置2天，弃上层乙醇溶液，重复操作3次，最后将乙醇挥干，得金昌枣脱脂粉末；
(2)对金昌枣脱脂粉末进行水提，得水提浓缩液：向金昌枣脱脂粉末中加水，金昌枣脱脂粉末与水的料液比为1:10g/mL，80℃提取3h，重复操作3次，合并水提液，60℃减压浓缩，得水提浓缩液。
(3)除去水提浓缩液中的蛋白，得脱蛋白浓缩液：采用Sevage法除蛋白，向水提浓缩液中加入4倍水提浓缩液体积的Sevage试剂，所述的Sevage 试剂为氯仿和正丁醇按照体积比为氯仿:正丁醇＝3:1组成的混合物，振荡 30min，4000rpm离心20min，取上清，重复操作5次；随后60℃减压浓缩除去有机试剂，得脱蛋白浓缩液。
(4)采用醇沉法从脱蛋白浓缩液中制备金昌枣粗多糖：向脱蛋白浓缩液中加入4倍脱蛋白浓缩液体积的95wt％乙醇，4℃下静置12h充分沉淀多糖，5000rpm、4℃离心15min，收集沉淀物；将沉淀物溶解于蒸馏水中，使用分子截留量8000Da透析袋流水透析48h，浓缩，冷冻干燥得金昌枣粗多糖。
(5)分离得到具有免疫调节功能的金昌枣粗多糖：取金昌枣粗多糖2g，配置成浓度为40mg/mL的溶液，上样量为50mL，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl 溶液洗脱，流速为1mL/min，硫酸-苯酚法跟踪检测，合并0.1mol/L的NaCl 溶液洗脱组分，然后洗脱液经浓缩、透析、冷冻干燥得多糖JCS-2。
第二部分金昌枣多糖的表征
(一)多糖平均相对分子量的测定
JCS-1和JCS-2的平均相对分子量分别通过Waters 515凝胶渗透色谱系统(GPC)测定，该系统配备Waters Ultrahydrogel预装柱(250,1000,2000； 30cm×7.8mm,粒径为6μm)和Waters 2414示差检测器。流动相为3mM 乙酸钠(含0.05％叠氮化钠)溶液，流速0.5mL/min，柱温为40℃，进样量为50μL。Dextran系列标准葡聚糖(相对分子量分别为5.2，10，48.6， 668，2000kDa)为标样做标准曲线。相对分子量和保留时间的关系可以表示为：
log(Mw)＝-0.1869T+12.061R2＝0.98
(二)多糖的单糖组成分析
1、酸水解多糖为单糖：称取2mg多糖样品于具塞试管中，加入3mL4 mol/L的三氟乙酸(TFA)，密封，121℃反应水解4h。冷却后将水解产物置于减压真空干燥箱中快速干燥，依次加入甲醇2mL，减压蒸干，重复5 次，直至TFA无残留，干燥产物备用。
2、水解单糖的衍生化：上述水解产物加入200μL水复溶，再加200μL 0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇(0.4355g/5mL)溶液，封口膜封紧，涡旋混匀。在70℃水浴中反应100min，取出放置10min，冷却至室温，加入200μL 0.3mol/L的HCl中和，加水至2mL，再加等体积的氯仿，涡旋震荡，静置。吸取上层水相，再重复萃取3次。用带有0.22 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。
3、混合单糖标样的衍生：称取单糖标准品(甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)溶于5mL的去离子水中，取100μL此混合标准液，加入100μL0.6mol/L的NaOH溶液充分溶解，加200μL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液，封紧，涡旋混匀；在70℃水浴中反应100min，取出放置10min，冷却至室温，加入200μL 0.3mol/L的HCl 中和，加水至2mL，再加等体积的氯仿，涡旋震荡，静置。吸取上层水相，再重复萃取3次。用带有0.22μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。
4、色谱测定条件：采用Agilent 1100高效液相色谱系统。色谱柱为 C18色谱柱(250nm×4.6nm)；流动相为磷酸缓冲溶液(0.01M,pH＝6.7) 和乙腈混合液体积比为83:17，流速为1mL/min，进样量为20μL；检测器是SPD-15C紫外可见检测器254nm，柱温30℃。
(三)紫外光谱分析
将金昌枣多糖样品配成200μg/mL的溶液，使用紫外-可见分光光度计扫描200-800nm范围内的光谱特性，扫描间距为0.5nm。结果如图4，其在260nm和280nm处均无特征吸收峰，表明多糖无蛋白质和核酸。
(四)红外光谱分析
准确称取干燥JCS-1，JCS-2各2mg，加入干燥的溴化钾粉末混匀研磨，倒入压片模具压片1min，采用BRUKER TENSOR 27FTIR在4000～400cm-1范围内进行扫描，并记录结果。结果如图5所示，可以看出：红外光谱分析显示，组分JCS-1和JCS-2都3420.3cm-1的吸收峰为糖类O-H的伸缩振动， 2929.2cm-1为糖分子甲基或亚甲基C-H的伸缩振动；1400～1200cm-1的一组峰为C-H变角振动，由以上3个特征峰可以判断JCS-1具有糖类结构。 1724.2cm-1的吸收峰表明JCS-1中含有-COO基团，950～1200cm-1处的强吸收则是吡喃环的吸收峰，902.8cm-1的弱吸收为β-吡喃环的吸收峰。上述红外测定结果证实JCS-1是一类酸性多糖，具有β-吡喃环结构。JCS-2的红外光谱图和JCS-1相似，说明JCS-2也是酸性糖。
(五)扫描电子显微镜
取适量的JCS-1和JCS-2冻干样品黏于金属块的导电胶上，喷金后，电子枪加速电压10kV，进行观察。JCS-1不同放大倍数(1K、10K、20K)的扫描电子显微镜如图6所示，由图可知JCS-1大多呈无规则碎片状，排列无规则，相互交错在一起，说明多糖在水溶液中以无规则聚集体存在，这可能是因为多糖分子间的相互作用、结合的紧密度不同而形成了不同的聚集体。 JCS-2不同放大倍数(1K、10K、20K)的扫描电子显微镜如图6所示，JCS-2 多呈卷曲片状，结合较为紧密，表面较为平整。
第三部分金昌枣多糖的用途
材料与试剂：金昌枣多糖JCS-1，JCS-2(实施例1、实施例2制备)， RMPI-1640培养基(Gibco公司)，双抗溶液(Solarbio公司)，脂多糖 (LPS)(Sigma公司)，刀豆球蛋白(ConA)(阿拉丁试剂公司)，胎牛血清(杭州四季青)，中性红(Sigma公司)，Griess试剂(Sigma)，四甲基偶氮唑盐 (MTT)(Sigma公司)。
仪器：CO2培养箱MCO-15AC(Sanyo)，酶联免疫检测仪DNM-9602(北京普朗新技术有限公司酶标仪)，倒置光学显微镜BK-LED(百康生物科技有限公司显微镜)，数显恒温水浴锅HH-4(常州国华电器有限公司)，多功能高速离心机HM-15(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。
一、JCS-1和JCS-2对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红功能的影响
中性红溶液：称取0.075g中性红粉末，用PBS缓冲溶液充分溶解后， 0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存，备用。
细胞裂解液：将1mL冰醋酸加入到99mL蒸馏水中配成1％的醋酸溶液，再加入100mL无水乙醇，混合均匀，4℃保存。
调整巨噬细胞RAW264.7细胞浓度为1×106/mL，向96孔细胞培养板中每孔加入90μL细胞混悬液，放入细胞培养箱中培养1h后，然后加入不同度的金昌枣多糖溶液或者LPS溶液10μL(多糖终浓度为10，50，100μg/mL， LPS终浓度为2μg/mL)，每个浓度6个平行组，在37℃、5％CO2条件下培养24h。随后，弃细胞培养上清液，PBS洗涤2次，加入预热的中性红溶液继续孵育2h。随后每孔再弃上清液，用PBS缓冲溶液清洗细胞3次，之后每孔加入200μL细胞裂解液，放入4℃冰箱过夜，在酶标仪490nm波长测定吸光值，通过计算吞噬指数来比较细胞的吞噬能力，计算公式如下：
吞噬指数＝A样品/A空白对照
结果如图7所示，金昌枣多糖JCS-1和JCS-2在都可显著得促进巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力。
二、JCS-1和JCS-2对巨噬细胞RAW264.7产生一氧化氮(NO)的影响
RAW264.7细胞(1×106/mL)加入到96孔板中，随后每孔分别添加PBS(空白对照组)，LPS(阳性对照组)，不同浓度的组分多糖JCS-1(10，50，100μ g/mL)和JCS-2(10，50，100μg/mL)进行处理，每个浓度6个平行组，在37 ℃、5％CO2条件下培养24h。100μL细胞上清液样品中加入50μLGriessA 试剂，摇床上震荡10min，再加入50μLGriessB试剂，摇床上震荡10min，用酶标仪测定各孔在540nm处的吸光度值，然后根据标准曲线(亚硝酸钠标准曲线)计算NO含量。结果如图8所示，说明金昌枣多糖JCS-1，JCS-2 可以显著刺激巨噬细胞RAW264.7产生NO。
三、JCS-1和JCS-2对小鼠脾淋巴细胞的增殖的影响
(1)溶液的配制红细胞裂解液的配制：称取1g三羟甲基氨基甲烷和7.5 g NH4Cl，用超纯水溶解后定容至1000mL，121℃灭菌20min后，4℃保存备用。
(2)小鼠的饲养昆明小白鼠，雌性，20±2g被随机地分配到含有木屑的塑料盒子中，置于21℃、50％相对湿度的动物房里饲养。
小鼠脾淋巴细胞的获得：充氮气窒息处死小鼠，75％酒精浸泡10min，无菌条件下取出小鼠脾脏，PBS缓冲液冲洗2次，去除表面污血等。脾脏用注射器内芯研磨过70μm的筛网，PBS缓冲液冲洗筛网数次，然后再过40μm 筛网，收集分离的脾细胞悬液至离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液。加入红细胞裂解液12mL，吹打混匀，4℃条件静置8～10min，红细胞完全破碎后1000rpm离心5min，弃去上清液，用PBS重悬细胞，离心，重复2次，洗去多余红细胞裂解液。最后用RPMI-1640(含10％新生牛血清) 重悬细胞，计数调整细胞浓度为8～10×106cells/mL。
将小鼠淋巴细胞悬浮液混匀后加到96孔板中(每孔100μL)，然后加入LPS溶液、不同浓度的多糖溶液、LPS溶液或ConA溶液，每个浓度6个平行组。多糖的终浓度为10，50，100μg/mL且使多糖和2μg/mL的LPS或 5μg/mL的ConA共孵育。48h后，加入MTT溶液，再孵育4h后，弃上清液，加入DMSO溶液，摇床上震荡溶解10min后，在490nm处测定吸光度值。脾细胞增殖率按公式计算：
增值率(％)＝(A样品-A空白对照)/A空白对照
如图9所示，JCS-1和JCS-2都能够明显协同LPS促进B细胞增值。但是在测试浓度范围内JCS-1不能协同ConA刺激T细胞的增值，JCS-2仅在浓度为100μg/mL时才表现出显著的促进T细胞增值作用，说明这两种金昌枣多糖可以选择性地促进B细胞的增殖。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤
(1)制备金昌枣脱脂粉末；
(2)对金昌枣脱脂粉末进行水提，得水提浓缩液；
(3)除去水提浓缩液中的蛋白，得脱蛋白浓缩液；
(4)采用醇沉法从脱蛋白浓缩液中制备金昌枣粗多糖；
(5)分离得到具有免疫调节功能的金昌枣粗多糖。
2.根据权利要求1所述的具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中：将新鲜金昌枣去核、烘干、粉碎，得金昌枣粉；随后向金昌枣粉中加入5-15倍金昌枣粉质量的70-75wt％乙醇，充分搅拌，静置1天以上，弃上层乙醇溶液，重复操作3次或3次以上，最后将乙醇挥干，得金昌枣脱脂粉末。
3.根据权利要求2所述的具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中：向金昌枣脱脂粉末中加水，金昌枣脱脂粉末与水的料液比为1:5-15g/mL，75-85℃提取1h以上，重复操作3次或3次以上，合并水提液，50-70℃减压浓缩，得水提浓缩液。
4.根据权利要求3所述的具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中：向水提浓缩液中加入2-5倍水提浓缩液体积的Sevage试剂，所述的Sevage试剂为氯仿和正丁醇按照体积比为氯仿:正丁醇＝2-5:1组成的混合物，振荡，离心，取上清，重复操作；随后50-70℃减压浓缩除去有机试剂，得脱蛋白浓缩液。
5.根据权利要求4所述的具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中：向脱蛋白浓缩液中加入2-5倍脱蛋白浓缩液体积的90-95wt％乙醇，4℃下静置，充分沉淀多糖，离心，收集沉淀物；将沉淀物溶解于蒸馏水中，使用分子截留量8000Da透析袋流水透析，浓缩，冷冻干燥得金昌枣粗多糖。
6.根据权利要求5所述的具有免疫调节功能的金昌枣多糖的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中：取金昌枣粗多糖，配置成浓度为35-45mg/mL的溶液，每次上样量为50mL，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为0.8-1.2mL/min，硫酸-苯酚法跟踪检测；合并0.05mol/L的NaCl溶液洗脱组分，得洗脱液一，然后洗脱液一经浓缩、透析、冷冻干燥得多糖JCS-1；合并0.1mol/L的NaCl溶液洗脱组分，得洗脱液二，然后洗脱液二经浓缩、透析、冷冻干燥得多糖JCS-2。
7.具有免疫调节功能的金昌枣多糖的应用，其特征在于，利用权利要求1-9任一制备的金昌枣多糖制备免疫调节剂，用于促进巨噬细胞的吞噬作用、增加巨噬细胞的一氧化氮的产生量、或者促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110128559A (zh) * 2019-04-29 2019-08-16 华南农业大学 一种具有免疫调节的火参果果皮多糖的制备方法及其应用
CN111138558A (zh) * 2020-02-18 2020-05-12 安徽大学 一种天然免疫增强多糖pcp及其制备方法和用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102477104A (zh) * 2010-11-25 2012-05-30 苏州宝泽堂医药科技有限公司 拐枣多糖的分离纯化方法
CN102786603A (zh) * 2012-07-16 2012-11-21 宁夏大学 一种长枣抗肿瘤活性多糖的分离纯化制备方法
CN103965370A (zh) * 2014-05-20 2014-08-06 河南中烟工业有限责任公司 大枣多糖、提取纯化方法及其作为烟草保润剂的应用
CN106109620A (zh) * 2016-07-14 2016-11-16 塔里木大学 一种红枣加工废弃物的深加工方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102477104A (zh) * 2010-11-25 2012-05-30 苏州宝泽堂医药科技有限公司 拐枣多糖的分离纯化方法
CN102786603A (zh) * 2012-07-16 2012-11-21 宁夏大学 一种长枣抗肿瘤活性多糖的分离纯化制备方法
CN103965370A (zh) * 2014-05-20 2014-08-06 河南中烟工业有限责任公司 大枣多糖、提取纯化方法及其作为烟草保润剂的应用
CN106109620A (zh) * 2016-07-14 2016-11-16 塔里木大学 一种红枣加工废弃物的深加工方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110128559A (zh) * 2019-04-29 2019-08-16 华南农业大学 一种具有免疫调节的火参果果皮多糖的制备方法及其应用
CN110128559B (zh) * 2019-04-29 2021-02-19 华南农业大学 一种具有免疫调节的火参果果皮多糖的制备方法及其应用
CN111138558A (zh) * 2020-02-18 2020-05-12 安徽大学 一种天然免疫增强多糖pcp及其制备方法和用途

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