CN108409883B - 一种鹰嘴豆碱性多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹰嘴豆碱性多糖的制备方法，包括以下步骤：1)取鹰嘴豆粉碎过筛，浸泡除脂，离心，收集残渣，加水，离心，收集沉淀，加稀碱提取，离心收集上清液，加酸中和、离心，收集上清液并浓缩；2)将浓缩的上清液除淀粉，脱蛋白，透析脱盐，冻干得鹰嘴豆粗多糖；3)将鹰嘴豆粗多糖溶解，离心，上清液进行阴离子交换层析，梯度洗脱后，紫外检测，合并洗脱液，得到两个主峰；4)将洗脱液分别进行凝胶过滤层析，等度洗脱后，紫外检测，得到两个目的洗脱峰，即纯化的鹰嘴豆碱性多糖。本发明所用材料为提取中性多糖所剩的残渣，经济环保，提高了鹰嘴豆的利用率；粗多糖提取工艺简单，对企业的技术要求低，可适应与大范围的推广。

Description

一种鹰嘴豆碱性多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，特别涉及一种鹰嘴豆碱性多糖的制备方法。

背景技术

鹰嘴豆(chickpea)是一年生或多年生豆科鹰嘴豆属植物，株高1-2米，花果期6-9月，嫩苗、嫩荚、种子均可供食用。种子幼时呈绿色，成熟后通体呈暗黄、微红或淡白色，质地较为坚硬，直径4-7mm，大小与黄豆相似，表面有尖状突起，因其与鹰嘴相似而得名鹰嘴豆。鹰嘴豆又名桃尔豆、鸡豆、鸡豌豆，是世界第三大豆类，在中国新疆地区已有两千多年种植历史，主产于地中海气候地区，具有耐热、耐干旱、耐贫瘠等特征，因而在非洲、亚洲、地中海沿岸、美洲以及中国青海、新疆、甘肃等地都有广泛种植，尤其在亚洲西部和中东地区，是当地居民重要食用蔬菜之一。

鹰嘴豆营养丰富，富含多种优质植物蛋白(球蛋白)，经研究发现，与其他豆类相比，鹰嘴豆蛋白在消化吸收、功效比值以及生物利用价值方面占绝对优势，因而鹰嘴豆也有“豆中之王”的美誉。此外，鹰嘴豆还是一种良好的植物氨基酸补充剂，鹰嘴豆中含有8种人体必需氨基酸以及10多种非必需氨基酸，且含量高出燕麦2倍以上，对少年儿童生长发育及中老年强身健体具有不可低估的作用。同时，鹰嘴豆中富含的维生素、碳水化合物、脂肪、叶酸、膳食纤维以及钙、镁、铁、锌、磷等多种微量元素，无论是从种类，还是数量上，都大大超过其他豆类，具有较高的食用和药用价值。

国内外关于多糖的提取方法有很多，包括：溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法，微波法等。分离纯化多糖方法包括：沉淀法、盐析法、超滤法等。

本发明在此基础上提出一种具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆碱性多糖的制备方法。该方法能够得到具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆碱性多糖，经过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化得到的鹰嘴豆碱性多糖。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鹰嘴豆碱性多糖的制备方法，该方法能够得到具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆碱性多糖，该多糖能够使DPPH和ABTS自由基清除活性增强，金属还原能力增强；而且该多糖能够刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌产生NO、MCP-1、TNF-α和IL-6因子。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种鹰嘴豆碱性多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)取清洗干净的鹰嘴豆，粉碎过60目筛，95％乙醇浸泡3d除脂，离心，收集残渣烘干，加入蒸馏水，离心，收集沉淀，加入稀碱提取，离心，收集上清液，加酸中和，离心，收集上清液并浓缩；

2)将步骤1)得到的浓缩的上清液用α-淀粉酶法除淀粉，Sevag法进行脱蛋白处理，再装入透析袋4℃过夜透析脱盐，冻干，得鹰嘴豆粗多糖；

3)将步骤2)得到的鹰嘴豆粗多糖用蒸馏水溶解，13000r/min离心20min，上清液进行阴离子交换层析，梯度洗脱后，490nm紫外检测，合并收集洗脱液，得到两个主峰；

4)将步骤3)得到的目的洗脱液分别进行凝胶过滤层析，等度洗脱后，在206nm紫外检测，分别收集得到两个目的洗脱峰，即纯化的鹰嘴豆碱性多糖。

优选地，上述技术方案中，所述步骤1)具体为：

11)取清洗干净的鹰嘴豆，粉碎，过60目筛，按固液比1:6加入95％乙醇，浸泡3d除脂；

12)离心收集残渣，烘干，按料液比1:15，在温度为90℃条件下，持续搅拌4h，离心，收集沉淀。

13)将沉淀按料液比1:5-1:20加入0.1-0.4M NaOH溶液，室温提取2-5h，离心，收集上清液，加酸中和，离心，收集上清液并浓缩。

优选地，上述技术方案中，所述步骤13)的按料液比1:10；NaOH溶液浓度为0.3M；提取时间4h；离心条件：3500r、10min；烘干温度为60℃。

优选地，上述技术方案中，所述步骤2)采用的α-淀粉酶除淀粉处理具体为：将浓缩的上清液中加入一定量的α-淀粉酶，使酶浓度达到20U/mL，37℃水浴酶解至I₂-KI检测不变蓝，然后沸水浴中保持10min，使淀粉酶变性失活。

优选地，上述技术方案中，所述步骤2)的Sevag法进行脱蛋白处理具体为：将浓缩的上清液与Sevage试剂按5：1混合，振荡，离心，去蛋白。

优选地，上述技术方案中，所述Sevage试剂为氯仿和正丁醇按体积比5:1混合形成。

优选地，上述技术方案中，所述步骤3)具体为：

将步骤2)得到的鹰嘴豆粗多糖用蒸馏水溶解，离心，上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF填料柱，用超纯水平衡过夜，梯度洗脱，洗脱液为0-2M NaCl溶液，洗脱流速4ml/min，以8ml/管速度自动收集，在490nm紫外检测，收集目的洗脱液，分别冻干。

优选地，上述技术方案中，所述步骤4)具体为：

将步骤3)得到的目的洗脱液分别上丙烯葡聚糖凝胶s-300填料柱，等度洗脱，洗脱液为0.15M NaCl溶液，洗脱流速为0.5ml/min，自动收集，在206nm紫外检测，得到两个目的洗脱峰，即纯化的鹰嘴豆碱性多糖。

优选地，上述技术方案中，透析过夜的时间为8-12h，所述透析袋4℃过夜透析脱盐需要进行流水透析。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

本发明的方法能够得到具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆碱性多糖，该多糖能够使DPPH和ABTS自由基清除活性增强，金属还原能力增强；而且该多糖能够刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌产生NO、MCP-1、TNF-α和IL-6因子，经过超声处理后鹰嘴豆碱性多糖功效更强。

本方法具有鹰嘴豆碱性多糖筛选、纯化等作用，最终得到鹰嘴豆碱性多糖CAP-1和CAP-2。经过除淀粉和脱蛋白处理后，鹰嘴豆多糖纯度由43％增加至76％。

同时，本发明还具有以下有有益效果：

本发明所用材料为提取中性多糖所剩的残渣，经济环保，提高了鹰嘴豆的利用率；对鹰嘴豆碱性多糖进行提取并进行纯化工艺；经过系统提取纯化研究，鹰嘴豆碱性多糖CAP-1和CAP-2；粗多糖提取工艺简单，对企业的技术要求低，可适应与大范围的推广。

附图说明

图1：本发明的各组多糖的ABTS自由基清除活性。

图2：本发明的各组多糖的DPPH自由基清除活性。

图3：本发明的各组多糖的Fe3+还原能力。

图4：本发明的各组多糖NO含量。

图5：本发明的各组多糖MCP-1含量。

图6：本发明的各组多糖IL-6含量。

图7：本发明的各组多糖TNF-α含量。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1鹰嘴豆粗多糖的制备

分别研究提取温度、提取时间以及料液比对鹰嘴豆碱性多糖得率的影响。

(1)提取温度、提取时间以及料液比对鹰嘴豆蛋白得率的影响。

准确称取100g的鹰嘴豆粉碎，过60目筛后，将样品与95％乙醇按固液比1:6浸泡3天除脂，离心收集残渣，烘干。将烘干后的残渣放入500mL三角瓶中，加入蒸馏水，按料液比1:15，在温度为90℃条件下，持续搅拌4h，离心，收集沉淀，将沉淀按料液比1:5-1:20加入0.1-0.4M NaOH溶液，室温提取2-5h，离心，收集上清液，加酸中和，离心，收集上清液并浓缩。按照一定的料液比、在一定提取温度下、搅拌提取一定时间后，离心收集上清液，将上清液浓缩，除淀粉，脱蛋白、脱盐，冻干，得鹰嘴豆粗多糖。

分别考察料液比1：5、1：10、1：15、1:20，NaOH溶液浓度0.1,0.2,0.3，0.4M,搅拌提取时间2h、3h、4h、5h为考察因素和指标，建立起正交分析表。

单因素试验结果如下：

设定鹰嘴豆样品为100g。

其中，固液比设为1:10，搅拌时间为3h，实验分析NaOH溶液浓度对多糖得率的影响，结果如表1所示：

表1：固液比1:10，搅拌时间3h，NaOH溶液浓度对多糖得率的影响。

NaOH溶液浓度M	得率％
		0.1	1.43
0.2	2.01
		0.3	2.36
0.4	2.29

其中，固液比设为1:10，NaOH溶液浓度0.2M，实验分析提取时间对多糖得率的影响，结果如表2所示：

表2：固液比1:10，NaOH溶液浓度0.2M，提取时间对多糖得率的影响。

提取时间h	得率％
		2	1.30
3	1.96
		4	2.24
5	2.18

其中，搅拌时间为3h，NaOH溶液浓度0.2M，实验分析固液比对多糖得率的影响，结果如表3所示：

表3：搅拌时间3h，NaOH溶液浓度0.2M，固液比对多糖得率的影响。

固液比	得率％
		1：5	1.82
1：10	2.13
		1：15	2.05
1：20	1.97

结果表明(如表1-表3所示)：在料液比1:10，提取时间4h，NaOH溶液浓度0.3M效果较好，将离心后的上清液浓缩并用α-淀粉酶法除淀粉出去淀粉，Sevag法脱蛋白，得到的粗多糖溶液，经过除淀粉和脱蛋白处理后，鹰嘴豆多糖纯度由43％增加至76％，经过透析冻干后，多糖得率为2.42％。

实施例2鹰嘴豆粗多糖的纯化

(1)第一次纯化处理：阴离子交换层析

使用

explore100仪器，将两种鹰嘴豆粗多糖样品用蒸馏水溶解，离心(转速13000r/min，20min)后，上清液装上DEAE-琼脂糖凝胶FF(GE公司生产，货号17-0709-01)柱，用超纯水平衡过夜，梯度洗脱，洗脱液为0-2M NaCl，洗脱流速4ml/min，以8ml/管速度自动收集，490nm紫外检测，分别收集目的洗脱液，冻干。

(2)第二次纯化处理：丙烯葡聚糖凝胶s-300凝胶过滤层析

将上述得到的目的洗脱液分别进一步的进行凝胶过滤层析，填料为丙烯葡聚糖凝胶s-300，等度洗脱。洗脱液为0.15M NaCl溶液，流速为0.5ml/min。

在206nm紫外检测总糖含量并结合苯酚-硫酸法进行糖含量的定量的分析，最终两种多糖在206nm均产生两个主要峰，将收集到的峰分别冻干，得纯化后的鹰嘴豆碱性多糖(简称：CAP-1和CAP-2)。

实施例3各种多糖的抗氧化活性作用

测定上述各组多糖DPPH和ABTS自由基清除活性，以及Fe3+还原能力，从而证明鹰嘴豆碱性多糖的抗氧化活性作用。

结果表明(如图1-3所示)：分离纯化后鹰嘴豆碱性多糖均具有较高的抗氧化活性，且其中多糖CAP-2抗氧化活性最高。

实施例4各种多糖的免疫活性作用

进行细胞实验，测定上述各组多糖的对RAW264.7小鼠巨噬细胞NO、MCP-1、TNF-α和IL-6因子含量变化，从而证明鹰嘴豆碱性多糖的免疫活性作用。

结果表明(如图4-7所示)：CAP-1和CAP-2具有较强的免疫作用，能够显著促进小鼠RAW246.7巨噬细胞NO、IL-6、MCP-1和TNF-α等细胞因子的分泌，且随着浓度的增加，免疫活性增强。

本发明的方法能够得到具有抗氧化活性和免疫调节活性的鹰嘴豆碱性多糖，而且该多糖能够刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌产生NO、MCP-1、TNF-α和IL-6因子。本方法具有鹰嘴豆碱性多糖提取、纯化等作用，最终得到鹰嘴豆碱性多糖CAP-1和CAP-2。

本发明的提取过程中使用了α-淀粉酶法除淀粉，Sevag法进行脱蛋白，经过除淀粉和脱蛋白处理后，鹰嘴豆多糖纯度由43％增加至76％。得到的纯品的纯度大于99％。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (4)

1.一种鹰嘴豆碱溶性多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取清洗干净的鹰嘴豆，粉碎过60目筛，按固液比1:6加入95％乙醇浸泡3d除脂，离心，收集残渣烘干，按料液比1:15加入蒸馏水，在温度为90℃条件下，持续搅拌4h，离心，收集沉淀，将沉淀按料液比1:5-1:20加入0.1-0.4M NaOH溶液提取2-5h，离心，收集上清液，加酸中和，离心，收集上清液并浓缩；

2)将步骤1)得到的浓缩的上清液用α-淀粉酶法除淀粉，将浓缩的上清液与Sevage试剂按5：1混合，振荡，离心，去蛋白，再装入透析袋4℃过夜透析脱盐，冻干，得鹰嘴豆粗多糖；

3)将步骤2)得到的鹰嘴豆粗多糖用蒸馏水溶解，13000r/min离心20min，上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF填料柱，用超纯水平衡过夜，梯度洗脱后，洗脱液为0-2M NaCl溶液，洗脱流速4ml/min，以8ml/管速度自动收集，490nm紫外检测，得到两个洗脱峰，收集洗脱峰对应的洗脱液，分别冻干；

4)将步骤3)得到的目的洗脱液分别上丙烯葡聚糖凝胶s-300填料柱，等度洗脱，洗脱液为0.15M NaCl溶液，洗脱流速为0.5ml/min，自动收集，在206nm紫外检测，得到纯化后的鹰嘴豆碱溶性多糖CAP-1和CAP-2。

2.根据权利要求1所述的鹰嘴豆碱溶性多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中将沉淀按料液比1:10；加入NaOH溶液浓度为0.3M；提取时间4h；离心条件：3500r/min、离心10min；残渣烘干的温度为60℃。

3.根据权利要求1所述的鹰嘴豆碱溶性多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2)采用的α-淀粉酶除淀粉处理具体为：将浓缩的上清液中加入一定量的α-淀粉酶，使酶浓度达到20U/mL，37℃水浴酶解至I₂-KI检测不变蓝，然后沸水浴中保持10min，使淀粉酶变性失活。

4.根据权利要求1所述的鹰嘴豆碱溶性多糖的制备方法，其特征在于，所述Sevage试剂为氯仿和正丁醇按体积比5:1混合形成。

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