CN108892704A - 一种花生叶可溶性蛋白的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种花生叶可溶性蛋白的提取方法及其应用，包括如下步骤：1)以鲜花生叶为原料，经晒干，打粉；2)加入蒸馏水，调节pH，浸提；3)对浸提后溶液进行离心，分离得上清液，弃掉沉淀；4)调节所得上清液pH；5)对pH调节后的溶液进行离心，沉淀分离花生叶可溶性蛋白；6)将所得沉淀用蒸馏水进行回溶，并调节pH；7)将回溶完全的蛋白溶液经过真空冷冻干燥后，得到花生叶可溶性蛋白粉。本发明利用了碱溶酸沉法提取花生叶中可溶性蛋白，花生叶蛋白提取率较高，为44.59％，且操作简单，易于实现。经考马斯亮蓝法分析与抗氧化活性测定，表明所得花生叶可溶性蛋白的纯度为63.83％，并且具有良好的抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明属于从天然原料中提取功能性生物大分子物质领域，具体涉及一种从花生叶中提取可溶性蛋白的方法。
背景技术
植物叶蛋白是从新鲜植物茎叶中经过压榨后提取得到的绿色蛋白浓缩物，其中富含人体所需的必须氨基酸和非必须氨基酸，营养价值丰富。植物茎叶蛋白是全球最多的可再生蛋白质资源之一，它的提取物和加工产品将广泛用于食品、饲料、医药、农药、化妆品和植物生长调节剂等领域，叶蛋白也可以作进一步分离的原料，能够生产许多功能性的活性物质，如叶绿素、胡萝卜素、纯蛋白和维生素E等。我国植物茎叶蛋白产品研究刚刚起步不久，工业化生产尚未完全形成，相应标准也不够完善，而叶蛋白纯化后活性蛋白及多肽等的相关研究也将是今后的研究热点。
花生作为我国的四大油料作物之一，目前我国已然成为世界上花生生产、消费和进出口的大国，包括花生种植面积和花生产量均在世界前列。花生加工产业中会产生大量的花生副产品及废料，诸如花生叶、花生壳、花生渣等，这些产物都是潜在的植物蛋白资源。如果这部分资源没有充分利用,就会造成严重的资源浪费。所以，从花生加工产业的这些副产物中提取天然的植物蛋白，不仅可以提高花生相关加工产业的附加值，同时还会给社会带来较大的经济利益。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种利用碱溶酸沉法从花生叶中提取可溶性蛋白的方法。
本发明采用的技术方案为：一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，包括如下步骤：
1)以鲜花生叶为原料，经晾干，打粉，得花生叶粉；
2)取适量花生叶粉，加入蒸馏水，并调节pH，浸提，获得花生叶粉浸提溶液；
3)对花生叶粉浸提溶液进行离心，分离得上清液，弃掉沉淀；
4)调节所得上清液的pH；
5)对pH调节后的溶液进行离心，取沉淀；
6)将所得沉淀用蒸馏水进行回溶，并调节pH，得粗产物；
7)将粗产物经过真空冷冻干燥后，得到花生叶可溶性蛋白粉。
上述的一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，步骤2)中，花生叶粉与蒸馏水的料液比为1g：15-25mL；调节pH＝7-9；浸提时间为30-40min。优选的，花生叶粉与蒸馏水的料液比为1g：20mL；调节pH＝9；浸提时间为40min。
上述一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，步骤3)中，离心条件是：将花生叶粉浸提溶液在5000r/min的转速条件下离心20min。
上述一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，步骤4)中，调节上清液pH为2。
上述一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，步骤5)中，离心条件是：将上清液在5000r/min的转速条件下离心30min。
上述一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，步骤6)中，调节pH为7。
本发明具有以下有益效果：本发明操作简单，易于实现，本发明利用了碱溶酸沉法提取花生叶可溶性蛋白，蛋白提取率较高，高达44.59％，本方法利用响应面法优化提取条件、以提高产品的提取率，简化提取工艺。同时，还对所得花生叶可溶性蛋白进行了成分测定、考马斯亮蓝法分析与抗氧化活性测定，系统的评价了所得的花生叶可溶性蛋白的特点与功能。
附图说明
图1为本发明方法中料液比对花生叶可溶性蛋白提取率影响。
图2为本发明方法中浸提时间对花生叶可溶性蛋白提取率影响。
图3为本发明方法中浸提pH对花生叶可溶性蛋白提取率影响。
图4a为本发明料液比与浸提pH对花生叶可溶性蛋白提取率影响的响应面二维图。
图4b为本发明料液比与浸提pH对花生叶可溶性蛋白提取率影响的响应面三维图。
图5a为本发明浸提时间与浸提pH对花生叶可溶性蛋白提取率影响的响应面二维图。
图5b为本发明浸提时间与浸提pH对花生叶可溶性蛋白提取率影响的响应面三维图。
图6为不同浓度的本发明方法提取花生叶可溶性蛋白和抗坏血酸对羟基自由基清除率。
图7为不同浓度的本发明方法提取花生叶可溶性蛋白和抗坏血酸对超氧阴离子清除率。
图8为不同浓度的本发明方法提取花生叶可溶性蛋白和抗坏血酸对DPPH自由基清除率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不受实施例的限制。
实施例1
(一)一种花生叶可溶性蛋白的提取方法
1)以鲜花生叶为原料，晾干，将洗净晒干后的花生叶用打粉机打粉，并过筛，得花生叶粉。
2)取过筛后的花生叶粉40g，加入800mL蒸馏水，充分搅拌使叶粉均匀混合，然后调pH 9.0，搅拌浸提40min，获得花生叶粉浸提溶液。
3)将花生叶粉浸提溶液在5000r/min的条件下离心20min，分离得上清液，弃掉沉淀。
4)调节所得上清液的pH为2.0。
5)对pH调节后的溶液在5000r/min的转速条件下离心30min，得沉淀，为花生叶可溶性蛋白。
6)将离心所得沉淀放入烧杯中，加入约100mL蒸馏水，调节溶液pH 7.0，充分搅拌至蛋白沉淀完全回溶，得粗产物。
7)将粗产物放入-20℃冰箱中预冻，然后进行真空冷冻干燥，最终得花生叶可溶性蛋白粉。
(二)最佳提取工艺条件
为了确定最佳的提取工艺条件，探索适宜的工艺参数条件，分别考察步骤2)中影响花生叶可溶性蛋白提取过程的主要因素，即料液比、浸提时间和浸提pH，依次做单因素实验进行考察。
1、料液比对花生叶可溶性蛋白提取率的影响：
方法同(一)，控制其它因素一定，设定浸提pH 9，浸提时间30min。料液比试验设定值：1:10、1:20、1:30、1:40(g/mL)。
2、浸提时间对花生叶可溶性蛋白提取率的影响：
方法同(一)，控制其它因素一定，设定浸提pH 9，料液比1:20。浸提时间试验设定值：20、30、40、50min。
3、浸提pH对花生叶可溶性蛋白提取率的影响：
方法同(一)，控制其它因素一定，设定浸提时间30min，料液比1:20，浸提pH试验设定值：6、7、8、9、10。
结果如图1、图2和图3所示，单因素试验结果表明，料液比(A)、浸提时间(B)和浸提pH(C)三个变量对蛋白提取率有较大的影响，单因素实验的最佳值分别为：料液比1∶20、浸提时间30min、浸提pH 9。
(三)碱溶酸沉法提取花生叶可溶性蛋白响应面优化及分析
利用Design-Expert 8.0.6软件，选取三个自变量：料液比(A)、浸提时间(B)和浸提pH(C)，以蛋白质提取率(Y)为响应值，进行响应面条件优化试验设计。响应面试验的因素和水平如下表(表1)。
表1 Box-Behnken试验设计因素水平
试验采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计及数据结果分析。1、试验设计结果
表2 Box-Behnken试验设计结果
2、回归模型方差分析
表3响应面试验回归模型方差分析
为了考察三个变量：料液比(A)、浸提时间(B)和浸提pH(C)对于蛋白提取率的影响，利用Box-Behnken试验设计，试验结果如表3所示。通过应用多元回归方法分析实验数据,对实验数据进行多元回归拟合，获得料液比(A)、浸提时间(B)、浸提pH(C)的二次项回归方程为:
Y＝46.13-0.65A+4.05B+3.96C-0.27AB-1.86AC+2.92BC-5.27A2-2.44B2-9.57C2
响应面方差分析和误差分析的二次模型如表3所示。回归模型具有较高的F值62.29)和较低的假定值(P<0.0001)，表明模型是非常显著的。失拟项F值(0.57)表示，模型失拟项相比于纯误差不显著。与此同时，P值(0.6626)不显著、R2(0.9877)表明模型的高准确性，并表示此模型可以解释大部分的因变量的变化。因此，综合看来，模型成立，可以对花生叶可溶性蛋白的提取工艺进行优化分析，同时回归方程能够较准确的预测蛋白提取率随着各单因素的变化规律。
3、各因素交互作用分析
各因素的交互作用指的是两个因素在不同水平上呈现出的差异，料液比(A)、浸提时间(B)和浸提pH(C)各有三个水平，每个因素的每个水平在不同单因素上的效应都具有一定区别，这表示各因素之间存在交互作用。采用降维分析法，探讨交互式操作变量对反应的影响，确定最优水平的每个变量的最大响应。三维响应面和二维轮廓响应面图提供了回归方程的图形分析，如图4a和图4b、图5a和图5b所示。
从图4a和图4b可知，随着料液比的增大，蛋白质提取率呈先增后降的趋势；随着pH的提高，蛋白质提取率呈现出先增加后下降的趋势；从等高线的疏密分部及响应面的倾斜程度可知，料液比和浸提pH的交互作用对蛋白质提取率影响显著，且浸提pH的影响较料液比较明显。从图5a和图5b可知，随着浸提时间的增加，蛋白质提取率呈现出先增后降的趋势；随着浸提pH的升高，蛋白质提取率呈现出先增加后下降的趋势；从等高线的疏密分布及响应面的倾斜程度可知，浸提时间和浸提pH的交互作用对蛋白质提取率影响显著，且浸提pH的影响较浸提时间明显。
应用响应面优化后，得到提取花生叶可溶性蛋白的最佳工艺参数为浸提pH 9.0、浸提时间为40min、料液比为1g:20mL。在此提取条件下，提取所得花生叶可溶性蛋白的纯度为63.83％，蛋白提取率为49.10％。
实施例2花生叶可溶性蛋白抗氧化性质的测定
(一)花生叶可溶性蛋白制备
1)以鲜花生叶为原料，晾干，将洗净晒干后的花生叶用打粉机打粉，并过筛，得花生叶粉。
2)取过筛后的花生叶粉40g，加入800mL蒸馏水，充分搅拌使叶粉均匀混合，然后调pH 9.0，搅拌浸提40min，获得花生叶粉浸提溶液。
3)将花生叶粉浸提溶液在5000r/min的条件下离心20min，分离得上清液，弃掉沉淀。
4)调节所得上清液的pH 2.0。
5)对pH调节后的溶液在5000r/min的转速条件下离心30min，得沉淀，为花生叶可溶性蛋白。
6)将离心所得沉淀放入烧杯中，加入约100mL蒸馏水，调节pH 7.0，充分搅拌至蛋白沉淀完全回溶，得粗产物。
7)将粗产物放入-20℃冰箱中预冻，然后进行真空冷冻干燥，最终得花生叶可溶性蛋白粉。
(二)花生叶可溶性蛋白粉成分测定
将(一)中所得花生叶可溶性蛋白粉进行蛋白、多糖及多酚含量的测定。经实验测得，花生叶可溶性蛋白粉中蛋白含量为51.26％，多糖含量为3.6％，多酚含量为8.39％。
(三)检测
1、羟基自由基清除率
羟基自由基被认为是最有害的活性氧自由基,它们的存在会影响细胞中生物大分子物质的活性。因此，样品的羟基自由基清除能力对生命系统的保护有非常重要的意义。花生叶可溶性蛋白和抗坏血酸(阳性对照)的羟基自由基清除效果如图6所示。图6表明羟基自由基的清除效果随着浓度的增大，羟自由基的清除效果逐渐提高。
2、超氧阴离子自由基清除率
过度产生超氧化物阴离子自由基被认为是细胞内活性氧积累的开始，会导致氧化还原状态失衡，还会导致相关有害生理后果。所以，超氧化物阴离子自由基清除能力是检测蛋白活性的重要指标。不同浓度的花生叶可溶性蛋白和抗坏血酸(阳性对照)的清除效果如图7所示。蛋白样品表现出较高的超氧阴离子清除能力，且随着浓度的增加，自由基清除率明显增加。蛋白浓度从0.1mg/L增加到0.75mg/L，超氧阴离子自由基清除率从13.91％增加到75.08％。当蛋白浓度为2mg/L时，蛋白的清除率已经达到98.40％。比较表明，花生叶可溶性蛋白与抗坏血酸对于清除超氧化物自由基的影响基本相等。
3、DPPH自由基清除率
清除DPPH自由基是一种被广泛使用的评估化合物自由基清除能力性质的模型方法。不同浓度的花生叶可溶性蛋白和抗坏血酸(阳性对照)的清除DPPH自由基能力的测定结果如图8所示。从图中可以看出，蛋白样品表现出较好的DPPH自由基清除效果，且随着蛋白溶液浓度的增加，DPPH自由基清除率有比较明显的提高。通过对比二者的对于DPPH自由基清除的能力，发现抗坏血酸(阳性对照)在浓度为0.25mg/mL时的抑制效果就达到了最佳，而花生叶可溶性蛋白在浓度为2mg/mL时才到达最佳效果，两者最佳效果相差较小。
Claims (8)
1.一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以鲜花生叶为原料，经晾干，打粉，得花生叶粉；
2)取适量花生叶粉，加入蒸馏水，并调节pH，浸提，获得花生叶粉浸提溶液；
3)对花生叶粉浸提溶液进行离心，分离得上清液，弃掉沉淀；
4)调节所得上清液的pH；
5)对pH调节后的溶液进行离心，取沉淀；
6)将所得沉淀用蒸馏水回溶，并调节pH，得粗产物；
7)将粗产物经过真空冷冻干燥后，得到花生叶可溶性蛋白粉。
2.如权利要求1所述的一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，其特征在于，步骤2)中，花生叶粉与蒸馏水的料液比为1g：15-25mL；调节pH＝7-9；浸提时间为30-40min。
3.如权利要求2所述的一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，其特征在于，步骤2)中，花生叶粉与蒸馏水的料液比为1g：20mL；调节pH＝9；浸提时间为40min。
4.如权利要求1所述的一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，其特征在于，步骤3)中，离心条件是：将花生叶粉浸提溶液在5000r/min的转速条件下离心20min。
5.如权利要求1所述的一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，其特征在于，步骤4)中，调节上清液pH＝2。
6.如权利要求1所述的一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，其特征在于，步骤5)中，离心条件是：将上清液在5000r/min的转速条件下离心30min。
7.如权利要求1所述的一种花生叶可溶性蛋白的提取方法，其特征在于，步骤6)中，调节pH为7。
8.按照权利要求1-7任一项所述的提取方法提取的花生叶可溶性蛋白在保健食品中的应用。
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