CN112625085A - 一种牛大力叶蛋白及其提取方法 - Google Patents

一种牛大力叶蛋白及其提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112625085A
CN112625085A CN202011488765.6A CN202011488765A CN112625085A CN 112625085 A CN112625085 A CN 112625085A CN 202011488765 A CN202011488765 A CN 202011488765A CN 112625085 A CN112625085 A CN 112625085A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
beautiful millettia
millettia root
leaf protein
extracting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011488765.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112625085B (zh
Inventor
娄文勇
罗思媛
黄智�
陈曦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN202011488765.6A priority Critical patent/CN112625085B/zh
Publication of CN112625085A publication Critical patent/CN112625085A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112625085B publication Critical patent/CN112625085B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了一种牛大力叶蛋白及其提取方法。该方法包括：清洗牛大力叶子进行除杂，烘干后粉碎，过筛备用；取牛大力叶粉加入水中，并调节pH，浸提；对浸提溶液进行离心，随后弃掉沉淀、收集上清液，即牛大力叶蛋白质提取液；调节牛大力叶蛋白质提取液的pH，静置，离心，收集沉淀；所得沉淀用蒸馏水回溶，并调节pH，透析；将所得产物进行冷冻干燥，得到牛大力叶蛋白粉。本发明采用碱提酸沉法提取牛大力叶蛋白，蛋白提取率较高，可达80.29％，且工艺简单，操作可行，易于实现。经红外光谱分析、圆二色谱分析、分子量和氨基酸成分测定以及抗氧化活性测定，表明牛大力叶蛋白是一种优质的新型植物蛋白来源，且具有良好的抗氧化活性。

Description

一种牛大力叶蛋白及其提取方法
技术领域
本发明属于植物产品的开发利用领域，主要涉及一种牛大力叶蛋白及其提取方法。
背景技术
牛大力为豆科崖豆藤属，学名是美丽崖豆藤，民间也常称之为金钟根、山莲藕、猪脚笠、大力牛等。牛大力喜温湿，多生长于山坡草丛中，主要分布在广东、广西、福建、台湾、湖北、湖南、贵州、江西等亚热带地区。其干燥根可以入药，性味甘、平，具有补虚润肺，强筋活络等功用。牛大力药用历史悠久，临床上已证明其对多种慢性疾病有治疗作用，主要用来治疗腰痛、肾虚带下、风湿性关节炎、腰肌劳损、慢性肝炎、病后体虚等。同时，在两广地区人们直接使用牛大力充当药膳、药酒、茶饮或者煲汤原料，牛大力作为药食两用中药，具有很高的营养和医药保健价值。此外，大力牛叶子也可以用于泡水或煲汤，具有疏散风热、清热解毒、活血的功效，还可以治疗风热感冒、咽喉疼痛、肺虚咳嗽、慢性肝炎等。
植物叶蛋白，是从绿色植物的新鲜茎叶中提取得到的蛋白质制品，其营养价值高，蛋白质含量在50％-80％间，富含人体所需的氨基酸，其中八种必需氨基酸的含量较高。作为全球最多的可再生蛋白质资源之一，植物茎叶蛋白的提取物与加工产品在食品、化妆品、饲料、农药、医药和植物生长调节剂等领域有着广泛的应用。叶蛋白还能被用作进一步分离的原料，进而生产出具备不同功能的活性物质，如纯蛋白、胡萝卜素、叶绿素和维生素等，达到强身健体、预防疾病、抗衰老等功效。目前我国关于叶蛋白产品的研究还处于起步阶段，工业化生产模式尚未完善，有关标准也不够完整规范，但叶蛋白纯化后的活性蛋白及多肽等相关研究已成为如今的研究热点，因此该产品具有极其广阔的市场与效益空间，是一个亟待开发的新兴产业。
目前国内外对于牛大力的研究尚不深入，相关文献和专利都较少。其中还有很大一部分有关牛大力种植、培养方面的研究。因此现有的关于其有效成分和生物活性的报道屈指可数，其中国内外研究比较多的活性成分主要为糖类、生物碱和黄酮类化合物。为了提高牛大力保健作用和应用价值，现将研究目光聚焦于牛大力叶蛋白这一研究方向。经查新，关于牛大力叶蛋白的提取方法尚未发现有关报道，在《一种花生叶可溶性蛋白的提取方法及其应用》这篇最接近的专利中提到的碱提酸沉条件下蛋白提取率并不高，只达到44.59％，故需进一步探索牛大力叶蛋白更优的提取条件及其应用。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种牛大力叶蛋白及其提取方法。
本发明提供得的牛大力叶蛋白的提取方法是一种采用碱提酸沉法从牛大力叶子中提取蛋白质的方法。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的牛大力叶蛋白的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将牛大力叶子清洗除去杂质，烘干，粉碎，过筛，得到牛大力叶粉；
(2)碱提：将步骤(1)所述牛大力叶粉加入蒸馏水中，混合均匀，得到混合液，调节所述混合液的pH为碱性，进行浸提处理，离心，弃掉沉淀，取上清液，得到牛大力叶蛋白质提取液；
(3)酸沉：调节步骤(2)所述牛大力叶蛋白质提取液的pH值为1.5-5.0，静置处理，离心取沉淀；
(4)透析：将步骤(3)所述沉淀加入蒸馏水中(回溶)，混合均匀，得到蛋白溶液，调节所述蛋白溶液的pH为中性，然后进行透析处理，取透析袋中的保留液；
(5)冷冻干燥：将步骤(4)所述保留液冷冻干燥，得到所述牛大力叶蛋白。
进一步地，步骤(1)所述烘干的温度为20-40℃。
优选地，步骤(1)所述烘干的温度为30℃。
进一步地，步骤(1)所述过筛的筛孔大小为100目。
进一步地，步骤(2)所述牛大力叶粉与水的料液比(w/v)为1:10-50g/mL；步骤(2)中，调节所述混合液的pH为9.0-13.0。
进一步地，步骤(2)所述浸提处理的温度为35-55℃，浸提处理的时间为1-3h。
进一步地，步骤(3)所述离心取上清液的速率为6000-12000r/min，离心取上清液的时间为5-20min。
优选地，步骤(3)所述离心取上清液的速率为8000r/min，离心取上清液的时间为10min。
进一步地，步骤(3)所述静置处理的时间为0.5-2h。
优选地，步骤(3)所述静置处理的时间为1h。
进一步地，步骤(3)所述离心取沉淀的速率为6000-12000r/min，离心取沉淀的时间为5-20min。
优选地，步骤(3)所述离心取沉淀的速率为8000r/min，离心取沉淀的时间为10min。
进一步地，步骤(4)所述沉淀与水的体积比为1:2-10；所述透析处理采用的透析袋截留分子量为8000-15000Da，透析处理的时间为12-48h。
优选地，步骤(4)所述沉淀与水的体积比为1:5。
优选地，步骤(4)所述透析处理采用的透析袋截留分子量为14000Da。
优选地，步骤(4)所述透析处理的时间为24h。
优选地，步骤(4)中，所述蛋白溶液的pH值调节为7.0。
本发明提供一种由上述的提取方法制备得到的牛大力叶蛋白。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明工艺简单，操作可行，易于实现；本发明采用碱提酸沉法提取牛大力叶蛋白，蛋白提取率较高，可达80.29％；
(2)本发明提供的提取方法通过对影响蛋白质提取率的pH、料液比、反应时间及反应温度进行单因素试验，再利用响应面试验优化牛大力叶蛋白的提取工艺，同时，还对所得牛大力叶蛋白进行了红外光谱分析、圆二色谱分析、分子量和氨基酸成分测定以及抗氧化活性测定，系统地评价了所得牛大力叶蛋白的结构与功能。
附图说明
图1为pH值对牛大力叶蛋白提取率的影响结果图。
图2为料液比对牛大力叶蛋白提取率的影响结果图。
图3为反应时间对牛大力叶蛋白提取率的影响结果图。
图4为反应温度对牛大力叶蛋白提取率的影响结果图。
图5为料液比与反应时间对牛大力叶蛋白提取率影响的响应面二维图。
图6为料液比与反应时间对牛大力叶蛋白提取率影响的响应面三维图。
图7为料液比与反应温度对牛大力叶蛋白提取率影响的响应面二维图。
图8为料液比与反应温度对牛大力叶蛋白提取率影响的响应面三维图。
图9为反应时间与反应温度对牛大力叶蛋白提取率影响的响应面二维图。
图10为反应时间与反应温度对牛大力叶蛋白提取率影响的响应面三维图。
图11为牛大力叶蛋白的红外光谱图。
图12为牛大力叶蛋白的圆二色谱图。
图13为牛大力叶蛋白的SDS-PAGE图。
图14为不同浓度的牛大力叶蛋白和抗坏血酸对ABTS自由基的清除率结果图。
图15为不同浓度的牛大力叶蛋白和抗坏血酸对DPPH自由基的清除率结果图。
图16为不同浓度的牛大力叶蛋白和抗坏血酸对羟基自由基的清除率结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1牛大力叶蛋白的提取方法
一种牛大力叶蛋白的提取方法，步骤为：
(1)原料预处理：将牛大力叶子作为原料进行清洗除杂，经30℃恒温烘干后粉碎，过100目筛备用。
(2)碱提：取牛大力叶粉，按1:10-50(g/mL)的比例加入蒸馏水，并调节pH为9.0-13.0，反应时间为1-3h，反应温度为35-55℃。将牛大力叶粉浸提溶液在8000r/min的转速下离心10min，随后弃掉沉淀、收集上清液，即牛大力叶蛋白质提取液。
(3)酸沉：调节牛大力叶蛋白质提取液的pH为1.5-5.0，静置1h，将提取液在8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀。
(4)透析：所得沉淀用蒸馏水回溶，沉淀与蒸馏水的体积比为1:5，并调节pH为7.0，透析24h，所述透析处理采用的透析袋截留分子量为14000Da，取透析袋中的保留液。
(5)冷冻干燥：将(4)所得保留液进行冷冻干燥，得到牛大力叶蛋白粉。
实施例2最佳提取工艺条件
为了确定最佳的提取工艺条件，探索适宜的工艺参数，分别考察步骤中影响牛大力叶蛋白提取过程的主要因素，即pH、料液比、反应时间和反应温度，依次做单因素实验进行考察。
(1)碱提过程中pH值对牛大力叶蛋白提取率的影响
方法同实施例1，控制其它因素一定，设定料液比为1:20(g/mL)，反应时间为2.0h，反应温度为50℃，酸沉pH为4.5。碱提过程中pH试验设定值为：9.0、10.0、11.0、12.0、13.0。
(2)碱提过程中牛大力叶粉与蒸馏水的料液比对牛大力叶蛋白提取率的影响
方法同实施例1，控制其它因素一定，设定pH为12.0，反应时间为2.0h，反应温度为50℃，酸沉pH为4.5。料液比试验设定值为：1:10、1:20、1:30、1:40、1:50(g/mL)。
(3)碱提过程中的反应时间对牛大力叶蛋白提取率的影响
方法同实施例1，控制其它因素一定，设定pH为12.0，料液比为1:40(g/mL)，反应温度为50℃，酸沉pH为4.5。反应时间试验设定值为：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0(h)。
(4)碱提过程中的反应温度对牛大力叶蛋白提取率的影响
方法同实施例1，控制其它因素一定，设定pH为12.0，料液比为1:40(g/mL)，反应时间为2.0h，酸沉pH为4.5。反应温度试验设定值为：35、40、45、50、55(℃)。
结果如图1、图2、图3和图4所示，单因素试验结果表明，最优条件分别确定为pH为12.0、料液比为1:40g/mL、反应时间为2.0h、反应温度为50℃。同时在pH值、料液比、反应时间和反应温度四个变量中，后三者对牛大力叶蛋白提取率有较大的影响，故设定为响应面试验的三个因素。
实施例3碱提酸沉法提取牛大力叶蛋白的响应面试验
利用Design-Expert软件，选取三个自变量料液比(A)、反应时间(B)和反应温度(C)，以蛋白质提取率(Y)为响应值，进行响应面条件优化试验设计。响应面试验的因素和水平如下表(表1)所示。
表1Box-Behnken试验设计因素水平
Figure BDA0002840120500000061
试验采用Design-Expert软件进行响应面试验设计及数据结果分析。
(1)试验设计结果
表2Box-Behnken试验设计结果
Figure BDA0002840120500000062
Figure BDA0002840120500000071
(2)回归模型方差分析
表3响应面试验回归模型方差分析
Figure BDA0002840120500000072
为了考察三个变量料液比(A)、反应时间(B)和反应温度(C)对于蛋白提取率的影响，利用Box-Behnken试验设计，试验结果如表3所示。通过应用多元回归方法分析实验数据，对实验数据进行多元回归拟合，获得料液比(A)、反应时间(B)和反应温度(C)的二次项回归方程为：Y＝79.55+3.85A+0.89B+0.41C-1.26AB-0.04AC-0.49BC-4.34A2-5.35B2-5.42C2
响应面方差分析和误差分析的二次模型如表3所示。回归模型具有较高的F值(167.46)和较低的假定值(P<0.0001)，表明模型是非常显著的。失拟项F值(0.90)表示，模型失拟项相比于纯误差不显著。与此同时，P值(0.5656)不显著、R2(0.9907)表明模型的高准确性，并表示此模型可以解释大部分的因变量的变化。因此，综合看来，模型成立，可以对牛大力叶蛋白的提取工艺进行优化分析，同时回归方程能够较准确的预测蛋白提取率随着各单因素的变化规律。
(3)各因素交互作用分析
各因素的交互作用指的是两个因素在不同水平上呈现出的差异，料液比(A)、反应时间(B)和反应温度(C)各有三个水平，每个因素的每个水平在不同单因素上的效应都具有一定区别，这表示各因素之间存在交互作用。采用降维分析法，探讨交互式操作变量对反应的影响，确定最优水平的每个变量的最大响应。三维响应面和二维轮廓响应面图提供了回归方程的图形分析，如图5和图6、图7和图8、图9和图10所示。
从图5和图6可知，在反应时间一定的条件下，随着料液比的增加，蛋白提取率是提高的，在料液比为1:40左右，蛋白提取率出现最大值，随后料液比的继续增大，蛋白提取率变化较慢，这是由于料液比的继续增大，蛋白质的溶解度达到动态平衡的过程，不再溶解。在料液比一定的条件下，随着反应时间的增加，蛋白提取率先增加后减小，在1.8h左右，蛋白提取率出现最大值，即料液比约为1:40、反应时间约为1.8h时，曲面出现最高点，此时蛋白提取率最大。同时料液比与反应时间所形成的等高线与方差分析表结合，说明了两者间的交互作用明显。
从图7和图8可知，当反应温度一定时，随着料液比的增大，蛋白提取率先逐渐升高后趋于稳定，当料液比一定时，反应温度升高，蛋白提取率先增加后减小。同时，等高线的疏密形状反应交互作用的强弱，越接近圆形表示交互作用约弱，越接近椭圆表示交互作用约强，通过等高线分布偏圆形与方差分析表结合得知，料液比与反应温度的交互作用不明显。
从图9和图10可知，当反应温度一定时，随着反应时间的增加，蛋白提取率先增后降，当反应时间一定时，温度升高，蛋白提取率也呈先增后降的趋势，同时等高线的疏密形状反应交互作用的强弱，通过等高线分布为圆与方差分析表结合得知，反应时间与反应温度的交互作用不明显。
为确定各因素的最佳取值，采用Design Expert 8.0.6软件进行岭脊分析，得出回归模型存在最大值点，Y的最大估计值为77.72％，稳定点(A，B，C)的代码值为(0.507，-0.347，0.652)，对应的实际值为料液比1:45(w/v)，反应时间1.85h，反应温度53.26℃。
为检验所建模型和响应面优化法的可靠性，在优化条件下对模型进行验证。
在上述优化参数的最佳条件下，蛋白提取率最高可达77.72％，验证测试的结果显示蛋白质提取率可达到79.25％，接近预测值。故证实了响应面数据的可行性。考虑到实际操作和方便性的因素，最佳参数确定如下：料液比1:40(w/v)、反应时间2.0h、反应温度50℃。
实施例4牛大力叶蛋白的红外光谱分析
在1640cm-1左右为肽键中C＝O的伸缩振动吸收，在1550cm-1左右为N-H吸收峰。从图11可知，牛大力叶蛋白的红外谱图含—CONH—特征吸收峰，其C＝O的吸收峰为1623.0cm-1，N-H的吸收峰为1548.2cm-1。
红外光谱一般含有酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ三组吸收谱带，从这三组谱带中可判断蛋白含有的主要二级结构。查阅发现，酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ对应的吸收谱带分别为1600-1700cm-1、1530-1550cm-1、3070-3440cm-1。酰胺Ⅰ中，α-螺旋特征吸收峰在1650-1658cm-1间、β-折叠在的两个主要特征峰为1638cm-1、1687cm-1；酰胺Ⅱ中主要为N-H吸收峰1550cm-1；酰胺Ⅲ中，α-螺旋为1290-1340cm-1，无规则卷曲为1255-1288cm-1，β-折叠为1181-1248cm-1。牛大力叶蛋白谱图中，在1344.0cm-1左右有吸收峰，说明存在α-螺旋结构；在1188.1cm-1、1639.0cm-1有吸收峰，说明含有β-折叠。
实施例5牛大力叶蛋白的圆二色谱分析
如图12所示，牛大力叶蛋白的圆二色谱图中，在198nm处有一负槽，说明牛大力叶蛋白存在α-螺旋结构；在200nm附近有一正峰，214nm处有一负峰，说明存在β-折叠；在206nm附近有一个正峰，说明存在β-转角。结合表3圆二色谱二级结构得知，β-折叠、β-转角为牛大力叶蛋白的主要结构。
表4叶蛋白的圆二色谱二级结构
Figure BDA0002840120500000091
实施例6牛大力叶蛋白的SDS-PAGE分析
本发明对牛大力叶蛋白样品进行了SDS-PAGE分析，从图13可知，牛大力叶蛋白的相对分子质量在15.2KDa左右。图13中的条带1为牛大力叶蛋白的条带，条带2为Marker。
实施例7牛大力叶蛋白的氨基酸组成
表5牛大力叶蛋白的氨基酸含量(单位g/100g)
Figure BDA0002840120500000092
Figure BDA0002840120500000101
注：必需氨基酸用*标记。
表6牛大力叶蛋白的各氨基酸百分含量(％)
Figure BDA0002840120500000102
Figure BDA0002840120500000111
注：必需氨基酸用*标记。
经分析牛大力叶蛋白氨基酸组成成分，如表4和表5所示，牛大力叶蛋白中氨基酸种类有16种，氨基酸组成较为齐全、含量丰富，含有人体所需的七种必需氨基酸，所占百分比为39.53％，含量相对较高。其中，谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸含量最高，分别是2.83g/100g、2.32g/100g、2.07g/100g，这三种氨基酸分别占总氨基酸的比例为13.72％、11.26％、10.01％，其他氨基酸总量占总氨基酸的比例为65.01％。谷氨酸医用价值较高，作为碳氮源参与机体的代谢，提升脑部活力，具有很好的益智功能。天门冬氨酸能有效促进T淋巴细胞的形成，加强机体免疫系统。精氨酸能促进肌肉蛋白合成，增强机体的免疫力，在细胞分裂、伤口复原和激素分泌等各种生理过程中，也扮演着重要的角色。相反，甲硫氨酸(Met)的含量最低，为1.20％，是第一限制性氨基酸。而必需氨基酸与非必需氨基酸含量比值(EAA/NEAA)为65.17％，高于WHO/FAO理想蛋白质标准规定的60％，说明牛大力叶蛋白是一种较为优质的植物蛋白来源。
实施例8牛大力叶蛋白抗氧化活性的测定
(1)ABTS自由基清除率的测定
在ABTS自由基清除率的测定中，分析图14可知，牛大力叶蛋白与阳性对照抗坏血酸的抗氧化活性均较强，且二者的清除能力基本相当。结果表明，牛大力叶蛋白能清除ABTS自由基，且随着浓度的增加，ABTS自由基的清除率略有增加。
(2)DPPH自由基清除率的测定
清除DPPH自由基是一种被广泛使用的评估化合物自由基清除能力性质的模型方法。不同浓度的牛大力叶蛋白和阳性对照抗坏血酸的清除DPPH自由基能力的测定结果如图15所示。由图15可知，蛋白样品表现出极强的DPPH自由基清除能力且随着蛋白溶液浓度的增加，其自由基的清除能力逐渐提高。通过对比二者对于DPPH自由基的清除能力，发现阳性对照抗坏血酸在浓度为0.25mg/mL时的抑制效果就达到了最佳，而牛大力叶蛋白在浓度为0.5mg/mL时才到达最佳效果，但最佳效果时叶蛋白的清除能力甚至强于抗坏血酸。
(3)羟基自由基清除率的测定
羟基自由基被认为是最有害的活性氧自由基，它们的存在会影响细胞中生物大分子物质的活性。因此，样品的羟基自由基清除能力对生命系统的保护有非常重要的意义。牛大力叶蛋白和抗坏血酸阳性对照的羟基自由基清除效果如图16所示。图16表明羟基自由基的清除效果随着样品浓度的增大，自由基清除率有比较明显的提高。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种牛大力叶蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料预处理：将牛大力叶子清洗除去杂质，烘干，粉碎，过筛，得到牛大力叶粉；
(2)碱提：将步骤(1)所述牛大力叶粉加入水中，混合均匀，得到混合液，调节所述混合液的pH为碱性，进行浸提处理，离心取上清液，得到牛大力叶蛋白质提取液；
(3)酸沉：调节步骤(2)所述牛大力叶蛋白质提取液的pH值为1.5-5.0，静置处理，离心取沉淀；
(4)透析：将步骤(3)所述沉淀加入水中，混合均匀，得到蛋白溶液，调节所述蛋白溶液的pH为中性，然后进行透析处理，取透析袋中的保留液；
(5)冷冻干燥：将步骤(4)所述保留液冷冻干燥，得到所述牛大力叶蛋白。
2.根据权利要求1所述的牛大力叶蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述烘干的温度为20-40℃。
3.根据权利要求1所述的牛大力叶蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述过筛的筛孔大小为100目。
4.根据权利要求1所述的牛大力叶蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述牛大力叶粉与水的料液比为1:10-50g/mL；步骤(2)中，调节所述混合液的pH为9.0-13.0。
5.根据权利要求1所述的牛大力叶蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述浸提处理的温度为35-55℃，浸提处理的时间为1-3h。
6.根据权利要求1所述的牛大力叶蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述离心取上清液的速率为6000-12000r/min，离心取上清液的时间为5-20min。
7.根据权利要求1所述的牛大力叶蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述静置处理的时间为0.5-2h。
8.根据权利要求1所述的牛大力叶蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述离心取沉淀的速率为6000-12000r/min，离心取沉淀的时间为5-20min。
9.根据权利要求1所述的牛大力叶蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(4)所述沉淀与水的体积比为1:2-10；所述透析处理采用的透析袋截留分子量为8000-15000Da，透析处理的时间为12-48h。
10.一种由权利要求1-9任一项所述的提取方法制备得到的牛大力叶蛋白。
CN202011488765.6A 2020-12-16 2020-12-16 一种牛大力叶蛋白及其提取方法 Active CN112625085B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011488765.6A CN112625085B (zh) 2020-12-16 2020-12-16 一种牛大力叶蛋白及其提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011488765.6A CN112625085B (zh) 2020-12-16 2020-12-16 一种牛大力叶蛋白及其提取方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112625085A true CN112625085A (zh) 2021-04-09
CN112625085B CN112625085B (zh) 2022-08-12

Family

ID=75313792

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011488765.6A Active CN112625085B (zh) 2020-12-16 2020-12-16 一种牛大力叶蛋白及其提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112625085B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105433181A (zh) * 2015-12-31 2016-03-30 尹佳妮 一种牛大力速溶饮品及其制备方法
CN107307247A (zh) * 2017-06-02 2017-11-03 广东粤森生态农业科技有限公司 一种牛大力植物能量功能饮料及其制备方法
CN108892704A (zh) * 2018-07-18 2018-11-27 辽宁大学 一种花生叶可溶性蛋白的提取方法及其应用
CN110903409A (zh) * 2019-12-06 2020-03-24 华南理工大学 一种牛大力多糖及制备方法以及其在抗菌方面中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105433181A (zh) * 2015-12-31 2016-03-30 尹佳妮 一种牛大力速溶饮品及其制备方法
CN107307247A (zh) * 2017-06-02 2017-11-03 广东粤森生态农业科技有限公司 一种牛大力植物能量功能饮料及其制备方法
CN108892704A (zh) * 2018-07-18 2018-11-27 辽宁大学 一种花生叶可溶性蛋白的提取方法及其应用
CN110903409A (zh) * 2019-12-06 2020-03-24 华南理工大学 一种牛大力多糖及制备方法以及其在抗菌方面中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SI-YUAN LUO等: "Extraction and characterization of a functional protein from Millettia speciosa Champ. leaf", 《NATURAL PRODUCT RESEARCH》 *
冯梦莹: "牛大力功能成分的分离纯化、结构鉴定及活性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》 *
赖富丽 等: "牛大力藤叶脂溶性成分的GC-MS分析", 《热带作物学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112625085B (zh) 2022-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CH714997B1 (de) Festes Präparat für die Zubereitung eines funktionellen Getränks und Verfahren zu seiner Herstellung.
CN102302427B (zh) 葛仙米营养保湿物质的生产与提取方法
CN102417546B (zh) 一种玫瑰花粗多糖的提取方法
CN106666484B (zh) 鲟鱼复合粉、鲟鱼骨酒及应用
CN107668314A (zh) 一种工业化生产豌豆活性肽及制备方法
CN109180825A (zh) 鹿茸菇多糖提取物及其制备方法与应用
CN100560599C (zh) 同时制备藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法
CN106561932A (zh) 一种茉莉花茶及其制作方法
CN103333784B (zh) 一种大蒜醋及其制备方法
CN106867824A (zh) 雄蚕精酒及其制作方法
CN112625085B (zh) 一种牛大力叶蛋白及其提取方法
CN103497881A (zh) 一种营养露酒及其制备方法
CN106432480A (zh) 一种葛仙米藻胆蛋白的提取方法
CN117281885A (zh) 一种富硒山药糖蛋白作为免疫调节药物的应用
CN111328948A (zh) 一种生姜膏及其制备方法
CN110613650A (zh) 一种含有秋葵水解糖蛋白silky-wsp的精华液及其制备方法
CN113475712B (zh) 一种鹿皮胶及制备方法
CN101933549A (zh) 利用核桃叶、杜仲叶、松针制备复合茶的方法
CN104911056B (zh) 一种共发酵法玛咖黄酒及其加工方法
CN106509661A (zh) 一种驴皮糕及其制备方法
CN113501858A (zh) 电磁裂解技术提取荞麦小分子肽液和肽粉的方法
CN110029038A (zh) 一种玛咖保健酒及其制备工艺
CN110591865A (zh) 具有护肝功能的富硒蛹虫草酒及其制备方法
CN108949474A (zh) 一种鳄鱼酒及其制备方法
CN109198109A (zh) 一种无花果茶及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant