CN105200107B - 瘤背石磺肌肉粗蛋白的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种瘤背石磺肌肉粗蛋白的提取方法，具体如下：将瘤背石磺解剖后取出内脏，洗净剩余肌肉并搅碎，用石油醚去脂，并用无水乙醇去除石油醚，过滤后烘干至干粉状，称取一定量的干粉，按照一定的固液比加入蒸馏水，调整pH和温度，同时加入胰蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解，酶解过程中不断调节溶液pH，反应结束后高温灭活，离心取上清液，冷冻干燥后，即得瘤背石磺肌肉粗蛋白。本发明具有针对性强、操作简便、无污染、条件温和等特点；对瘤背石磺体内活性物质后续研究具有重要意义和科研价值。

Description

瘤背石磺肌肉粗蛋白的提取方法

技术领域

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种瘤背石磺肌肉粗蛋白的提取方法。

背景技术

瘤背石磺(Onchidium struma)在江苏沿海及上海又名土海参、海癞子、土鸡等，是软体动物门(Mollusc)腹足纲(Gastropoda)肺螺亚纲(Pulmonata)缩眼目(Stylommatophora)石磺科(Onchidiidae)的一种生物。瘤背石磺的身体表面分布着许多瘤状突起，背部中间有一背眼，可以自由的伸缩，触角顶端的眼没有感光作用，是一种介于海洋和陆地之间的过渡带海洋软体动物。

瘤背石磺的肌肉粗蛋白是瘤背石磺中的有效活性成分之一，瘤背石磺的活体肌肉中含有7种人体必需氨基酸。腹足和外套膜是瘤背石磺的可食部分，两者肌肉中的谷氨酸和甘氨酸的比例为6.51％和4.77，同时还含有铁、钙、锰、铝等矿物质，以及维生素B1、B2等，与一般的植物蛋白相比更容易消化、吸收和利用，营养价值也相对较高，具有抗氧化，抗肿瘤，降血压，调节免疫等功能。在食品，保健品和药品等领域有广泛的应用。

通过对现有文献的检索发现，申请号为201310516990.X的中国发明专利申请公开了一种采用瘤背石磺酶解提取蛋白多肽的方法。首先将干品瘤背石磺粉碎后按比例加入蒸馏水浸泡制成料液；然后调节料液的pH值并按比例加入木瓜蛋白酶搅拌均匀；接着上述料液加温至50～60℃水解蛋白质，蛋白质水解后升温进行灭酶，自然冷却至室温后放入高速离心机离心获得上清液，并按比例加入粉末活性炭搅匀后加温至50～60℃，保温一段时间后过滤去除粉末活性炭；接下来按比例加入β-环状糊精搅匀后升温至65～70℃后保温，自然冷却至室温即获得液态蛋白多肽；将液态蛋白多肽采用真空低温浓缩并真空冷冻干燥后即制得蛋白多肽成品。然而，该方法中步骤繁琐，在操作过程中会对瘤背石磺中的蛋白含量和活性造成损失；酶解时间(5～10h)过长，成本偏高、蛋白酶解率欠佳的同时还容易造成蛋白的损失。并且，该发明专利申请中并未明确指出究竟酶解的是瘤背石磺内脏还是肌肉蛋白，而根据相关文献调查显示，瘤背石磺肌肉蛋白和内脏蛋白所含成分是不同的，因此很有必要分别对两者进行一些研究，而根据(黄金田，瘤背石磺营养成分分析及品质评价)文献，瘤背石磺肌肉中含有大量氨基酸和蛋白质，因此对肌肉蛋白的研究是很有必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供了一种瘤背石磺肌肉粗蛋白的提取方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种瘤背石磺肌肉粗蛋白提取方法，所述方法包括如下步骤：

S1、样品预处理：将瘤背石磺致死后解剖，取出内脏，用蒸馏水洗净剩余部分后搅碎，加入石油醚浸泡去脂，过滤后加入无水乙醇浸泡去除石油醚，过滤洗净后放入烘箱烘干至干粉状，得干粉样品；

S2、肌肉酶解：按照80～100mL·g^-1的固液比，在所述干粉样品中加入蒸馏水，调节pH值为8.5～9.5，加入由胰蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合蛋白酶水浴反应1～3h，所述水浴反应的温度为40～50℃；在高温下灭活，冷却，离心后去除沉淀物，取上清液，冷冻干燥，即得所述瘤背石磺肌肉粗蛋白。

在本发明中，水浴反应时间为1～3h。这是由于根据单因素实验显示，在本发明酶解过程中，最佳时间为2h，而超过3h后酶解效果开始下降，部分酶开始失活。

优选的，步骤S1中，所述瘤背石磺为产自上海崇明湿地的瘤背石磺。

优选的，步骤S1中，所述蒸馏水的温度为4～8℃；所述石油醚浸泡去脂的时间为6～10h，所述无水乙醇浸泡去除石油醚的时间为4～8h，所述烘干时间为10～15h。发明人发现，未经去脂处理的瘤背石磺干粉的粘度较大，会影响瘤背石磺干粉的酶解过程，本发明通过石油醚有效的去除瘤背石磺肌肉中的脂质，并通过无水乙醇去除石油醚，提高了酶解率。

优选的，步骤S2中，所述pH值是通过氢氧化钠溶液和/或稀盐酸溶液来进行调节的。

优选的，步骤S2中，所述灭活温度为90～100℃；所述灭活时间为10～20min。

优选的，步骤S2中，所述离心速度为3000～4000r·min^-1；所述离心的时间为10～20min。

优选的，步骤S2中，每1g所述样品干粉对应的复合蛋白酶的用量为0.08g～0.10g。

优选的，所述复合蛋白酶中胰蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为1∶2。采用该比例的复合蛋白酶时酶解效果最佳。

优选的，所述水浴反应过程中不断调节溶液的pH值为8.5～9.5。所述pH值是通过氢氧化钠溶液和/或稀盐酸溶液来进行调节的。发明人发现实际操作中反应液的pH会随着反应的进行而变化，从而对酶的水解造成损失，甚至造成酶的失活，因此本发明在反应过程中通过氢氧化钠和稀盐酸对反应溶液的pH进行控制，维持pH的稳定。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明利用复合酶解法提取瘤背石磺肌肉的粗蛋白，双酶之间的酶切位点相互互补，这样间接增加了酶切特异位点，从而提高酶解效率；与其他方法相比，本发明的酶解法还具有过程条件易控制、条件温和、成本低、效率高等优点。

2、利用本发明的方法得到的粗蛋白更加易于分离纯化，提取率较高，且提取的瘤背石磺肌肉蛋白具有抗氧化，抗肿瘤，调节免疫功能等作用，具有很高的应用价值和良好的市场开发前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及一种瘤背石磺肌肉粗蛋白的提取方法；具体包括如下步骤：

用4℃蒸馏水洗净解剖后的瘤背石磺肌肉组织，并加入石油醚浸泡6h去脂，过滤后加入无水乙醇浸泡4h，过滤放入烘箱中烘干10h。称取1g瘤背石磺肌肉干粉，置于250mL三角烧瓶中，加入80mL蒸馏水，搅拌均匀后，通过0.1mol·L^-1的NaOH和0.1mol·L^-1的HCl调整溶液pH至8.5，按照加酶量8％(即1g干粉对应的复合蛋白酶的用量为0.08g)加入复合蛋白酶(酶比例，即胰蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为1∶2)，将反应液放入水浴锅中，调节水浴锅温度为40℃，保持溶液水浴反应1h，反应过程中不断通过0.1mol·L^-1的NaOH和0.1mol·L^-1的HCl维持溶液pH为8.5。反应结束后将水浴锅温度设定为90℃，灭活10min，冷却后，将溶液分别装入10ml离心管中，放入离心机中，在3000r·min^-1的转速下离10min，离心后收集上清液，冷冻干燥，即得瘤背石磺肌肉粗蛋白。整个工艺流程操作渐变，绿色高效，获得的瘤背石磺肌肉粗蛋白具有良好的活性。

实施例2

本实施例涉及一种瘤背石磺肌肉粗蛋白的提取方法；具体包括如下步骤：

把采集回来的瘤背石磺解剖后去除内脏，将剩余的瘤背石磺肌肉组织用6℃蒸馏水洗净并加入石油醚浸泡7h去脂，过滤后加入无水乙醇浸泡5.5h，过滤放入烘箱中烘干13.5h得到干粉。称取1g瘤背石磺肌肉干粉，置于250mL三角烧瓶中，加入88mL蒸馏水，通过0.1mol·L^-1的NaOH和0.1mol·L^-1的HCl调整溶液pH至9.1，搅拌均匀后，加入9％的复合蛋白酶(酶比例为1∶2)，溶液放入水浴锅中并调节温度为45℃，水浴2.2h，反应过程中不断通过0.1mol·L^-1的NaOH和0.1mol·L^-1的HCl维持溶液pH为9.1。反应结束后升温至95℃，高温灭活15min，冷却，并将溶液装入10ml离心管中，在3500r·min^-1的转速下离心15min，离心后收集上清液，冷冻干燥，即得瘤背石磺肌肉粗蛋白。整个工艺流程操作渐变，绿色高效，获得的瘤背石磺肌肉粗蛋白具有良好的活性。

实施例3

本实施例涉及一种瘤背石磺肌肉粗蛋白的提取方法；具体包括如下步骤：

将瘤背石磺解剖后去除内脏，在8℃蒸馏水下洗净剩余肌肉组织，放入石油醚中浸泡10h去脂，过滤后加入无水乙醇浸泡8h，过滤放入烘箱中烘干20h。称取1g瘤背石磺肌肉干粉，置于250mL三角烧瓶中，加入100mL蒸馏水，并搅拌均匀，用0.1mol·L^-1的NaOH和0.1mol·L^-1的HCl使溶液pH为9.5，加入10％的复合蛋白酶(酶比例为1∶2)，将水浴锅温度设定为50℃，水浴反应3h，反应过程中利用0.1mol·L^-1的NaOH和0.1mol·L^-1的HCl维持溶液pH为9.5。3h后升温至100℃，灭活20min，冷却后，将溶液分别装入10ml离心管中，设定转速为4000r·min^-1，离心20min获得上清液，冷冻干燥，即得瘤背石磺肌肉粗蛋白。整个工艺流程操作渐变，绿色高效，获得的瘤背石磺肌肉粗蛋白具有良好的活性。

对比例1

本对比例涉及一种瘤背石磺肌肉粗蛋白的提取方法；具体包括如下步骤：

用4℃蒸馏水洗净解剖后的瘤背石磺肌肉组织，并加入石油醚浸泡6h去脂，过滤后加入无水乙醇浸泡4h，过滤放入烘箱中烘干10h。称取1g瘤背石磺肌肉干粉，置于250mL三角烧瓶中，加入80mL蒸馏水，搅拌均匀后，通过0.1mol·L^-1的NaOH和0.1mol·L^-1的HCl调整溶液pH至8.5，按照加酶量8％加入木瓜蛋白酶，将反应液放入水浴锅中，调节水浴锅温度为40℃，保持溶液水浴反应1h，反应过程中不断通过0.1mol·L^-1的NaOH和0.1mol·L^-1的HCl维持溶液pH为8.5。反应结束后将水浴锅温度设定为90℃，灭活10min，冷却后，将溶液分别装入10ml离心管中，放入离心机中，在3000r·min^-1的转速下离10min，离心后收集上清液，冷冻干燥，即得瘤背石磺肌肉粗蛋白。

对以上实施例和对比例获得的瘤背石磺肌肉粗蛋白进行性能测试，结果如表1所示。

总氮含量测定采用微量凯氏定氮法(GB/T5009.5-2010)，氨基酸态氮含量采用甲醛电位滴定法测定，

水解度的计算：式中：

DH-水解度，％；

M₁-水解液中氨基态氮的含量，g；

M₂-样品总氮的含量，g。

表1

序号	水解度
		实施例1	13.18％
实施例2	14.58％
		实施例3	12.6％
对比例1	10.25％

由表1可知，通过对比例1与实施例1的比较发现，采用复合酶解的实施例1对应的酶解效率有了显著的提高。瘤背石磺的肌肉组织很硬，利用普通的单一蛋白酶很难水解。发明人通过大量的创造性劳动，确定了本发明的双酶水解工艺，显著提高了酶解的效果。同时，发明人还发现，双酶水解过程最难以控制的是酶解过程中反应溶液的pH变化，本实验通过不断的使用氢氧化钠和稀盐酸溶液调节pH，维持的反应溶液的pH平衡，也保证了蛋白酶在最适的pH条件下进行水解蛋白反应，进而更好地保障了酶解效果。

Claims (7)

1.一种瘤背石磺肌肉粗蛋白提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、样品预处理：将瘤背石磺致死后解剖，取出内脏，用蒸馏水洗净剩余部分后搅碎，加入石油醚浸泡去脂，过滤后加入无水乙醇浸泡去除石油醚，过滤洗净后放入烘箱烘干至干粉状，得干粉样品；

S2、肌肉酶解：按照80～100mL·g^-1的固液比，在所述干粉样品中加入蒸馏水，调节pH值为8.5～9.5，加入由胰蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合蛋白酶水浴反应1～3h，所述水浴反应的温度为40～50℃；在高温下灭活，冷却，离心后去除沉淀物，取上清液，冷冻干燥，即得所述瘤背石磺肌肉粗蛋白；

步骤S2中，每1g所述干粉样品对应的复合蛋白酶的用量为0.08g～0.10g；所述复合蛋白酶中胰蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为1:2。

2.如权利要求1所述的瘤背石磺肌肉粗蛋白提取方法，其特征在于，步骤S1中，所述瘤背石磺为产自上海崇明湿地的瘤背石磺。

3.如权利要求1所述的瘤背石磺肌肉粗蛋白提取方法，其特征在于，步骤S1中，所述蒸馏水的温度为4～8℃；所述石油醚浸泡去脂的时间为6～10h，所述无水乙醇浸泡去除石油醚的时间为4～8h，所述烘干时间为10～20h。

4.如权利要求1所述的瘤背石磺肌肉粗蛋白提取方法，其特征在于，步骤S2中，所述pH值是通过氢氧化钠溶液和/或稀盐酸溶液来进行调节的。

5.如权利要求1所述的瘤背石磺肌肉粗蛋白提取方法，其特征在于，步骤S2中，所述灭活温度为90～100℃；所述灭活时间为10～20min。

6.如权利要求1所述的瘤背石磺肌肉粗蛋白提取方法，其特征在于，步骤S2中，所述离心速度为3000～4000r·min^-1；所述离心的时间为10～20min。

7.如权利要求1所述的瘤背石磺肌肉粗蛋白提取方法，其特征在于，步骤S2中，所述水浴反应过程中不断调节溶液的pH值为8.5～9.5。