CN103215329A - 一种酶解湖羊胎盘制备羊胎素冻干粉的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酶解湖羊胎盘制备羊胎素冻干粉的方法，湖羊胎盘经过清洗、切块破碎、制成匀浆、调节pH、加胰蛋白酶保温酶解、抽提、灭酶、过滤和冷冻干燥等步骤制得羊胎素冻干粉。通过以水解度为指标，作温度、酶浓度、pH值的单因素和正交试验分析，得到优化酶解的条件为：酶解温度35-55℃，pH7-11，酶浓度10-50U/g。在优化条件下，湖羊水解度为35.36%，羊胎素冻干粉产率为17.56%。经SDS-PAGE电泳检测，证明羊胎的主要大分子蛋白被降解成了小分子肽。本发明是首次采用湖羊胎盘生产羊胎素，为利用湖羊胎生产羊胎素保健食品、化妆品提供了可靠的科学依据与技术手段。

Description

一种酶解湖羊胎盘制备羊胎素冻干粉的方法

技术领域

本发明涉及农业副产品深加工领域，特别涉及一种酶解湖羊胎盘制备羊胎素的方法。

背景技术

胎盘，中药名“紫河车”，在我国作为传统中药、滋补品已有悠久历史。现代科学研究发现，胎盘含有丰富的免疫蛋白、多肽、游离氨基酸，具有免疫调节、美容等保健功能。羊胚胎是母羊在分娩前的成型或半成型胚胎，为胎儿与母体营养物质交换的重要组织。据《本草纲目》记载："羊胎，母羊腹中的胎兽，性味甘温，具有益气补虚，温中暖下，调补肾虚、羸瘦之功效……"。中医认为，羊胎具有养血安神、丰肌泽肤、延年益寿等功效，是大补元气的滋补强壮药。现代研究表明，羊胎的成分与生物活性与人体胎盘非常类似，是一种机体免疫功能的调节剂和营养、美容保健品。羊胎素是以新鲜羊胚胎或羊胎盘为主要原料制备成的活性多肽。它通过提高人体组织细胞的分裂速度，活化人体细胞，加速老化细胞的分解排除，有效改善人体内分泌，促使人体机能恢复到最佳状态，使人体整体机能得以提高，衰老状态得到延续，外在皮肤自然恢复到当年的细润光泽，富有弹性。羊胎素的神奇功效已被越来越多的人所证实。

中国绵羊分为三大系,即蒙古羊系、藏绵羊系和哈萨克绵羊系。湖羊是太湖平原重要的家畜之一，在太湖平原的育成和饲养已有八百多年的历史，由于受到太平湖的自然条件和人为选择的影响，逐渐育成的独特的一种稀有白色羔皮羊品种，产区在浙江、江苏间的太湖流域，所以称为“湖羊”。湖羊品种形成于10世纪初，由蒙古绵羊选育而成，属于蒙古绵羊类群的短脂尾羊，畜牧学分类上为羔皮、肉食兼用的粗毛羊，是世界上唯独产白色羔皮羊品种，是我国一级保护地方畜禽品种，已被列入首批138个国家级畜禽遗传资源保护品种，是我国南方唯一的国家级绵羊保护品种。湖羊以繁殖率高、肉质鲜美、膻味小、耐湿耐热等优点而广受农户欢迎。它具有四季发情、终年繁殖、多胎多羔等优势。湖羊小母羊4～5月龄性成熟，两年产3胎或一年产2胎，每胎产羔2～3只。由于湖羊既能适应西北干寒沙漠，又能适应江南炎热潮湿的环境，能在全国各地不同自然条件下舍饲、放牧、半放半舍饲饲养，对环境适应能力之强为世界罕见。早在1956年国务院就提出：“湖羊既是稀有品质，又是出口物资，应特别注意繁殖和发展”。由于“退耕还草”工程的需要,湖羊已开始被大批量引入到新疆、甘肃、宁夏、内蒙等西部地区。目前湖羊在西北至新疆、西藏、内蒙，东南到湖南、湖北、江西、福建、安徽等地均有养殖，数量之大、地域之广、谓之空前。

历史上湖羊皮价值昂贵，是我国20世纪20至80年代的重要出口换汇物资。20世纪九十年代以后，随着羔皮市场的衰落，湖羊发展发生逆转，从“皮主肉从”进入到“肉主皮从”时期。进入21世纪以来，随着我国经济建设的快速发展，市场经济的发展和人民生活水平的提高，对羊肉的需求与日俱增，市场需求量日益加大，加之国家对湖羊品种的政策保护和扶植，农民饲养湖羊的积极性很高，存栏数大增。近年来，各地已形成一批从事湖羊养殖的农业企业和专业合作社，湖养养殖业面临新的发展机遇。

藏绵羊是分布于我国青藏高原及与其毗邻的川、滇、甘等高寒地区,是在长期的自然和人工选择培育下形成的高寒地区地方品种。目前我国羊胎素生产企业通常使用藏绵羊羊胎为原料，而用湖羊胎盘制备羊胎素的方法未见相关报道。从湖羊羊胎盘中提取羊胎素不仅可以充分利用农产品生产的副产物，达到资源利用的最大化，而且能发挥特色资源优势，为提高农民收入开辟新途径，为现代农业发展、医学发展作出贡献。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种酶解湖羊胎盘制备羊胎素的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：一种酶解湖羊胎盘制备羊胎素冻干粉的方法，包括如下步骤：

（1）采集胎盘月龄为2-3个月的湖羊胎盘，清洗，装入聚丙烯薄膜袋，-20℃冷冻保存；

（2）将冷冻羊胎解冻，用水将表面清洗干净，用刀将其切成碎块后，再用绞肉机破碎成羊胎肉糜；

（3）将羊胎肉糜与水按1:10的质量配比混匀，放入具有恒温搅拌功能的容器中，充分混匀后，在温度为35-55℃、pH值为7-11的恒温磁力搅拌水浴环境中加入10-50U/g的胰蛋白酶，酶解反应4h；最后再在95℃水浴中加热20min，使胰蛋白酶充分失活，得酶解液；

（4）将所得酶解液抽滤，95℃条件下灭酶20min，得到羊胎素酶解液，然后将所得羊胎素酶解液抽滤，浓缩；

（5）将羊胎素酶解液冷冻干燥，制备成羊胎素冻干粉。

优选地，所述步骤3中，温度为45℃，酶浓度为40U/g，pH值为8.0。

本发明的有益效果是：

1、本发明率先用湖羊胎盘替代传统藏绵羊胎盘，作为羊胎素的生产原料，湖羊胎盘与藏绵羊胎盘的羊胎素的氨基酸组成和比例接近，显示两种羊胎素具有同样的营养保健价值。

2、本发明研究形成了一整套利用湖羊胎酶解制备羊胎素的优化工艺，为利用湖羊胎资源生产高附加值的营养保健产品提供了切实可行的技术方法、检测方法，具有产业化前景。

3、应用本发明，用湖羊胎制备羊胎素的水解度为35.36%，冻干粉产率为17.56%，经电泳检测,显示大分子蛋白降解成了小分子肽。

附图说明

图1为湖羊胎酶解单因素试验结果图

图2为以水解度（氨基态氮含量）为考察指标，用湖羊胎酶解制备羊胎素的正交试验结果图；

图1为湖羊胎酶解单因素试验中，温度对酶解效果的影响图；

图2为湖羊胎酶解单因素试验中，胰蛋白酶浓度对酶解效果的影响图；

图3为湖羊胎酶解单因素试验中，pH对酶解效果的影响图；

图4为以水解度（氨基态氮含量）为考察指标，用湖羊胎酶解制备羊胎素的正交试验中，温度对酶解效果的影响图；

图5为以水解度（氨基态氮含量）为考察指标，用湖羊胎酶解制备羊胎素的正交试验中，胰蛋白酶浓度对酶解效果的影响图；

图6为以水解度（氨基态氮含量）为考察指标，用湖羊胎酶解制备羊胎素的正交试验中，pH对酶解效果的影响图；

图7是从分别用湖羊和藏绵羊羊胎为原料酶解制备的羊胎素的SDS-PAGE电泳分析图；其中，泳道1、2、3分别为藏绵羊羊胎酶解液的4倍稀释液、2倍稀释液和原液，泳道4为酶解前藏绵羊胎蛋白液；泳道5、6、7分别为湖羊胎酶解液的4倍稀释液、2倍稀释液和原液，泳道8为酶解前的湖羊胎蛋白液。

具体实施方式

本发明酶解湖羊胎盘制备羊胎素冻干粉的方法，包括如下步骤：

1、采集产于太湖平原杭嘉湖地区的胎盘月龄为2-3个月的湖羊胎盘，清洗，装入聚丙烯薄膜袋，-20℃冷冻保存。

2、将冷冻羊胎解冻，用水将表面清洗干净，用刀将其切成碎块，再绞肉机破碎成羊胎肉糜。

3、将羊胎肉糜与水按照1:10的质量配比混匀，放入具有恒温搅拌功能的容器中，充分混匀后，在一定温度（因素一:35-55℃）、pH值（因素二:7-11）的恒温磁力搅拌水浴环境中加入一定量的胰蛋白酶（因素三:10-50U/g），酶解反应4h；最后再在95℃水浴中加热20min，使胰蛋白酶充分失活，得酶解液

4、将所得酶解液抽滤，浓缩，得到浓缩羊胎素酶解液；

5、将羊胎素酶解液冷冻干燥，制备成羊胎素冻干粉。

以酶解以水解度为指标，对各种样品进行测定，根据水解度选定适宜的正交试验条件。温度（40、45、50℃）、pH值（7、8、9）、酶量范围（20、30、40U/g）。根据单因素试验结果，设定正交3⁴因素：温度（40、45、50℃）、pH值（7、8、9）、酶量范围（20、30、40U），进行三水平酶解试验。对9组试验样品水的解度结果作统计和极差分析，得出影响水解度的因素顺序为：温度＞酶量＞pH值；最佳反应组合酶解温度为45℃，酶浓度40U，pH值为8。综合考虑到生产成本与效率，选择工艺条件：水料比10:1、温度45℃，酶浓度为40μ/g，pH值8.0，水解时间4h。9个组合中最高水解度为30.22%。

将湖羊胎与藏绵羊胎分别称量，按同样条件进行酶解，结果两者的水解度分别为35.36%、40.47%。最优条件下得到的湖羊胎水解度35.36%，高于（4）的9个组合的最高水解度30.22%。

分别取湖羊与藏绵羊羊胎的酶解液，同时取未酶解的湖羊与藏绵羊羊胎作为对照，作SDS-PAGE蛋白电泳分析，与未酶解的羊胎蛋白相比，显示经酶解后，原来羊胎中的多数蛋白大分子条带已消失，降解成为小分子。

将上述湖羊胎盘与藏绵羊胎盘酶解液用冻干设备分别冻干，冻干后马上分别称量，得出每百克湖羊胎盘与藏绵羊胎的冻干羊胎素产率分别为17.56克和19.44克。

分别取湖羊胎与藏绵羊胎进行质量分析，结果显示两者的含水量分别为83.9%和86.6%，蛋白含量分别为14.6%和12.5%，显示湖羊胎质量优于藏绵羊胎。

分别取冻干湖羊羊胎素与藏绵羊羊胎素样品，作氨基酸成分与比例分析。结果表明，两者必需氨基酸的含量非常接近，几乎没有什么区别，第一、第二限制性氨基酸也相同。这为用湖羊羊胎代替青海羊羊胎提取羊胎素提供了营养学依据。

下面结合具体实施例和和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1：湖羊与藏绵羊羊胎蛋白与水分含量比较

根据《食品安全国家标准食品中水分的测定GB5009.3-2010》，采用直接干燥法分别测定鲜湖羊与藏绵羊羊胎的水分含量。方法如下：取洁净的称量瓶，置于100℃烘箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热1.0h，取出盖好；置干燥器内冷却0.5h，称量，并重复干燥至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。分别取用绞肉机绞碎的试样（湖羊与藏绵羊羊胎各三组平行试验）放入称量瓶中，加盖，精密称量后，置于100℃烘箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2～4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入100℃烘箱中干燥1h左右，取出，放入干燥器内冷却0.5h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重，记录并比较两者水分含量。每种样品分别做三次平行实验。由表1结果可见，湖羊与藏绵羊羊胎水分含量分别为83.91%和86.65%,即湖羊胎的水分略低于藏绵羊。但经t检验，两者无显著差异（p=0.1543,即p>0.05）。

表1湖羊胎与藏绵羊胎水分含量(%)

样品	1	2	3	平均
					湖羊胎	84.32	82.14	85.28	83.91±1.31
藏绵羊胎	86.70	87.14	86.10	86.65±0.43

采用《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定GB/T5009.5-2010》，按凯氏定氮法，分别别测定湖羊与藏绵羊羊胎的蛋白质含量。取两种鲜羊胎2-5g（空白管不加），移入消化管中，加入0.2g CuSO₄，6g K₂SO₄，20ml浓硫酸，摇匀后在管口放一小漏斗，放入消化炉中消化，开始调节温度为280℃，至内容物完全炭化、泡沫消失，再加强火力至380℃保持管内物质微沸，消化至液体呈蓝绿色透明澄清状，继续加热0.5h，取下冷却，将管内消化液定容至100ml，再利用微量凯氏定氮法，经过蒸馏、标准盐酸滴定，测出两种羊胎的含氮量，换算为总蛋白含量。每种样品分别做三次平行实验。

用凯式定氮法测定湖羊胎盘与藏绵羊胎盘粗蛋白含量，结果显示（表2）以湿基计，湖羊与藏绵羊羊胎的蛋白含量分别为14.59%和12.50%，即湖羊胎的蛋白含量高于藏绵羊胎。但经t检验，两者有极显著差异（p=0.0005,即p<0.01）。

表2湖羊与藏绵羊羊胎粗蛋白含量（%）

样品	1	2	3	蛋白含量
					湖羊胎	14.52	14.59	14.67	14.59±0.06
藏绵羊胎	12.49	12.40	12.60	12.50±0.08

实施例2：用湖羊胎酶解制备羊胎素条件的单因素优化

羊胎酶解流程如下：将羊胎切块，解冻，绞碎，去掉表面渗出的水分，分成每份3g羊胎样品，放具有恒温搅拌功能的容器中，加入十倍的蒸馏水，充分混匀后，在一定温度（因素一）、pH（因素二）的恒温磁力搅拌水浴环境中加入一定量的胰蛋白酶（因素三），酶解反应4h。然后再在95℃水浴中加热20min，使胰蛋白酶充分失活。酶解液分为两份，一份用于测可溶性蛋白含量，一部装袋冷冻备份。

羊胎酶解效果采用水解度（氨基态氮含量%）为考核指标,水解度测定方法如下：水解度DH(degree of hydrolysis)算法为DH=h/htot×100%=(水解液中的-NH₂含量–原料中的-NH₂含量)/htot，其中h为水解后每g蛋白质被裂解的肽键毫摩尔数(mmol/g)，htot为每克原料蛋白质的肽键毫摩尔数(mmol/g)。水解液和原料中的-NH₂含量参考甲醛滴定法[檀志芬，生庆海，邱泉若，等．蛋白质水解度的测定方法[J]．食品工业科技，2005，26(7)：174-176]测定。具体过程为吸取3.0ml羊胎水解物，置于100ml容量瓶中，加水定容，混匀后吸取20.0ml置于200ml烧杯中，加60ml水，开动磁力搅拌器，加氢氧化钠标准溶液[C(NaOH)=0.025mol/L]滴定至pH为8.2，加入10.0ml甲醛（3046-49-9）溶液，混匀。再用强氧化钠标准溶液滴定至pH=9.2，记下消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数V1。同时取80ml蒸馏水，先用强氧化钠溶液调pH至8.2，再加入10.0ml甲醛溶液，用氢氧化钠标准溶液滴定至pH=9.2，作为空白对照，记下消耗氢氧化钠标准溶液的毫升数V2。氨基态氮含量计算公式如下：X=[（V1-V2）×C×0.014]/(m×20/100)×100%。m为羊胎样品的质量（g）。根据氨基态氮含量可判断蛋白质的水解程度。

根据水解度，按上述流程分别进行温度、pH、酶量对羊胎盘酶解效果的影响考核：

1）温度对羊胎酶解效果的影响。在液料比10:1、酶量80U、pH为9的条件下，观察温度对羊胎酶解效果的影响，作出温度-水解度曲线（图1）。结果显示，在设定的35、40、45、50、55℃等5个温度中，湖羊胎在45℃下的水解度最高，低于或高于45℃都会造成水解度下降。

2）胰蛋白酶浓度对羊胎酶解效果的影响。在液料比10:1、45℃、pH为9的条件下，观察酶浓度对酶解效果的影响，作出酶浓度-水解度曲线（图2）。结果显示，在设定的10、20、30、40、50U等5种酶量下，在40U时达到最高，在40U以下，水解度随着酶浓度的提供先缓慢增加；在40U以上，水解度进入不再变化，进入平台期。

3）pH对酶解效果的影响。在液料比10:1、酶量80U、45℃下酶解4h，观察pH对酶解效果的影响。测定在不同条件下的水解程度，作出pH-水解度曲线（图3）。分析结果表明，在设定的7、8、9、10、11等5个pH值中，pH为8时，水解度较高，酶解效果好；pH值高于8，水解度下降。

实施例3：用湖羊胎酶解制备羊胎素条件的复因素正交试验

根据实施例3单因素试验结果，选定适宜的正交试验条件如表3。

表3正交试验因素水平表

根据表3设计，进行3⁴9个组合的正交酶解试验，结果见表4。

表4正交试验结果分析表

正交实验结果分析(表4)及各因素极差分析图（图4-图6）显示，影响水解度的因素顺序为：温度＞酶量＞pH值；最佳反应组合为A₂B₃C₂，即：酶解温度45℃，酶浓度40U，pH值为8。最高一组水解度为30.22%。根据综合因素，确定最佳工艺条件为：水料比10:1、45℃、酶浓度40μ/g、pH值8.0，酶解4h。

经过最优工艺试验验证，在上述水解条件下，湖羊与青海羊水解度（表5）分别为35.36%、40.47%，高于所有正交试验组的水解度。根据得到的羊胎素冻干粉，湖羊胎和藏绵羊胎最终的产物得率（表6）分别为17.56%和19.44%。

根据上述最佳条件，分别用湖羊胎、藏绵羊胎作最佳工艺验证试验，结果见表5，该结果显示，湖羊和藏绵羊胎的平均水解度分别为35.36%和40.47%，藏绵羊胎的水解度略高于湖羊胎，但经t检验，两者无显著差异（p=0.0228，>0.05）。

表5最优工艺下湖羊和藏绵羊羊胎的水解度（%）比较

样品	1	2	3	平均
					湖羊胎	37.01	33.58	35.50	35.36±1.40
藏绵羊胎	40.71	39.99	40.71	40.47±0.34

在最佳工艺验证试验，做定量湖羊胎、藏绵羊胎酶解，酶解液抽滤，冷冻干燥，称量测定羊胎素冻干粉得率。结果见表6。该结果显示，湖羊和藏绵羊胎羊胎素冻干粉得率分别为17.56%和19.44%，两者十分接近，与水解度相符。

表6最优工艺下湖羊和藏绵羊羊胎素产率（%）比较

实施例4：用湖羊与藏绵羊羊胎生产羊胎素的酶解程度和营养价值比较

湖羊与藏绵羊羊胎水解产物SDS-PAGE电泳检测。分别取实施例中最佳条件下的湖羊与藏绵羊羊胎的酶解液，同时取未酶解的湖羊与藏绵羊羊胎作为对照，作SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果见图7。该图显示，与未酶解的羊胎蛋白相比，经酶解后，两种羊胎中的多数蛋白大分子条带均已消失，降解成为小分子。

湖羊与藏绵羊羊胎素的氨基酸种类与比例分析。对实施例3所制备的湖羊和藏绵羊羊胎素冻干粉作氨基酸含量分析，结果如表7所示。该结果显示，两者所含的氨基酸种类和含量十分类似。

表7湖羊和藏绵羊羊胎素氨基酸含量分析

氨基酸名称	湖羊（g/100g）	藏绵羊（g/100g）
			天冬氨酸ASP	5.8121	5.7323
苏氨酸THR	3.1232	3.2326
			丝氨酸SER	3.1132	3.0233
谷氨酸GLU	11.9653	11.2365
			脯氨酸PRO	4.6323	4.4653
甘氨酸GLY	9.2653	9.3126
			丙氨酸ALA	5.7465	5.6325
半胱氨酸CYS	0.8423	0.8632
			缬氨酸VAL	4.2465	4.3656
蛋氨酸MET	1.8123	1.8793
			异亮氨酸ILE	3.4569	3.2653
亮氨酸LEU	7.1632	7.0656
			酪氨酸TYR	2.2656	2.3326
苯丙氨酸PHE	3.4132	3.6532
			赖氨酸LYS	3.9132	3.8932
组氨酸HIS	1.5132	1.5867
			精氨酸ARG	6.0132	6.0659

分别对湖羊和藏羊羊胎素冻干粉作氨基酸评分分析，结果见表8。该结果显示，结果表明，两种羊胎素均检测到17种氨基酸，氨基酸总质量分数为分别为78.29%和77.60%，其中人体的必需氨基酸占总氨基酸的比值(EAA/TAA)分别为38.56%和39.30%，氨基酸必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)分别为60.94%和64.74%。根据FAO/WHO（1973年）的理想模式,质量较好的蛋白质的EAA/TAA在40%左右,EAA/NEAA在60%以上。结果显示，湖羊和藏绵羊羊胎素冻干粉的氨基酸组成均符合上述指标。再从必需氨基酸评分（AAS）看，湖羊和藏绵羊胎素的第一限制性氨基酸均为赖氨酸，AAS为0.71；湖羊和藏绵羊羊胎素的第二限制性氨基酸也均为蛋氨酸（胱氨酸），ASS分别为0.76和0.78。对比发现，湖羊羊胎素的异亮氨酸、亮氨酸略高于藏绵羊，其他必需氨基酸则不如藏绵羊，但总体来说，两者必需氨基酸的含量非常接近。该结果为用湖羊代替藏绵羊制备羊胎素提供了重要科学依据。

表8湖羊胎与藏羊胎羊胎素的必需氨基酸营养价值分析

AAS*=aa/AA(FA0/WH0)，式中:aa为试验样品氨基酸总质量分数(%),AA(FAO/WHO)为FAO/WHO评分标准模式中同种氨基酸总质量分数(%)。

Claims (2)

1.一种酶解湖羊胎盘制备羊胎素冻干粉的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）采集胎盘月龄约为2-3个月的湖羊胎盘，清洗，装入聚丙烯薄膜袋，约-20℃冷冻保存；

（2）将冷冻羊胎解冻，用水将表面清洗干净，用刀将其切成碎块后，再用绞肉机破碎成羊胎肉糜；

（3）将羊胎肉糜与水按照1:10的质量配比混匀，放入具有恒温搅拌功能的容器中，充分混匀后，在温度为35-55℃、pH值为7-11的恒温磁力搅拌水浴环境中加入10-50 U/g的胰蛋白酶，酶解反应4h；最后再在95℃水浴中加热20min，使胰蛋白酶充分失活，得酶解液；

（4）将所得羊胎素酶解液抽滤，浓缩；

（5）将浓缩后的羊胎素酶解液冷冻干燥，制备成羊胎素冻干粉。

2.根据权利要求1所述酶解湖羊胎盘制备羊胎素冻干粉的方法，其特征在于，所述步骤3中，优选地，温度为45℃，酶浓度为40U/g，pH值为8.0。

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