CN105420325B - 一种胎盘多肽的制备方法 - Google Patents

一种胎盘多肽的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105420325B
CN105420325B CN201510995668.9A CN201510995668A CN105420325B CN 105420325 B CN105420325 B CN 105420325B CN 201510995668 A CN201510995668 A CN 201510995668A CN 105420325 B CN105420325 B CN 105420325B
Authority
CN
China
Prior art keywords
placenta
polypeptide
extraction
preparation
carries out
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510995668.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105420325A (zh
Inventor
杨刚
钟正晓
李祥
蒋志鸿
王�华
班凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUIZHOU TAIBANG BIOLOGICAL PRODUCT CO Ltd
Original Assignee
GUIZHOU TAIBANG BIOLOGICAL PRODUCT CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUIZHOU TAIBANG BIOLOGICAL PRODUCT CO Ltd filed Critical GUIZHOU TAIBANG BIOLOGICAL PRODUCT CO Ltd
Priority to CN201510995668.9A priority Critical patent/CN105420325B/zh
Publication of CN105420325A publication Critical patent/CN105420325A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105420325B publication Critical patent/CN105420325B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种生物活性物质的制备方法，具体为一种胎盘多肽的制备方法。一种胎盘多肽的制备方法，是将胎盘剪碎后加入生理盐水进行组织匀浆，然后将所得产品与蛋白酶混合进行酶解反应，离心并收集离心液，通过反胶团萃取制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液，粗提液进行超滤，收集超滤液，干燥制得胎盘多肽。本发明制备方法简单，生产成本低、设备投入少，易于大规模生产。

Description

一种胎盘多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物活性物质的制备方法，具体为一种胎盘多肽的制备方法。
背景技术
胎盘中含有多种治疗疾病的激素、酶，还有防病健身及美容的生理活性肽，细胞生长因子等物质，因此现代胎盘制剂研究的成果不仅用于疾病治疗，还被广泛应用到保健及美容领域。生理活性肽是指具有生物活性的多肽，这些多肽小到只有2个氨基酸的双肽，也可以达到复杂的长链或环状多肽，它们在细胞生理及代谢功能的调节上具有重要的作用。
目前，具备生物活性多肽可以通过超滤法或酶解法进行制备。例如申请人于2011年公开的专利文献一种胎盘多肽注射液制备方法(专利申请号：201110209778.X)通过透析及超滤对多肽进行收集；如专利文献羊功能性食品及其制备方法(专利申请号：200310104854.6)。由于胎盘中所含有的多肽含量较低，通过透析超滤等物理方法只能收集胎盘中所含有的多肽成分，不能充分利用胎盘中的蛋白质，原因在于蛋白质分解产物包括多肽和氨基酸，因而多肽所得率比较低。采用酶解法进行多肽制备时，当酶解反应结束之后，需要对蛋白酶进行灭酶变性失活处理，在蛋白酶变性失活的同时，也容易导致部分多肽的失活，造成多肽的损失，进而影响多肽的收率。
发明内容
针对现有技术所得多肽收率低的问题，本发明的目的在于提供一种一种胎盘多肽的制备方法，以提高胎盘多肽的收率。
本发明采用如下技术方案：一种胎盘多肽的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)将胎盘剪碎后按1:2～1:3质量比加入生理盐水进行组织匀浆；
2)将步骤1)所得产品按50:1～60:1质量比与蛋白酶混合进行酶解反应，离心并收集离心液；
3)通过反胶团萃取制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液：将步骤2)收集到的离心液作为前萃取水相，以己醇和石油醚为有机相，以AOT(2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠)和司盘-60为混合表面活性剂进行前萃取，以KCl溶液作为反萃取水相进行反萃取；
4)将步骤3)所得胎盘多肽、蛋白酶粗提液进行超滤，收集超滤液，干燥制得胎盘多肽。
优选的是：步骤1)中所述胎盘为无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘。
优选的是：步骤2)中所述蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶中的至少一种。
优选的是：步骤2)中所述酶解的温度为30～50℃，酶解时间为4～5h，pH为5～9。
优选的是：所述己醇和石油醚体积比为1:3～1:5，混合表面活性剂和有机相质量体积比为5g/L，所述AOT和司盘-60质量比2:1～3:1，其中有机相和水相体积比为2:1～3:1；所述有机相和KCl溶液水相体积比为2：1～3:1，所述KCl溶液浓度为2mol/L。
优选的是：所述前萃取温度为40～45℃，萃取时间为15～20min；反萃取温度为35～40℃，萃取时间为30～40min。
本发明采用的酶解、反胶团萃取、超滤步骤是通过反复筛选和研究比较得出的结果，其各步骤中的参数经济合理，既能提高胎盘多肽的含量，又充分考虑到介质用量、操作时间等因素，达到优化改进的目的。其中：
本发明利用蛋白酶对胎盘中所含的蛋白质进行水解，得到生物活性肽，弥补了胎盘中天然活性多肽含量不足，做到了对胎盘的充分利用，多肽收率最高可达73％。
本发明在酶解反应结束之后通过反胶团萃取制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液，所得的粗提液经过超滤即可将多肽和蛋白酶分离开来，分别制得所需的胎盘多肽及蛋白酶。减少了常规酶解方法需要对蛋白酶进行变性失活步骤，另外所得蛋白酶还可以循环使用。
本发明制备方法简单，生产成本低、设备投入少，易于大规模生产。
具体实施方式
下面进一步描述本发明的技术方案，但要求保护的范围并不局限于所述。下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
将无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘剪碎后按1:2质量比加入生理盐水进行组织匀浆；将所得组织匀浆按50:1质量比与复合酶混合，所述复合酶由质量比为1:1的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶组成，在30℃、pH为5条件下酶解4h，5000r/min离心收集离心液，将收集到的离心液作为前萃取水相，以1:3体积比的己醇和石油醚为有机相，其中前萃取的有机相和水相体积比为2:1，以2:1质量比的AOT和司盘-60为混合表面活性剂，在40℃条件下萃取15min，以2mol/L KCl溶液作为反萃取水相，其中反萃取的有机相和KCl溶液水相体积比为2:1，在35℃条件下反萃取30min，萃取结束制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液，通过超滤对胎盘多肽、蛋白酶进行分离，收集分子量在5000-1000道尔顿之间的多肽。将所得滤液干燥制得胎盘多肽。经检测，多肽收率为71.4％。
实施例2
将无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘剪碎后按1:2.5质量比加入生理盐水进行组织匀浆；将所得组织匀浆按55:1质量比与复合酶混合，所述复合酶由五种相同质量的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶组成，在35℃、pH为6条件下酶解4.5h，5000r/min离心收集离心液，将收集到的离心液作为前萃取水相，以1:4体积比的己醇和石油醚为有机相，其中前萃取的有机相和水相体积比为2.5:1，以2.5:1质量比的AOT和司盘-60为混合表面活性剂，在42℃条件下萃取16min，以2mol/L KCl溶液作为反萃取水相，其中反萃取的有机相和KCl溶液水相体积比为2.5:1，在38℃条件下反萃取35min，萃取结束制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液，通过超滤对胎盘多肽、蛋白酶进行分离，收集分子量在5000-1000道尔顿之间的多肽。将所得滤液干燥制得胎盘多肽。经检测，多肽收率为73％。
实施例3
将无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘剪碎后按1:3质量比加入生理盐水进行组织匀浆；将所得组织匀浆按60:1质量比与木瓜蛋白酶混合，在50℃、pH为9条件下酶解5h，5000r/min离心收集离心液，将收集到的离心液作为前萃取水相，以1:5体积比的己醇和石油醚为有机相，其中前萃取的有机相和水相体积比为3:1，以3:1质量比的AOT和司盘-60为混合表面活性剂，在45℃条件下萃取20min，以2mol/L KCl溶液作为反萃取水相，其中反萃取的有机相和KCl溶液水相体积比为3:1，在40℃条件下反萃取40min，萃取结束制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液，通过超滤对胎盘多肽、蛋白酶进行分离，收集分子量在5000-1000道尔顿之间的多肽。将所得滤液干燥制得胎盘多肽。经检测，多肽收率为72.2％。
将无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘剪碎后按1:3质量比加入生理盐水进行组织匀浆，将所得匀浆按重量平均分为三份，分别作为A、B、C三组实验原料。
所述A组实验按照专利申请201110209778.X实施例1中方法进行胎盘多肽提取。
所述B组实验按照本发明实施1中方法进行胎盘多肽提取。
所述C组实验按照专利申请200310104854.6实施例1中方法对所得组织匀浆进行离心、超滤，分别收集滤液及沉淀，将所得沉淀按实施例1方法进行酶解、灭酶，收集滤液及沉淀中分子量在5000-1000道尔顿之间的多肽。
三组实验多肽提取率(所得多肽占匀浆中所含胎盘重量百分含量)见表1。
表1三组实验多肽提取率
实验组 多肽收率
A组 43.3％
B组 71.8％
C组 50.7％
从实验数据可以看出，按照本发明方法制备方法所得多肽收率最高，且本发明方法所分离出的蛋白酶还能保存酶活力，可以循环使用。

Claims (3)

1.一种胎盘多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将胎盘剪碎后按1:2～1:3质量比加入生理盐水进行组织匀浆；
2)将步骤1)所得产品按50:1～60:1质量比与蛋白酶混合进行酶解反应，离心并收集离心液；所述蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶中的至少一种；
3)通过反胶团萃取制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液：将步骤2)收集到的离心液作为前萃取水相，以己醇和石油醚为有机相，以AOT和司盘-60为混合表面活性剂进行前萃取，以KCl溶液作为反萃取水相进行反萃取；其中，前萃取过程中，所述己醇和石油醚体积比为1:3～1:5，混合表面活性剂和有机相质量体积比为5g/L，所述AOT和司盘-60质量比2:1～3:1，有机相和前萃取水相体积比为2:1～3:1，前萃取温度为40～45℃，萃取时间为15～20min；反萃取过程中，所述有机相和KCl溶液水相体积比为2：1～3:1，所述KCl溶液浓度为2mol/L，反萃取温度为35～40℃，萃取时间为30～40min；
4)将步骤3)所得胎盘多肽、蛋白酶粗提液进行超滤，收集分子量在5000-1000道尔顿之间的多肽超滤液，干燥制得胎盘多肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述胎盘为无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述酶解的温度为30～50℃，酶解时间为4～5h，pH为5～9。
CN201510995668.9A 2015-12-28 2015-12-28 一种胎盘多肽的制备方法 Active CN105420325B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510995668.9A CN105420325B (zh) 2015-12-28 2015-12-28 一种胎盘多肽的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510995668.9A CN105420325B (zh) 2015-12-28 2015-12-28 一种胎盘多肽的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105420325A CN105420325A (zh) 2016-03-23
CN105420325B true CN105420325B (zh) 2017-05-31

Family

ID=55498861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510995668.9A Active CN105420325B (zh) 2015-12-28 2015-12-28 一种胎盘多肽的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105420325B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107574217A (zh) * 2017-09-30 2018-01-12 上海新肌生物科技有限公司 一种纳米级胶原蛋白的提纯方法
RU2828386C1 (ru) * 2024-01-31 2024-10-10 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная компания Стемма" Способ получения экстракта из плаценты человека

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106083991A (zh) * 2016-06-22 2016-11-09 贵州泛特尔生物技术有限公司 一种人胎盘中⒋3kd多肽的分离纯化方法
CN110317847B (zh) * 2019-05-24 2021-11-26 科索瑞生物科技(天津)有限公司 一种动物组织来源的提取物及其制备方法和用途
CN110331180B (zh) * 2019-08-02 2021-04-16 正大食品（襄阳）有限公司 一种猪胎盘多肽生产方法
CN111388649B (zh) * 2020-03-19 2023-09-12 杭州三江上御生物科技有限公司 一种富血小板血浆胎盘多肽组合物及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100402548C (zh) * 2006-02-22 2008-07-16 郑彬 鹿胎盘生理活性多肽的制备方法
CN102284057A (zh) * 2011-07-26 2011-12-21 贵州泰邦生物制品有限公司 一种胎盘多肽注射液制备方法
CN104372057A (zh) * 2014-11-17 2015-02-25 得利斯集团有限公司 一种胎盘素的提取方法
CN104593459A (zh) * 2014-12-30 2015-05-06 唯美度科技（北京）有限公司 一种从胎盘中提取的低分子量多肽

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107574217A (zh) * 2017-09-30 2018-01-12 上海新肌生物科技有限公司 一种纳米级胶原蛋白的提纯方法
CN107574217B (zh) * 2017-09-30 2020-12-01 上海新肌生物科技有限公司 一种纳米级胶原蛋白的提纯方法
RU2828386C1 (ru) * 2024-01-31 2024-10-10 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная компания Стемма" Способ получения экстракта из плаценты человека

Also Published As

Publication number Publication date
CN105420325A (zh) 2016-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105420325B (zh) 一种胎盘多肽的制备方法
US11884953B2 (en) Method for preparing protein peptide based on connective tissue and prepared protein peptide and use thereof
CN111670997B (zh) 增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法、增强免疫复合蛋白肽饮品及其制备方法
US20180258147A1 (en) Pearl protein preparation method and a water-soluble pearl protein and acid-soluble pearl protein obtained by adopting this method
CN107653291A (zh) 多步酶法协同制备藏牦牛皮胶原蛋白和胶原多肽的方法
CN107164442B (zh) 一种胶原蛋白多肽及应用
CN105018555A (zh) 一种大鲵皮胶原蛋白肽的制备方法
CN106282287A (zh) 一种提取白果生物活性多肽的方法
CN102286590A (zh) 一种海蜇降压肽的制备方法
CN113402599A (zh) 一种从人胎盘中提取纯化i型胶原蛋白的优化方法
CN106963718A (zh) 一种具有抗皮肤衰老功效的化妆品组合物
CN108546281A (zh) 一种人参低聚肽及其制备方法和应用
CN109527270A (zh) 水蛭特异性营养诱导液及天然水蛭素的提取方法
CN108611391A (zh) 一种东海乌参胶原蛋白低聚肽的修饰方法及其应用
CN104593459A (zh) 一种从胎盘中提取的低分子量多肽
CN105039480A (zh) 一种中华鳖源胶原蛋白的纯化方法
CN109486887A (zh) 一种超声和酶解协同制备牡蛎多肽的方法
CN103215329A (zh) 一种酶解湖羊胎盘制备羊胎素冻干粉的方法
CN100456948C (zh) 一种燕麦肽及其提取方法
CN112501229B (zh) 一种牛骨胶原肽的生产工艺
CN110218755A (zh) 一种降血糖的牡丹活性肽的制备方法
CN104774895B (zh) 制备林蛙皮胶原蛋白的方法
CN110042139A (zh) 一种动物血活性复合肽的制备方法及其应用
CN110229860A (zh) 一种促进骨髓基质细胞增殖的动物皮小分子肽制备方法
CN105779540A (zh) 蓝莓小分子肽组合物、其提取方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant