CN105420325B - 一种胎盘多肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物活性物质的制备方法，具体为一种胎盘多肽的制备方法。一种胎盘多肽的制备方法，是将胎盘剪碎后加入生理盐水进行组织匀浆，然后将所得产品与蛋白酶混合进行酶解反应，离心并收集离心液，通过反胶团萃取制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液，粗提液进行超滤，收集超滤液，干燥制得胎盘多肽。本发明制备方法简单，生产成本低、设备投入少，易于大规模生产。

Description

一种胎盘多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物活性物质的制备方法，具体为一种胎盘多肽的制备方法。
背景技术
胎盘中含有多种治疗疾病的激素、酶，还有防病健身及美容的生理活性肽，细胞生长因子等物质，因此现代胎盘制剂研究的成果不仅用于疾病治疗，还被广泛应用到保健及美容领域。生理活性肽是指具有生物活性的多肽，这些多肽小到只有2个氨基酸的双肽，也可以达到复杂的长链或环状多肽，它们在细胞生理及代谢功能的调节上具有重要的作用。
目前，具备生物活性多肽可以通过超滤法或酶解法进行制备。例如申请人于2011年公开的专利文献一种胎盘多肽注射液制备方法(专利申请号：201110209778.X)通过透析及超滤对多肽进行收集；如专利文献羊功能性食品及其制备方法(专利申请号：200310104854.6)。由于胎盘中所含有的多肽含量较低，通过透析超滤等物理方法只能收集胎盘中所含有的多肽成分，不能充分利用胎盘中的蛋白质，原因在于蛋白质分解产物包括多肽和氨基酸，因而多肽所得率比较低。采用酶解法进行多肽制备时，当酶解反应结束之后，需要对蛋白酶进行灭酶变性失活处理，在蛋白酶变性失活的同时，也容易导致部分多肽的失活，造成多肽的损失，进而影响多肽的收率。
发明内容
针对现有技术所得多肽收率低的问题，本发明的目的在于提供一种一种胎盘多肽的制备方法，以提高胎盘多肽的收率。
本发明采用如下技术方案：一种胎盘多肽的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)将胎盘剪碎后按1:2～1:3质量比加入生理盐水进行组织匀浆；
2)将步骤1)所得产品按50:1～60:1质量比与蛋白酶混合进行酶解反应，离心并收集离心液；
3)通过反胶团萃取制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液：将步骤2)收集到的离心液作为前萃取水相，以己醇和石油醚为有机相，以AOT(2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠)和司盘-60为混合表面活性剂进行前萃取，以KCl溶液作为反萃取水相进行反萃取；
4)将步骤3)所得胎盘多肽、蛋白酶粗提液进行超滤，收集超滤液，干燥制得胎盘多肽。
优选的是：步骤1)中所述胎盘为无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘。
优选的是：步骤2)中所述蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶中的至少一种。
优选的是：步骤2)中所述酶解的温度为30～50℃，酶解时间为4～5h，pH为5～9。
优选的是：所述己醇和石油醚体积比为1:3～1:5，混合表面活性剂和有机相质量体积比为5g/L，所述AOT和司盘-60质量比2:1～3:1，其中有机相和水相体积比为2:1～3:1；所述有机相和KCl溶液水相体积比为2：1～3:1，所述KCl溶液浓度为2mol/L。
优选的是：所述前萃取温度为40～45℃，萃取时间为15～20min；反萃取温度为35～40℃，萃取时间为30～40min。
本发明采用的酶解、反胶团萃取、超滤步骤是通过反复筛选和研究比较得出的结果，其各步骤中的参数经济合理，既能提高胎盘多肽的含量，又充分考虑到介质用量、操作时间等因素，达到优化改进的目的。其中：
本发明利用蛋白酶对胎盘中所含的蛋白质进行水解，得到生物活性肽，弥补了胎盘中天然活性多肽含量不足，做到了对胎盘的充分利用，多肽收率最高可达73％。
本发明在酶解反应结束之后通过反胶团萃取制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液，所得的粗提液经过超滤即可将多肽和蛋白酶分离开来，分别制得所需的胎盘多肽及蛋白酶。减少了常规酶解方法需要对蛋白酶进行变性失活步骤，另外所得蛋白酶还可以循环使用。
本发明制备方法简单，生产成本低、设备投入少，易于大规模生产。
具体实施方式
下面进一步描述本发明的技术方案，但要求保护的范围并不局限于所述。下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
将无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘剪碎后按1:2质量比加入生理盐水进行组织匀浆；将所得组织匀浆按50:1质量比与复合酶混合，所述复合酶由质量比为1:1的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶组成，在30℃、pH为5条件下酶解4h，5000r/min离心收集离心液，将收集到的离心液作为前萃取水相，以1:3体积比的己醇和石油醚为有机相，其中前萃取的有机相和水相体积比为2:1，以2:1质量比的AOT和司盘-60为混合表面活性剂，在40℃条件下萃取15min，以2mol/L KCl溶液作为反萃取水相，其中反萃取的有机相和KCl溶液水相体积比为2:1，在35℃条件下反萃取30min，萃取结束制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液，通过超滤对胎盘多肽、蛋白酶进行分离，收集分子量在5000-1000道尔顿之间的多肽。将所得滤液干燥制得胎盘多肽。经检测，多肽收率为71.4％。
实施例2
将无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘剪碎后按1:2.5质量比加入生理盐水进行组织匀浆；将所得组织匀浆按55:1质量比与复合酶混合，所述复合酶由五种相同质量的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶组成，在35℃、pH为6条件下酶解4.5h，5000r/min离心收集离心液，将收集到的离心液作为前萃取水相，以1:4体积比的己醇和石油醚为有机相，其中前萃取的有机相和水相体积比为2.5:1，以2.5:1质量比的AOT和司盘-60为混合表面活性剂，在42℃条件下萃取16min，以2mol/L KCl溶液作为反萃取水相，其中反萃取的有机相和KCl溶液水相体积比为2.5:1，在38℃条件下反萃取35min，萃取结束制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液，通过超滤对胎盘多肽、蛋白酶进行分离，收集分子量在5000-1000道尔顿之间的多肽。将所得滤液干燥制得胎盘多肽。经检测，多肽收率为73％。
实施例3
将无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘剪碎后按1:3质量比加入生理盐水进行组织匀浆；将所得组织匀浆按60:1质量比与木瓜蛋白酶混合，在50℃、pH为9条件下酶解5h，5000r/min离心收集离心液，将收集到的离心液作为前萃取水相，以1:5体积比的己醇和石油醚为有机相，其中前萃取的有机相和水相体积比为3:1，以3:1质量比的AOT和司盘-60为混合表面活性剂，在45℃条件下萃取20min，以2mol/L KCl溶液作为反萃取水相，其中反萃取的有机相和KCl溶液水相体积比为3:1，在40℃条件下反萃取40min，萃取结束制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液，通过超滤对胎盘多肽、蛋白酶进行分离，收集分子量在5000-1000道尔顿之间的多肽。将所得滤液干燥制得胎盘多肽。经检测，多肽收率为72.2％。
将无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘剪碎后按1:3质量比加入生理盐水进行组织匀浆，将所得匀浆按重量平均分为三份，分别作为A、B、C三组实验原料。
所述A组实验按照专利申请201110209778.X实施例1中方法进行胎盘多肽提取。
所述B组实验按照本发明实施1中方法进行胎盘多肽提取。
所述C组实验按照专利申请200310104854.6实施例1中方法对所得组织匀浆进行离心、超滤，分别收集滤液及沉淀，将所得沉淀按实施例1方法进行酶解、灭酶，收集滤液及沉淀中分子量在5000-1000道尔顿之间的多肽。
三组实验多肽提取率(所得多肽占匀浆中所含胎盘重量百分含量)见表1。
表1三组实验多肽提取率
实验组 多肽收率
A组 43.3％
B组 71.8％
C组 50.7％
从实验数据可以看出，按照本发明方法制备方法所得多肽收率最高，且本发明方法所分离出的蛋白酶还能保存酶活力，可以循环使用。

Claims (3)

1.一种胎盘多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将胎盘剪碎后按1:2～1:3质量比加入生理盐水进行组织匀浆；
2)将步骤1)所得产品按50:1～60:1质量比与蛋白酶混合进行酶解反应，离心并收集离心液；所述蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶中的至少一种；
3)通过反胶团萃取制得胎盘多肽、蛋白酶粗提液：将步骤2)收集到的离心液作为前萃取水相，以己醇和石油醚为有机相，以AOT和司盘-60为混合表面活性剂进行前萃取，以KCl溶液作为反萃取水相进行反萃取；其中，前萃取过程中，所述己醇和石油醚体积比为1:3～1:5，混合表面活性剂和有机相质量体积比为5g/L，所述AOT和司盘-60质量比2:1～3:1，有机相和前萃取水相体积比为2:1～3:1，前萃取温度为40～45℃，萃取时间为15～20min；反萃取过程中，所述有机相和KCl溶液水相体积比为2：1～3:1，所述KCl溶液浓度为2mol/L，反萃取温度为35～40℃，萃取时间为30～40min；
4)将步骤3)所得胎盘多肽、蛋白酶粗提液进行超滤，收集分子量在5000-1000道尔顿之间的多肽超滤液，干燥制得胎盘多肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述胎盘为无乙肝、无丙肝、无艾滋病、无梅毒病毒的胎盘。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述酶解的温度为30～50℃，酶解时间为4～5h，pH为5～9。
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