CN104593459A - 一种从胎盘中提取的低分子量多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种从胎盘中提取的低分子量多肽。胎盘富含孕育生命所必需的所有原始生命物质，其中含有丰富的蛋白质和与机体正常运转相关的多种活性多肽。本发明提供的多肽提取自胎盘，经匀浆和三种不同的酶连续酶解后，获得被充分讲解且分子量均一的多肽，再经过滤膜抽滤和截留分子量为4～5kD的超滤膜超滤，可以获得低分子量的多肽；从免疫学角度出发，低分子量的肽抗原性差，只能诱导机体产生很弱的免疫反应，在不经载体偶联的情况下即会失去免疫原性，最大程度地减少多肽的致敏性，使得其应用时的安全性大大提高。将本发明提供的低分子量多肽用于抗衰老测试，结果表明本发明提供的低分子量多肽能够显著改善皮肤弹性，具有优异的抗衰老功效。

Description

一种从胎盘中提取的低分子量多肽

技术领域

本发明涉及多肽领域，具体涉及了一种从胎盘中提取的低分子量多肽。

背景技术

胎盘富含孕育生命所必需的所有原始生命物质。目前，胎盘尤其是羊胎盘的药用和保健功效越来越受到人们的关注。就羊胎盘而言，其中含有丰富的蛋白质、17种氨基酸、14种微量元素、磷脂、脂多糖、维生素，还有与免疫功能和机体正常运转相关的多种活性多肽，其营养成分天然搭配的比例最接近人体的需求。《本草纲目》中即对羊胎盘的功效有所记载："羊胎，母羊腹中的胎兽，性味甘温，具有益气补虚，温中暖下，调补肾虚、羸瘦之功效"。科学家经过大量实验证实，羊胎盘还具有养血安神、丰肌泽肤、延年益寿等功效，是大补元气的滋补强壮药。综上所述，胎盘的功能特性日益为人们所认识，客观上也提出了胎盘深加工的要求。由于胎盘中含有大量人体必需的活性物质，因此，从中提取功能性的多肽具有广阔的开发前景。

专利文献CN103784935A公开了一种改良的胎盘多肽的制备方法，包括如下步骤：收集健康产妇足月分娩的胎盘作为原料冷冻；将冻融后的物料在60±2℃条件下进行病原微生物灭活处理，并不断搅拌，以提高灭活效果；对灭活处理后的物料以2000～5000rpm离心分离10～60分钟后取上清液，先经0.3～1.0μm孔径的膜深层过滤，在用截留分子量为10000D的超滤膜超滤，获得超滤液；向超滤液中加入占滤液重量百分比为5～10％的赋形剂，然后使用0.22μm的膜进行除菌过滤后分装；将分装后的样品进行真空冷冻干燥，即得。

然而，现有技术公开的技术方案中，需要对胎盘进行冻融，会造成活性物质的损失；没有经过多步酶解，多肽的分子量均一性差，且适用的超滤膜的截留分子量过大，无法获得高浓度、高活性的低分子量多肽。

发明内容

本发明的目的克服现有技术的缺陷，提供一种以胎盘为原料，采用混合多步酶解法制备而成的低分子量多肽，所述多肽具有优异的抗衰老功效。

本发明提供了一种低分子量多肽，所述低分子量多肽以胎盘为原料，由包括以下步骤的方法提取得到：

所述低分子量多肽由包括以下步骤的方法制备而成：

1)取羊胎盘肉阜和子叶，去除筋膜并清洗后沥干，切成小块后经组织匀浆机粉碎成80～200目的匀浆液；

2)在步骤1)所得述匀浆液中，加入稀盐酸溶液和胃蛋白酶，36～38℃反应3～5h；

3)将步骤2)产物pH调至6.0～8.0，加入中性蛋白酶，48～52℃反应2～3h；

4)将步骤3)产物pH维持在6.0～8.0，加入菠萝蛋白酶，53～57℃反应3～5h，反应结束后升温至68～72℃，维持10～20min，使酶灭活；

5)将步骤4)产物用0.4～0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为4～5kD的超滤膜超滤，所得滤液经脱苦脱色、真空浓缩后、喷雾干燥，即得低分子量多肽。

本发明步骤1)中，所述胎盘优选为羊的胎盘，由于羊胎盘的资源丰富，且其中营养成分与人体比较接近，使用安全；清洗胎盘时应彻底，防止胎盘表面覆盖的生物物质影响提取时酶的活性；该步骤中，匀浆时水的加入量为每g固体加入0.5～1ml水，优选为纯净水。

本发明步骤2)中，所述稀盐酸与步骤1)所述匀浆液的体积比为5～15：1，优选为10:1，所述稀盐酸的质量百分比浓度为0.2～0.4％，优选为0.3％。

本发明步骤2)中，所述胃蛋白酶的比活为2500～4000U/g，优选为3000U/g，其加入后终浓度为0.1～0.3％，优选为0.2％。

本发明步骤3)中，所述中性蛋白酶的比活为30000～60000U/g，优选为40000U/g，其加入后终浓度为0.2～0.6％，优选为0.4％。

本发明步骤4)中，所述菠萝蛋白酶的比活为400000～800000U/g，优选为600000U/g，其加入后终浓度为0.7～1.3％，优选为1％。

本发明步骤5)中，所述脱苦脱色具体为：所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1～3h后，优选为2h，过滤除去活性炭。

作为优选方案，本发明所述低分子量多肽由包括以下步骤的方法制备而成：

1)取羊胎盘肉阜和子叶，去除筋膜并清洗后沥干，切成小块后经组织匀浆机粉碎成100目的匀浆液；

2)在步骤1)所得述匀浆液中，加入稀盐酸溶液和胃蛋白酶，37℃反应4h；所述稀盐酸与匀浆液的体积比为10：1，所述稀盐酸的质量百分比浓度为0.3％；所述胃蛋白酶的比活为3000U/g，其加入后终浓度为0.2％；

3)将步骤2)产物pH调至7.0，加入中性蛋白酶，50℃反应2.5h；所述中性蛋白酶的比活为50000U/g，其加入后终浓度为0.4％；

4)将步骤3)产物pH维持在7.0，加入菠萝蛋白酶，55℃反应4h，所述菠萝蛋白酶的比活为600000U/g，其加入后终浓度为1％；反应结束后升温至70℃，维持15min，使酶灭活；

5)将步骤4)产物用0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌3h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得低分子量多肽。

为了保证制备得到的低分子量多肽的活性，除了酶解反应对温度的特别要求外，本发明各个步骤的操作温度均优选为0～4℃。

本发明进一步保护所述低分子量多肽在制备化妆品、食品、保健品、药品中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案可以取得显著的效果。由于低分子量的肽抗原性差，只能诱导机体产生很弱的免疫反应，在不经载体偶联的情况下即会失去免疫原性，最大程度地减少多肽的致敏性，使得其应用时的安全性大大提高，无异味、不致敏。此外，本发明提供的低分子量多肽具有显著的抗衰老功效，可广泛应用于化妆品、食品、保健品、药品中。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

低分子量多肽按照以下步骤制备而成：

1)取800g羊胎盘肉阜和子叶，去除筋膜并清洗后沥干，切成小块后经组织匀浆机粉碎成80目的匀浆液100ml；

2)在步骤1)所得述匀浆液中，加入稀盐酸溶液和胃蛋白酶，36℃反应3h；所述稀盐酸的体积为500ml，所述稀盐酸的质量百分比浓度为0.2％；所述胃蛋白酶的比活为2500U/g，其加入后终浓度为0.1％；

3)将步骤2)产物pH调至6.0，加入中性蛋白酶，48℃反应2h；所述中性蛋白酶的比活为30000U/g，其加入后终浓度为0.2％；

4)将步骤3)产物pH维持在6.0，加入菠萝蛋白酶，53℃反应3h，所述菠萝蛋白酶的比活为400000U/g，其加入后终浓度为0.7％；反应结束后升温至68℃，维持10min，使酶灭活；

5)将步骤4)产物用0.4μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为4kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得低分子量多肽。

实施例2

低分子量多肽按照以下步骤制备而成：

1)取800g羊胎盘肉阜和子叶，去除筋膜并清洗后沥干，切成小块后经组织匀浆机粉碎成100目的匀浆液100ml；

2)在步骤1)所得述匀浆液中，加入稀盐酸溶液和胃蛋白酶，37℃反应4h；所述稀盐酸的体积为1000ml，所述稀盐酸的质量百分比浓度为0.3％；所述胃蛋白酶的比活为3000U/g，其加入后终浓度为0.2％；

3)将步骤2)产物pH调至7.0，加入中性蛋白酶，50℃反应2.5h；所述中性蛋白酶的比活为50000U/g，其加入后终浓度为0.4％；

4)将步骤3)产物pH维持在7.0，加入菠萝蛋白酶，55℃反应4h，所述菠萝蛋白酶的比活为600000U/g，其加入后终浓度为1％；反应结束后升温至70℃，维持15min，使酶灭活；

5)将步骤4)产物用0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌3h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得低分子量多肽。

实施例3

低分子量多肽按照以下步骤制备而成：

1)取800g羊胎盘肉阜和子叶，去除筋膜并清洗后沥干，切成小块后经组织匀浆机粉碎成200目的匀浆液100ml；

2)在步骤1)所得述匀浆液中，加入稀盐酸溶液和胃蛋白酶，38℃反应5h；所述稀盐酸的体积为1500ml，所述稀盐酸的质量百分比浓度为0.4％；所述胃蛋白酶的比活为4000U/g，其加入后终浓度为0.3％；

3)将步骤2)产物pH调至8.0，加入中性蛋白酶，52℃反应3h；所述中性蛋白酶的比活为60000U/g，其加入后终浓度为0.6％；

4)将步骤3)产物pH维持在8.0，加入菠萝蛋白酶，57℃反应5h，所述菠萝蛋白酶的比活为800000U/g，其加入后终浓度为1.3％；反应结束后升温至72℃，维持20min，使酶灭活；

5)将步骤4)产物用0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得低分子量多肽。

对比例1

与实施例2相比，区别仅在于，不进行步骤2)的胃蛋白酶水解，步骤1)后即为步骤3)。

对比例2

与实施例2相比，区别仅在于，不进行步骤3)的中性白酶水解，步骤2)后即为步骤4。

对比例3

与实施例2相比，区别仅在于，不进行步骤4)的菠萝白酶水解，步骤3)后即为步骤5)。

实验例1：多肽分子量的测定

检测方法：通过凝胶层析法测定分子量，试验过程中选用0.1mol/L的Tris-HCl洗脱液平衡处理SPhedexG-25凝胶柱后，在220nm的波长下，检测浓度为2mg/ml的标准物质：还原性谷胱甘肽(307Da)、缩宫素(1007Da)、胰高血糖素(3485Da)、和胰岛素(5808Da)，根据标准物质分子量对数和洗脱体积，拟合得回归方程为：y＝-38.148x+198.62(R²＝0.9932)；其中，y为洗脱体积，x为相应分子量的对数值。

将各实施例和对比例所得多肽分别配置为浓度为5mg/ml，在上述条件下分别进样洗脱，将出峰体积带入标准曲线，即可得样品分子量及其分布范围，通过峰面积归一法，确定不同分子量蛋白肽的相对百分含量，所得结果如表1所示。

表1：多肽分子量分布

	≥3000Da	3000～1000Da	1000～300Da	＜300Da
					实施例1	--	3.8％	57.3％	38.9％
实施例2	--	4.4％	61.2％	34.4％
					实施例3	--	5.0％	49.6％	45.4％
对比例1	21.5％	26.7％	33.4％	18.4％
					对比例2	32.5％	33.5％	31.6％	2.4％
对比例3	19.7％	22.4％	21.9％	36％

实验例2：抗衰老测试

试验原理：将各实施例所得低分子多肽按照以下质量混合，配制成溶液：实施例所得多肽0.25g，透明质酸钠0.25g，丙二醇3g，甘油6g，Transcutol P 10g，双咪唑烷基脲0.25g，水53.25g。

试验方法：通过皮肤弹性测试，反应不同样品疗效；试验中，选取30位健康志愿者，随机分为三组，每日早晚使用相应的样品或对照品，分别0周、1周、2周、3周、4周后，测试区域皮肤弹性R2、R5、R7值，数值越接近1，皮肤弹性越好(Reviscometer RV600，弹性纤维组织测试探头，Courage+Khazaka electronic GmbH(CK)公司)；

试验区域为面部左右颧骨、鼻尖与瞳孔交线处左右脸颊、太阳穴与嘴角交线处左右侧；其中，其中R2＝Ua/Uf，R5＝Ur/Ue，R7＝Ur/Uf；Uf为皮肤最大拉伸量；Ue为恒定负压加到皮肤上后，0.1秒钟时皮肤的拉伸量，定位弹性部分拉伸量；Ur为取消负压后，皮肤就会迅速恢复原状态，同样分为弹性部分值Ur，即取消负压0.1秒后，皮肤的恢复值和粘弹性部分值，或称塑性部分值；Ua为从取消负压到下一次连续测试皮肤表面再加负压时皮肤的恢复值。

检测结果如表2所示。

表2：皮肤改善情况

由表2结果可知，由各实施例加工而成的样品能显著改善皮肤弹性，优于各对比例，由此反映出抗皮肤衰老功效，其中实施例2效果最为显著，表明从胎盘中提取的低分子量多肽有着显著的抗衰老功效。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种从胎盘中提取的低分子量多肽，其特征在于，所述低分子量多肽由包括以下步骤的方法制备而成：

1)取羊胎盘肉阜和子叶，去除筋膜并清洗后沥干，切成小块后经组织匀浆机粉碎成80～200目的匀浆液；

2)在步骤1)所得述匀浆液中，加入稀盐酸溶液和胃蛋白酶，36～38℃反应3～5h；

3)将步骤2)产物pH调至6.0～8.0，加入中性蛋白酶，48～52℃反应2～3h；

4)将步骤3)产物pH维持在6.0～8.0，加入菠萝蛋白酶，53～57℃反应3～5h，反应结束后升温至68～72℃，维持10～20min，使酶灭活；

5)将步骤4)产物用0.4～0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为4～5kD的超滤膜超滤，所得滤液经脱苦脱色、真空浓缩后、喷雾干燥，即得低分子量多肽。

2.根据权利要去1所述的低分子量多肽，其特征在于，步骤2)所述稀盐酸与步骤1)所述匀浆液的体积比为5～15：1，所述稀盐酸的质量百分比浓度为0.2～0.4％。

3.根据权利要求1所述的低分子量多肽，其特征在于，步骤2)所述胃蛋白酶的比活为2500～4000U/g，其加入后终浓度为0.1～0.3％。

4.根据权利要求1所述的低分子量多肽，其特征在于，步骤3)所述中性蛋白酶的比活为30000～60000U/g，其加入后终浓度为0.2～0.6％。

5.根据权利要求1所述的低分子量多肽，其特征在于，步骤4)所述菠萝蛋白酶的比活为400000～800000U/g，其加入后终浓度为0.7～1.3％。

6.根据权利要求1所述的低分子量多肽，其特征在于，步骤5)所述脱苦脱色具体为：所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1～3h后，过滤除去活性炭。

7.根据权利要求1所述的低分子量多肽，其特征在于，所述低分子量多肽由包括以下步骤的方法制备而成：

1)取羊胎盘肉阜和子叶，去除筋膜并清洗后沥干，切成小块后经组织匀浆机粉碎成80～200目的匀浆液；

2)在步骤1)所得述匀浆液中，加入稀盐酸溶液和胃蛋白酶，36～38℃反应3～5h；所述稀盐酸与匀浆液的体积比为5～15：1，所述稀盐酸的质量百分比浓度为0.2～0.4％；所述胃蛋白酶的比活为2500～4000U/g，其加入后终浓度为0.1～0.3％；

3)将步骤2)产物pH调至6.0～8.0，加入中性蛋白酶，48～52℃反应2～3h；所述中性蛋白酶的比活为30000～60000U/g，其加入后终浓度为0.2～0.6％；

4)将步骤3)产物pH维持在6.0～8.0，加入菠萝蛋白酶，53～57℃反应3～5h，所述菠萝蛋白酶的比活为400000～800000U/g，其加入后终浓度为0.7～1.3％；反应结束后升温至68～72℃，维持10～20min，使酶灭活；

5)将步骤4)产物用0.4～0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为4～5kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1～3h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得低分子量多肽。

8.根据权利要求1所述的低分子量多肽，其特征在于，所述低分子量多肽由包括以下步骤的方法制备而成：

1)取羊胎盘肉阜和子叶，去除筋膜并清洗后沥干，切成小块后经组织匀浆机粉碎成100目的匀浆液；

2)在步骤1)所得述匀浆液中，加入稀盐酸溶液和胃蛋白酶，37℃反应4h；所述稀盐酸与匀浆液的体积比为10：1，所述稀盐酸的质量百分比浓度为0.3％；所述胃蛋白酶的比活为3000U/g，其加入后终浓度为0.2％；

3)将步骤2)产物pH调至7.0，加入中性蛋白酶，50℃反应2.5h；所述中性蛋白酶的比活为50000U/g，其加入后终浓度为0.4％；

4)将步骤3)产物pH维持在7.0，加入菠萝蛋白酶，55℃反应4h，所述菠萝蛋白酶的比活为600000U/g，其加入后终浓度为1％；反应结束后升温至70℃，维持15min，使酶灭活；

5)将步骤4)产物用0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌3h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得低分子量多肽。

9.权利要求1～8任意一项所述低分子量多肽在制备化妆品、食品、保健品或药品中的应用。