CN108721320A - 小分子透明质酸片段的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明基于对一种小分子透明质酸片段进行的小动物、大动物及人体临床的实验研究，发现了此种透明质酸片段在注射使用时具有的一系列新用途。实验结果显示，该小分子透明质酸片段在注射使用时出乎意料地具有治疗多种疾病的效果，并且具有快速止痛、止痒，增加体力精力的功效，使得该小分子透明质酸片段在制备相关疾病的治疗或辅助治疗药物上有巨大的应用价值。此外，实验结果还显示其能够减少皮下脂肪，特别是人体头、面、颈部的皮下脂肪降低尤为明显；同时还具有面部美容和抗衰老的功效，并且使用时通过腹部皮下脂肪层注射即可，无需面部注射，不引起疼痛和面部炎症，因此，所述的小分子透明质酸片段在美体美容领域也具有突出的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及小分子透明质酸片段的应用领域，特别是涉及小分子透明质酸片段在制备治疗包括固体肿瘤在内的多种疾病的药物中的应用，以及在面部美容、增加体力和精力、减少皮下脂肪等方面的用途。
背景技术
透明质酸，又称玻璃酸、糖醛酸、玻尿酸，英文名hyaluronic acid(简称HA)，是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，双糖单位可达25000道尔。人体皮下组织、表皮和口咽粘膜等组织含有大量的大分子透明质酸。换句话说，大分子透明质酸是人类皮肤、粘膜、皮下等各种组织的基本建筑材料，具有保水和保湿功能。市场现有的透明质酸产品主要是以添加大分子透明质酸为主要功效成分的面部护理或面部美容产品。
近年来一系列的研究表明，依据分子量的大小区分的小分子透明质酸与大分子透明质酸在小动物实验和细胞水平的研究中均显示出功能上的差异，主流文献表明小分子透明质酸是炎症的降解产物，和炎症分布一致，其功能是引发和促进炎症反应，主要参考文献包括：
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而申请人近年来的研究成果(专利申请号200780052196.7、201310325056.X、201310454955.X、201410153593.5、201510065499.9、201510065498.4、201510067326.0、201510333526.6)却还提示另一种可能性，即小分子透明质酸体外制剂具有抑制一些皮肤粘膜炎症的功能。这些文献提示小分子透明质酸的这种抑制炎症的功能可能与分子大小的程度有关，也可能与其生产方法有关。并且，小动物实验、大动物实验和人体实验的对比结果还提示小分子透明质酸的功能在小动物、大动物和人体中可能完全不同。例如，以上专利文献表明分子量10-60KD的小分子透明质酸可以制成体外制剂局部使用(如日用品、卫生用品、化妆品、护肤品、消毒用品等)，有助于缓解或治疗皮肤和粘膜炎症，而小于10KD的小分子透明质酸基本没有上述功效。然而，最近CEDARS-SINAI MEDICAL CENTER的专利WO/2014/165713表明采用细菌streptococci透明质酸酶切割产生的小于10KD的小分子透明质酸不引起炎症反应，但细菌Streptomyces透明质酸酶产生的大于10KD的小分子透明质酸却引起炎症反应，提示小分子透明质酸的功能还可能与切割酶的种类有关(即与切割后的透明质酸片段的立体结构或分子排列有关)。
以上这些互相矛盾的研究结果提示小分子透明质酸片段的确切功能目前难以确定，也许小分子透明质酸片段的生产方式、分子量大小、切割酶种类、使用方式等都可能影响到其功能表现，但目前除了这些已知可能的因素外，尚有很多科研人员并不能肯定的其他未知因素，如尚无可靠的大动物的实验结果。也因此，行业人士虽然寄希望于小分子透明质酸的医用价值，但是仍很难预测小分子透明质酸的临床研究和成药性的成功与否，尤其难以确定临床适应症。而我们在先的研究虽然获得了一种可行有效的小分子透明质酸体外制剂，但由于人体的内环境十分复杂，小分子透明质酸的体内注射使用也可能与体外制剂完全不同，在人、大动物和小动物体内的作用也未必一致，因此，更加有待于临床研究的验证。另外，作为体内注射使用的小分子透明质酸将在更多方面有更高的要求，例如需要满足高纯度、无严重疼痛、无过敏反应、需要明确适应症和副作用，明确每次注射剂量、注射途径等。解决以上这些问题有重大的科研意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供小分子透明质酸片段在以下多个方面的应用，包括：
小分子透明质酸片段在制备治疗固体肿瘤的药物中的应用。
具体地，所述的固体肿瘤包括但不限于肺癌、胰腺癌、口腔癌、脑膜瘤、胃癌、卵巢癌。
小分子透明质酸片段在制备治疗干眼症、飞蚊症、眼结膜疾病、玻璃体浑浊、由玻璃体浑浊引起的玻璃体剥离或视力下降的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备治疗肌筋膜炎、肌肉肌腱损伤、骨质增生、骨刺、椎间盘突出、腰背颈椎病的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备治疗痛风、关节炎、强直性脊柱炎的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备促进脑梗死或脑出血后功能恢复的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备治疗痛经、子宫内膜异位症、子宫腺肌症的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备治疗牙周疾病、口腔溃疡和咽喉疾病的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备治疗带状疱疹、神经性皮炎、牛皮癣、湿疹、疱疹样湿疹、汗疱疹的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备治疗烧伤、创伤、手术创口的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备治疗疼痛或瘙痒的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备治疗急性胰腺炎的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备治疗手术后或腹膜透析后引发的腹腔粘膜粘连、盆腔粘膜粘连的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在用于增加或恢复化疗后体力和精力或制备治疗化疗后副作用的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在用于面部美容或制备治疗面部衰老的药物中的应用。
小分子透明质酸片段在制备用于减少皮下脂肪组织的药物中的应用。
上述的小分子透明质酸片段是分子量为10-60KD的透明质酸片段，所述的透明质酸片段是以大分子透明质酸为原料，通过重组人透明质酸酶PH20切割后获得的。
进一步地，所述的重组人透明质酸酶PH20是采用动物细胞或酵母或植物表达生产的且纯度在98.5％以上的重组人透明质酸酶。
进一步地，所述的小分子透明质酸片段被制成注射剂应用，所述的注射剂含有有效量的所述分子量为10-60KD的透明质酸片段。
进一步地，所述注射剂为腹部皮下脂肪层或痛/痒点部位或患病部位用注射剂。
进一步地，所述注射剂的使用量为每日注射1-2次，每次注射所述的透明质酸片段的有效量为100-200mg。
进一步地，所述的注射剂为液体制剂，其通过以下步骤制备获得：A.将大分子透明质酸原料配制成溶液，引入氯化钠和镁离子，并加入重组人透明质酸酶PH20进行切割，获得含有分子量10-60KD的透明质酸片段的反应液；B.对获得的反应液中残留的重组人透明质酸酶PH20进行灭活处理；C.进行病毒灭活以及细菌过滤或灭活。
进一步地，所述步骤A中大分子透明质酸原料预先通过105度的烘烤处理5-6小时后再配制成溶液。
进一步地，所述步骤A中大分子透明质酸原料的分子量为800-1200KD，每克所述大分子透明质酸原料对应加入4000-5000单位的所述重组人透明质酸酶PH20进行切割，酶切反应5-6小时。
进一步地，所述步骤A中大分子透明质酸原料直接配制成溶液，所述大分子透明质酸原料的分子量为800-1200KD，每克所述大分子透明质酸原料对应加入15000-20000单位的所述重组人透明质酸酶PH20进行切割，酶切反应5-6小时。
进一步地，所述步骤A中引入的所述氯化钠和镁离子在配制溶液中的浓度分别为80-90mM和1mM。
进一步地，所述步骤B之后还对被灭活的重组人透明质酸酶进行去除。
进一步地，每2-4ml的所述注射剂中含所述透明质酸片段100mg，且含灭活的重组人透明质酸酶残留不超过20ug。
进一步地，所述镁离子在所述注射剂中的终浓度为1mM，所述氯化钠在所述注射剂中的终浓度为115-125mM。
由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明基于对一种小分子透明质酸片段进行的小动物、大动物及人体临床的实验研究，发现了此种透明质酸片段在注射使用时具有的一系列新用途。实验结果显示，该小分子透明质酸片段在注射使用时出乎意料地具有治疗多种疾病的效果，并且具有快速止痛、止痒，增加体力精力的功效，使得该小分子透明质酸片段在制备相关疾病的治疗或辅助治疗药物上有巨大的应用价值。此外，实验结果还显示其能够减少皮下脂肪，特别是人体头、面、颈部的皮下脂肪降低尤为明显；同时还具有面部美容和抗衰老的功效，并且使用时通过腹部皮下脂肪层注射即可，无需面部注射，不引起疼痛和面部炎症，因此，所述的小分子透明质酸片段在美体美容领域也具有突出的应用潜力。
(2)所述的小分子透明质酸片段作为注射剂应用，可以制成液体制剂形式，生产方便，制剂稳定，适于批量化生产，人体注射使用时未出现过敏反应、副作用。
附图说明
上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1中(a)(b)是生产高纯度的有糖化的重组人透明质酸酶的激流式动物细胞反应器放大培养和大规模培养工作间。
图2是动物细胞(CHO细胞)生产的高纯度的有糖化的重组人透明质酸酶的电泳图。
图3是一种实验用液体制剂形式的透明质酸片段注射剂。
图4显示分子量10KD-60KD的透明质酸片段的抑菌效果(图中1％B-HA指含有1％的分子量10KD-60KD的透明质酸片段的注射液处理组)。
图5显示本发明注射剂对小动物皮肤创口的抗炎和抑菌效果(图中B-HA指采用分子量10KD-60KD的透明质酸片段的注射处理组)。
图6中(a)-(e)分别显示小分子透明质酸片段注射液对IL-1、IL-6、IFN-β、IFN-α、IL-10的影响(图中：LPS＝endotoxin内毒素；L+A＝LPS脂多糖+anti-human TLR4singlechain antibody抗人TLR4单链抗体；L+HA＝LPS脂多糖+分子量10KD-60KD的透明质酸片段)。
图7是患有玻璃体浑浊和玻璃体剥离的受试者的眼科实验室诊断结果。
图8是部分受试者采用小分子透明质酸片段腹部皮下脂肪层注射治疗前后照片对比图，显示小分子透明质酸片段注射剂对人体面部美容和面部抗衰老的治疗效果。
图9是大面积烧伤病例采用小分子透明质酸片段注射治疗前后的对比图。
图10是神经性皮炎病例(病灶在图中箭头处)在采用小分子透明质酸片段腹部皮下脂肪层注射治疗后的效果。
图11是牛皮癣病例在采用小分子透明质酸片段腹部皮下脂肪层注射治疗前后的效果。
图12是脑膜瘤病例在采用小分子透明质酸片段注射治疗前后的显影剂核磁影像检查报告单。
具体实施方式
如前所述，基于目前行业内的研究成果，小分子透明质酸的确切功能难以确定，甚至基于目前的科学实验结果，出现了互相矛盾的功能现象，而这种现象的作用机理尚未完全明确。本发明在原有的研究基础之上(专利申请号200780052196.7、201310325056.X、201310454955.X、201410153593.5、201510065499.9、201510065498.4、201510067326.0、201510333526.6)，通过设计小动物、大动物以及人体实验的研究，希望对小分子透明质酸片段的未知功能进行更加深入的探索。经小动物和大动物实验研究，发明人发现小分子透明质酸片段在注射使用时对小动物的治疗作用不确定，对大动物有明确的抗炎作用，同时，对人体临床研究的结果还意外地显示出小分子透明质酸片段在注射使用时具有一系列新用途，这种用途通过更方便的注射方式(如腹部皮下脂肪层注射或痛/痒点部位注射或患病部位注射)而得以体现。
临床研究的实验结果显示，该小分子透明质酸片段在注射使用时出乎意料地具有治疗多种疾病或缓解病症的效果。具体地，所述的多种疾病包括但不限于肺癌、胰腺癌、口腔癌、脑膜瘤、胃癌、卵巢癌等固体肿瘤，以及干眼症、飞蚊症、眼结膜疾病、玻璃体浑浊、由玻璃体浑浊引起的玻璃体剥离或视力下降，肌筋膜炎、肌肉肌腱损伤、骨质增生、骨刺、椎间盘突出、腰背颈椎病，痛风、关节炎、强直性脊柱炎，包括但不限于冠心病、血管支架后并发症的心血管疾病，痛经、子宫内膜异位症、子宫腺肌症，牙周疾病、口腔溃疡和咽喉疾病，带状疱疹、神经性皮炎、牛皮癣、湿疹、疱疹样湿疹、汗疱疹，烧伤、创伤、手术创口等，手术后或腹膜透析后引发的腹腔粘膜粘连、盆腔粘膜粘连等，此外，还能防止固体肿瘤转移，促进脑梗死或脑出血后功能恢复，增加或恢复化疗后体力和精力或治疗化疗后副作用，快速缓解疼痛或瘙痒等，这些结果使得小分子透明质酸片段在制备相关疾病的治疗或辅助治疗药物上有巨大的应用价值。
此外，实验结果还显示小分子透明质酸片段能够减少皮下脂肪，特别是人体头、面、颈部的皮下脂肪降低尤为明显。同时，还具有面部美容和抗衰老的功效。区别于市场现有的大分子透明质酸通过面部注射使用以填充物的方式注入于真皮皱折凹陷或欲丰润的部位，以达到填充凹陷、除皱、塑形等面部美容用途，本发明中所述的小分子透明质酸片段在使用时通过腹部皮下脂肪层注射即可，而无需面部注射，不引起疼痛和面部炎症，因此，小分子透明质酸片段在美体美容领域也具有突出的应用潜力。
本发明在上述实验中所使用的小分子透明质酸片段，是通过如下特定的生产方法获得的：所述小分子透明质酸片段是由重组人透明质酸酶PH20切割大分子透明质酸后获得的分子量为10KD-60KD的透明质酸片段。在生产过程中，所述的重组人透明质酸酶PH20可以采用动物细胞或酵母或植物表达生产，例如，在先的专利申请文献中(公告号CN104342420A、CN103468662A、CN105018547A)均记载了利用动物细胞Chinese hamsterovary生产有糖化的重组人透明质酸酶PH20。
为确保注射使用的安全性，所述重组人透明质酸酶PH20优选高纯度(纯度>98.5％为佳)，所述大分子透明质酸原料纯度采用医疗级纯度>98.5％为佳。实际生产时，可以直接采用高纯度的原料，也可以通过对低纯度的重组人透明质酸酶PH20和大分子透明质酸原料进行纯化后再进行后续步骤。此外，酶切反应完成后，还应该对所述重组人透明质酸酶进行灭活，以及进行病毒灭活和细菌过滤或灭活。虽然结合临床研究的结果，我们发现含有重组人透明质酸酶残留蛋白的透明质酸片段在注射使用时没有发生过敏反应和副作用，但仍然建议灭活之后对重组人透明质酸酶PH20残留蛋白进行分离去除。
为了便于注射使用，所述的小分子透明质酸片段在实验时被制成液体形式的注射液使用，所述注射液中含有有效量的分子量为10-60KD的透明质酸片段。实际应用时，用于注射使用的所述的小分子透明质酸片段可以制成其他注射剂的形式，例如，还可以制成供临用前配成溶液的无菌粉末或浓溶液。
以下通过具体的实施例对本发明进行说明，应当理解，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。并且以下实施例中所涉及的药品或试剂，如无特殊说明，均能够通过正常商业途径进行购买。以下实施例中所涉及实验技术或操作方法，如无特殊说明，均为本领域已知的常规实验技术或操作方法。
实施例1
目的：重组人透明质酸酶PH20的生产及含有小分子透明质酸片段的注射液的制备
方法：以公告号CN104342420A、CN103468662A、CN105018547A专利文献中记载的方法为基础，利用动物细胞(CHO细胞)生产有糖化的重组人透明质酸酶PH20。包括：将有糖化的重组人透明质酸酶PH20的基因cDNA人工合成，插入富含GC的pMH3、pMH4、pMH5空表达载体，建成pMH3-PH20、pMH4-PH20、pMH5-PH20表达载体(采用公告号为CN102124019A的专利文献记载的方法构建表达载体以便极高地表达重组蛋白)；再将pMH3-PH20、pMH4-PH20、pMH5-PH20的cDNA表达载体转入CHO-S细胞系，筛选高表达PH20的CHO-S细胞系，在图1所示的激流式动物细胞反应器进行放大和大规模培养；将含有PH20的丰收液经0.22um过滤后采用离子柱等2-3步分离，再经细菌过滤和病毒过滤灭活、超滤浓缩等步骤后，制成纯度>99.0％的无菌无病毒的有糖化的重组人透明质酸酶PH20。
使用工作体积25升的在位清洁在位灭菌的酶解混合罐，准备注射级分子量为800-1200KD的透明质酸原料；将注射级分子量800-1200KD的透明质酸原料一次或分多次加入注射级的纯水，再依次加入氯化钠80-90mM、镁离子1mM、重组人透明质酸酶15000-20000单位(约15-20微克)/每克大分子透明质酸，充分混合，在37度反应5-6小时至透明质酸片段的分子量达到10KD-60KD。加氯化钠35-45mM将渗透压调至280-300毫渗量/升(mOsm/L)，再经加热84-95度30-60分钟(重组人透明质酸酶热灭活、部分细菌灭活和降低pH病毒灭活)，再经0.22um细菌过滤。过滤后得到溶液1，该溶液1中含有灭活的重组人透明质酸酶残留。进一步地，依次或分别采用亲和柱层析、沉淀、超滤和透析方法，将溶液1中灭活的重组人透明质酸酶PH20残留蛋白分离出去，得到只含有10KD-60KD的透明质酸片段、氯化钠和镁离子的溶液2。
为研究注射液制剂的生产方法，并明确灭活后的重组人透明质酸酶的影响，该实施例中按照上述生产方法获得了两种含有所述透明质酸片段的注射液：一种以溶液1为基础，含有无酶活性的灭活的重组人透明质酸酶PH20残留蛋白(为使得使用更安全可靠，实际生产中控制该残留蛋白量)。另一种则以溶液2为基础，不含灭活的重组人透明质酸酶PH20残留蛋白。
结果：
获得纯度>99％的动物细胞(CHO细胞)生产的有糖化的重组人透明质酸酶(图2)；
制备出以下两种含有小分子透明质酸的注射液，注射液小瓶分装制成每支有效含量为100mg的所述透明质酸片段(图3)。封装后，所述注射液可在4到12度或-8到-70度或室温下稳定储存2年。
注射液1：每2-4ml含有分子量为10KD-60KD的透明质酸片段100mg，以及灭活的无酶活性的重组人透明质酸酶PH20残留蛋白小于20微克(内毒素小于0.5IU/ml、无菌、无病毒)，氯化钠终浓度为115-125mM、镁离子终浓度为1mM。
注射液2：每2-4ml含有分子量为10KD-60KD的透明质酸片段100mg，不含灭活的重组人透明质酸酶PH20残留蛋白(内毒素小于0.5IU/ml、无菌、无病毒)，氯化钠终浓度为115-125mM、镁离子终浓度为1mM。
结论：结果表明成功制造了含有重组人透明质酸酶残留蛋白的透明质酸片段的注射液1和不含重组人透明质酸酶残留蛋白的注射液2，明确透明质酸片段注射液的生产工艺。
此外，下述后续的实验中，我们发现两种形式的注射液具有基本一致的治疗作用，也均无过敏反应和其他副作用(符合国内生物药品和三类医疗器械的规范标准)，提示灭活后的重组人透明质酸酶PH20对透明质酸片段注射液的效果及安全无影响，注射液中分子量10KD-60KD的透明质酸片段为主要活性成分，对于这种具有生物活性的透明质酸片段，我们简称之为B-HA)。
实施例2
目的：研究上述透明质酸片段注射液(注射液1和注射液2)的体外实验、分子细胞学实验、小动物实验。
方法：使用生理盐水稀释1倍的注射液1和注射液2，分别做体外实验抑菌实验、分子细胞学实验、小动物抑菌实验。
结果：图4显示注射液1体外实验中抑制牙龈噗啉单胞菌克隆生长，提示透明质酸片段注射液不利于牙龈噗啉单胞菌生长(注：阴性对照为生理盐水，阳性对照为抗菌素甲硝唑)；
图5显示注射液1小鼠体内实验中抑制牙龈噗啉单胞菌克隆生长，提示透明质酸片段注射液不利于小动物表皮创口牙龈噗啉单胞菌生长；
图6显示注射液1明显促进了人TLR4受体阳性细胞分泌IL-10，同时也在一定程度上抑制了内毒素(endotoxin)引起的TNF，IL-1，IL-6和interferon beta的分泌。
注射液2的结果与上述基本相同，未示出。
结论：
上述透明质酸片段注射液(注射液1和注射液2)有明显体外人体细胞抗炎作用，其主要作用机制之一可能是促进抗炎细胞因子IL-10分泌，提示B-HA和普通透明质酸不一样，虽然有透明质酸的化学组成，但可能通过与众不同的分子排列与TLR4结合，拮抗内毒素和促进抗炎细胞因子IL-10分泌，从而达到抗炎、止痛、止痒和有效治疗多种疾病和疾病状态的作用；当然，也有文章(Cuixia Yang,Manlin Cao,Hua Liu,Yiqing He,Jing Xu,Yan Du,Yiwen Liu,Wenjuan Wang,Lian Cui,Jiajie Hu,Feng Gao,The high and low molecularweight forms of hyaluronan have distinct effects on CD44 Clustering,Publishedon November 1,2012as Manuscript M112.349209)提示透明质酸片段的治疗作用机制可能还参与了CD44受体介导的炎症细胞移走功能的调节。这是一种小分子透明质酸片段治疗多种疾病和疾病状态的新机制，也是一种检测B-HA活性的有效方法。
2.上述透明质酸片段注射液(注射液1和注射液2)体内体外均有抑菌的效果。
实施例3
研究背景：实施例2的研究表明B-HA有可能通过一种与TLR4结合并促进抗炎细胞因子IL-10分泌的新机制，达到抗炎、止痛、止痒和有效治疗多种疾病和疾病状态的作用。这种新机制为B-HA出乎意料之外地治疗多种疾病和疾病状态提供了理论基础。
目的：研究上述透明质酸片段注射液(注射液1和注射液2)的小动物和对大动物的炎症作用效果。
研究背景：文献研究表明，透明质酸的生物活性不但与分子量大小和/或制备生产方法有关，还会与动物大小有关。小动物鼠类的研究提示透明质酸的生物活性是促进炎症，但大动物和人的实验研究表明透明质酸的生物活性是抑制炎症。因此，本实施例使用不同大小的动物，快速研究了上述透明质酸片段注射液(注射液1和注射液2)对不同炎症的调控效果，明确了透明质酸片段注射液的大动物抗炎活性。
3.1小鼠颈部创口炎症、脊髓创面神经轴突出芽和创口控制实验。
本实验共使用雌性ICR小鼠10只，剥离出颈部脊髓，使用11号手术刀将其切断。使用PEG MW 400细胞膜融合剂保护切断的脊髓创面，然后将肌肉和皮肤缝合，使用含有静脉高营养的生理盐水和透明质酸片段注射液+静脉高营养的的生理盐水每天4次通过小鼠尾静脉提供营养。手术4周后所有的小鼠显示了部分的神经行为恢复，杀死所有的小鼠，将切断的脊髓创面部分使用干冰冻存和进行冷冻切片，再用4％的福尔马林固定和使用Anti-neurofilament 200和DAPI免疫组化学染色，使用荧光或共聚焦显微镜检查神经轴突出芽情况。
结果：表1显示了上述透明质酸片段注射液1与对照调控小鼠颈部创口炎症、脊髓创面神经轴突出芽和创口愈合情况。注射液2与注射液1情况基本相同，无明显差异，此处未示出。
表1小鼠颈部创口炎症、脊髓创面神经轴突出芽和创口愈合情况
注：脊髓创面轴突出芽情况判定－、+、++分别代表没有出芽、有出芽、明显有出芽；创口炎症控制情况判定－、+、++分别代表创口炎症控制不好、控制好、控制非常好；创口愈合情况判定－、+、++分别代表创口愈合非常不正常、正常、比正常明显好。
结论：上述透明质酸片段注射液(注射液1和注射液2)没有明显控制小鼠颈部创口炎症，没有明显促进小鼠脊髓创面神经轴突出芽和创口愈合，表明透明质酸片段注射液对小动物小鼠没有明显抗炎效果。
3.2.小鼠心肌炎症控制实验。
本实验采用六周大小的C57/BL6小鼠10只，使用血管紧张素II(1,500ng/kg perminute)连续7天，制造小鼠心肌炎症模型。5个小鼠一组，第一组使用透明质酸片段注射液+生理盐水注射，第二组使用生理盐水注射。7天后心脏切片和hematoxylin、eosin和Massontrichrome做组织化学染色，观察心肌炎症细胞浸润情况。
结果：见表2。表2显示了上述透明质酸片段注射液1与对照控制小鼠心肌炎症细胞浸润实验的效果。注射液2与注射液1情况基本相同，无明显差异，此处未示出。
表2小鼠心肌炎症细胞浸润情况
| 样本数 | 炎症细胞浸润情况 | |
| 生理盐水 | 5 | + |
| 1％B-HA+生理盐水 | 5 | ++ |
注：炎症细胞浸润情况判定－、+、++分别代表可见炎症细胞浸润不明显、炎症细胞浸润明显、炎症细胞浸润非常明显。
结论：上述透明质酸片段注射液(注射液1和注射液2)明显促进血管紧张素II引发的小鼠心肌炎症细胞浸润，表明透明质酸片段注射液对小动物小鼠有促进炎症的生物活性。
3.3狗腹腔黏连实验。
本实验采用健康比格犬6只，体重6.8±0.8kg。预饲7天后，将6只犬随机分为空白对照组两只，B-HA低剂量和高剂量组各两只。实验犬在术前禁食12小时、禁水6小时。术前15分，高剂量组犬背部皮下按0.8ml/kg注射上述透明质酸片段注射液；低剂量组犬背部皮下按0.4ml/kg注射上述透明质酸片段注射液；空白组不注射。麻醉，常规术部准备，仰卧保定，在脐后2cm处腹中线常规打开腹腔，探查到盲肠，找到回盲部，将距回盲部约20cm处的回肠从腹腔取出、隔离，进行常规肠管切断并以全层连续缝合方式进行端端吻合术。缝合完毕后向吻合部注射生理盐水，检查吻合部密闭性，低剂量组与高剂量组在术部均涂抹上述透明质酸片段注射液2ml，之后逐层缝合腹壁。在手术中详细记录手术操作情况。术后禁食3天，之后逐量给予流食(在酸奶中适当加入口服液补盐)，待动物排便后饲喂泡软的狗粮，并逐渐过渡到正常狗粮，每天上午进行术后观察，连续进行7天。
结果：1.术后观察：对犬术后情况进行观察，发现没治疗空白组在术后2天內精神与活动状况较实验组明显差，术后4天內有发烧，术后5天至监测结束，体温、精神与活动状况才恢复术前水平；2.透明质酸片段注射液低剂量与高剂量组精神与活动状况术后与术前无明显差异，表明透明质酸片段注射液有效控制术后系统炎症因子引发的发热、腹腔炎症和疼痛，不影响活动和促进肠蠕动恢复，减少腹腔黏连的可能性；3.术后7天各组剖腹探查，眼观未见有创口愈合障碍，如肠吻合口瘘和肠道狭窄或梗阻。空白组可见手术部位与大网膜粘连，实施例1透明质酸片段注射液低剂量与高剂量组未见手术部位与大网膜粘连。空白组和透明质酸片段注射液低剂量与高剂量组均有手术创口受创部位与临近肠道的局部粘连，推测手术创口受创部位与临近肠道的局部粘连需高粘度的所述透明质酸片段的凝胶物理方法阻隔才可能有效。
表3.透明质酸片段注射液预防和治疗狗腹腔黏连实验结果。
结论：通过皮下注射透明质酸片段注射液(注射液1和注射液2)与术部涂抹给药的方式，可明显改善犬肠吻合术的术后系统炎症因子引发的发热、腹腔炎症和疼痛，不影响活动和促进肠蠕动恢复，减少腹腔黏连有可能性。另外，未观察有创口愈合障碍，如肠吻合口瘘和肠道狭窄或梗阻等，对局部腹腔黏连有预防和治疗作用，表明上述透明质酸片段注射液对大动物犬有明显的抗炎和止痛效果。
3.4.狗皮肤创口炎症控制实验。
健康比格犬6只，体重6.8±0.8kg。预饲7天后，将6只犬随机分为空白对照组3只，透明质酸片段注射液治疗组3只。实验犬在术前禁食12h、禁水6h。术前15min，透明质酸片段注射液1治疗组1和透明质酸片段注射液2治疗组2犬背部皮下按0.8ml/kg注射含1％B-HA的生理盐水，空白组注射犬背部皮下注射生理盐水。麻醉，常规术部准备，在背后中线两侧切口3cm，不缝合，使用污染土污染创口。术后每天在治疗组1和2犬背部皮下按0.8ml/kg注射透明质酸片段注射液+生理盐水，空白组注射犬背部皮下注射生理盐水，每天上午进行术后观察，连续进行7天。
结果：见表4。
表4.透明质酸片段注射液治疗组犬的背部创口炎症结果。
通过术后1-7天观察，透明质酸片段注射液治疗组1、2犬的背部创口炎症和愈合情况明显好于空白组犬的背部创口炎症和愈合情况。
结论：透明质酸片段注射液皮下注射有效控制犬的背部创口炎症和促进犬的背部创口愈合，表明透明质酸片段注射液对大动物犬有抗炎效果。
3.5.猫口腔创口炎症控制实验。
受试为宠物医院接诊患口腔创口炎症的宠物猫共15只，局部透明质酸片段注射液1注射50mg治疗5只(治疗组1)，局部透明质酸片段注射液2注射50mg治疗5只(治疗组2)，每天1次，连续进行3天，每天上午观察治疗效果。宠物医院接诊患口腔创口炎症的宠物猫另外5只没有治疗，设定为对照组。
结果：见表5。
表5.透明质酸片段注射液治疗猫的口腔创口炎症结果。
透明质酸片段注射液治疗后1-3天观察表明，局部注射透明质酸片段注射液1或注射液2均对宠物猫的口腔创口炎症明显控制创口的红肿，有快速创口抗炎作用。
结论：透明质酸片段注射液对宠物猫的口腔创口炎症有快速的抗炎作用，能明显控制创口的红肿痛，表明透明质酸片段注射液对猫有抗炎效果。
6.牛炎症性咳嗽控制实验。
兽医院接诊患炎症性咳嗽的乳牛7只，皮下透明质酸片段注射液1注射1g治疗，每天1次，连续进行3天，每天上午观察治疗效果。另外7只兽医院接诊患炎症性咳嗽的乳牛没有治疗，设定为对照组。
结果：见表6。
表6.透明质酸片段注射液治疗牛炎症性咳嗽效果。
透明质酸片段注射液1治疗后1-3天观察表明，透明质酸片段注射液1皮下1g注射后3小时即可控制乳牛炎症性咳嗽，治疗3天后全部治愈。
结论：透明质酸片段注射液注射有效治疗乳牛炎症性咳嗽，表明透明质酸片段注射液注射液对大动物牛有抗炎效果。
3.7马关节炎症控制实验。
兽医院接诊患关节炎症的马7只，皮下实施例1透明质酸片段注射液1注射1g治疗，每天1次，连续进行3天，每天上午观察治疗效果。
结果：见表7。
表7.透明质酸片段注射液治疗马关节炎症疼痛的效果。
透明质酸片段注射液1治疗后1-3天观察马疼痛引起的行走异常表明，透明质酸片段注射液1皮下1g注射后1天明显减轻马关节炎疼痛引起的行走异常，治疗3天后效果更加明显。
结论：实透明质酸片段注射液有效治疗大动物马关节炎的疼痛，表明透明质酸片段注射液对大动物马有抗炎效果。
本实施例3研究小结：实施例3的研究结果表明小分子透明质酸片段在小鼠与大动物的功能研究结果完全不一样，因此，预测小分子透明质酸片段对人类(大动物的一种)可能会与小鼠的透明质酸功能研究结果完全不同。
实施例4
研究背景：以上实施例3的研究提示一些在先文献中描述的使用小鼠进行的透明质酸功能研究不能代表大动物和人的透明质酸功能研究结果，上述小分子透明质酸片段注射液可能对人类(大动物的一种)会有“意外”的不同功能。
目的：研究以上实施例1中含有重组人透明质酸酶PH20残留蛋白的注射液1(实验组1)和不含重组人透明质酸酶PH20残留蛋白的注射液2(实验组2)的人体面部美容抗衰老效果和安全性。
方法：使用含有重组人透明质酸酶PH20残留蛋白的透明质酸片段的注射液，即实施例1透明质酸片段注射液1为实验组1，对中国目前空气污染、饮水污染和工作压力大的环境中各种疾病或亚临床问题多发的或衰老和衰老相关疾病多发的98例受试者(平均年龄62±18岁，男50例，女48例)进行临床研究；使用不含重组人透明质酸酶残留蛋白的透明质酸片段注射液，即实施例1透明质酸片段注射液2为实验组2，每次100mg(指注射液中含有的所述分子量为10KD-60KD的透明质酸片段100mg，下同)腹部皮下脂肪层注射，每日1-2次，连续注射至少7天以上，对中国目前空气污染、饮水污染和工作压力大的环境中各种疾病或亚临床问题多发的或衰老和衰老相关疾病多发的100例受试者(平均年龄61±20岁，男49例，女51例)进行临床研究；
采用受试者治疗前后面容观察或照片对比评分的方法对比两种注射液美容效果(评分：无效、不能确定、明显有效)，采用医生问询本人感受、症状、体检和实验室检查的方法评价注射液的安全性，即副作用的有无，包括注射部位疼痛的有无、注射前后身体不适、精力体力状况、身体原有疼痛、身体原有疾病和身体原有各种亚临床问题的改变情况。
结果：见表8。
表8：两种注射液治疗面部美容抗衰老的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
图8显示部分受试者治疗前后照片对比，显示透明质酸片段注射液对人体面部美容和面部衰老的治疗效果，还表明透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射明显减少头、面、颈、肩、背、腹及上下肢部位皮下脂肪组织厚度。
表9：两种注射液减少皮下脂肪的效果。
| 无效 | 不能确定 | 明显有效 | 样本数 | |
| 实验组1 | 6 | 18 | 74 | 98 |
| 实验组2 | 3 | 18 | 79 | 100 |
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
表10：两种注射液腹部皮下脂肪层深部注射后疼痛、局部红肿、局部和全身过敏的有无情况。
| 无 | 不能确定 | 有 | 样本数 | |
| 实验组1 | 98 | 0 | 0 | 98 |
| 实验组2 | 100 | 0 | 0 | 100 |
除以上美容效果、安全和副作用外，我们还发现9例受试者因劳累，在腹部皮下脂肪层注射后感到舒服和有困感；困感持续0.5-1.5小时，其中3例第一次注射后小睡1.0小时，醒后精神和体力明显增加；另6例注射2次后不再发生注射后困感。
表11：两种注射液注射后困感的副作用情况。
| 无 | 不能确定 | 有 | 样本数 | |
| 实验组1 | 92 | 0 | 6 | 98 |
| 实验组2 | 97 | 0 | 3 | 100 |
出乎意外地，所有198例受试者中185例受试者在腹部皮下脂肪层注射后30分钟后均感到精力体力开始增加，表现为愿意说话、洗碗、做饭、散步、计划外出旅行、工作和不想休息等，持续3-4天。
表12：两种注射液注射后精神和体力增加的效果。
| 无 | 不能确定 | 明显有 | 样本数 | |
| 实验组1 | 0 | 8 | 90 | 98 |
| 实验组2 | 0 | 5 | 95 | 100 |
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
所有198例受试者(包括实验组1的98例，实验组2的100例)中有77例受试者有不同肩背腰腿手臂疼痛，出乎意外地，腹部皮下脂肪层注射后30分钟后均感疼痛减轻，其中27例追加局部痛点部位50mg注射，疼痛减轻在注射后2分钟开始出现，和其中12例自述的以前局部利多卡因混合强的松注射封闭治疗的效果相当。
表13：两种注射液的止痛效果
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
所有198例受试者(包括实验组1的98例，实验组2的100例)中有83例受试者有不同程度的瘙痒，出乎意外地，腹部皮下脂肪层注射后1天后均感疼痛减轻或消失。
表14：两种注射液的止痒效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
结论：
1、含有和不含重组人透明质酸酶残留蛋白的透明质酸片段的两种透明质酸片段注射液(注射液1和注射液2)都有人体面部美容和面部抗衰老的效果。
2、含有和不含重组人透明质酸酶残留蛋白的透明质酸片段的两种注射液(注射液1和注射液2)都明显减少头面颈肩背腹上下肢部位皮下脂肪组织厚度。
3、含有和不含重组人透明质酸酶残留蛋白的透明质酸片段的两种注射液(注射液1和注射液2)腹部皮下脂肪层注射均未观察皮肤注射后疼痛、局部红肿、局部和全身过敏，使用方便。
4、含有和不含重组人透明质酸酶残留蛋白的透明质酸片段的两种注射液(注射液1和注射液2)腹部皮下脂肪层注射在第一次注射后感到舒服，有困感，想睡眠，发生率小于4.0％。
5、出乎意外地，含有和不含重组人透明质酸酶残留蛋白的透明质酸片段的两种注射液(注射液1和注射液2)腹部皮下脂肪层注射有明显的增加精力体力的效果。
6、出乎意外地，含有和不含重组人透明质酸酶残留蛋白的透明质酸片段的两种注射液(注射液1和注射液2)腹部皮下脂肪层注射有快速明显的止痛效果。
7、出乎意外地，含有和不含重组人透明质酸酶残留蛋白的透明质酸片段的两种注射液(注射液1和注射液2)腹部皮下脂肪层注射有明显的止痒效果。
8、以上实验结果表明实施例1中透明质酸片段的两种注射液注射液1和注射液2是等效的一种透明质酸片段注射液，即活性成分相同等量的100mg透明质酸片段注射液。
实施例5
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(注射液1和注射液2)的新临床适应症肌筋膜炎和陈旧运动损伤。
方法：进一步分析注射液透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症肌筋膜炎和陈旧运动损伤的治疗效果。
结果：
快速有效治疗肌筋膜炎和陈旧运动损伤：肌筋膜炎和陈旧运动损伤是运动损伤和老年退化性相关性疾病，发病机制不完全明了，美国有专门治疗这种疾病的职业chiropractor，目前还没有治愈的方法。
我们共分析了198例受试者中患有腰背颈上下肢肌筋膜炎受试者12例(实验组1的6例和实验组2的6例)和陈旧运动损伤14例(实验组1的6例和实验组2的8例)，结果如表15所示：
表15：透明质酸片段注射液治疗肌筋膜炎和陈旧运动损伤的效果
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
其中1例57岁男性受试者因陈旧运动损伤17年，患颈背肌筋膜炎3年，每年天气寒冷时发作，疼痛非常折磨人，一定肌肉运动牵扯也会引发疼痛，颈背活动范围受限。腹部皮下脂肪层一次100mg注射30分钟后均感疼痛减轻，后来追加颈背局部痛点部位100mg深部注射效果更佳。2个月内注射15x100mg后，背部痛点结节消失，颈背部肌肉厚度明显变薄，12个月未再复发。结果表明，透明质酸片段注射液除止痛外，最终解决了陈旧运动损伤和肌筋膜炎的炎症病变，达到了肌肉和肌筋膜重组再生的目的。
结论：透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射或痛点部位注射或患病部位注射用于有效治疗有疼痛的腰背颈肩肌筋膜炎和肌肉肌腱损伤。
实施例6
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症骨刺和椎间盘突出或腰背颈椎病。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症骨刺和椎间盘突出或腰背颈椎病的治疗效果。
结果：
透明质酸片段注射液快速有效治疗骨刺和椎间盘突出或腰背颈椎病：骨刺和椎间盘突出或腰背颈椎病是一种老年退化性和运动损伤相关性疾病，发病机制不完全明了，目前还没有治愈的方法。我们共分析了198例受试者中患有腰背颈骨质增生和骨刺受试者30例(实验组1的17例和实验组2的13例)，结果如表16所示：
表16：透明质酸片段注射液治疗骨刺和椎间盘突出或腰背颈椎病的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
其中1例57岁女性受试者患腰背颈骨质增生和骨刺14年，时发作，疼痛非常折磨人，一定肌肉运动牵扯也会引发疼痛，颈背活动范围受限，上肢发麻和工作能力下降。腹部皮下脂肪层100mg注射一天后自述疼痛感减轻50％以上，并能到厨房包饺子做饭；第二天100mg注射后自述疼痛感减轻80％以上；第三天100mg注射后自述疼痛感减轻95％以上。2个月内注射15x100mg后2个月未再复发。结果表明，透明质酸片段注射液除止痛外，最终开始陈旧损伤的炎症病变重组再生。
其中另一例57岁女性受试者患颈骨质增生和骨刺4年，颈背活动范围受限，时发作，疼痛折磨人和有面部麻木感，一定肌肉运动牵扯也会引发疼痛，上肢发麻和工作能力下降。腹部皮下脂肪层100mg注射一天后自述疼痛感减轻50％以上；第二天100mg注射后自述疼痛感减轻80％以上。2个月内注射15x100mg后2个月未再复发，表明透明质酸片段注射液除止痛外，也开始陈旧损伤的炎症病变的重组再生过程。注：以上所有受试者继续治疗，等待6个月以上复发或未复发的结果。
其中另1例74岁男性受试者患复合腰背颈椎病20年，疼痛非常折磨人，行动障碍，准备住院手术治疗。采用透明质酸片段注射液腹部皮下脂肪层注射，8个月内注射60x100mg，无疼痛，可以行走和游泳，表明保守非手术治疗成功，提示透明质酸片段注射液最终可以治愈陈旧损伤的炎症病变和促进组织重组再生。
结论：透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射或痛点部位注射或患病部位注射用于有效治疗有疼痛的骨质增生、骨刺、椎间盘突出、腰背颈椎病。
实施例7
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症玻璃体浑浊和玻璃体剥离。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症玻璃体浑浊和玻璃体剥离的治疗效果。
结果：
透明质酸片段注射液快速有效治疗玻璃体浑浊：玻璃体浑浊是一种老年退化性疾病，发病机制不明，目前还没有有效的治疗方法。玻璃体浑浊又称飞蚊症，进一步发展成玻璃体剥离，损害眼底和影响视力。我们共分析了198例受试者中患有玻璃体浑浊和玻璃体剥离的受试者19例(实验组1的11例和实验组2的8例)，结果如表17所示：
表17：透明质酸片段注射液治疗玻璃体浑浊和玻璃体剥离的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
61岁女性受试者一例，图7为患有玻璃体浑浊和玻璃体剥离的受试者实验室诊断，因需面部美容治疗，接受透明质酸片段腹部皮下脂肪层100毫克注射治疗，注射后第2天偶然发现眼部视力改善，第三天发现眼部飞蚊斑点变小；继续采用15x100毫克每三天注射一次，视力继续改善(由0.2改善到0.5)和飞蚊斑点继续变薄变浅，两个月内无明显反复。以上结果表明透明质酸片段注射液惊奇的快速有效治疗玻璃体混浊(飞蚊症)和玻璃体剥离。
结论：透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射用于有效治疗飞蚊症或玻璃体浑浊和其引起的玻璃体剥离和视力下降。
实施例8
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症有瘙痒(慢性炎症)和疼痛(炎症性疼痛)的创口疤痕。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症有瘙痒(慢性炎症)和疼痛(炎症性疼痛)的创口疤痕的治疗效果。
结果：
透明质酸片段注射液治疗有瘙痒(慢性炎症)和疼痛(炎症性疼痛)的创口疤痕：有疤痕体质人的轻微创口可逐渐形成大型疤痕，不断增厚和瘙痒，治疗目标是止痒和减少疤痕增厚；大面积烧伤后没有植皮形成的疤痕不断增厚，瘙痒和有慢性炎症反应(图9)，治疗目标是止痒、消除炎症和减少疤痕增厚；手术创口主要是红肿、疼痛、炎症反应性渗出和继发感染，治疗目标是加速愈合和减少疤痕形成。我们共分析了198例受试者中患有瘙痒(慢性炎症)和疼痛(炎症性疼痛)的创口疤痕的受试者14例(实验组1的5例和实验组2的9例)，结果如表18所示：
表18：透明质酸片段注射液治疗有瘙痒(慢性炎症)和疼痛(炎症性疼痛)的创口疤痕的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
63岁女性12年前下肢大面积烧伤，未植皮，严重瘙痒，入睡困难，疤痕周边有炎症。透明质酸片段注射2x100mg连续3天后疤痕变薄、疤痕周边炎症消失、瘙痒明显减轻、疼痛明显减轻；透明质酸连续注射30x100mg后疤痕和周边皮肤明显改善，包括疤痕变薄、炎症消失、瘙痒减轻，但未彻底消失(图9)。
结论：透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射用于治疗有炎症、瘙痒和疼痛的大面积烧伤、创伤疤痕、手术创口疤痕。
实施例9
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症手术或腹膜透析后引发的腹腔粘膜粘连。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症手术或腹膜透析后引发的腹腔粘膜粘连的治疗效果。
结果：
透明质酸片段注射液快速有效治疗手术或腹膜透析后引发的腹腔粘膜粘连：手术损伤、腹腔透析等几乎均引起腹腔粘膜炎症和粘连，根据轻重程度的不同可以引发症状和病理改变，包括腹痛、腹部压痛、腹部包块和肠梗阻。目前，还没有可行的办法根除腹腔粘连。我们共分析了198例受试者中患有手术或透析后腹腔粘膜粘连的受试者10例(实验组1的5例和实验组2的5例)，结果如表19所示：
表19：透明质酸片段注射液快速治疗手术或腹膜透析后引发的腹腔粘连。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
43岁女性胃大部切除和周围淋巴结扫除后一个月，开始进非流食后，发现腹部有硬块和疼痛，进食后呕吐，严重消瘦和身体虚弱，经临床诊断为腹腔粘连引发肠梗阻。透明质酸片段腹部皮下脂肪层注射5x100mg后，以上症状和体征全部消失，进非流食后无肠梗阻再发生，精神状态明显好转。治疗结果表明透明质酸片段注射治疗可能是通过减少腹腔粘膜处的炎症，最终达到了消除腹腔粘连症状和体征。
43岁女性卵巢切除手术，手术前一天开始透明质酸片段腹部皮下脂肪层注射100mg，每天一次，连续5天。手术完成后，精神状态明显好与一般手术后的精神状态，当天可以走路，无发烧，有肠鸣音和当天排气，手术后创口愈合明显好与一般手术后的创口愈合。
53岁女性肠吻合手术，手术前一天开始透明质酸片段腹部皮下脂肪层注射100mg，每天一次，连续7天。手术完成后，精神状态明显好与一般手术后的精神状态，当天可以扶床慢走路，无发烧，有肠鸣音和当天排气，手术后创口愈合明显好与一般手术后的创口愈合。
结论：透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射或患病处使用有效治疗手术后、腹膜透析后引发的腹腔粘膜粘连和盆腔粘膜粘连，有效控制手术引起的炎症症状，明显加速手术后恢复和减少手术后的痛苦。
实施例10
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症有痛经的子宫内膜异位症或盆腔粘膜粘连。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症有痛经的子宫内膜异位症或盆腔粘膜粘连的治疗效果。
结果：
透明质酸片段注射液治疗有痛经的子宫内膜异位症或盆腔粘膜粘连：子宫内膜异位症经常伴有不孕不育和痛经；不孕不育和痛经可能跟盆腔粘膜炎症和粘连有关；治疗痛经和子宫内膜异位症或盆腔粘膜粘连和尚无有效方法；我们共分析了198例受试者中患有盆腔粘膜粘连和痛经的受试者9例(实验组1的4例和实验组2的5例)，结果如表20所示：
表20：透明质酸片段注射液治疗有痛经的子宫内膜异位症或盆腔粘膜粘连。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
38岁女性，患有严重子宫腺肌症，超声检查子宫明显增大，痛经非常严重。月经开始透明质酸片段腹部皮下脂肪层注射100mg，每天一次，连续3天，痛经明显减轻。
41岁女性，患有严重子宫腺肌症，超声检查子宫明显增大，CA125明显高于正常人，痛经严重。月经开始透明质酸片段腹部皮下脂肪层注射100mg，每2天一次，连续40天，两次月经期间痛经基本消失，CA125恢复正常，超声检查子宫开始减小。
33岁女性，不孕，检查发现患有子宫内膜异位症和卵巢囊肿，微创手术切除后，开始透明质酸片段腹部皮下脂肪层注射100mg，每4天一次，连续6个月，第7个月怀孕。
以上结果表明透明质酸注射明显减轻了痛经，表明透明质酸注射减少了盆腔内子宫内膜异位症的炎症程度和盆腔粘连引起的牵涉痛的程度，提示透明质酸片段注射液也可能用来治疗子宫内膜异位症和盆腔粘连引起的输卵管蠕动不良造成的不孕不育。
结论：透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射用于有效控制痛经和有效治疗有痛经的子宫内膜异位症和相关疾病问题。
实施例11
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症有瘙痒的神经性皮炎、牛皮癣、瘙痒的老年湿疹、疱疹样湿疹或汗疱疹。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症有瘙痒的神经性皮炎、牛皮癣、瘙痒的老年湿疹、疱疹样湿疹或汗疱疹的治疗效果。
结果：
透明质酸片段注射液治疗有瘙痒的神经性皮炎、牛皮癣、瘙痒的老年湿疹、疱疹样湿疹或汗疱疹：我们共分析了198例受试者中患有神经性皮炎、牛皮癣、瘙痒的老年湿疹、疱疹样湿疹或汗疱疹受试者29例(实验组1的14例和实验组2的15例)，结果如表21所示：
表21：透明质酸片段注射液治疗有瘙痒的神经性皮炎和牛皮癣的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
表21中的其中一例神经性皮炎受试者(男，57岁)患神经性皮炎8年，双侧对称性多处皮肤病变，严重瘙痒和局部皮肤炎症性皮损。之前采用Stelara(抗IL-12/23抗体)注射治疗，效果受试者不满意。采用透明质酸片段注射液20x100mg腹部皮下脂肪层注射后瘙痒基本消失、皮肤炎症性皮损基本恢复(图10)，效果受试者满意。
表21中的其中一例牛皮癣受试者(男，52岁)患牛皮癣18年，腹部、上肢和下肢多处局部皮肤炎症性皮损和皮损处增厚，伴有瘙痒症状。两年前曾使用Stelara(抗IL-12/23抗体)注射治疗，效果受试者不满意。采用透明质酸片段注射液10x100mg腹部皮下脂肪层注射后，瘙痒基本消失，增厚皮损明显变薄，皮肤炎症性皮损明显恢复(图11)，效果受试者满意。
表21中的其中一例牛皮癣受试者(女，76岁)患牛皮癣48年，腹部、上肢和下肢多处局部皮肤炎症性皮损和皮损处增厚，伴有瘙痒症状，没有使用皮质激素。采用透明质酸片段注射液20x100mg腹部皮下脂肪层注射后，瘙痒消失，皮损全部消失，效果受试者非常满意。
表22：透明质酸片段注射液治疗有瘙痒的老年湿疹和疱疹样湿疹或汗疱疹的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
表22中的其中一例汗疱疹受试者(女，33岁)患汗疱疹9年，每年夏季发病。采用透明质酸片段注射液20x100mg腹部皮下脂肪层注射后，注射期间和注射后1年没再发生汗疱疹。
表21、22的结果表明透明质酸片段注射液腹部皮下脂肪层注射能有效治疗有瘙痒的神经性皮炎、牛皮癣、瘙痒的老年湿疹、疱疹样湿疹或汗疱疹。
结论：透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射用于有效治疗瘙痒的神经性皮炎、牛皮癣、瘙痒的老年湿疹和疱疹样湿疹或汗疱疹。
实施例12
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症衰老相关疾病牙周炎症、口腔溃疡、咽喉炎症、眼结膜炎症。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症衰老相关疾病牙周炎症、口腔溃疡、咽喉炎症、眼结膜炎症的治疗效果。
结果：
衰老定义为各组织器官功能下降，包括皮肤面容改变和体力精力下降，更突显的是各种常见疾病多发，包括衰老相关牙周炎症、口腔溃疡、咽喉炎症、眼结膜炎症。透明质酸片段注射液快速治疗衰老相关牙周炎症、口腔溃疡、咽喉炎症、眼结膜炎症。牙周炎症、口腔溃疡、咽喉炎症、眼结膜炎症老年人多发，是衰老相关疾病，也与中国目前空气污染、饮水污染和工作压力大的环境相关联。我们共分析了198例受试者中患有牙周炎症、口腔溃疡、咽喉炎症、眼结膜炎症受试者66例(实验组1的36例和实验组2的30例)，结果如表23所示：
表23：透明质酸片段注射液治疗牙周炎症、口腔溃疡、咽喉炎症、眼结膜炎症的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
表23的结果表明透明质酸片段注射液比我们以前局部使用透明质酸片段注射液喷涂有更快速的治疗衰老相关牙周炎症、口腔溃疡、咽喉炎症、眼结膜炎症的效果。
结论：1.透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射用于快速治疗衰老相关牙周疾病和口腔溃疡，包括化疗和衰老引起的牙周疾病和口腔溃疡；2.透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射用于快速治疗衰老相关咽喉疾病，包括化疗和衰老引起的咽喉疾病；3.透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射用于快速治疗衰老相关眼结膜疾病，包括化疗和衰老引起的眼结膜疾病。
实施例13
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症直性脊柱炎。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症直性脊柱炎的治疗效果。
结果：透明质酸片段注射液有效治疗强直性脊柱炎。
强直性脊柱炎是炎症性疼痛和脊柱严重变型的疾病。我们共分析了198例受试者中患有早期强直性脊柱炎的受试者3例(实验组1的2例和实验组2的1例)，结果如表24所示：
表24：透明质酸片段注射液治疗强直性脊柱炎的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
早期强直性脊柱炎是炎症性疼痛的疾病，透明质酸片段注射液治疗的止痛效果表明强直性脊柱炎的炎症减退或消除，提示炎症引起的脊柱严重变型不会继续发展。
结论：透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射用于有效治疗疼痛的早期强直性脊柱炎。
实施例14
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症肿瘤化疗后体力精力恢复。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症固体肿瘤化疗后体力精力恢复的治疗效果。
结果：
透明质酸片段注射液用于肿瘤化疗后体力精力恢复：我们共分析了198例受试者中有肿瘤化疗后需要体力精力恢复的受试者32例(实验组1的17例和实验组2的15例)，结果如表25所示：
表25：透明质酸片段注射液治疗固体肿瘤化疗后体力精力恢复和缓解化疗相关粘膜并发症明(包括口腔、咽喉、眼结膜、肠道粘膜的并发症症状和体征)的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。
结论：透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射用于不同肿瘤化疗后体力精力恢复和有效缓解化疗相关粘膜并发症明。
实施例15
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症肺癌。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症肺癌的治疗效果。
结果：
透明质酸片段注射液用于治疗晚期肺癌：我们共分析了198例受试者中有晚期肺癌化疗结合透明质酸片段注射的受试者7例(实验组1的5例和实验组2的2例，每3-5天注射一次，持续注射治疗12个月以上或治疗到去世)，结果如表26所示：
表26.晚期肺癌化疗结合透明质酸片段注射的治疗效果。
注：本实验实验组采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。对照组为采用化疗治疗晚期肺癌的其他病例。
表26中的64岁女性受试者被诊断为右肺肺癌，伴有左肺、脑、骨、纵膈淋巴结转移，已无法手术切除治疗，采用了放疗和特罗凯化疗。受试者放疗和化疗后身体虚弱，开始透明质酸片段注射液100mg腹部皮下脂肪层注射，每3-5天注射一次。受试者体力精力在注射第一天开始恢复，注射3个月后CT检查发现肿瘤和转移包块缩小，注射12个月后仍在家中正常生活，不需住院治疗。本治疗结果表明透明质酸片段注射液可以防止肺癌的发展和进一步转移，明显延长生存期。
表26中的78岁男性受试者被诊断为右肺肺癌，伴有纵膈淋巴结转移，已无法手术切除治疗，分子学检测表明靶向化疗药物治疗应无明显效果。受试者仍然使用化药药物治疗，并开始透明质酸片段注射液100mg腹部皮下脂肪层注射，每3天注射一次，共透明质酸片段注射液治疗3个月。受试者体力精力在注射第3天开始恢复，注射3个月后CT检查发现肿瘤和转移包块明显缩小，透明质酸片段持续注射治疗12个月后仍在家中正常生活，CT检查发现减小的肿瘤和转移包块没有进一步发展，不需住院再治疗。本治疗结果表明透明质酸片段注射液可以防止肺癌的发展和进一步转移。
透明质酸片段注射液用于治疗早期肺癌：我们共分析了198例受试者中有早期肺癌手术结合化疗和透明质酸片段注射的受试者5例(实验组1的3例和实验组2的2例，手术开始前1周，每3-5天注射一次，连续注射治疗3个月)，结果如表27所示：
表27.早期肺癌手术结合化疗和透明质酸片段注射的预防复发效果。
注：本实验实验组采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。对照组为采用手术结合化疗治疗的其他病例。
结论：1.本实验结果表明透明质酸片段注射液可以防止晚期肺癌的发展和进一步转移；2.本实验结果还表明透明质酸片段注射液可以防止早期肺癌手术后复发。
实施例16
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和注射液2)的新临床适应症胰腺癌。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症胰腺癌的治疗效果。
结果：
胰腺癌是一种非常恶性的肿瘤，转移后发展迅速，最快的90天内死亡。国外的研究表明炎症和肿瘤相关炎症细胞可能是胰腺癌发展和转移的重要促进因素。
透明质酸片段注射液用于治疗晚期胰腺癌：我们共分析了198例受试者中有晚期胰腺癌手术结合化疗和透明质酸片段注射的受试者5例(实验组1的3例和实验组2的2例，手术开始前2周，每3-5天注射一次，连续注射治疗>12个月或治疗到去世)，结果如表28所示：
表28.晚期胰腺癌化疗结合B-HA透明质酸片段注射液的治疗效果。
注：本实验实验组采用自身对照，即与受试者当前或治疗前一段时期的状态做对比。对照组为采用化疗治疗的其他病例。
表28中的胰头癌化疗后受试者(男，46岁)因黄疸发现胰头癌转移到肝脏，堵塞胆管造成黄疸，经手术放入支架和鼻胆管引流术解决了黄疸问题，每月化疗，同时采用中药治疗。采用透明质酸片段注射液5x100mg腹部皮下脂肪层注射，体力精力恢复；透明质酸片段注射液20x100mg腹部皮下脂肪层注射后超声检查显示胰头癌和转移到肝脏的包块开始缩小，受试者患者正常工作超过90天。以上结果表明透明质酸片段注射液可以促进治疗固体肿瘤化疗后体力精力恢复和可能通过抑制炎症防止了胰头癌的发展和进一步转移。国外报道(Halozyme Receives Orphan Drug Designation For PEGylated Recombinant HumanHyaluronidase PH20For Pancreatic Cancer at：http：//www.halozyme.com/Investors/News-Releases/News-Release-Details/2014/Halozyme-Receives-Orphan-Drug-Designation-For-PEGylated-Recombinant-Human-Hyaluronidase-PH20-For-Pancreatic-Cancer/default.aspx#sthash.aLjvxToQ.dpuf)长效透明质酸酶PEGPH20结合化疗有效延长胰腺导管癌病人的生存时间，其作用机制本实验结果提示可能是利用人体内透明质酸生产类似本发明所述的小分子透明质酸片段的注射液而生产作用。
结论：本实验结果表明透明质酸片段注射液可以防止晚期胰腺癌的发展和进一步转移，明显延长生存期。
实施例17
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症胃癌。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症胃癌的治疗效果。
结果：
透明质酸片段注射液用于治疗晚期胃癌：我们共分析了198例受试者中有晚期胃癌手术结合化疗和透明质酸片段注射的受试者4例(实验组1的3例和实验组2的1例，每1-5天注射一次，连续注射治疗>12个月)，结果如表29所示：
表29.晚期胃癌化疗结合B-HA透明质酸片段注射液的治疗效果。
注：本实验实验组采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。对照组为采用化疗治疗的其他病例。
表29中的一名胃癌化疗后受试者(男，62岁)胃癌多处转移，脑转移肿块压迫呼吸中枢引发呼吸困难，ICU抢救。采用透明质酸片段注射液100mg腹部皮下脂肪层注射，每天1次，连续20天注射。透明质酸片段注射10天后，该受试者呼吸平稳，体力精力恢复，出院回家休养。该受试者出院后，在家使用透明质酸片段注射液100mg腹部皮下脂肪层注射，每3-5天注射1次，连续12个月或以上。
结论：本实验结果表明透明质酸片段注射液可以防止晚期胃癌的发展和进一步转移，明显延长生存期。
实施例18
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症卵巢癌。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症卵巢癌的治疗效果。
结果：透明质酸片段注射液用于治疗晚期卵巢癌：我们共分析了198例受试者中有晚期卵巢癌化疗结合透明质酸片段注射的受试者5例(实验组1的2例和实验组2的3例，每3天注射一次，连续注射治疗3个月)，结果如表30所示：
表30.晚期卵巢癌化疗结合B-HA透明质酸片段注射液的治疗效果。
注：本实验实验组采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。对照组为采用化疗治疗的其他病例。
表30中的卵巢癌手术化疗后受试者(女，62岁)因淋巴结转移化疗和放疗，身体极度虚弱，24小时卧床。采用透明质酸片段注射液20x100mg腹部皮下脂肪层注射，体力精力注射1x100mg后第二天开始恢复，全部注射完20x100mg后CA125从治疗前500U/ml惊奇地降到50U/ml，肿瘤和转移包块缩小，表明透明质酸片段注射液可以促进治疗卵巢癌化疗后体力精力恢复和可能通过抑制炎症防止了卵巢癌的发展和进一步转移。
结论：本实验结果表明透明质酸片段注射液可以降低晚期卵巢癌的癌症指标CA125和控制晚期卵巢癌或晚期卵巢癌转移肿块继续生长和转移。
实施例19
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症有明显进食困难口腔癌。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症有明显进食困难口腔癌的治疗效果。
结果：透明质酸片段注射液用于治疗口腔癌：我们共分析了198例受试者中有明显进食困难的口腔癌的透明质酸片段注射的受试者10例(实验组1的6例和实验组2的4例，表中实验组每1天注射一次，连续注射15次，对照组生理盐水注射+口服抗菌素甲硝唑)，结果如表31所示：
表31.透明质酸片段注射液治疗有明显进食困难的口腔癌的效果。
结论：本实验结果表明透明质酸片段注射液可以用来治疗有明显进食困难口腔癌。
实施例20
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症脑膜瘤手术后复发。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症脑膜瘤手术后复发的治疗效果。
结果：
透明质酸片段注射液用于治疗脑膜瘤手术后复发：我们共分析了198例受试者中有脑膜瘤手术后复发的透明质酸片段注射的受试者5例(实验组1的3例和实验组2的2例，每3-5天注射一次，连续注射12个月以上)，结果如表32所示：
表32.透明质酸片段注射液治疗脑膜瘤手术后复发的效果。
注射液注：本实验实验组采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。对照组为采用空白处理的其他病例。
表32中的一例女性受试者(62岁)，2007年因头痛频发，经显影剂核磁影像诊断为脑膜瘤，同年手术后，头痛消失。2015年开始头痛频发，经显影剂核磁影像诊断为脑膜瘤残留或复发，即脑膜明显增厚。透明质酸片段注射液腹部皮下脂肪层注射100mg共15次，头痛发作明显减少。受试者继续每5天注射一次，在后续12个月内每次100mg注射约60次，显影剂核磁影像检查结果表明以前脑膜瘤残留或复发的病灶由18.3x12.7x112.2mm减少到16.3x7.9x13.2mm(图12)，病灶没有继续生长反而减小，最后受试者不再有头疼发作。以上结果表明透明质酸片段注射液可以用于治疗脑膜瘤或脑膜瘤手术后复发。
结论：本实验结果表明透明质酸片段注射液可以控制脑膜瘤手术后复发。
实施例21
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症脑栓塞后功能恢复。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症脑栓塞后功能恢复的效果。
结果1:透明质酸片段注射液用于脑栓塞后功能恢复：我们共分析了198例受试者中有脑栓塞后上肢僵硬功能恢复需要的受试者3例(实验组1的3例，每2天注射一次，连续10次)，结果如表33所示：
表33：透明质酸片段注射液用于脑栓塞后上肢僵硬功能恢复的效果
注：本实验采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。
表33中的1例男性受试者(79岁)脑栓塞后3年，全身发凉、上肢僵硬、手指不能放松，透明质酸片段注射液100mg/次腹部皮下脂肪层注射10次后，全身发凉、上肢僵硬、手指不能放松明的症状和体征明显好转，要求继续透明质酸片段注射。
表33中的1例男性受试者(82岁)脑栓塞后8年，上肢僵硬，手指不能放松和疼痛，透明质酸片段注射液100mg/次腹部皮下脂肪层注射10次后，上肢僵硬和手指不能放松明、疼痛的症状和体征明显好转。
表33中的1例男性受试者(56岁)脑栓塞后1年，上肢僵硬，手指不能放松和麻木，透明质酸片段注射液100mg/次腹部皮下脂肪层注射10次后，上肢僵硬、手指不能放松和麻木的症状和体征明显好转。
五、结果2:透明质酸片段注射液用于脑栓塞后功能恢复：我们共分析了198例受试者中有脑栓塞后上肢软弱功能恢复需要的受试者4例(实验组1的1例和实验组2的3例)，结果如表34所示：
表34：透明质酸片段注射液用于脑栓塞后功能恢复的效果
注：本实验采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。
表34中的一例男性受试者(67岁)脑栓塞后30天，半身软，走路无力，透明质酸片段注射液10次(100mg/次)腹部皮下脂肪层注射后，半身软明显好转、走路有力，表明透明质酸片段注射液可用于脑栓塞后的功能恢复。
表34中的另一例男性受试者(59岁)脑栓塞后4天，视力受损，只能看见20cm内的物体，透明质酸片段注射液10次(100mg/次)腹部皮下脂肪层注射后，视力明显好转，可以看见40cm内的物体，表明透明质酸片段注射液可用于脑栓塞后的功能恢复。
结论：透明质酸片段注射液通过腹部皮下脂肪层注射有效促进脑栓塞后的功能恢复。
实施例22
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症心绞痛。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症心绞痛的治疗效果。
透明质酸片段注射液用于治疗心血管疾病引发的心绞痛：冠心病、血管支架后并发症等心血管疾病本质上是慢性炎症性疾病，急需有效的防治方法。我们共分析了198例透明质酸片段注射液受试者中有心绞痛的受试者6例(实验组1的3例和实验组2的3例，每天注射一次，连续注射20次)，结果如表35所示：
表35：透明质酸片段注射液用于治疗心血管疾病引发的心绞痛的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。
结论：表35的结果表明透明质酸片段注射液腹部皮下脂肪层注射有效治疗心血管疾病引发的心绞痛。
实施例23
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症正在发作的有疼痛的痛风。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症正在发作的有疼痛的痛风的治疗效果。
透明质酸片段注射液用于治疗痛风：我们共分析了198例透明质酸片段注射液受试者中有正在发作的有疼痛的痛风的受试者5例(实验组1的3例和实验组2的2例，每天注射1次，连续注射5次)，结果如表36所示：
表36：透明质酸片段注射液用于治疗正在发作的有疼痛的痛风的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。
结论：表36的结果表明透明质酸片段注射液腹部皮下脂肪层注射有效治疗正在发作的有疼痛的痛风。
实施例24
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应没有用过皮质激素的关节炎。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症没有用过皮质激素的关节炎的治疗效果。
透明质酸片段注射液用于治疗没有过皮质激素治疗的关节炎：我们共分析了198例透明质酸片段注射液受试者中有没有用过皮质激素的关节炎的受试者6例(实验组1的3例和实验组2的3例，每天注射1次，连续注射15次)，结果如表37所示：
表37：透明质酸片段注射液用于治疗没有用过皮质激素的关节炎的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。
透明质酸片段注射液用于治疗已经用皮质激素的关节炎：我们共分析了198例透明质酸片段注射液受试者中已经用皮质激素的关节炎的受试者4例(实验组1的2例和实验组2的2例，每天注射1次，连续注射15次)，结果如表38所示：
表38：透明质酸片段注射液用于治疗已经用皮质激素的关节炎的效果。
注：本实验采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。
结论：1.透明质酸片段注射液腹部皮下脂肪层注射有效治疗没有用过皮质激素的关节炎；2.透明质酸片段注射液腹部皮下脂肪层注射治疗已用皮质激素的关节炎无效。
实施例25
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症疼痛严重的带状疱疹。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症疼痛严重的带状疱疹的治疗效果。
透明质酸片段注射液用于治疗痛风：我们共分析了198例透明质酸片段注射液受试者中有疼痛严重的带状疱疹的受试者5例(实验组1的2例，实验组2的3例，每天注射1次，连续注射10次)，结果如表39所示：
表39：透明质酸片段注射液用于治疗疼痛严重的带状疱疹的效果。
注：1.本实验采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比；2.另设没有治疗的空白对照组2例受试者10天之内2例疼痛加重，3例疼痛没有减轻。
结论：表39的结果表明透明质酸片段注射液腹部皮下脂肪层注射有效治疗疼痛严重的带状疱疹。
实施例26
目的：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，明确透明质酸片段注射液(实施例1透明质酸片段注射液1和2)的新临床适应症疼痛严重的急性胰腺炎。
方法：进一步分析透明质酸片段注射液治疗前后“实施例4”共198例受试者所患有的疾病和亚临床问题的改变情况，包括注射前病史、症状、体征和实验室检查结果，以及透明质酸片段注射液注射后的症状、体征和实验室检查结果的改变，明确透明质酸片段注射液对新临床适应症症疼痛严重的急性胰腺炎的治疗效果。
透明质酸片段注射液用于治疗痛风：我们共分析了198例透明质酸片段注射液受试者中有疼痛严重的急性胰腺炎的受试者6例(实验组1的3例，实验组2的3例，下表中实验组每天透明质酸片段注射液+抗菌素注射1次，对照组每天抗菌素注射1次，连续注射10次)，结果如表40所示：
表40：透明质酸片段注射液用于治疗急性胰腺炎的效果。
注：本实验实验组采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。
结论：表40的结果表明透明质酸片段注射液腹部皮下脂肪层注射有效治疗疼痛严重的急性胰腺炎。
实施例27
目的：比较不同方法生产的小分子透明质酸片段皮下注射对受试犬和人的疼痛研究。
方法：本发明实施例1中采用人重组透明质酸酶直接酶切大分子透明质酸原料，生产出小分子(分子量10-60KD)透明质酸片段注射液1和注射液2，在人体腹部皮下脂肪层深部注射使用的上述实施例中没有引起疼痛。
申请人在先的研究成果(申请号201410153593.5、公告号CN105018547A的专利文献)中还记载了一种对大分子透明质酸原料首先采用烘烤加热的方法，以减少大分子透明质酸原料的分子量，然后再采用重组人透明质酸酶酶切大分子透明质酸生产小分子透明质酸片段。
本实施例中也借鉴了上述方式增加了对大分子透明质酸原料的烘烤，烘烤的目的是使用物理方法减少大分子透明质酸原料的分子量，降低溶解后的粘度。并且，烘烤后，由于大分子透明质酸原料的分子量降低，后续进行切割的重组人透明质酸酶可以进一步降低使用量，可以大大降低成本。
实施时，除烘烤步骤外，其余步骤基本与实施例1中相同。具体地，实施过程按照以下具体步骤进行：
使用工作体积25升的在位清洁在位灭菌的酶解混合罐，准备注射级分子量为800-1200KD的透明质酸原料(与实施例1中相同)；
对注射级分子量800-1200KD的透明质酸原料进行以下处理：120度干烤1-2小时(处理1)，或105度分别干烤5-6小时(处理2)；
再将干烤后的注射级分子量800-1200KD的透明质酸原料一次或分多次加入注射级的纯水，再依次加入氯化钠80-90mM、镁离子1mM、重组人透明质酸酶(制备方法与实施例1中相同)，4000-5000单位/每克大分子透明质酸原料，充分混合，在37度反应5-6小时，至透明质酸片段的分子量达到10KD-60KD。加氯化钠35-45mM将渗透压调至280-300毫渗量/升(mOsm/L)，再经加热84-95度30-60分钟(重组人透明质酸酶热灭活、部分细菌灭活和降低pH病毒灭活)，再经0.22um细菌过滤。
过滤后制成透明质酸片段注射液，包括：
注射液3(经处理1，包括120度干烤步骤)：
每2-4ml含有分子量为10KD-60KD的透明质酸片段100mg，以及灭活的无酶活性的重组人透明质酸酶PH20残留蛋白小于20微克(内毒素小于0.5IU/ml、无菌、无病毒)，氯化钠终浓度为115-125mM、镁离子终浓度为1mM。
注射液4(经处理2，包括105度干烤步骤)：
每2-4ml含有分子量为10KD-60KD的透明质酸片段100mg，以及灭活的无酶活性的重组人透明质酸酶PH20残留蛋白小于20微克(内毒素小于0.5IU/ml、无菌、无病毒)，氯化钠终浓度为115-125mM、镁离子终浓度为1mM。
对上述不同方法生产的小分子透明质酸片段注射液3和注射液4以及实施例中的注射液1，分别对受试犬和人进行皮下注射使用，发现了上述注射液3在注射时发生了疼痛副作用，受试犬的疼痛表现为注射开始和注射过程中强烈挣扎，受试人疼痛表现为告知注射人疼痛和要求立即终止注射。
结果：见表41。
表41.不同方法生产的小分子透明质酸片段皮下注射对受试犬和人产生引发疼痛的研究结果。
结论：1、出乎意料地，120度干烤处理生产出的小分子透明质酸片段皮下注射对受试犬和人引起严重疼痛，不能做为注射剂使用；2、出乎意料地，105度干烤处理生产出的小分子透明质酸片段皮下注射没有对受试犬和人引起疼痛，可以做为注射剂使用(该注射剂在足够样本量的受试者中也显示出对上述疾病或病症的治疗效果，这里未列出具体结果。此外，基于对生产成本的考虑，该种生产方式制成的透明质酸片段注射剂适合于发展成实验动物用或兽用产品。)；3、不经过烘烤处理而直接采用重组人透明质酸酶酶切生产的出小分子透明质酸片段皮下注射没有对受试犬和人引起疼痛，可以做为注射剂使用。
实施例28
目的：探讨其它种类透明质酸酶切方法活化和商业化生产有上述实施例所表现出来的治疗作用的小分子透明质酸片段的可能性。
方法：(1)研究现有文献中已发现的多种透明质酸酶的生产方法和酶切大分子透明质酸生产小分子透明质酸片段的结果；(2)采用自主或合作生产不同透明质酸酶，验证其酶切和活化大分子透明质酸的可行性；(3)研究什么样的透明质酸酶可以切割活化大分子透明质酸到什么样大小的分子量？什么样的酶切割末端结构能够活化小分子透明质酸有上述实施例中透明质酸片段注射液所表现出来的治疗作用？什么样的透明质酸酶残留不引起人类过敏反应？
结果和讨论：我们结合现有文献研究了多种透明质酸酶的生产方法，以及它们酶切大分子透明质酸的方法，现将研究结果分别报告如下：
1、除本文研究的中性人精子顶体透明质酸酶PH20(或Hyal3或SPAM1)外，人类还有细胞内的酸性透明质酸酶Hyal1和Hyal2。通过文献“Recombinant human hyaluronidaseHyal-1:Insect cells versus Escherichia coli as expression system andidentification of low molecular weight inhibitors，Glycobiology，17(4):444-53，2007”，我们发现昆虫细胞Drosophila Schneider-2(DS-2)生产的重组人Hyal1透明质酸酶比活性8.6U/mg，最佳反应pH值3.5-4.0，但这种生产方式产量太低，不适合用于活化和商业化生产小分子透明质酸片段注射液。此外，我们使用实施例1中的表达体系构建方式，采用动物细胞(CHO-S细胞)、富含GC的pMH3、pMH4、pMH5表达载体和人Hyal1和Hyal2cDNA生产重组人Hyal1和Hyal2蛋白，发现获得的Hyal1和Hyal2透明质酸酶的活性远小于我们目前生产的PH20(1x105U/mg酶蛋白)，提示重组人Hyal1和Hyal2不适用于动物细胞生产。
2、酵母表达的中性人精子顶体透明质酸酶PH20(或Hyal3或SPAM1)产量可达到商业化水平，比活性可达到1万IU/mg酶蛋白，适合用于酶切活化和商业化生产小分子透明质酸片段注射液。我们使用酵母表达的中性人精子顶体透明质酸酶PH20，酶切后依次或分别使用重组人透明质酸酶亲和柱层析、沉淀、柱层析、透析、超滤浓缩等，将含有重组人透明质酸酶残留蛋白去除，制造不含有重组人透明质酸酶残留蛋白的类似实施例1中的透明质酸片段注射液2(分子量为10KD-60KD的透明质酸片段100mg/2-4毫升、氯化钠115-125mM、镁离子1mM)，并对各种衰老相关疾病多发的38例受试者进行临床研究，表42的结果表明酵母表达的中性人精子顶体透明质酸酶PH20虽然比活性小，对透明质酸片段注射液的纯度有一定影响，将含有重组人透明质酸酶残留蛋白去除，可以用于制造表现出人体治疗作用且无过敏副作用的透明质酸片段注射液。
表42：使用酵母表达的中性人精子顶体透明质酸酶PH20制造的透明质酸片段注射液2对各种衰老相关疾病多发的38例受试者的临床效果
注：本实验采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。
3、我们通过合作实验室使用植物拟南芥Arabidopsis thaliana生产含油种子表达系统生产中性人精子顶体透明质酸酶PH20融合蛋白，发现可以用于生产上述有人体治疗作用且无过敏副作用的透明质酸片段注射液，具体效果见表43。与动物细胞Chinesehamster ovary细胞生产的高纯度的有糖化的重组人透明质酸酶比较，这种方式生产透明质酸酶PH20融合蛋白成本低，产量大，活性低，但去除含有的透明质酸酶PH20融合蛋白残留成本稍高。此外，基于我们前期的对外用小分子透明质酸的研究成果，我们认为这种植物表达的透明质酸酶PH20可适合用于生产纯度要求低的外用的小分子透明质酸雾化剂、喷剂和凝胶制剂等。
表43：使用植物表达的中性人精子顶体透明质酸酶PH20制造的透明质酸片段注射液2对各种衰老相关疾病多发的35例受试者的临床效果
注：本实验采用自身对照，即与受试者治疗当时或前一段时期的状态做对比。
4、羊或牛睾丸提取的透明质酸酶主要为中性羊或牛精子顶体透明质酸酶PH20，人使用前需做皮肤过敏实验。这种透明质酸酶虽然成本低，但纯度也低，且去除透明质酸酶蛋白残留的成本也高，经与动物细胞Chinese hamster ovary细胞生产的高纯度的有糖化的重组人透明质酸酶比较，认为不适合生产纯度要求高的有人体治疗作用且无过敏副作用的透明质酸片段注射液。
5、CEDARS-SINAI MEDICAL CENTER的专利WO/2014/165713表明细菌streptococci透明质酸酶产生的小于10KD的小分子透明质酸不引起炎症反应，但细菌Streptomyces透明质酸酶产生的大于10KD的小分子透明质酸引起炎症反应，这和我们上述有治疗功效的分子量为10KD-60KD的透明质酸片段相互矛盾，但此处重点考虑的是细菌透明质酸酶残留蛋白可能会对人体产生过敏反应，不适合生产纯度要求高的用于人体治疗使用且无过敏副作用的透明质酸片段注射液。
6、蜜蜂毒液中的透明质酸酶过敏原性很强，除促进蜂毒吸收外，还对人引起过敏反应。提取蜜蜂毒液中的和微生物表达的蜜蜂毒液中的透明质酸酶都不适合生产纯度要求高的用于人体治疗使用且无过敏副作用的透明质酸片段注射液。
7、吸血的水蛭分泌水蛭透明质酸酶，可以溶解皮肤，帮助水蛭进入人体吸血。文献“Enzymatic production of specifically distributed hyaluronanoligosaccharides，Carbohydr Polym，2015，129:194-200”和“High-yield novel leechhyaluronidase to expedite the preparation of specific hyaluronan oligomers(2014)，Scientific Reports 4,Article number 4471”表明水蛭透明质酸酶融合蛋白在酵母表达的产量、酶切活性、成本都能达到商业化要求，并能将大分子透明质酸切割成小分子透明质酸。但是，水蛭透明质酸酶残留会引起过敏反应，需彻底清除方有可能用来生产有上述实施例所表现出来的有治疗作用且无过敏副作用的透明质酸片段注射液。
因此，综合上述研究结果，我们认为，本发明中所述的小分子透明质酸片段生产过程中，适合采用的重组人透明质酸酶可以通过动物细胞或酵母或植物表达生产，这些生产方式获得的重组人透明质酸酶满足对安全性和活性的要求，并且，通过这些生产方式生产的小分子透明质酸片段注射液，经实际的人体实验使用验证，表现出了确实有效的治疗作用且无过敏、无副作用现象的产生。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (30)
1.小分子透明质酸片段在制备治疗固体肿瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的固体肿瘤包括肺癌、胰腺癌、口腔癌、脑膜瘤、胃癌、卵巢癌。
3.小分子透明质酸片段在制备治疗干眼症、飞蚊症、眼结膜疾病、玻璃体浑浊、由玻璃体浑浊引起的玻璃体剥离或视力下降的药物中的应用。
4.小分子透明质酸片段在制备治疗肌筋膜炎、肌肉肌腱损伤、骨质增生、骨刺、椎间盘突出、腰背颈椎病的药物中的应用。
5.小分子透明质酸片段在制备治疗痛风、关节炎、强直性脊柱炎的药物中的应用。
6.小分子透明质酸片段在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
7.小分子透明质酸片段在制备促进脑梗死或脑出血后功能恢复的药物中的应用。
8.小分子透明质酸片段在制备治疗痛经、子宫内膜异位症、子宫腺肌症的药物中的应用。
9.小分子透明质酸片段在制备治疗牙周疾病、口腔溃疡和咽喉疾病的药物中的应用。
10.小分子透明质酸片段在制备治疗带状疱疹、神经性皮炎、牛皮癣、湿疹、疱疹样湿疹、汗疱疹的药物中的应用。
11.小分子透明质酸片段在制备治疗烧伤、创伤、手术创口的药物中的应用。
12.小分子透明质酸片段在制备治疗疼痛或瘙痒的药物中的应用。
13.小分子透明质酸片段在制备治疗急性胰腺炎的药物中的应用。
14.小分子透明质酸片段在制备治疗手术后或腹膜透析后引发的腹腔粘膜粘连、盆腔粘膜粘连的药物中的应用。
15.小分子透明质酸片段在用于增加或恢复化疗后体力和精力或制备治疗化疗后副作用的药物中的应用。
16.小分子透明质酸片段在用于面部美容或制备治疗面部衰老的药物中的应用。
17.小分子透明质酸片段在制备用于减少皮下脂肪组织的药物中的应用。
18.根据权利要求1-17任一项所述的应用，其特征在于，所述的小分子透明质酸片段是分子量为10-60KD的透明质酸片段，所述的透明质酸片段是以大分子透明质酸为原料，通过重组人透明质酸酶PH20切割后获得的。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的重组人透明质酸酶PH20是采用动物细胞或酵母或植物表达生产的且纯度在98.5％以上的重组人透明质酸酶。
20.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的小分子透明质酸片段被制成注射剂应用，所述的注射剂含有有效量的所述分子量为10-60KD的透明质酸片段。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述注射剂为腹部皮下脂肪层或痛/痒点部位或患病部位用注射剂。
22.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述注射剂的使用量为每日注射1-2次，每次注射所述的透明质酸片段的有效量为100-200mg。
23.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述的注射剂为液体制剂，其通过以下步骤制备获得：
A.将大分子透明质酸原料配制成溶液，引入氯化钠和镁离子，并加入重组人透明质酸酶PH20进行切割，获得含有分子量10-60KD的透明质酸片段的反应液；
B.对获得的反应液中残留的重组人透明质酸酶PH20进行灭活处理；
C.进行病毒灭活以及细菌过滤或灭活。
24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述步骤A中大分子透明质酸原料预先通过105度的烘烤处理5-6小时后再配制成溶液。
25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述步骤A中大分子透明质酸原料的分子量为800-1200KD，每克所述大分子透明质酸原料对应加入4000-5000单位的所述重组人透明质酸酶PH20进行切割，酶切反应5-6小时。
26.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述步骤A中大分子透明质酸原料直接配制成溶液，所述大分子透明质酸原料的分子量为800-1200KD，每克所述大分子透明质酸原料对应加入15000-20000单位的所述重组人透明质酸酶PH20进行切割，酶切反应5-6小时。
27.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述步骤A中引入的所述氯化钠和镁离子在配制溶液中的浓度分别为80-90mM和1mM。
28.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述步骤B之后还对被灭活的重组人透明质酸酶进行去除。
29.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，每2-4ml的所述注射剂中含所述透明质酸片段100mg，且含灭活的重组人透明质酸酶残留不超过20ug。
30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述镁离子在所述注射剂中的终浓度为1mM，所述氯化钠在所述注射剂中的终浓度为115-125mM。
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