CN111249302A - 一种透明质酸片段的新应用及稳定制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种透明质酸片段作为人中性粒细胞移走抑制剂、人单个核细胞移走抑制剂、人单个核细胞凋亡促进剂和/或人中性粒细胞β防卫素分泌促进剂的应用；所述透明质酸片段为使用结构上有两个结合区的透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子量透明质酸原料制造而成的平均分子量35±8KDa的透明质酸片段；本发明还公开了上述透明质酸片段在制备治疗中性粒细胞及单个核细胞介导的炎症性疾病药物中的应用。本发明还公开了上述透明质酸片段的稳定制造方法及基于上述稳定制造方法而形成的透明质酸酶注射液及透明质酸注射液的联合应用方法。本发明通过研究发现了透明质酸片段的稳定制造方法、制造原理和抗炎机制，为其药学研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种透明质酸片段的新应用及稳定制造方法。
背景技术
目前，科学社会对于人体细胞外基质透明质酸的生理功能和药学功效还是没有统一的看法。最早的透明质酸产品都是平均分子量大于1200kDa的治疗关节炎的注射液，如Durolane and Synvisc。文献研究表明透明质酸的生理和药学功效于其分子量大小有关(1)。文献研究还表明人初乳提取的平均分子量35kDa的透明质酸片段有多种生理功能和药学功效(2、3、4、5、6、7)。人初乳提取的平均分子量35kDa的透明质酸片段在女性乳房由透明质酸酶切割制造。女性乳房是性腺，其透明质酸酶是男性性腺睾丸的精子顶体透明质酸酶PH20(8、9)。
本发明人使用重组人透明质酸酶PH20(10、11、12)6小时酶解分子量300-1600kDa的透明质酸原料，制造了平均分子量35kDa的有生物活性的透明质酸片段B-HA(13)。本发明人还使用生物活性透明质酸片段B-HA做原料，制造了1类医疗器械B-HA产品(LUQIN FoodDrug Medical Device registration number:20190021)。这些1类医疗器械B-HA产品曾被用来进行说明书外临床研究临床表现为红肿硬痛的皮肤粘膜炎症(13、14、15、16、17)。这些临床研究结果表明生物活性透明质酸片段B-HA有明确抑制临床上皮肤粘膜红肿硬痛的活性(13、14、15、16、17)，为其临床皮肤粘膜抗炎活性提供了事实依据，其临床研究结果在地方杂志进行了发表和申报了专利(13、14、15、16、17)。图1为重组人透明质酸酶PH20充分酶解大分子透明质酸原料制造的平均分子量35±8KDa透明质酸片段B-HA抑制人皮肤红肿硬痛图解，其机制需要进一步研究。
综上所述，上述现有技术对生物活性透明质酸片段B-HA的稳定制造方法、制造原理、生物活性的作用机制和新的生物活性以及潜在新临床应用的研究还有限，还需进一步研究和开发。
背景技术参考文献：
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种采用特殊制造方法制造的透明质酸片段的新应用及其稳定制造方法。
为解决上述技术问题，本发明主要使用透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子量的透明质酸原料研究了制造平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA的稳定制造方法和制造原理。本发明还研究了这种平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA调解人中性粒细胞和单个核细胞(主要为淋巴细胞)移走、吞噬、凋亡、分泌炎症因子TNF和分泌β防卫素(beta-defensin)的作用，探讨了其治疗人中性粒细胞和淋巴细胞介导的炎症性疾病的可能性。
基于上述研究获得如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种透明质酸片段的新应用，所述透明质酸片段为使用结构上有两个结合区的透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子量透明质酸原料制造而成的平均分子量35±8KDa的透明质酸片段；所述应用为：所述透明质酸片段作为人中性粒细胞移走抑制剂的应用；和/或所述透明质酸片段作为人单个核细胞移走抑制剂的应用；和/或所述透明质酸片段作为人单个核细胞凋亡促进剂的应用；和/或所述透明质酸片段作为人中性粒细胞β防卫素分泌促进剂的应用。
另一方面，本发明提供了一种透明质酸片段的新应用，所述透明质酸片段为使用结构上有两个结合区的透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子量透明质酸原料制造而成的平均分子量35±8KDa的透明质酸片段；所述应用为：所述透明质酸片段在制备治疗中性粒细胞移走相关炎症性疾病药物中的应用；和/或所述透明质酸片段在制备治疗人单个核细胞移走相关炎症性疾病药物中的应用；和/或所述透明质酸片段在制备治疗人单个核细胞凋亡相关炎症性疾病药物中的应用；和/或所述透明质酸片段在制备人中性粒细胞β防卫素治疗的炎症性疾病药物中的应用。
作为本发明进一步地改进，所述人单个核细胞凋亡为人淋巴细胞凋亡。
再一方面，本发明提供了一种透明质酸片段的稳定制造方法，使用结构上有两个结合区的透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子量透明质酸原料制造平均分子量35±8KDa的透明质酸片段；酶解时间为10-20分钟。
再一方面，本发明还提供了一种透明质酸酶注射液及透明质酸注射液的联合应用方法，所述透明质酸酶注射液为结构上有两个结合区的透明质酸酶PH20的注射液，所述透明质酸注射液为高或中分子量透明质酸的注射液；透明质酸酶注射液及透明质酸注射液在注射前预混10-20分钟，使透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子量透明质酸制造成平均分子量35±8KDa的透明质酸片段。
进一步地，所述足量或轻度过量充分酶解为：
(1)10-20分钟足量或轻度过量充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量和1-6小时足量或轻度过量充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量基本一致，变异系数CV<15％；
(2)>99％高或中分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解的低分子透明质酸片段产物被022um滤膜全部顺利滤过；
(3)透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后没有残留或少量残留，残留量<15％，80度45分钟可以全部灭活。
进一步地，所述透明质酸酶PH20为重组人透明质酸酶PH20或牛睾丸透明质酸酶PH20；所述高分子透明质酸的分子量为1600kDa；所述中分子透明质酸的分子量为300kDa；所述透明质酸片段的平均分子量为35±8KDa。
进一步地，所述透明质酸片段的平均分子量为35±8kDa。
进一步地，足量或轻度过量充分酶解高分子量透明质酸时，所述透明质酸酶PH20的用量为20000U/g；足量或轻度过量充分酶解中分子量透明质酸时，所述透明质酸酶PH20的用量为5000U/g。
本发明建立了一种平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA的稳定制造方法，发现了其制造原理和抗炎活性。本发明表明在一定的反应时间范围内不同来源不同结构的透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解高分子量或中分子量的透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量大小明显不同，其生物活性和受体结合活性也不同。本发明发现10-20分钟足量或轻度过量充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量和1-6小时足量或轻度过量充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量基本一致。本发明发现重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解制造的平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA抑制新鲜提取的人中性粒细胞移走、抑制新鲜提取的人中性粒细胞移走、促进新鲜提取的人单个核细胞(主要为淋巴细胞)凋亡和促进新鲜提取的中性粒细胞β防卫素分泌。这个研究进一步提示这种平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA是治疗人中性粒细胞和淋巴细胞介导的和中性粒细胞β防卫素治疗的炎症性疾病的候选药物。
附图说明
上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1.重组人透明质酸酶PH20充分酶解大分子透明质酸原料制造的平均分子量35±8KDa透明质酸片段B-HA抑制人皮肤红肿硬痛图解。
图2为使用重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量(20000U/g透明质酸)充分酶解和非足量(3000U/g透明质酸)部分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量曲线；
图3为使用重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量(5000U/g透明质酸)充分酶解和非足量(1000U/g透明质酸)部分酶解中分子量300kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量曲线；
图4为使用提取牛睾丸透明质酸酶pH20足量或轻度过量(20000U/g透明质酸)充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量曲线；
图5为使用重组水蛭透明质酸酶足量或轻度过量(100000U/g透明质酸)充分酶解和非足量(20000U/g透明质酸)部分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量曲线；
图6使用重组水蛭透明质酸酶足量或轻度过量(25000U/g透明质酸)充分酶解和非足量(5000U/g透明质酸)部分酶解中分子量300kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量曲线；
图7、图8分别为B-HA和HA抑制中性粒细胞移走的柱状对比图及效果对比图(n＝4，胶滴内外分别含5％和10％FBS)；
图9、图10分别为B-HA和HA抑制单个核细胞移走的柱状对比图及效果对比图(n＝4，注：胶滴内外分别含5％和10％FBS)；
图11为B-HA和HA对人中性粒细胞吞噬荧光颗粒的柱状对比图；
图12为B-HA对联合培养的人中性粒细胞和人血管上皮细胞分泌防卫素的效果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明进行说明，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
目的：研究使用不同透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解和非足量部分酶解高或中分子透明质酸原料生产低分子透明质酸片段的稳定制造方法和制造原理。
方法：
1、本发明使用的透明质酸和透明质酸片段分子量的测定方法包括电泳测定方法和18角度激光测定方法。高或中分子量透明质酸原料生产厂家和本发明采用粘度计和18角度激光测定。
2、透明质酸原料：平均分子量300kDa(中分子)和1600kDa(高分子)的透明质酸原料(华西福瑞达生物科技有限公司)。
3、透明质酸酶：重组人透明质酸酶PH20(绍兴惠荟科技有限公司)、提取牛睾丸透明质酸酶PH20(1500u/支，H31022111，上海第一生化制药厂)、重组水蛭透明质酸酶(江南大学)。以上透明质酸酶的活性测定方法不同，本发明按供应商提供的活性标记。重组水蛭透明质酸酶详见参考文献Yuan Panhong，Kang Zhen,Jin Peng,Liu Long,Zhu Guocheng,Chen Jian,Preparation of small hyaluronan by enzymatic hydrolysis in vitro(Chinese),Journal of Food Science and Technology,2016,34(2):51-55；Peng Jin,Zhen Kang,Na Zhang,Guoheng Du,and Jian Chen,High-yield novel leechhyaluronidase to expedite the preparation of specific hyaluronan oligomers,Scientific Reports,DOI:10.1038/srep04471(2014)。
4、使用相同的生产方法酶解制造低分子透明质酸片段：先采用预实验确定重组人透明质酸酶PH20(以下称PH20)、提取牛睾丸透明质酸酶PH20和重组水蛭透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解和非足量部分酶解的酶使用量,然后再生产制造。透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解的定义为：(1)10-20分钟足量或轻度过量充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量和1-6小时足量或轻度过量充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量基本一致(变异系数CV<15％)；(2)>99％高或中分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解的低分子透明质酸片段产物被022um滤膜全部顺利滤过；(3)透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后基本没有残留或少量残留(<15％)，80度45分钟全部灭活。透明质酸酶非足量部分酶解定义为10-20分钟酶解高分子(通过本研究预实验决定为1600kDa)或中分子(通过本研究预实验决定为300kDa)透明质酸原料的透明质酸片段分子量较大，1-6小时酶解的高或中分子透明质酸原料的透明质酸片段分子量较小，既部分酶解或非充分酶解的高或中分子透明质酸原料后形成透明质酸片段分子量大小按酶解时间长短由低到高的梯度。透明质酸酶解制造的时间点包括：10分钟、20分钟、40分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时酶解。重组人透明质酸酶PH20和提取牛睾丸透明质酸酶pH20酶解反应使用pH7.4。重组水蛭透明质酸酶使用pH 6.5。
5、使用不同生产方法制造低分子量透明质酸片段：本发明使用的透明质酸片段制造方法包括使用重组人透明质酸酶PH20和重组水蛭透明质酸酶的制造方法，还包括酸、碱、热、臭氧、超声等理化(或非生物酶)制造方法。
图2为使用重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量(20000U/g透明质酸)充分酶解和非足量(3000U/g透明质酸)部分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量曲线。透明质酸酶解后测定酶解产物透明质酸片段的取样时间为10分钟、20分钟、40分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时。
图2的结果表明重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量(20000U/g透明质酸)充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的所有透明质酸片段的平均分子量在30-40kDa之间变动，既35kDa上下变动(35±8kDa，n＝10)。本发明发现(1)10-20分钟短时间充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段和1-6小时长时间充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段产物的分子量基本一致(变异系数CV<15％)；(2)>99％高分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解成可以被0.22um滤膜有效滤过的低分子透明质酸片段产物；(3)透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后基本没有或很少残留(<15％)，65度60分钟可以全部灭活。
图2的结果进一步表明透明质酸酶PH20非足量(3000U/g透明质酸)部分酶解高分子量1600kDa透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量在45-105kDa之间，10-20分钟短时间酶解高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段分子量较大，1-6小时长时间酶解高分子透明质酸原料的透明质酸片段分子量较小，既部分酶解高分子透明质酸原料后形成的透明质酸片段分子量大小按酶解时间长短由低到高的梯度。
图3为使用重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量(5000U/g透明质酸)充分酶解和非足量(1000U/g透明质酸)部分酶解中分子量300kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量曲线。透明质酸酶解后测定酶解产物透明质酸片段的取样时间为10分钟、20分钟、40分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时。
图3的结果表明重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量(5000U/g透明质酸)充分酶解中分子量300kDa的透明质酸原料制造的所有透明质酸片段的平均分子量在30-40kDa之间变动，既35kDa上下变动(35±6kDa，n＝10)。本发明发现(1)10-20分钟短时间充分酶解高分子量300kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段和1-6小时长时间充分酶解高分子量300kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段产物的分子量基本一致(变异系数CV<15％)；(2)>99％高分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解成可以被022um滤膜有效滤过的低分子透明质酸片段产物；(3)透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后基本没有或很少残留(<15％)，65度60分钟可以全部灭活。
图3的结果进一步表明透明质酸酶PH20非足量(1000U/g透明质酸)部分酶解高分子量300kDa透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量在43-102kDa之间，10-20分钟短时间酶解高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段分子量较大，1-6小时长时间酶解高分子透明质酸原料的透明质酸片段分子量较小，既部分酶解高分子透明质酸原料后形成的透明质酸片段分子量大小按酶解时间长短由低到高的梯度。
图4为使用提取牛睾丸透明质酸酶pH20足量或轻度过量(20000U/g透明质酸)充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量曲线。透明质酸酶解后测定酶解产物透明质酸片段的取样时间为10分钟、20分钟、40分钟、1小时、2小时、3小时、4小时5、小时6小时。
图4的结果表明提取牛睾丸透明质酸酶PH20足量或轻度过量(20000U/g透明质酸)充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的所有透明质酸片段的平均分子量在30-40kDa之间变动，既34kDa上下变动(34±4kDa，n＝10)。本发明发现(1)10-20分钟短时间充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段和1-6小时长时间充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段产物的分子量基本一致(变异系数CV<15％)；(2)>99％高分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解成可以被022um滤膜有效滤过的低分子透明质酸片段产物；(3)透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后基本没有或很少残留(<15％)，65度60分钟可以全部灭活。
图5为使用重组水蛭透明质酸酶足量或轻度过量(100000U/g透明质酸)充分酶解和非足量(20000U/g透明质酸)部分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量曲线。透明质酸酶解后测定酶解产物透明质酸片段的取样时间为10分钟、20分钟、40分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时。
图5的结果表明重组水蛭透明质酸酶足量或轻度过量(100000U/g透明质酸)充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的所有透明质酸片段的分子量平均1.0kDa。本发明发现(1)10-20分钟短时间充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段和1-6小时长时间充分酶解高分子量1600kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段产物的分子量一致；(2)>99％高分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解成可以被022um滤膜有效滤过的低分子透明质酸片段产物；(3)透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后基本没有或很少残留(<15％)，65度60分钟可以全部灭活。
图5的结果进一步表明重组水蛭透明质酸酶非足量(20000U/g透明质酸)部分酶解高分子量1600kDa透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量在2-8kDa之间，10-20分钟短时间酶解高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段分子量较大，1-6小时长时间酶解高分子透明质酸原料的透明质酸片段分子量较小，既部分酶解高分子透明质酸原料后形成的透明质酸片段分子量大小按酶解时间长短由低到高的梯度。
以上研究结果与重组水蛭透明质酸酶提供单位的文献报道基本相符(YuanPanhong，Kang Zhen,Jin Peng,Liu Long,Zhu Guocheng,Chen Jian,Preparation ofsmall hyaluronan by enzymatic hydrolysis in vitro(Chinese),Journal of FoodScience and Technology,2016,34(2):51-55；Peng Jin,Zhen Kang,Na Zhang,GuohengDu,and Jian Chen,High-yield novel leech hyaluronidase to expedite thepreparation of specific hyaluronan oligomers,Scientific Reports,DOI:10.1038/srep04471(2014))。
图6为使用重组水蛭透明质酸酶足量或轻度过量(25000U/g透明质酸)充分酶解和非足量(5000U/g透明质酸)部分酶解中分子量300kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量曲线。透明质酸酶解后测定酶解产物透明质酸片段的取样时间为10分钟、20分钟、40分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时。
图6的结果表明重组水蛭透明质酸酶足量或轻度过量(25000U/g透明质酸)充分酶解中分子量300kDa的透明质酸原料制造的所有透明质酸片段的分子量平均1.0kDa。本发明发现(1)10-20分钟短时间充分酶解高分子量300kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段和1-6小时长时间充分酶解高分子量300kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段产物的分子量一致；
(2)>99％高分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解成可以被022um滤膜有效滤过的低分子透明质酸片段产物；(3)透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后基本没有或很少残留(<15％)，65度60分钟可以全部灭活。
图6的结果进一步表明重组水蛭透明质酸酶非足量(5000U/g透明质酸)部分酶解中分子量300kDa透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量在2-5kDa之间，10-20分钟短时间酶解高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段分子量较大，1-6小时长时间酶解高分子透明质酸原料的透明质酸片段分子量较小，既部分酶解高分子透明质酸原料后形成的透明质酸片段分子量大小按酶解时间长短由低到高的梯度。
以上研究结果与重组水蛭透明质酸酶提供单位的文献报道基本相符(YuanPanhong，Kang Zhen,Jin Peng,Liu Long,Zhu Guocheng,Chen Jian,Preparation ofsmall hyaluronan by enzymatic hydrolysis in vitro(Chinese),Journal of FoodScience and Technology,2016,34(2):51-55；Peng Jin,Zhen Kang,Na Zhang,GuohengDu,and Jian Chen,High-yield novel leech hyaluronidase to expedite thepreparation of specific hyaluronan oligomers,Scientific Reports,DOI:10.1038/srep04471(2014))。
讨论：
本发明结果表明使用不同透明质酸酶(重组人透明质酸酶PH20、提取牛透明质酸酶PH20和重组水蛭透明质酸酶)足量或轻度过量充分酶解高分子和中分子透明质酸原料制造的透明质酸片段分子量大小明显不同(图1，2，3，4，5)。例如，最近CEDARS-SINAI MEDICALCENTER的Gorege Liu等多个实验室的研究(见本段引用的参考文献)表明细菌streptococci透明质酸酶切割产生的透明质酸片段分子量为2Mers(约400Da)。细菌Streptomyces透明质酸酶产生的透明质酸片段分子量为4-16mers(约800-5600Da)，也提示不同透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解高分子和中分子透明质酸原料制造的透明质酸片段分子量大小不同。Gorege Liu实验室的研究还表明这些不同分子量的酶切产物调解免疫的作用也不同，进一步支持本实验使用不同透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解高分子和中分子透明质酸原料制造的透明质酸片段分子量大小和功能都不同的观点。
本段引用的参考文献
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本发明结果(图2，3，4，5，6)还表明透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解高或中分子透明质酸原料的时间长短与制造的透明质酸片段分子量大小关系不密切，10-20分钟短时间充分酶解高或中分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量和1-6小时长时间充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量基本一致(变异系数CV<15％)。本发明结果进一步表明使用重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子透明质酸原料可以稳定制造平均分子量35±8KDa或接近的商业化透明质酸片段。
本发明还发现透明质酸酶酶解的低分子透明质酸片段产物均能被0.22um滤膜全部滤过，而高分子和中分子透明质酸原料不能被0.22um滤膜滤过。本发明结合酶解前后透明质酸含量测定和凝胶电泳测定发现>99％中和高分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解成可以被0.22um滤膜全部滤过的低分子透明质酸片段。本发明进一步发现透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后残留<15％，65度60分钟可以全部灭活。
在所有透明质酸酶中(见本段引用的参考文献)，透明质酸酶PH20是唯一在中性pH条件下反应的透明质酸酶，其结构特殊，具有两个结合点，既N端透明质酸和C端卵子透明带两个结合点。换句话说，PH20即是透明质酸酶，也是卵子透明带的吸附蛋白。
本段引用的参考文献：
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以上发现的制造原理，既使用不同来源的透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解高或中分子透明质酸原料制造的透明质酸片段分子量大小明显不同，与透明质酸酶的结构，既透明质酸和蛋白结合点的数目有关。不同来源的透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解制造的透明质酸片段的分子量大小还与生物活性和受体结合活性有关(Cyphert JM,TrempusCS,Garantziotis S:Size matters:molecular weight specificity of hyaluronaneffects in cell biology(Review Article).Int J Cell Biol2015,2015:1-8.)。
综上所述，足量或轻度过量充分酶解方定义为：(1)10-20分钟短时间充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量和1-6小时长时间充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量基本一致(变异系数CV<15％)；(2)>99％中和高分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解成可以被022um滤膜有效滤过的低分子透明质酸片段产物；(3)透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后基本没有或很少残留(<15％)，80度45分钟可以全部灭活。
文献研究表明人初乳提取的透明质酸片段平均分子量35kDa(背景介绍参考文献2、3、4、5、6、7)，最大可能由男性性腺睾丸的精子顶体透明质酸酶PH20制造(背景介绍参考文献8、9)。本发明表明这种由女性乳房制造的平均分子量35kDa的透明质酸片段可以由重组人男性性腺睾丸的精子顶体透明质酸酶PH20(背景介绍参考文献89)和牛睾丸提取的透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解分子量1600kDa或分子量300kDa的透明质酸原料稳定获得(图2，3，4，5，6)。本发明结果表明在一定的时间范围内使用PH20足量或轻度过量充分酶解分子量1600kDa或300kDa透明质酸原料均得到上下变动不大的平均分子量35kDa的透明质酸片段。因此，本发明建立了稳定的重组人透明质酸酶PH20切割平均分子量1600kDa或分子量300kDa的透明质酸原料制造平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA方法，明确了其制造原理。换句话说，使用人和牛透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解切割透明质酸原料制造的酶解产物的平均分子量都是上下变动不大的35±8KDa。本制造方法，既透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解高分子和中分子透明质酸原料的时间长短，对产品B-HA的分子量影响不大。
结论：1.使用不同透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解高分子和中分子透明质酸原料制造的透明质酸片段分子量大小明显不同；2.透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解高分子和中分子透明质酸原料的时间长短与制造的透明质酸片段分子量大小关系不密切，选择范围大；3.这个发现和制造原理可能与透明质酸酶的结构和透明质酸和蛋白结合点的数目有关；4.使用重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高分子和中分子透明质酸原料可以稳定制造平均分子量35±8KDa或接近的商业化透明质酸片段；5.不同透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解制造的透明质酸片段的分子量大小可能与受体结合和生物活性有关。
实施例2
目的：研究使用重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高分子和中分子透明质酸原料稳定制造平均分子量35±8KDa的透明质酸片段(以下称B-HA)对新鲜提取的人白细胞(中性粒细胞和单个核细胞)移走、吞噬、凋亡、TNFɑ分泌、IL-6分泌和beta-defensin分泌的作用。
结果：
1.B-HA对中性粒细胞分泌炎症因子TNFɑ的效果
表1.B-HA在有无红细胞存在的情况下均不明显促进或抑制人中性粒细胞分泌TNFɑ(p>0.05；p>0.05)。使用不同健康志愿者新鲜提取的人中性粒细胞得到类似结果。
表1.B-HA在有无红细胞存在的情况下对人中性粒细胞分泌TNF的作用。
2.B-HA和HA对人中性粒细胞移走的作用
图7和图8结果表明fMLP组和Blank组比较差异非常显著，P<0.01；LPS组和Blank组比较差异显著，P<0.05；B-HA组和Blank组比较差异显著，P<0.05；HA组和Blank组比较差异显著，P<0.05。
图9和图10结果表明fMLP组和Blank组比较差异非常显著，P<0.05；LPS组和Blank组比较差异显著，P<0.05；B-HA组和Blank组比较差异非常显著，P<0.01；HA组和Blank组比较差异显著，P<0.05。
讨论：
本发明使用新鲜提取的人中性粒细胞和人单个核细胞(主要为淋巴细胞)研究透明质酸片段B-HA的抗炎活性。
虽然B-HA和HA都抑制了中性粒和单个核细胞的移走，但分子量35±8KDa的B-HA人体组织渗透性远比分子量1600kDa的HA更好，更有药用价值。另外，分子量35±8KDa的B-HA比分子量1600kDa的HA粘度小很多，对人体组织，尤其是小血管的堵塞副作用小。由于B-HA和HA都抑制了中性粒和单个核细胞的移走，因此它们通过细胞表面CD44结合产生作用的可能性大(见本段参考文献)。
白细胞包括55-70％中性粒细胞、20-40％淋巴细胞和3-10％单核细胞。中性粒细胞靶向移走到炎症区释放炎症因子也是靶向引发炎症性损伤的原因(见本段参考文献)。因此，人体组织渗透性好的低分子量B-HA阻断人中性粒和单个核细胞的炎症区靶向移走药学和临床意义重大。同时，低分子量B-HA不促进主要炎症因子TNFɑ分泌，表明其副作用小，更有临床价值。
本段参考文献：
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3、B-HA、HA和中性粒细胞吞噬
图11所示，B-HA和HA对人中性粒细胞吞噬荧光颗粒的效果中，B-HA与Blank相比较无显著差异，P>0.05；HA与Blank相比较无显著差异，P>0.05；LPS与Blank相比较差异非常显著，<P<0.01。
4.B-HA和HA对人中性粒细胞和单个核细胞凋亡的效果
本发明已有结果表明LPS明显抑制中性粒细胞凋亡，支持本发明方法可靠。本发明还表明LPS对单个核细胞凋亡无明显作用。表2的结果提示B-HA对人中性粒细胞凋亡没有明显作用(p>0.05)。表3的结果提示B-HA促进单个核细胞凋亡(p<0.01)。
表2.B-HA对中性粒细胞凋亡的效果。
| V | A | L | A+L | |
| Blank | 75.80 | 15.29 | 8.28 | 23.57 |
| Blank | 73.88 | 16.57 | 8.29 | 24.86 |
| B-HA | 73.94 | 15.99 | 9.38 | 25.37 |
| B-HA | 73.27 | 17.39 | 8.48 | 25.87 |
注：V代表非凋亡细胞；A代表早期凋亡细胞；L代表晚期凋亡细胞。
表3.B-HA对单个核细胞凋亡的效果。
| V | A | L | A+L | |
| Blank | 83.86 | 11.78 | 4.25 | 16.03 |
| Blank | 86.23 | 9.59 | 4.15 | 13.75 |
| B-HA | 78.52 | 12.77 | 8.65 | 21.42 |
| B-HA | 79.80 | 11.44 | 8.69 | 20.13 |
注：V代表非凋亡细胞；A代表早期凋亡细胞；L代表晚期凋亡细胞。
讨论：单个核细胞主要为淋巴细胞和少量单个核细胞。淋巴细胞袖状渗出是慢性皮肤炎症的特征之一。Lyve-1是CD44类似物，广泛分布于人体淋巴系统(本段参考文献)。HA和B-HA均可能与人体透明质酸受体Lyve-1结合。B-HA促进单个核细胞凋亡的效果可能也通过人体透明质酸受体Lyve-1结合。B-HA促进单个核细胞凋亡的效果提示其抑制淋巴细胞相关慢性炎症的作用。
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5.B-HA和HA对人中性粒细胞分泌beta-defensin的效果
图12的结果表明B-HA组和Blank组比较差异非常显著，P<0.001；LPS组和Blank组比较差异显著，P<0.001。图12的结果表明B-HA对联合培养的人中性粒细胞和人血管上皮细胞防卫素分泌有明显促进作用。
讨论：本段参考文献报道HA35对上皮细胞等beta-defensin分泌有促进作用，但对人中性粒细胞defensins分泌没有报道。本发明首次研究了生产方法明确的B-HA对人新鲜提取的中性粒细胞beta-defensin分泌进行了研究。
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文献研究表明活性多肽防卫素主要在炎症区靶向移走的中性粒细胞中制造，其拥有三个二硫键结构异常稳定，即使在中性粒细胞死亡后局部释放仍有抗炎症抗菌等多种生物活性(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11)。因此，发现不引发炎症因子TNF等分泌的中性粒细胞防卫素分泌诱导剂对无副作用治疗人类炎症性疾病很重要(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11)。本发明结果提示B-HA刺激体内中性粒细胞大量制造活性多肽防卫素并在这些含有大量活性多肽防卫素等的中性粒细胞靶向移走到炎症区释放或死亡后释放活性多肽防卫素等产生抗炎抗菌的治疗作用。
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实施例3
目的:使用商品化的透明质酸酶PH20注射液和高分子透明质酸注射液短时间制造平均分子量为35.4kDa的B-HA或HA35治疗蚊虫叮咬造成的局部大面积红肿硬痛的高敏炎症反应。
方法：
蚊虫(蚊子或大黄蜂)叮咬的高敏反应(有快速产生的叮咬局部大面积红肿硬痛)病人12例。说明书外使用以下注射液患处注射，然后观察治疗后叮咬局部大面积红肿硬痛的变化情况。
注射前将重组人透明质酸酶PH20注射液(Hylenex,150unit/mL injectionsolution，Hylozyme Inc)和平均分子量1600kDa的Durolane20mg/ml,3ml/Vial(Genvrier)按透明质酸酶20000U/g透明质酸比例混合，37度20分钟，足量或轻度过量充分酶解制造平均分子量为35.4kDa的B-HA或HA35(参考实施例1图1)。或注射前将提取牛睾丸透明质酸酶PH20(1500u/支，H31022111，上海第一生化制药厂)和平均分子量1600kDa的透明质酸注射液10mg/ml,2ml/Vial(施沛特)按透明质酸酶20000U/g透明质酸比例混合，37度20分钟，足量或轻度过量充分酶解制造平均分子量为35.4kDa的B-HA或HA35(参考实施例1图3)。使用所制造的平均分子量为35.4kDa的B-HA或HA35在蚊虫或蜂叮咬红肿硬处注射。注：以上两种方法制造的混合液留样使用凝胶电泳和18角度激光测定其平均分子量为35.4kDa。
结果:
使用商品化的透明质酸酶PH20注射液和高分子透明质酸注射液短时间制造平均分子量为35.4kDa的B-HA或HA35患处局部注射快速治疗蚊虫叮咬造成的局部大面积红肿硬痛的高敏炎症反应。
表4.使用商品化的透明质酸酶PH20注射液和高分子透明质酸注射液短时间制造平均分子量为35.4kDa的B-HA或HA35患处局部注射快速治疗蚊虫叮咬造成的局部大面积红肿硬痛的高敏炎症反应的情况。
结论:使用商品化的透明质酸酶PH20注射液和高分子透明质酸注射液短时间足量或轻度过量充分酶解制造平均分子量为35.4kDa的B-HA或HA35快速治疗蚊虫叮咬造成的局部大面积红肿硬痛的高敏炎症反应。
本发明发现了使用分子较大有两个结合区的重组人透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高分子量1600kDa或300kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段的平均分子量35±8KDa的活性透明质酸片段。本发明还发现使用其它分子较小的有一个结合区透明质酸酶如水蛭和链球菌透明质酸酶超剂量和超长时间生物酶解不同分子量的透明质酸原料均稳定生产出分子量2.6kDa和0.8kDa的透明质酸片段。本发明结果提示在一定的酶用量和酶解时间范围内不同来源的透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解高分子量1600kDa或300kDa的透明质酸原料制造的透明质酸片段产分子量大小不同，其生物活性或功能也不同。本发明发现平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA抑制人中性粒细胞移走和促进人单个核细胞(主要为淋巴细胞)凋亡,提示平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA是治疗人中性粒细胞和淋巴细胞介导的炎症性疾病的候选药物。同时，本发明进一步发现平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA促进中性粒细胞防卫素分泌，是中性粒细胞介导的组织炎症区靶向释放的防卫素抗炎抗菌制剂。
综上所述，本发明完成了一种平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA的稳定制造方法、制造原理和抗炎活性研究，为这种平均分子量35±8KDa的透明质酸片段B-HA的药学研究奠定了基础。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种透明质酸片段的新应用，其特征在于，所述透明质酸片段为使用结构上有两个结合区的透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子量透明质酸原料制造而成的平均分子量35±8KDa的透明质酸片段；
所述应用为：
所述透明质酸片段作为人中性粒细胞移走抑制剂的应用；
和/或所述透明质酸片段作为人单个核细胞移走抑制剂的应用；
和/或所述透明质酸片段作为人单个核细胞凋亡促进剂的应用；
和/或所述透明质酸片段作为人中性粒细胞β防卫素分泌促进剂的应用。
2.一种透明质酸片段的新应用，其特征在于，所述透明质酸片段为使用结构上有两个结合区的透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子量透明质酸原料制造而成的平均分子量35±8KDa的透明质酸片段；
所述应用为：
所述透明质酸片段在制备治疗中性粒细胞移走相关炎症性疾病药物中的应用；
和/或所述透明质酸片段在制备治疗人单个核细胞移走相关炎症性疾病药物中的应用；
和/或所述透明质酸片段在制备治疗人单个核细胞凋亡相关炎症性疾病药物中的应用；
和/或所述透明质酸片段在制备人中性粒细胞β防卫素治疗的炎症性疾病药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的新应用，其特征在于，所述人单个核细胞凋亡为人淋巴细胞凋亡。
4.一种透明质酸片段的稳定制造方法，其特征在于，使用结构上有两个结合区的透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子量透明质酸原料制造平均分子量35±8KDa的透明质酸片段；酶解时间为10-20分钟。
5.一种透明质酸酶注射液及透明质酸注射液的联合应用方法，其特征在于，所述透明质酸酶注射液为结构上有两个结合区的透明质酸酶PH20的注射液，所述透明质酸注射液为高或中分子量透明质酸的注射液；
透明质酸酶注射液及透明质酸注射液在注射前预混10-20分钟，使透明质酸酶PH20足量或轻度过量充分酶解高或中分子量透明质酸制造成平均分子量35±8KDa的透明质酸片段。
6.根据权利要求1-3任一项所述的新应用，或权利要求4所述的稳定制造方法，或权利要求5所述的联合应用方法，其特征在于，所述足量或轻度过量充分酶解为：
(1)10-20分钟足量或轻度过量充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量和1-6小时足量或轻度过量充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量基本一致，变异系数CV<15％；
(2)>99％高或中分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解的低分子透明质酸片段产物被022um滤膜全部顺利滤过；
(3)透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后没有残留或少量残留，残留量<15％，80度45分钟可以全部灭活。
7.根据权利要求1-3任一项所述的新应用，或权利要求4所述的稳定制造方法，或权利要求5所述的联合应用方法，其特征在于，所述透明质酸酶PH20为重组人透明质酸酶PH20或牛睾丸透明质酸酶PH20；
所述高分子透明质酸的分子量为1600kDa；所述中分子透明质酸的分子量为300kDa；所述透明质酸片段的平均分子量为35±8KDa。
8.根据权利要求7所述的新应用或制造方法或联合应用方法，其特征在于，所述透明质酸片段的平均分子量为35±8kDa。
9.根据权利要求7所述的新应用或制造方法或联合应用方法，其特征在于，足量或轻度过量充分酶解高分子量透明质酸时，所述透明质酸酶PH20的用量为20000U/g；
足量或轻度过量充分酶解中分子量透明质酸时，所述透明质酸酶PH20的用量为5000U/g。
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