CN101914561A - 一种具有抗菌和修复功能的融合蛋白及其生产方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗菌和修复功能的融合蛋白及其生产方法和应用。所述融合基因是将人源抗菌肽基因和细胞生长因子基因通过一段疏水性多肽接头拼接得到;所述融合蛋白是将所述融合基因采用原核或酵母表达系统表达获得,其由人源抗菌肽、多肽接头和细胞生长因子基因从融合蛋白的N端到C端依次编码。本发明同时提供了所述融合蛋白在制备治疗外伤、烧烫伤、冻伤、慢性溃疡或褥疮的药物方面的应用。本发明创造性地将这两种多肽基因融合在一起,成功构建成具有抗感染和促进损伤组织修复双重功能的融合蛋白,同时提高了作为临床用药的安全性,并且使其半衰期得到了延长。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种具有抗菌和修复功能的融合蛋白及其生产方法和应用,尤其是涉及所述融合蛋白在制备用于上皮修复和伤口愈合方面的外用药物。
技术背景
创伤愈合障碍是临床上常见的难题,包括烧烫伤、冻伤、慢性溃疡、糖尿病褥疮和感染造成的创面愈合障碍等。传统的创面护理包括通过机械或酶去除坏死组织来形成肉芽组织,同时可能需辅以抗菌治疗避免侵入性感染。一般使用如双氧水、碘酒和抗生素等多种局部抗微生物试剂,但必须考虑这些试剂对基质和新生表皮的毒副作用风险。此外,部分伤口是治疗抵抗性的,所以需要附加的治疗。研究表明机体的创伤愈合包括炎症、增殖、重新塑型三个阶段,需要多种细胞和多种生长因子参与调控。其中多肽生长因子是细胞增殖和分化的激素样调节剂。已经从各种组织和细胞中分离并鉴定了许多生长因子,其中包括但不只限于成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板衍生的生长因子、神经生长因子以及造血细胞生长因子等。
成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factors,FGFs),共有十几种,其中主要包括酸性成纤维细胞生长因子(acidic Fibroblast Growth Factor,aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bovine Fibroblast Growth Factor,bFGF)两种,是一类来源于中胚层和神经外胚层的多种类型细胞、具有广泛生物学活性的细胞生长因子。其中,aFGF具有促进神经再生、参与新生血管的形成、促进表皮细胞的增殖加速伤口愈合等生理功能,在临床上具有广泛的应用前景,可用于创伤修复、心血管疾病治疗、神经系统疾病治疗等。aFGF作用机制有以下几种假说:①诱导腺苷酸或鸟苷酸循环酶;②激发磷脂酶降解磷脂酰肌醇产生第二信使二酰基甘油和IP3,然后激活蛋白激酶C和引起钙内流;③FGF受体与酪氨酸激酶有关。然而,至今在临床实践中用aFGF治疗包括烧烫伤、冻伤、慢性溃疡、糖尿病褥疮和感染造成的创面愈合障碍等效果都不是很理想。可能的原因涉及以下几点:①伤口愈合过程往往伴发炎症过程,因而必须解决缩短创伤愈合时间、提高愈合质量的同时,又避免细菌感染;②aFGF作为多肽直接外用于伤口部位,易被机体环境失活或被伤口部位存在的蛋白酶迅速降解,活性半衰期只有数小时或更短,达不到所期望的促创面愈合的效果;③aFGF具有促有丝分裂活性可促进多种细胞的分裂、增殖,在临床上应用存在诱发或促进肿瘤生成的潜在风险。针对上述问题,可通过截短aFGF以删除其促有丝分裂的活性,改善其安全性;改造aFGF以提高其热稳定性及抗蛋白酶水解活性,从而延长其半衰期,增强其生物学活性;使用控制释放速度的持续递送系统以延长其作用时间等途径解决。
抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMP)是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子多肽,广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。人源抗菌肽LL-37存在于白细胞以及屏障器官如皮肤、粘膜、呼吸道上皮和生殖器官,全长37个氨基酸,具有典型的双亲性α螺旋结构,分子量为4.5KDa。LL-37具有广谱抗菌作用,其抗菌活性依赖其螺旋构象的形成,通过“地毯样”机制杀灭细菌。另有研究表明LL-37具有中和内毒素的作用,能与脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和CD14结合,中和LPS的生物活性。此外近年来还发现它还具有促进受伤部位血管再生的作用。这说明LL-37是一种多功能的抗菌肽,有开发成为具有抗菌和增强免疫力双重作用药物的潜力。
为了获得活性更高、多功能的蛋白类药物,大量研究通过改变肽链长度、电荷、增强螺旋度,氨基酸置换,融合相同或不同的抗菌肽/蛋白等方式来进行肽类药物分子的改造与设计。其中融合技术较为常用,目前国内外已有大量关于新型融合蛋白研究开发的报道。通过将两种或多种蛋白或其功能域或与其它分子融合成一种新的蛋白,可以取长补短,发挥其综合效应,或使其某些活性显著提高,出现单一蛋白简单合用所不具备的生物学效应。另一方面,虽有文献报道将昆虫抗菌肽、凝血酶切割序列和成纤维细胞生长因子的基因进行融合构建融合基因,并将融合基因克隆入合适的表达载体后在大肠杆菌、毕赤酵母中进行表达获得融合蛋白,哺乳动物体内的各种凝血酶能特异性识别该融合蛋白中的凝血酶切割序列并切割融合蛋白,使得该融合蛋白能裂解为具有抗菌功能的抗菌肽和修复功能的成纤维细胞生长因子从而发挥其功能。这为开发抗菌和促伤口愈合的功能蛋白药物进行了有益探索,然而现有的融合蛋白在机体被凝血酶切割后,易被机体环境失活或被伤口部位存在的蛋白酶降解,活性半衰期只有数小时或更短,达不到所期望的促创面愈合的效果。
现有技术未见既有利于发挥抗菌和修复功能的综合效应、又提高作为临床用药的安全性、并且使其半衰期得到了延长的相关融合蛋白的技术报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的融合基因,将人源抗菌肽基因和细胞生长因子基因通过一段疏水性多肽接头拼接得到,其中所述的多肽接头的氨基酸序列为(GGGGS)n,其中N是大于或等于1的整数,G表示甘氨酸残基,S表示丝氨酸残基。
本发明的另一个目的是提供一种以融合蛋白形式产生的、同时具有抗菌和促进损伤组织修复、伤口愈合功能的多肽。例如将改造后的人源抗菌肽和成纤维细胞生长因子(FGF)基因构建得到的融合基因通过原核或真核表达系统表达后获得的融合蛋白,那么所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明的再一个目的是提供生产具有上述融合蛋白的方法,该方法包括以下步骤:
(1)获得编码人源抗菌肽LL-37和细胞生长因子的DNA序列;
(2)对步骤(1)所述的DNA序列进行适当的改造;
(3)利用SOE-PCR技术构建融合基因;
(4)构建重组表达质粒;
(5)将重组表达质粒转化宿主细胞,获得表达融合蛋白的工程菌并发酵培养;
(6)纯化分离得到融合蛋白。
实现本发明目的的一个优选实施方案,其中所说的融合基因具有如SEQID NO:1所示核苷酸序列。
实现本发明目的的一个优选实施方案,所述的表达载体包括但不只限于原核表达载体pET32a或真核表达载体pPIC 9。
本发明优选的表达宿主菌是大肠杆菌或酵母菌。
步骤(1)中,其中除作为基本活性成份的融合蛋白LL37-rhaFGF或其结构类似物外,所述的细胞生长因子还可含有选自表皮细胞生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)或其衍生物的一种或多种其他生长因子。
本发明的再一个目的是提供所述融合蛋白的应用,应用于制备含有本发明具有抗菌和促进损伤组织修复双重功能的融合蛋白以及医药上可接受之载体或赋形剂的药物组合物。
所述的药物组合物还可含有选自活性蛋白质保护剂、稳定剂、皮肤渗透剂和自由基清除剂的一种或多种辅助成份。
上述的活性蛋白质保护剂包括但不只限于人低分子量肽、氨基酸、血清白蛋白及金属阳离子。并且其中优选的氨基酸是赖氨酸、丝氨酸或甘氨酸,且优选的金属阳离子是Mn2+、Cu2+、Zn2+和Mg2+。
上述的稳定剂包括但不只限于羧甲基纤维素、硫酸葡聚糖、聚乙二醇、硫酸多糖和谷胱甘肽。
上述的皮肤渗透剂包括但不只限于卓月桂氮卓酮或二甲亚砜,并且所说的自由基清除剂包括但不只限于超氧化物歧化酶及其衍生物。
本发明的再一个目的是提供按本发明方法制备的具有抗菌和修复功能的融合蛋白及含有该融合蛋白的药物组合物在预防或治疗组织损伤中的应用。
所述受损伤的组织可以是皮肤组织、粘膜组织、肌肉组织、骨组织或神经组织。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
以成纤维细胞生长因子(FGF)为例,首先采用本领域技术人员熟知的方法从人胎脑组织中提取总RNA,用Primer Premier 5.0生物软件设计特异性引物,RT-PCR扩增得到rhaFGF改构体基因,将目的片段克隆入pMD20-T载体,进行PCR、酶切、测序鉴定。根据大肠杆菌偏爱密码子合成人源抗菌肽LL37-Linker基因,将目的片段克隆入pMD20-T载体,进行PCR、酶切、测序鉴定。结果表明:所获得LL37和rhaFGF基因序列与预期完全相符,成功地获得了改造后的LL37和haFGF基因。
在成功地制备了LL37和haFGF基因的基础上,进一步以LL37/pMD20-T和rhaFGF/pMD20-T重组质粒为模板,用Primer Premier 5.0生物软件设计两对特异性引物,运用重叠延伸PCR(splice-overlap extension-PCR,SOE-PCR)技术将两段基因通过疏水性Linker序列进行体外基因重组构建具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的融合基因,命名为融合基因LL37-rhaFGF,参见附图1和附图2。将该融合基因克隆入pMD20-T载体,进行PCR、双酶切、测序鉴定。结果表明融合基因中LL37、rhaFGF和Linker序列、拼接组合的顺序及方向完全正确。运用NCBI服务器中的CDD程序和http://expasy.org网站提供的ProtParam、ProtScale、NPS@等相关生物信息学分析工具对融合蛋白的物理化学性质、功能域、疏水性、蛋白质二级结构进行预测分析。结果显示LL37-rhaFGF为阳离子蛋白,含179个氨基酸,其中酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和碱性氨基酸残基(Arg+Lys)含量分别为21和25个,分子量为19759.2Da,理论等电点为8.93,不稳定指数为41.68,脂溶性指数为72.40,GRAVY指数(两亲性指数)为-0.639。用NCBI上的CDD数据库分析该蛋白同时具有典型的CAP18_C和FGF超家族保守结构域。用ProtScale进行亲水性/疏水性分析显示该蛋白的亲水氨基酸数量大于疏水氨基酸。NPS@分析显示该蛋白二级结构以α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角为主要结构元件。
在成功地重组了融合基因的基础上进一步构建融合基因的原核表达质粒,对构建成功的重组质粒LL37-rhaFGF/pMD20-T和原核表达载体pET-32a分别进行NcoⅠ和Hind Ⅲ双酶切并以T4DNA连接酶连接,参见附图3。经菌液PCR初步鉴定为阳性的克隆摇菌抽取质粒进行NcoⅠ/Hind Ⅲ双酶切鉴定,结果表明重组质粒经NcoⅠ/Hind Ⅲ双酶切出与预期大小一致的条带,经DNA测序分析,无碱基错配,最终确定重组表达质粒LL37-rhaFGF/pET32a构建成功。
将构建成功的重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamine gel electrophoresis,SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western Blot)方法对表达产物进行分析鉴定,结果显示表达的蛋白为目的蛋白Trx-6His-LL37-rhaFGF。分别对影响外源基因表达的常规表达条件(诱导温度、诱导菌体起始浓度、诱导剂浓度、诱导时间)进行优化,发现LL37-rhaFGF/pET32a重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中最佳表达条件为:诱导温度为37℃、起始菌浓度为OD600约0.6、诱导剂IPTG的终浓度为1.0mM、诱导时间为6小时。由于诱导表达的目的蛋白带有6×His标签,能与HisTrapTM HP亲和层析柱上6×His配体特异性结合而挂在柱子上,其他杂蛋白不能与亲和层析柱结合而穿透,从而达到分离纯化的效果。再分别用含100mM、300mM、500mM咪唑的磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱目的蛋白,分段收集洗脱液,SDS-PAGE分析结果表明,100mM咪唑的PBS洗脱液中几乎不含融合蛋白,300mM咪唑的PBS洗脱液中含有大量融合蛋白,500mM咪唑的PBS洗脱液中含有少量的融合蛋白。纯化后的目的蛋白用肠激酶酶切去除Trx-6His标签蛋白,以EKaptureTM Agarose柱亲和捕获从反应混合液中去除肠激酶,酶切混合物再经HisTrapTM HP柱进一步纯化后得到融合蛋白LL37-rhaFGF,参见附图5。
木发明还涉及利用酵母分泌型(pPIC 9)表达系统表达融合蛋白LL37-rhaFGF。将构建成功的重组质粒LL37-rhaFGF/pMD20-T和真核表达载体pPIC 9分别进行NotⅠ和EcoRⅠ双酶切并以T4DNA连接酶连接,构建重组真核表达质粒LL37-rhaFGF/pPIC9,参见附图4。将重组质粒LL37-rhaFGF/pPIC9线性化后,用电转法转化至毕赤酵母宿主菌GS 115中,经高浓度G418耐受筛选试验发现少数转化子能够在含4mg/ml G418的抗性平板上生长,从而筛选得到高耐受性多拷贝阳性表达菌株GS115/pPIC9-LL37-rhaFGF。工程菌经0.5%甲醇诱导后,其发酵上清中含有重组表达的LL37-rhaFGF蛋白,SDS-PAGE证实其分子量为20KDa,与预期分子量相同。以6×His抗体作一抗,以辣根过氧化物酶标的山羊抗小鼠抗体为二抗,Western blot鉴定表达产物。结果显示诱导上清液在约20KDa处有条特异性条带而诱导前没有,Western blot鉴定为目的条带,表明融合蛋白表达成功。优化诱导表达条件(最佳温度、pH、甲醇浓度、诱导时间和培养基等条件)发现诱导温度28℃,甲醇浓度(体积比浓度)为0.5%,培养基pH5.0时表达条件最佳,在第96小时目的蛋白表达量最高,然后表达量下降,在诱导甲醇中加入0.5%(体积比浓度)的PMSF(蛋白酶抑制剂)有助于提高表达量。按照上述最佳表达条件进行大量表达,收集上清,用0.22μm微孔滤膜过滤后,过亲和层析柱进行纯化浓缩,用含100mM、300mM、500mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白,收集洗脱液,SDS-PAGE分析。100mM咪唑的PBS洗脱液中含有大量的融合蛋白,300mM咪唑的PBS洗脱液中含有少量融合蛋白,500mM咪唑的PBS洗脱液中几乎不含融合蛋白。结果表明,用含100mM咪唑的PBS洗脱液洗脱融合蛋白效果最佳,经扫描分析,纯化后融合蛋白纯度高达90%,纯化回收率约50%。将洗脱液用透析袋透析除盐后冻干,-80℃保存备用。
本发明进一步涉及含有融合蛋白LL37-rhaFGF的药物组合物,制备该药物组合的方法,以及该药物组合物在治疗组织损伤中应用。可以使用按照本发明所述方法制备的融合蛋白LL37-rhaFGF作为主要成分,与药学上可接受的赋形剂或稀释剂,以及其他辅助成份相混合,制成适于临床治疗应用的药物组合物。本发明药物组合物可被配制用来局部、肠道或阴道给药。可以按照医药工业领域已知的方法将本发明的药物组合物配制成适于局部用药的非限制性例子是溶液、喷雾剂、乳剂、软膏、悬浮剂、凝胶、贴膜和栓剂。如需要,可用添加了药物组合物的绷带或膏剂。
在制备适于局部用药的溶液时,所使用的辅助成份可以包括稀释剂或赋形剂,例如可使用生理盐水、无菌水或低浓度的(例如1-10mM)磷酸盐缓冲液(PBS)或蔗糖溶液作为稀释剂或赋形剂。可以使用抗坏血酸作为抗氧化剂,使用选自低分子量肽、人血清白蛋白、氨基酸例如丝氨酸或甘氨酸或赖氨酸及金属阳离子例如Mn2+、Mg2+、Cu2+、或Zn2+的一种或多种物质作为活性蛋白质保护剂。可经冷冻干燥,将本发明的药物组合物制成冻干粉未,使用时加入稀释剂重新配制并尽快使用之。可以使用选自羧甲基纤维素、肝素、聚乙二醇、多聚赖氨酸、硫酸多糖等高分子化合物,以及谷胱甘肽作为稳定剂,用以防止融合蛋白分子在储存期间发生分子多聚化而减少或丧失其生物学活性,或在溶液中被迅速降解。还可加入适当的皮肤渗透剂混合,按已知方法制成喷雾剂。在制备喷雾剂时最好使用可以在皮肤或创伤表面形成保护膜并具有稳定功能的基质成份。另外,也可以将本发明含有融合蛋白LL37-rhaFGF的药物组合物加在化妆品工业中已知的必要基质中制成皮肤保护剂,例如制成面膜、霜剂、乳剂、软膏、洗剂等形式的皮肤保护剂。另外,还可以在这些皮肤保护剂基质中加入自由基清除剂例如超氧化物歧化酶(SOD)或其衍生物,以及选自卓月桂氮卓酮和二甲基亚砜等的皮肤渗透剂。这样的皮肤保护剂除具有常规化妆品的功能外,还具有预防和/或治疗局部,特别是身体暴露部位组织损伤和/或感染的功能,以及刺激局部组织中上皮细胞和纤维细胞增殖,防止皮肤皱缩和老化的功能。
采用琼脂孔穴渗透法检测融合蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌等创面感染常见细菌的抑制作用,结果发现均有较强的抑菌活性,参见附图6。采用噻唑蓝(MTT)法体外检测融合蛋白对成纤维细胞和血管内皮细胞等细胞生长作用的影响,结果显示融合蛋白促NIH3T3细胞增殖的作用明显高于空白对照组,与haFGF标准品作用效果相当,参见附图7。通过体内实验观察融合蛋白对烧(创)伤小鼠模型伤口愈合情况的影响。结果显示:融合蛋白对烧烫伤具有抗感染,收敛结痂、镇痛、减少创面渗液,促进坏死组织脱落,促进上皮细胞生长和组织再生,减轻瘢痕组织增生等作用,参见附图8。这解决了现有药物中对烧烫伤治疗时间长、愈后留有疤痕等问题。可应用于制备既能缩短创伤愈合时间、提高愈合质量又能避免细菌感染的双功能新型多肽类药物,所述药物可应用于临床各度和各种面积的烧烫伤、冻伤、外伤、褥疮和慢性溃疡等创面愈合的治疗,也同时证明了本发明融合蛋白具有重要的应用价值。
最后还应指出的是,根据使用目的的不同,本发明的药物组合物中除含有作为主要活性成份的融合蛋白LL37-rhaFGF外,还可含有其他相关的生物学活性蛋白质,例如表皮细胞生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)或其衍生物,这些活性因子可与FGF协同作用,进一步提高本发明药物组合物的治疗效果。
本发明首次将人源抗菌肽LL37和经过改造的细胞生长因子进行融合,既有利于发挥二者抗菌和修复功能的综合效应,又提高了作为临床用药的安全性,并且使其半衰期得到了延长。本发明可被开发成溶液、喷雾剂、乳剂、软膏、悬浮剂、凝胶、贴膜和栓剂等产品形式,能用于治疗各度和各种面积的烧烫伤、冻伤、外伤、褥疮和慢性溃疡等创面愈合的治疗,因而具有非常好的应用前景,将给社会带来一定的经济效益和社会效益。具体将本发明有益效果归纳如下:
①首次采用SOE-PCR技术构建新的融合基因,在适宜的表达系统中表达得到融合蛋白。本发明融合蛋白综合了其亲本蛋白二者的功能,既能促进损伤组织修复,缩短创伤愈合时间、提高愈合质量又能避免细菌感染。同时本发明对该融合蛋白中细胞生长因子进行了改造,删除了其促有丝分裂活性,这克服了现有的细胞生长因子可能诱发或促进肿瘤的生成、在临床上应用存在潜在危险的缺陷(例如haFGF具促有丝分裂活性),改善了其作为临床用药的安全性。
②具体地提供了人源抗菌肽LL-37和人源性rhaFGF构建融合蛋白的具体、完整的技术方案。LL-37和人源性rhaFGF是小分子多肽,易被机体环境失活或被伤口部位存在的蛋白酶降解,活性半衰期短,达不到所期望的生物活性效果。本发明创造性地将这两种多肽基因融合在一起,成功构建成具有抗感染和促进损伤组织修复双重功能的融合蛋白,同时增加基因产物的大小,提高其热稳定性及抗蛋白酶水解活性,延长其半衰期。
③本发明采用基因工程方法构建融合基因,利用原核表达系统和真核表达系统生产融合蛋白,所需要的培养基和发酵用的实验设备均具有价格低廉和易于操作的优点,使得大批量、低成本的规模生产成为可能,具有很好的应用推广前景。
④本发明融合蛋白是蛋白质药物,可以通过降解、排泄以及受体介导的内吞等作用方式被清除,因而不会在体内蓄积,对人体无毒副作用。同时人源抗菌肽LL37不同于抗生素和其它化学类药物,具有不易产生耐药性的特点。
附图说明
图1融合基因LL37-rhaFGF的重组
图2重组质粒LL37-rhaFGF/pMD20-T构建图
图3重组原核表达质粒LL37-rhaFGF/pET32a构建图
图4重组真核表达质粒LL37-rhaFGF/pPIC9构建图
图5融合蛋白LL37-rhaFGF表达与纯化的SDS-PAGE鉴定图
图6融合蛋白的抑菌活性鉴定图
图7融合蛋白的促NIH3T3细胞增殖活性鉴定结果
图8烫伤后14天小鼠皮肤组织切片HE染色结果
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步举例描述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法,可参照本领域常规方法条件,如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的方法和条件,或按照制造产品厂商所建议的条件进行。
本发明创造性地将人源性抗菌肽LL37基因和人源性haFGF改构体基因通过一段疏水性多肽接头(Gly4Ser)3拼接成LL37-rhaFGF融合基因,并选择原核表达系统和酵母表达系统进行表达,采用的是常规的商品化的载体和表达宿主菌,本领域可以替代使用的酵母表达载体或其他原核载体不一一在实施例中赘述,但并不能因此限定本发明范围。
实施例1 LL37和haFGF基因的改造及融合基因LL37-rhaFGF的构建和融合蛋白LL37-rhaFGF的制备
本实施例利用Novagen公司的pET表达系统表达融合基因LL37-rhaFGF,以pET32a(+)质粒为表达载体,宿主细胞为大肠杆菌。
根据大肠杆菌偏爱密码子合成人源抗菌肽LL37-Linker基因,在基因的5′端依次引入NcoⅠ酶切位点和肠激酶蛋白酶切位点,去掉LL37基因的3′端终止密码子,加上优化后编码15个氨基酸的疏水性多肽(Gly4Ser)3的DNA序列;其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
参照Trizol Reagent使用说明提取人胎脑组织总RNA,根据Genbank公布的haFGF(Genebank登录号:S67291)cDNA序列,用Primer Premier 5.0生物软件设计特异引物:
P1:5’-CTCTACTGTAGCAACGGGGGCCACTT-3’;
P2:5’-CCCAAGCTTATTAATCAGAAGAGACT-3’。
其中下游引物P2依次引入大肠杆菌偏爱终止密码子和Hind Ⅲ限制性内切酶酶切位点。利用RT-PCR技术扩增得到haFGF的改构体基因rhaFGF,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
利用SOE-PCR技术构建融合基因,具体方法如下:
(1)PCR扩增LLF1和LLF2:用Primer Premier 5.0生物软件设计特异性引物P3和P4,以P3、P4为引物,采用TAKALA公司的PrimeSTAR HS DNAPolymerase,PCR反应体系为25μl,反应条件为:98℃ 10sec,68℃ 30sec,循环30次,扩增得到LLF1;
以上述引物P1、P2为引物,采用TAKALA公司的PrimeSTAR HS DNAPolymerase,PCR反应体系为25μl,反应条件为:98℃ 10sec,68℃ 40sec,循环30次,扩增得到LLF2。
上述引物序列分别为:
P3:5′-CATGCCATGGCGGACGACGACGACAA-3′;
P4:5′-TGCTACAGTAGAGGCTGCCGCCACC-3′
(P3、P4引物序列中划线部分为Nco I酶切位点,斜体为重叠DNA序列部分);
P1:5′-CTCTACTGTAGCAACGGGGGCCACTT-3′;
P2:5′-CCCAAGCTTATTAATCAGAAGAGACT-3′
(P1、P1引物序列中划线部分为Hind Ⅲ酶切位点,斜体为重叠DNA序列部分)。
(2)利用SOE-PCR技术,通过三步法构建融合基因。
具体方法如下:第一步以PCR回收产物LLF1、LLF2为模板,由于LLF1的3′端和LLF2的5′端具有部分重叠链,在扩增反应中通过重叠链的延伸从而将两段基因拼接起来,合成全长的融合蛋白基因。第二步再以引物P3和P2进行大量扩增。第三步用TaKaRa Taq聚合酶为融合基因加上Poly A尾,以利于下一步的TA克隆。向0.2ml Eppendorf管中逐项加入表1所列成分组成PCR反应体系:
表1:
反应条件为:98℃ 10sec,68℃ 30sec,循环10次。取出Eppendorf管加入表2所列成分:
表2
反应条件为:98℃ 10sec,68℃ 40sec,循环30次。取出Eppendorf管加入0.125μl TaKaRa Taq(5units/μl),72℃延伸20min。用TIANgel Midi Purification Kit回收,纯化PCR产物。
将目的片段克隆入pMD 20-T载体,得到重组质粒LL37-rhaFGF/pMD20-T,转化大肠杆菌DH5α,经过蓝白斑筛选、菌液PCR鉴定、酶切鉴定及DNA测序分析,结果表明获得的融合基因中LL37、rhaFGF及linker序列、拼接组合的顺序及方向完全正确,说明融合基因重组成功,序列表见SEQ ID NO.1所示。运用NCBI服务器中的CDD程序和http://expasy.org网站提供的ProtParam、ProtScale、NPS@等相关生物信息学分析工具对融合蛋白的物理化学性质、功能域、疏水性、蛋白质二级结构进行预测分析。结果显示LL37-rhaFGF为阳离子蛋白,含179个氨基酸,其酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和碱性氨基酸残基(Arg+Lys)含量分别为21和25个,分子量为19759.2Da,理论等电点为8.93,不稳定指数为41.68,脂溶性指数为72.40,GRAVY指数(两亲性指数)为-0.639。用NCBI上的CDD数据库分析该蛋白同时具有典型的CAP18C和FGF超家族保守结构域。用ProtScale进行亲水性/疏水性分析显示该蛋白的亲水氨基酸数量大于疏水氨基酸。NPS@分析显示该蛋白二级结构以α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角为主要结构元件。
琼脂糖凝胶电泳检测LL37-linke、rhaFGF和融合基因LL37-rhaFGF的PCR产物结果见附图1所示,附图1中M代表DNA分子量标准(DL 10000),1代表LL37-linker基因;2代表rhaFGF基因;3代表重组的融合基因LL37-rhaFGF。
将重组质粒LL37-rhaFGF/pMD 20-T和表达载体pET32a分别用限制性内切酶NcoⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切,然后用T4DNA连接酶连接过夜,连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3),转化菌种涂于含有氨苄青霉素的平板,培养16~18小时后,挑取单菌落培养后进行菌液PCR、酶切鉴定及DNA测序验证,结果表明融合基因表达质粒LL37-rhaFGF/pET32a构建成功。重组原核表达质粒LL37-rhaFGF/pET32a构建过程如附图3所示。
挑取LL37-rhaFGF/pET32a阳性单菌落到5ml LB液体培养基中(1%的蛋白胨,0.5%的酵母抽提粉,85mmol/L的氯化钠),37℃、220rpm振摇8~12小时,然后将此菌液按1∶100比例接种到新鲜的LB液体培养基中,37℃、220rpm振摇至OD600约0.6时,加入终浓度为1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4~6小时。离心收集菌细胞加入1×SDS-PAGE Buffer(50mM Tris-HCl pH6.8,100mM DTT,2%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油),煮沸5min,离心,取上清加样。制作6%的浓缩胶,15%的分离胶,电泳电压:浓缩胶80V,分离胶120V。电泳结束后,凝胶进行考马斯亮蓝染色、脱色、扫描分析,因融合蛋白含179个氨基酸,理论分子量约为19759.2Da,而载体pET32a具有Trx标签蛋白,分子量约为18kDa因此表达的目的蛋白应是大约37kDa。SDS-PAGE结果表明:诱导后菌体有明显表达条带,分子量大小与预期相符,目的蛋白主要是以包涵体的形式存在于超声裂菌后的沉淀中,约占总不溶性蛋白的79%。由于目的蛋白含有pET32a编码的6×His标签,采用鼠源His单克隆抗体为一抗进行Western Blot,结果显示诱导后的含重组质粒表达菌株在37kDa处有一条特异性条带而诱导前没有,进一步证实了表达的蛋白为带有His标签的目的蛋白Trx-6His-LL37-rhaFGF。
分别对影响外源基因表达的常规表达条件(诱导温度、诱导菌体起始浓度、诱导剂浓度、诱导时间)进行优化,以提高目的蛋白的表达水平。将转化菌接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振荡培养过夜。次日,按照体积比1∶100的比例将过夜培养菌液加入到装有50ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的250ml三角瓶中振荡培养,分别在菌体浓度生长至OD600约0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0时,分别加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol后置于37℃、34℃、31℃及28℃培养温度下进行诱导表达,并分别于诱导后2h、4h、6h、8h、10h、12h收菌。表达产物经15%SDS-PAGE电泳检测,结果表明LL37-rhaFGF/pET32a重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中最佳表达条件为:诱导温度为37℃、起始菌浓度为OD600约0.6、诱导剂IPTG的终浓度为1.0mM、诱导时间为6小时。按最佳诱导表达条件诱导表达基因工程重组菌1000ml,离心收集诱导表达的菌体进行超声破菌,4℃14000rpm离心30min,收集沉淀。用包涵体溶解液(50mmoL/L Tris-HCl buffer,8mmoL/L urea,PH8.0)溶解包涵体沉淀。由于诱导表达的目的蛋白带有6×His标签,能与6×His配体特异性结合因而可利用GE healthcare的HisTrapTM HP和蛋白纯化系统进行亲和层析纯化。将变性液离心之后所得上清过预平衡的HisTrapTM HP纯化柱,用Binding buffer洗去柱子上非特异性蛋白之后进行线性洗脱,咪哇浓度范围为0~500mM,洗脱总体积为柱床的10倍。收集洗脱液,SDS-PAGE分析,经凝胶扫描分析系统分析纯化产物Trx-6His-LL37-rhaFGF的纯度约为95%。经4℃下进行梯度透析逐步去除变性剂,得到的复性蛋白用重组肠激酶室温下酶切16小时。酶切后的蛋白混合溶液用Enterokinase Capture Kit去除残留肠激酶,滤液再过HisTrapTM HP柱去除N端Trx标签,收集穿透液,用U-Tube concentrator超滤除盐浓缩后冻干,-80℃保存备用。
SDS-PAGE方法检测目的蛋白Trx-6His-LL37-rhaFGF的表达、纯化和酶切及融合蛋白LL37-rhaFGF的纯化结果见附图5所示。附图5中,M代表蛋白质分子质量标准;1-2代表E.coli BL21/pET32a-LL37-rhaFGF诱导前和诱导后全菌蛋白;3代表E.coli BL21/pET32a-LL37-rhaFGF超声破菌后包涵体;4代表纯化后目的蛋白Trx-6His-LL37-rhaFGF;5代表目的蛋白Trx-6His-LL37-rhaFGF酶切后混合物;6代表酶切后纯化的融合蛋白LL37-rhaFGF。
实施例2本发明融合蛋白LL37-rhaFGF的药效学研究
(一)体外实验:
(1)采用琼脂孔穴渗透法检测融合蛋白对金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌等细菌的抑制作用。
将纯化冻干的融合蛋白用生理盐水溶解为2.5g/L的溶液,分别加到含有铜绿假单孢菌和金黄色葡萄球菌的琼脂孔内,以2.5g/L的氨苄西林(Ampicillin)作为阳性对照,以无菌水和生理盐水作阴性对照。置于37℃培养箱培养12~16h,测量抑菌圈大小,拍照记录结果。无菌蒸馏水和生理盐水对照无抑菌圈,而Ampicillin在两种菌平板中都有抑菌圈,直径大小约为2.5cm;融合蛋白LL-37-rhaFGF对铜绿假单孢菌有明显的抑制作用,抑菌圈直径约为1.5cm,对金黄色葡萄球菌抑制也较强,抑菌圈直径约为1.2cm,见附图6所示)。
以金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌这两种创面感染常见细菌为例,提供融合蛋白LL-37-rhaFGF抑菌实验结果见附图6所示,其中A代表融合蛋白对铜绿假单孢菌的抑菌作用;B代表融合蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。1:氨苄青霉素;2:融合蛋白LL37-rhaFGF;3:无菌蒸馏水;4:生理盐水。
(2)采用MTT法体外检测融合蛋白促NIH3T3细胞增殖活性。
将对数生长期的NIH3T3细胞,以5×103个细胞/孔加到96孔板中,贴壁培养24小时后弃上清,分别加入融合蛋白(LL37-haFGF组)和标准品haFGF(标准对照组),使终浓度分别为0.0(空白对照组)、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9g/L,于37℃温度下置于5%CO2培养箱中培养24小时,MTT法测定细胞在490nm波长下光密度值,将所得结果进行t-检验,分析样品组与对照组之间的差异。结果显示当融合蛋白浓度为0.40mg/ml时,促NIH3T3细胞增殖的增值率最高,融合蛋白促NIH3T3细胞增殖的作用明显高于空白对照组具有显著性差异,而与haFGF标准品作用相当,见附图7。
附图7提供了融合蛋白的促NIH3T3细胞增殖活性实验结果。其中图A示融合蛋白促NIH3T3细胞增殖作用明显高于空白对照组;图B示融合蛋白促NIH3T3细胞增殖作用与haFGF标准品相当。
(二)动物实验:
体内实验观察融合蛋白LL37-rhaFGF对烧(创)伤小鼠模型伤口愈合情况的影响。取健康雄性SPF级BALB/c小鼠54只,体重18~21克,以戊巴比妥钠麻醉小鼠,用8%Na2S进行脱毛。预先将直径2cm的圆形铁用长直钳夹住两边,放在沸水煮沸,取出后,立即平铺于待烫部位,以圆形铁接触小鼠皮肤后开始计时,烫伤时间为30s,制造深II度烫伤。随机将小鼠分成融合蛋白组、haFGF对照组和阴性对照组(0.9%生理盐水)3组,每组18只,每日涂药1次,观察创面变化;创伤愈合时间计算以未愈合面积小于30mm2。观察试验结果:第2天对照组小鼠伤口潮湿并伴有红肿现象,表面覆盖粘性分泌物出现感染现象;haFGF对照组小鼠伤口有少量浆液渗出;融合蛋白组小鼠第2天创面干燥,开始结痂。第7天,融合蛋白组小鼠创面边缘区域出现沿表面不规则增生的大量新鲜肉芽组织;haFGF对照组小鼠创面开始结痂;而对照组创面可见溃疡,表面附有坏死组织和炎症渗出物。第14天,融合蛋白组小鼠创面肉芽组织明显向心性、团块状、瘤性增生,痂壳脱落,新生的表皮已基本覆盖创面;haFGF对照组边缘区域出现大量新鲜肉芽组织;对照组小鼠溃疡面积缩小,可见不规则增生的新鲜肉芽组织,但溃疡表面仍附有坏死组织;第21天,融合蛋白组肉芽组织及上皮完全溶在一起,增生组织平整创口处被修复,而空白对照组创口仅见薄层肉芽组织伤口收缩不明显,创面修复不平整。平均融合蛋白组小鼠比haFGF对照组提前3~5d愈合,比空白对照组伤口提前8~10d愈合,且未出现细菌感染现象,创面表面未见疤痕。
烫伤后14天脱颈处死小鼠,切取创伤部位及周围皮肤作组织病理切片。采用免疫组化和普通病理切片技术观察融合蛋白对烧(创)伤小鼠模型伤口愈合情况的影响。结果显示空白对照组表皮不完整,溃疡表面有大量坏死组织及炎症渗出物,溃疡底部毛细血管及成纤维细胞数量稀疏,并见较多炎症细胞,愈合不佳;haFGF对照组伤口表面组织棘细胞层增生肥厚,底部可见很多新生血管和成纤维细胞增生,并见少量炎症细胞,肉芽组织基本充满伤口,但伤口未完全愈合;融合蛋白组肉芽组织更明显、更致密,表面已被增生的表皮完全覆盖,伤口已基本愈合,表皮完整。烫伤后14天小鼠皮肤组织病理切片图见附图8所示,A:空白对照组;B:haFGF标准品对照组;C:融合蛋白LL37-rhaFGF组。
Claims (10)
1.一种新的融合基因,其特征在于是将人源抗菌肽基因和细胞生长因子基因通过一段疏水性多肽接头拼接得到;所述的多肽接头的氨基酸序列为(GGGGS)n,其中n是大于或等于1的整数,G表示甘氨酸残基,S表示丝氨酸残基。
2.根据权利要求1所述新的融合基因,其特征在于是将人源抗菌肽基因和成纤维细胞生长因子基因通过一段疏水性多肽接头拼接得到,所述基因具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
3.一种具有抗菌和修复功能的融合蛋白,其特征在于是将权利要求1所述的融合基因采用原核或酵母表达系统表达获得,其含有人源抗菌肽、多肽接头和细胞生长因子基因从融合蛋白的N端到C端依次编码。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白,其特征在于所述人源抗菌肽为人源抗菌肽LL-37或其衍生物;所述细胞生长因子为成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、角质细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子或其衍生物。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白,其特征在于所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
6.一种权利要求3、4和5所述融合蛋白的生产方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)获得编码人源抗菌肽LL-37和细胞生长因子的DNA序列;
(2)对所述的DNA序列进行改造;
(3)利用SOE-PCR技术构建融合基因;
(3)构建重组表达质粒;
(4)将重组表达质粒转化宿主细胞,获得表达融合蛋白的工程菌并发酵培养;
(5)纯化分离得到所述融合蛋白。
7.根据权利要求6所述方法,其特征在于步骤(3)所述表达为原核表达(pET32a)系统或酵母(pPIC 9)表达系统。
8.一种权利要求3、4和5所述融合蛋白的应用,其特征在于应用于制备治疗外伤、烧烫伤、冻伤、慢性溃疡或褥疮的药物方面。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于所述药物的剂型为溶液、喷雾剂、乳剂、软膏、悬浮剂、凝胶、贴膜或栓剂。
10.一种药物组合物,其特征在于包含如权利要求3、4和5所述的融合蛋白及其他辅助成份和医药上可接受的载体或赋形剂。
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