CN109929027A

CN109929027A - 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法

Info

Publication number: CN109929027A
Application number: CN201711351111.7A
Authority: CN
Inventors: 赵燕燕; 陶文杰; 刘丽丽; 王鑫; 王广珺
Original assignee: Shandong Bioanty Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shandong Boan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN109929027B

Abstract

本发明涉及一种VEGF捕获剂融合蛋白的纯化方法，其包括以下步骤：(1)Protein A亲和层析；(2)阴离子交换层析；和(3)阳离子交换层析。本发明的纯化方法很好的避免在阳离子交换层析中洗脱蛋白过程中发生蛋白聚集，从而很大程度减少了纯化方法的步骤。

Description

采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，尤其是一种重组血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法。

背景技术

蛋白质通常称为“生物制品”，在今天的医药领域中起重要作用。为了保证生物药剂对人类的安全性，必须特异性地去除可能引起严重危害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质等杂质。另外，药监局对人用蛋白质的质量要求标准很高。人用生物制品其最大的挑战之一是在商品化规模上开发具有成本效益和有效的蛋白质纯化方法。

通常，使用经过基因工程改造能产生感兴趣的蛋白质的哺乳动物或细菌细胞系，通过插入一种含有该蛋白质基因的重组质粒，经过细胞培养来产生蛋白质。获得含有感兴趣蛋白质的澄清溶液后，通常尝试联合应用不同层析技术来将其与细胞产生的其它蛋白质分离。这些技术根据蛋白质的电荷、疏水程度、或大小来分离蛋白质混合物。这些技术中的每一种都可采用数种不同的层析树脂，这使得可对涉及的具体蛋白质制定专用的纯化方案。

血管内皮生长因子(VEGF)是多种肿瘤与血管性眼底疾病的重要治疗靶点，通过与特异性受体——血管内皮生长因子受体(VEGFR)结合刺激新生血管的形成。

以VEGF为靶点的药物阿柏西普(Aflibercept)，称为VEGF捕获剂融合蛋白是一种重组融合蛋白，现有技术是由人血管内皮细胞生长因子(VEGFR)受体的结合区与人免疫球蛋白G1的可结晶片段(Fc)融合而成。其结构较为复杂，二硫键和糖基化位点较多，其中含有较多的碱性电荷异构体，给下游纯化工作带来很大困难。

中国专利申请(公开号CN104853763A)对该融合蛋白进行了描述，并提供了其单体的氨基酸序列。若要将该蛋白纯化为药用级别，需要四个色谱分析步骤：蛋白质A亲和色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法和疏水作用色谱法。而这些繁杂的纯化过程无疑会增加药物的生产成本。该专利申请全文以引用的方式并入本文作为参考。

然而，本申请的发明人发现，此方法在阳离子交换层析步骤之后发生了蛋白凝集现象，并且更换缓冲液和洗脱液无法避免该现象的发生，而需要进行后续处理进一步去除凝集的蛋白，以使纯化之后的产物达到质量标准。

令人惊奇的是，本申请的发明人发现，在将阳离子交换层析步骤中，将洗脱方式由等度洗脱改为线性洗脱后，得到的洗脱液中不发生蛋白聚集的现象，并且收获的体积也小于等度洗脱，大幅减少了纯化工艺所需要进行的步骤的同时，为工艺中下一步的超滤浓缩节约了时间和成本。

发明内容

基于现有技术中存在的以上问题，本发明的目的是提供改良的VEGF捕获剂融合蛋白的纯化方法，尤其是一种包括亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析三个步骤的纯化方法。本发明的纯化方法很好的避免在阳离子交换层析中洗脱蛋白过程中发生蛋白聚集。

本发明所述VEGF捕获剂融合蛋白纯化方法，包括以下步骤：

(1)Protein A亲和层析

用含盐的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将含有由SEQ ID NO:1编码的VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使所述融合蛋白吸附于Protein A亲和层析介质上，上样结束后用所述含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含盐的缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

(2)阴离子交换层析

用含盐的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡，将步骤(1)处理后的蛋白液调节至pH8.30-8.50后进行上样，使融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后用Tris缓冲液进行冲洗，再用Bis-Tris缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

(3)阳离子交换层析

用Tris-MES平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡，将从步骤(2)收集的蛋白液调节至与平衡缓冲液一致后进行上样，使所述融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗，此后进行线性洗脱，收集洗脱液；其中，所述线性洗脱以23-100％洗脱缓冲液、4-10个柱体积的方式进行。

根据本发明的优选实施方案，在所述步骤(1)亲和层析中，用pH6.8-7.2，优选pH7.0，的磷酸盐平衡缓冲液(20mM NaH₂PO₄，110Mm NaCl)对亲和层析柱MabSuRe LX进行平衡，将含有由SEQ ID NO:1编码的VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样；使融合蛋白吸附于Protein A亲和层析介质上，上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗，再用pH值是2.8-3.0、浓度为100mM/L的甘氨酸缓冲液对融合蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

根据本发明的优选实施方案，在所述步骤(2)中，用Tris平衡缓冲液(pH8.30-8.50，50mM Tris，50mM NaCl)对阴离子交换层析柱QFF进行平衡，将步骤(1)处理后的蛋白液调节至pH8.40后进行上样，使融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后用Tris缓冲液(pH 8.30-8.50，50mM)进行冲洗；再用Bis-Tris缓冲液(pH 5.8-6.1，50mM)对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

根据本发明的优选实施方案，在所述步骤(3)中，使用Tris-MES平衡缓冲液(50mMTris，50mM MES，50mM NaCl，pH5.80-5.90)对阳离子交换层析柱Capto S Impact进行平衡，将步骤(2)收集的蛋白液调节至与所述平衡缓冲液一致后进行上样，使融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后用Tris-MES平衡缓冲液进行冲洗；再以23-100％洗脱缓冲液、7-10个柱体积的方式进行线性洗脱，并收集洗脱液；所述线性洗脱过程使用上样缓冲液和洗脱缓冲液，所述上样缓冲液pH值是5.80-5.90，优选5.90，其中MES浓度为50mM/L，NaCl浓度为50mM/L；所述洗脱缓冲液pH值是5.80-5.90，优选5.90，其中MES浓度为50mM/L，NaCl浓度为220mM/L。

本发明的纯化方法很好的避免在阳离子交换层析中洗脱蛋白过程中发生蛋白聚集，从而很大程度减少了纯化方法的步骤。另一方面，在发明所述融合蛋白的纯化工艺之后，即阳离子交换层析步骤结束后还需要经过超滤/渗滤(UFDF)步骤将蛋白进行浓缩和缓冲液置换，因此洗脱液体积变小将有会提高UFDF步骤的效率。在现有技术中，在阳离子交换层析步骤之后通常要得到体积约为10个柱体积的洗脱液，而本发明所得蛋白洗脱液的体积约为3-6个柱体积。

附图说明：

图1：VEGF捕获剂融合蛋白Aflibercept的氨基酸序列(SEQ ID:NO.1)。

具体实施方式

本文将通过以下实施例进一步说明所要保护的技术方案，这些实施例不作为本发明保护范围的限制。

1.实施例

实施例1：本发明所述纯化方法

本发明使用通过重组DNA技术基因工程化的CHO细胞，通过对哺乳动物细胞的培养产生VEGF捕获剂融合蛋白。CHO细胞用补料分批方法培养，培养液经过深层过滤、protein A亲和层析、阴离子交换层析纯化过程，得到VEGF捕获剂融合蛋白发酵液，其中VEGF捕获剂融合蛋白由SEQ ID NO:1氨基酸序列编码。

本发明中所提及的层析介质均是本领域中广泛适用的，且能够从商业途径购买获得。

(1)Protein A亲和层析

用1L磷酸盐平衡缓冲液(20mM NaH₂PO₄，110mM NaCl，pH7.0)对亲和层析柱MabSuReLX进行平衡，将含有所述VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使蛋白吸附于protein A亲和介质上。上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗，再用pH2.90，浓度为100mM的甘氨酸(Glycine)缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

(2)阴离子交换层析

用1L Tris平衡缓冲液(50mM Tris，50mM NaCl，pH8.40)的对阴离子交换层析柱QFF进行平衡，然后用氢氧化钠溶液将步骤(1)处理后的蛋白液的pH调节至8.40后进行上样，使融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上；上样结束后用Tris缓冲液(50mM Tris，pH8.40)进行冲洗，再用pH 5.9，浓度50mmol/L的双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲液双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲液对融合蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

经过上述步骤，收集的洗脱液中VEGF捕获剂融合蛋白类似物的单体含量为98.17％，聚体含量为1.83％。

将上述步骤(2)获得的洗脱液进行阳离子交换层析。

(3)阳离子交换层析

在体积为20ml的Capto S Impact层析柱中进行如下纯化过程：用pH8.40的Tris-MES的平衡缓冲液(50mM Tris，50mM MES，50mM NaCl)对阳离子交换层析柱进行平衡，然后用1mol/L的磷酸将阴离子交换层析步骤中收集的蛋白液的pH调节至与平衡缓冲液一致后进行上样，使融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上。上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗。再用表1中的线性洗脱方式对蛋白进行洗脱，收集洗脱液，测定得到的洗脱液中的单体和聚体含量。

表1：

在上表线性洗脱条件下，洗脱液中的单体含量在99.50％以上，高于上样液中的含量98.17％；洗脱液中的聚体含量为0.19％-0.48％，明显低于上样液中的1.83％。得到高质量纯化产物。

实施例2

为了验证线性洗脱的效果，在体积为120ml的Capto S Impact层析柱中再进行尝试。纯化过程如下：用pH8.40的Tris-MES的平衡缓冲液(50mM Tris，50mM MES，50mM NaCl)对阳离子交换层析柱进行平衡，将阴离子交换层析步骤中收集的蛋白液的pH调节至与平衡缓冲液一致后进行上样，使融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上。上样结束后用上述平衡缓冲液进行冲洗。再用表2中的线性洗脱方式对蛋白进行洗脱，收集洗脱液，测定得到的洗脱液中的单体和聚体含量。

表2：

在上表线性洗脱条件下，洗脱液中的单体含量在99.50％以上，高于上样液中的含量98.17％；洗脱液中的聚体含量为0.20％-0.43％，明显低于上样液中的1.83％。得到高质量的纯化产物。

对比实施例1：等度洗脱

在高20cm的Capto S Impact层析柱中进行如下纯化过程：用MES平衡缓冲液(50mMMES，50mM NaCl，pH5.9)对阳离子交换层析柱进行平衡，将所述阴离子交换层析步骤中收集的蛋白液的pH调节至5.9后进行上样，使蛋白吸附于阳离子交换层析介质上。上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗，用下表中的洗脱条件进行洗脱，测定得到的洗脱液中的单体和聚体含量。

表3：

	洗脱条件	洗脱液	单体％	聚体％
					1	50mM MES，250mM NaCl，pH5.9	192ml	97.53％	2.74％
2	50mM MES，260mM NaCl，pH5.9	188ml	98.02％	1.98％
					3	50mM MES，260mM NaCl，pH5.9	210ml	97.73％	2.27％
4	50mM MES，274mM NaCl，pH5.9	203ml	97.82％	2.18％

在上表等度洗脱条件下，洗脱液中的单体含量低于上样液(98.17％)，聚体含量高于上样液。因而纯化产物不能达到质量标准。

2.实验结果的比较和分析

在实施例1、实施例2中，表1和表2的线性洗脱条件下，洗脱液中的单体含量在99.50％以上，高于上样液中的单体含量(即98.17％)。洗脱液中的聚体含量为0.19％-0.48％，明显低于上样液中的聚集体的含量(即1.83％)。而在对比实施例中，洗脱液中的单体含量低于上样液，而聚体含量高于上样液。

由此可见，本发明所述的阳离子交换层析步骤，避免在阳离子交换层析中洗脱蛋白过程中发生蛋白聚集，能够仅通过三个纯化步骤得到高质量纯化产物，从而实现了本发明的发明目的。

另一方面，根据实施例1、实施例2的实验结果，所述线性洗脱所获得的洗脱液体积仅为3-6个柱体积，明显小于通过等度洗脱而得到的洗脱液体积，提高了纯化产物后续处理步骤的效率。

序列表

<110> 山东博安生物技术有限公司

<120> 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法

<130> CP1171013/CB

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr

195 200 205

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

210 215 220

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

225 230 235 240

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

245 250 255

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

260 265 270

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

290 295 300

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

305 310 315 320

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

420 425 430

Claims

1.一种VEGF捕获剂融合蛋白的纯化方法，其包括以下步骤：

(1)Protein A亲和层析

用含盐的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将含有由SEQ ID NO:1编码的VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使所述融合蛋白吸附于Protein A亲和层析介质上，上样结束后用所述含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含盐的缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液；

(2)阴离子交换层析

用含盐的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡，将步骤(1)处理后的蛋白液调节至pH8.30-8.50后进行上样，使融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后用Tris缓冲液进行冲洗，再用Bis-Tris缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液；

(3)阳离子交换层析

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述线性洗脱过程使用上样缓冲液和洗脱缓冲液，所述上样缓冲液pH值是5.80-5.90，并包含浓度为50mM/L的MES，浓度为50mM/L的NaCl；所述洗脱缓冲液pH值是5.80-5.90，并包含浓度为50mM/L的MES，浓度为220mM/L的NaCl。

3.如权利要求2所述的纯化方法，其中，所述上样缓冲液和所述洗脱缓冲液的pH值都是5.90。

4.如权利要求1或2所述的纯化方法，其中，所述线性洗脱以23-100％洗脱缓冲液、7-10个柱体积的方式进行。

5.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(1)Protein A亲和层析中，所述含盐的平衡缓冲液是NaH₂PO₄平衡缓冲液，其中NaH₂PO₄浓度为20mM/L，NaCl的浓度为110mM/L，该缓冲液的pH值是6.8-7.2。

6.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(1)Protein A亲和层析中，所述不含盐的缓冲液为甘氨酸缓冲液，其中甘氨酸浓度为100mM/L，该缓冲液的pH值是2.8-3.0。

7.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(2)阴离子交换层析中，所述含盐的平衡缓冲液是Tris平衡缓冲液，其含有50mM/L Tris，50mM/L NaCl，该平衡缓冲液的pH值是8.30-8.50。

8.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(2)阴离子交换层析中，所述蛋白液调节至pH8.40进行上样。

9.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(2)阴离子交换层析中，所述Tris缓冲液的pH值是8.30-8.50，浓度为50mM/L；所述Bis-Tris缓冲液的pH值是5.8-6.1，浓度为50mM/L。

10.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(3)阳离子交换层析中，所述Tris-MES平衡缓冲液的pH值是8.30-8.50，其中，Tris浓度为50mM/L，MES浓度是50mM/L，NaCl浓度是50Mm/L。