KR20150070711A

KR20150070711A - 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 침출된 단백질 a 제거 방법

Info

Publication number: KR20150070711A
Application number: KR1020130157234A
Authority: KR
Inventors: 이동우; 홍현주; 민병섭; 조유영; 권병오; 권기성
Original assignee: (주)셀트리온
Priority date: 2013-12-17
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2015-06-25
Also published as: KR102123700B1

Abstract

본 발명은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 정제 과정 중 레진으로부터 떨어져 나온 침출된 단백질 A를 혼합 방식 크로마토그래피를 이용하여 제거하는 방법에 관한 것이다. 본 발명을 이용하여 항체 또는 Fc-융합 단백질을 정제할 경우 단백질 A 친화성 크로마토그래피 공정을 거치면서 포함되어 있던 침출된 단백질 A 양이 절반 이상 제거될 수 있다.

Description

혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 침출된 단백질 A 제거 방법{Method for removing leached protein A by using mixed mode chromatography}

본 발명은 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 침출된 단백질 A 제거 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 정제 과정 중 레진으로부터 떨어져 나온 침출된 단백질 A를 혼합 방식 크로마토그래피를 이용하여 제거하는 방법에 관한 것이다.

단일 클론 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 능력과 관련된 모든 부분에서 체내에 사용이 가능하기 때문에 치료제 개발에 굉장히 매력적인 도구가 되고 있다. 면역글로블린과 관련이 없는 단백질 또는 그러한 단백질의 일부분을 면역글로블린의 Fc 부분과 결합시킨 Fc-융합 단백질 또한 바이오의약품의 또 다른 중요한 분류를 형성하고 있다. 이러한 분자들은 결합시킨 파트너의 유형에 따라 작용하는 기능의 다양성을 가질 수 있다. Fc 태그는 분자의 체내에서의 반감기를 향상시킬 뿐만 아니라 단일 클론 항체에 사용되는 것과 비슷한 정제 도구를 사용을 가능하게 한다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 1972년에 발견된 이후로, 이러한 크로마토그래피의 방식은 항체와 Fc-융합 단백질의 정제와 획득을 위한 믿음직한 도구가 되어왔다.

그러나 이러한 정제 과정 중 단백질 A는 레진(resin)으로부터 떨어져 나와 단일 클론 항체 또는 Fc-융합 단백질과 함께 용출되기 때문에 최종 제품에 단백질 A가 오염되지 않도록 정제 과정 중에서 제거를 해야 한다. 단백질 A의 잠재적인 면역과 유사분열 촉진 효과에 대한 안전성 때문에, 단백질 A에 의해 정제되는 체내에 주입되는 제품은 단백질 A의 오염에 대해 ppm (part-per-million) 수준으로 감시되어야 한다. FDA는 이러한 제품에 대하여 단백질 A의 제거에 대한 문서화된 증거를 요청한다.

이러한 정제공정에서의 불순물뿐만 아니라 항체 또는 Fc-융합 단백질의 인간에 대한 바이오의약품으로서의 안정성을 보장하기 위해서는 배양 공정으로부터의 불순물들, 예를 들면, 핵산, 바이러스 및 숙주 세포 단백질 등은 또한 최대한 제거되어야 한다. 이러한 부분에서의 규제 내역을 충족시키기 위해 언급된 친화성 크로마토그래피 이외의 정제 단계가 제조 공정에 이어져야 한다. 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법 등이 잘 확립되어 있으며 널리 사용되고 있다.

최근에는 이온 교환, 수소 결합 그리고 소수성 상호작용 등의 결합 방식의 조합을 포함하는 혼합 방식 크로마토그래피가 개발되었다. 대부분의 목적 단백질 또한 다양한 속성을 동시에 가지고 있기 때문에, 이러한 단백질의 다양성과 혼합 방식 크로마토그래피의 리간드(ligand) 사이의 상호작용은 독특한 방식의 선택성을 가지게 된다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 혼합 방식 크로마토그래피를 이용하여 침출된 단백질 A(leached protein A)를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 방법을 이용한 정제 공정을 포함하는 단백질 제제의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하고자, 본 발명의 일 구체예는 하기 단계를 포함하는 침출된 단백질 A(leached protein A)를 제거하는 방법을 제공한다:

a) 목적 단백질의 pI가 7.0 이하인 경우 단백질 함유 시료를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(protein A affinity chromatography)에 적재하여 용출하는 단계; 및

b) 단계 a)에서 용출된 단백질 용액을 혼합 방식 크로마토그래피(mixed mode chromatography)에 적재한 후 pH가 pH 4.0 내지 7.0이고, 염(salt) 농도가 30 내지 200 mM인 용출 용액(elution buffer)을 사용하여 목적 단백질을 회수하는 단계.

본 발명의 다른 일 구체예는 하기 단계를 포함하는 침출된 단백질 A(leached protein A)를 제거하는 방법을 제공한다:

a) 목적 단백질의 pI가 7.0 이상인 경우 단백질 함유 시료를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(protein A affinity chromatography)에 적재하여 용출하는 단계; 및

b) 혼합 방식 크로마토그래피(mixed mode chromatography) 컬럼을 pH가 pH 4.0 내지 7.0이고, 염(salt) 농도가 30 내지 200 mM인 평형 용액(equilibration buffer)으로 평형상태를 유지시킨 후, 단계 a)에서 용출된 단백질 용액을 상기 평형 용액과 동일 조건으로 적정하여 컬럼에 적재하여 흘러나오는 통과액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계.

본 발명의 다른 일 구체예는 상기 방법을 이용한 정제 공정을 포함하는 단백질 제제의 제조 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 구체예는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 공정을 거친 항체 또는 Fc-융합 단백질에서 침출된 단백질 A를 제거하고자 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한다. 여기서, 상기 혼합 방식 크로마토그래피는 이온교환 기능과 소수성 상호작용 기능의 혼합 모드 크로마토그래피(예; Capto adhere, Capto MMC, MEP HyperCell, Eshmuno HCX, 등), 음이온 교환기능과 양이온교환 기능의 혼합 모드 크로마토그래피(예; hydroxyapatite, Ceramic hydroxyapate, 등) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예는 하기 단계를 포함하는 침출된 단백질 A(leached protein A)를 제거하는 방법을 제공한다:

a) pI가 7.0 이하인 단백질 함유 시료를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(protein A affinity chromatography)에 적재하여 용출하는 단계; 및

여기서, 상기 단계 b)의 용출 용액의 전기전도도(conductivity)는 2~25 mS/m일 수 있다.

상기 단계 b)의 혼합 방식 크로마토그래피는 결합-용출성 방식(binding-elution mode)이다. 여기서, "결합-용출성 방식" 이란 생성물 제제 분리 기술을 나타내는 것으로서, 여기서 제제 내에 포함된 하나 이상의 생성물은 크로마토그래피 수지 또는 매질에 결합되었다가 용출 단계에서 용출된다.

일 예로, pI가 7 이하인 Fc-융합 단백질의 경우, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 공정을 거친 Fc-융합 단백질 용액을 이온교환 기능과 소수성 상호작용 기능의 혼합 방식 크로마토그래피(예: Capto adhere)의 레진으로 충진된 컬럼에 로딩한 후, pH 4.0 내지 7.0와 30 내지 200 mM의 염 농도를 가진 용출 용액을 사용하여 용출하는 방법으로 침출된 단백질 A를 제거하여 정제된 목적 단백질을 얻을 수 있다. 일 구체예로서, 상기 단계 b)에서 pH 5.5 내지 6.5와 30 내지 70 mM의 염 농도를 가진 용출 용액을 사용하여 결합-용출성 방식으로 침출된 단백질 A를 제거하여 정제된 목적 단백질을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 하기 단계를 포함하는 침출된 단백질 A(leached protein A)를 제거하는 방법을 제공한다:

하기 단계를 포함하는 침출된 단백질 A(leached protein A)를 제거하는 방법:

a) pI가 7.0 이상인 단백질 함유 시료를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(protein A affinity chromatography)에 적재하여 용출하는 단계; 및

여기서, 상기 단계 b)의 평형 용액의 전기전도도(conductivity)는 2~25 mS/m일 수 있다.

상기 단계 b)의 혼합 방식 크로마토그래피는 통과-흐름성 방식(flow-through mode)이다. 여기서, 상기 "통과-흐름성 방식" 이란 생성물 제제 분리 기술을 나타내는 것으로서, 여기서 제제 내에 포함된 하나 이상의 생성물은 통과-흐름성 크로마토그래피 수지 또는 매질을 통과하여 흐르게 되고, 동시에 하나 이상의 잠재적 오염원 또는 불순물은 크로마토그래피 수지 또는 매질에 결합된다.

일 예로, pI가 7 이상인 항체의 경우, 이온교환 기능과 소수성 상호작용 기능의 혼합 방식 크로마토그래피 (예: Capto adhere) 컬럼을 pH 4.0 ~ 7.0와 30 ~ 200 mM의 염 농도를 가진 평형 용액으로 평형상태로 유지시킨 후, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 공정을 거친 항체 용액을 상기 평형 용액과 같은 조건으로 적정하여 컬럼에 로딩한 다음, 흘러나오는 통과액으로부터 정제된 목적 단백질을 얻을 수 있다. 일 구체예로서, 상기 단계 b)에서 pH 5.5 내지 6.5와 30 내지 70 mM의 염 농도를 가진 평형 용액을 사용하여 통과-흐름성 방식으로 침출된 단백질 A를 제거하여 정제된 목적 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 단계 b)에서 회수된 단백질을 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 크로마토그래피에 적재하여 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 용출 용액 또는 평형 용액은 시트르산 나트륨, 염화나트륨, 황산나트륨, 인산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨 및 인산칼륨으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 불순물을 제거하고자 하는 단백질 함유 시료 중에 포함된 단백질은 생리 활성 단백질일 수 있으며, 일 예로, 상기 단백질은 항체 또는 융합 단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 항체는 단일클론항체일 수 있으며, 일 예로, 상기 항체는 항-CD20 항체 또는 항-ErbB3 항체일 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질은 Fc 융합 단백질일 수 있으며, 일 예로, 상기 Fc 융합 단백질은 TNFa 수용체 단편과 항체 Fc 단편의 융합 단백질(이하, TNFR-Fc 융합 단백질로 지칭)일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생리 활성 단백질" 이란, 포유 동물, 예를 들어 인간의 생리 활성 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 활성을 갖는 것이고, 천연의 것 또는 유전자 재조합에 의해 얻어진 것을 포함한다. 유전자 재조합에 의한 생리 활성 단백질은, 대장균 등의 박테리아 세포; 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, BHK 세포, COS 세포, 인간 유래의 세포 등의 동물 유래의 배양 세포에서 제조할 수 있으며, 사용 전에 이를 여러 가지 방법으로 분리 및 정제할 수 있다. 유전자 재조합에 의해서 얻어지는 단백질에는 천연 단백질과 아미노산 서열이 같은 것, 및 상기 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 결실, 치환, 부가한 것으로서 상기 생물학적 활성을 보유하는 것을 포함한다. 또한, 생리 활성 단백질은 PEG 등에 의해 화학적으로 개질된 것도 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "TNFR(tumor necrosis factor receptor)-Fc 융합 단백질"은 TNFR 단백질 전부 또는 일부분이 면역글로불린의 Fc 영역과 효소 작용에 의하여 연결되거나, 또는 유전자 조작을 통하여 상기 두 폴리펩타이드가 하나의 폴리펩타이드로 발현된 결과물을 의미한다. 상기 TNFR-Fc 융합 단백질은 TNFR 단백질과 면역글로불린의 Fc 영역이 직접 연결되거나 펩타이드 링커(peptide linker)를 통하여 연결될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

생리 활성 단백질이 단일클론 항체인 경우에는 단일클론 항체는 어떠한 방법으로 제조된 것이어도 된다. 단일클론 항체는 기본적으로는 공지 기술을 사용하여, 감작 항원을 통상의 면역 방법에 따라서 면역하고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해서 공지된 부모세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해, 단일클론인 항체 생성 세포를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.

다른 방법으로는, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터에 삽입하고, 유전자 재조합 기술을 사용하여 이것을 숙주에 도입하며, 이렇게 생성시킨 유전자 재조합 항체도 본 발명의 일 구체예에서 사용할 수 있다. 구체적으로는 하이브리도마의 mRNA 로부터 역전사 효소를 사용하여 항체의 가변 영역 (V 영역) 의 cDNA를 합성한다. 목적하는 항체의 V 영역을 암호화하는 DNA 가 얻어지면 이것을 원하는 항체 불변 영역 (C 영역)을 암호화하는 DNA 와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 삽입한다. 또는 항체의 V 영역을 암호화하는 DNA 를, 항체 C 영역의 DNA 를 포함하는 발현 벡터에 삽입해도 된다. 발현 제어 영역, 예를 들어, 인핸서(enhancer) 또는 프로모터의 제어 하에서 발현되도록 DNA 구성체를 발현 벡터에 삽입한다. 다음에, 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환하여 항체를 발현시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생리 활성 단백질 함유 시료" 또는 "단백질 함유 시료" 또는 "항체 함유 시료"란 배양에 의해 얻어진 생리 활성 단백질 분자 또는 단백질 또는 항체 분자를 포함하는 CHO 세포 등의 포유 동물 세포의 배양 배지, 또는 이것에 부분적 정제 등의 일정한 처리를 실시한 것을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "불순물"은 목적하는 단백질 이외의 물질이면 어떠한 물질이어도 포함되며, 불순물의 예로서는 단백질 다량체(aggregate), 단백질 분절체(fragment), DNA 오염물, 바이러스, 단백질 A (칼럼으로부터 용출됨), 숙주세포 유래 단백질(Host cell protein), 내독소, 배지 성분인 Hy-Fish (FL), IGF 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

본 발명을 이용하여 항체 또는 Fc-융합 단백질을 정제할 경우 단백질 A 친화성 크로마토그래피 공정을 거치면서 포함되어 있던 침출된 단백질 A 양이 절반 이상 제거될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 2에 따른 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 단백질 정제 단계를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 제1 용출에 의한 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 실시예 2에 따른 제2 용출에 의한 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 3에 따른 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 단백질 정제 단계를 도시한 것이다.
도 5a 내지 5f는 본 발명의 실시예 3에 따른 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 4에 따른 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 단백질 정제 단계를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 4에 따른 크로마토그램을 도시한 것이다.

이하, 실시 예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용한 TNFRc - Fc 융합 단백질의 정제

첫 번째 단계에서 TNFRc-Fc 융합단백질(pI 3.5 - 7.0)을 단백질 A 친화성 크로마토그래피(ProSep Ultra Plus)로 정제하였다. 단백질 A 컬럼으로부터 용출은 산성 조건에서 (100mM 아세트산 나트륨 완충제, pH 3.3 ± 0.1) 하에서 수행하였다. 여과 전에 2M 트리스 완충액을 사용하여 pH를 6.1에서 6.5 사이로 적정하였고 물로 희석하여 전도도를 3mS/cm이하로 희석하였다. 단백질 A 용출액은 0.3 - 10 mg/ml의 단백질 농도를 갖고 있으며 아세트산 나트륨과 트리스로 완충시키고 물로 희석된 용액이다. 이하, 상기 물질은 혼합 방식 크로마토그래피에 적재하기 위해 제조된, 조절된 단백질 A 용출액으로 지칭된다.

실시예 2: 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 TNFRc - Fc 융합 단백질의 정제

실시예 1에서 제조된 조절된 단백질 A 용출액을 음이온 교환기능과 소수성 상호작용 기능의 혼합 방식 크로마토그래피(Capto adhere, GE Healthcare)에 적재하여 침출된 단백질 A의 함유량을 분석하였다.

크로마토그래피 조건:

- 수지: Capto adhere

- 유속: 500 cm/h

- 평형: 25 mM NaPhosphate, pH 6.3 완충액

- 적재: 최대 30g 단백질/L 수지 부피

- 멸균: 1M NaOH 용액

- 재생: 100 mM NaCitrate, pH 2.5 완충액

- 세척: 9 mM NaCitrate, pH 4.9 완충액

- 용출: i) 선형 농도 구배와 ii) 단일 단계 구배

도 1의 절차에 따라 실험이 진행되었다. 조절된 단백질 A 용출액을 혼합 방식 크로마토그래피 컬럼에 적재하였고, 컬럼을 세척 완충액으로 12 컬럼 부피만큼 세척하였다. 결합된 TNFRc-Fc 융합 단백질을 선형 농도 구배와 단일 단계 구배, 두 가지 방법으로 용출시켰다.

제 1 용출은 10 mM NaCitrate, pH 6.0 (A 용출 완충액) 완충액과 250 mM NaCitrate, pH 6.0 (B 용출 완충액)을 20 컬럼 부피에 거쳐 선형 농도 구배 방식으로 용출하였다. pH는 6.0으로 유지되었으며, 용출 동안 분획을 각각 5 ml씩 수집하였다.

제 2 용출은 A 용출 완충액과 B 용출 완충액의 비율을 달리하여 단일 단계로 구배를 주어 용출하는 방식을 도입하였다. 비율은 각각 9:1, 8:2와 7:3으로 주었고 크로마토그램 상에서 자외선이 50 mAU 만큼 올라갈 때 용출액 수집을 시작하여 50 mAU 만큼 떨어질 때 수집을 완료하였다.

제 1 용출에 의해 도 2의 크로마토그램이, 제 2 용출에 의해 도면 3a 내지 3c가 각각 생성되었다.

제 1 용출에 의해 수집된 분획들은 1번 - 5번, 1번 - 8번과 1번 - 11번까지 혼합하여 선형 농도 구배에 의해 분리된 용출액의 침출된 단백질 A(leached protein A)를 각각 항-단백질 A ELISA로 분석하였고 결과는 표 1과 같다.

제 1 용출에 의한 분획의 수율과 항-단백질 A ELISA 분석 결과

분석 샘플		수율 (%)	Leached rPA 함유량 (ppm)
조절된 단백질 A 용출액		N/A	61.21
제 1 용출	1번 - 5번	65.89%	0.21
	1번 - 8번	76.56%	0.71
	1번 - 11번	79.13%	1.43

제 2 용출의 9:1(도 3a), 8:2(도 3b)와 7:3(도 3c)의 단일 단계 구배에 의해 분리된 TNFRc-Fc 융합 단백질 또한 각각 항-단백질 A ELISA로 분석되었으며 결과는 표 2와 같다.

제 2 용출에 의한 분획의 수율과 항-단백질 A ELISA 분석 결과

분석 샘플		수율 (%)	침출된 Potein A 함유량 (ppm)
조절된 단백질 A 용출액		N/A	64.16
제 2 용출	9:1	57.12%	0.40
	8:2	69.85%	9.71
	7:3	74.56%	19.30

혼합 방식 크로마토그래피의 적재 전 물질인 조절된 단백질 A 용출액에 함유된 침출된 단백질 A의 함유량은 약 60 ppm 정도였으나, 상기의 정제 과정을 거친 후 수율을 50% 이상 유지하면서 침출된 단백질 A가 65% 이상 제거됨을 확인하였다.

실시예 3: 침출된 단백질 A 제거를 위한 용출용액의 농도 및 pH 조건 확인 시험

실시예 2와 마찬가지로 실시예 1에서 제조된 조절된 단백질 A 용출액을 음이온 교환기능과 소수성 상호작용 기능의 혼합 방식 크로마토그래피(Capto adhere, GE Healthcare)에 적재하여 침출된 단백질 A의 함유량을 분석하였다.

크로마토그래피 조건:

- 수지: Capto adhere

- 유속: 500 cm/h과 300 cm/h (표3 참고)

- 평형: 25 mM NaPhosphate, pH 6.3 완충액

- 적재: 최대 30g 단백질/L 수지 부피

- 멸균: 1M NaOH 용액

- 재생: 100 mM NaCitrate, pH 2.5 완충액

- 세척: 9 mM NaCitrate, pH 4.9 완충액

- 용출: 30 - 70 mM NaCitrate, pH 5.5 - 6.5 (표3 참고)

도 4의 절차에 따라 실험이 진행되었다. 조절된 단백질 A 용출액을 혼합 방식 크로마토그래피 컬럼에 적재하였고, 컬럼을 세척 완충액으로 12 컬럼 부피만큼 세척하였다. 결합된 TNFRc-Fc 융합 단백질을 표3과 같은 조성을 가진 완충액과 조건으로 용출시켰다.

크로마토그래피 조건

Run #	적재량 (mg/ml)	평형 조건	세척 조건	용출 조건	유속 (cm/hr)
1	30	25mM NaPi, pH 6.3	9mM NaCitrate, pH 4.9	30mM NaCitrate, pH 6.0	500
2				50mM NaCitrate, pH 5.5
3				50mM NaCitrate, pH 6.5
4				50mM NaCitrate, pH 6.0
5				70mM NaCitrate, pH 6.0
6				50mM NaCitrate, pH 6.0	300

각각의 용출은 크로마토그램 상에서 자외선이 50 mAU 만큼 올라갈 때 용출액 수집을 시작하여 50 mAU 만큼 떨어질 때 수집을 완료하였고 분리된 용출액의 침출된 단백질 A(leached protein A)를 각각 항-단백질 A ELISA로 분석하였다.

조건에 따른 용출에 의한 수율과 항-단백질 A ELISA 분석 결과

Run #	용출 조건	농도 (mg/ml)	부피 (ml)	수율 (%)	단백질 A (ppm)
0	조절된 단백질 A 용출액			N/A	120.47
1	30mM NaCitrate, pH 6.0	2.80	20.28	48.10%	LOD*
2	50mM NaCitrate, pH 5.5	4.42	17.74	66.63%	1.59
3	50mM NaCitrate, pH 6.5	4.82	16.81	68.81%	4.87
4	50mM NaCitrate, pH 6.0	5.43	15.23	70.21%	6.21
5	70mM NaCitrate, pH 6.0	7.03	12.65	75.49%	19.13
6	50mM NaCitrate, pH 6.0 (유속: 300cm/hr)	5.98	13.80	69.98%	3.50

* 검출 한계

각각의 용출에 의해 도 5a 내지 5f의 크로마토그램이 생성되었으며, 처음 혼합 방식 크로마토그래피 컬럼에 적재되기 전의 조절된 단백질 A 용출액은 120.47 ppm의 단백질 A를 포함하고 있었으나 표 4와 같이 주어진 조건 하에서 검출 한계까지 제거가 되는 결과를 볼 수 있었다.

실시예 4: 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 항체의 정제

첫 번째 단계에서 항-CD20 단일클론항체(pI 7.9 - 8.8)을 단백질 A 친화성 크로마토그래피(MabSelect^TM SuRe, GE Healthcare)로 정제하였다. 단백질 A 컬럼으로부터 용출은 산성 조건에서 (50 mM 아세트산 나트륨, 완충제, pH 3.5 ± 0.1) 하에서 수행하였다. 여과 전에 1M 트리스 완충액을 사용하여 pH를 6.0 ± 0.2로 적정하였고 물로 희석하여 전도도를 9 mS/cm로 희석하였다. 단백질 A 용출액은 0.3 - 10 mg/ml의 단백질 농도를 갖고 있으며 아세트산 나트륨과 트리스로 완충시키고 물로 희석된 용액이다. 이하, 상기 물질은 혼합 방식 크로마토그래피에 적재하기 위해 제조된, 조절된 단백질 A 용출액으로 지칭된다.

제조된 조절된 단백질 A 용출액을 음이온 교환기능과 소수성 상호작용 기능의 혼합 방식 크로마토그래피(Capto adhere, GE Healthcare)에 적재하여 침출된 단백질 A의 함유량을 분석하였다.

크로마토그래피 조건:

- 수지: Capto adhere

- 유속: 200 cm/h

- 평형 및 추격: 50 mM NaPhosphate, pH 6.0 완충액

- 적재: 최대 20g 단백질/L 수지 부피

- 멸균: 1M NaOH 용액

- 재생: 100 mM NaCitrate, pH 2.5 완충액

도 6의 절차에 따라 실험이 진행되었다. 조절된 단백질 A 용출액을 혼합 방식 크로마토그래피 컬럼에 적재하였고, 적재 후 크로마토그램 상에서 자외선이 25 mAU만큼 올라갈 때 수집을 시작하여 추격 후 25 mAU까지 자외선이 떨어졌을 때까지 수집하였다. 침출된 단백질 A(leached protein A)를 각각 항-단백질 A ELISA로 분석하였다.

도 7과 같은 크로마토그램이 생성되었다. pI가 높은 단일클론항체이기 때문에 실시예 2와 3처럼 결합-용출 방식이 아닌 통과-흐름성 방식으로 정제되었으며, 96.84%의 높은 수율을 보이면서 침출된 단백질 A는 176.7 ppm로 포함되어 있던 조절된 단백질 A 용출액에서 해당 공정을 거쳐 0.88 ppm 까지 제거된 것을 확인할 수 있었다.

Claims

하기 단계를 포함하는 침출된 단백질 A(leached protein A)를 제거하는 방법:
a) 목적 단백질의 pI가 7.0 이하인 경우 단백질 함유 시료를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(protein A affinity chromatography)에 적재하여 용출하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 용출된 단백질 용액을 혼합 방식 크로마토그래피(mixed mode chromatography)에 적재한 후 pH가 pH 4.0 내지 7.0이고, 염(salt) 농도가 30 내지 200 mM인 용출 용액(elution buffer)을 사용하여 목적 단백질을 회수하는 단계.
하기 단계를 포함하는 침출된 단백질 A(leached protein A)를 제거하는 방법:
a) 목적 단백질의 pI가 7.0 이상인 경우 단백질 함유 시료를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(protein A affinity chromatography)에 적재하여 용출하는 단계; 및
b) 혼합 방식 크로마토그래피(mixed mode chromatography) 컬럼을 pH가 pH 4.0 내지 7.0이고, 염(salt) 농도가 30 내지 200 mM인 평형 용액(equilibration buffer)으로 평형상태를 유지시킨 후, 단계 a)에서 용출된 단백질 용액을 상기 평형 용액과 동일 조건으로 적정하여 컬럼에 적재하여 흘러나오는 통과액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 단계 b)의 혼합 방식 크로마토그래피는 결합-용출성 방식(binding-elution mode)임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 b)의 혼합 방식 크로마토그래피는 통과-흐름성 방식(flow-through mode)임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
단계 b)에서 혼합 방식 크로마토그래피는 이온교환 기능과 소수성 상호작용 기능의 혼합 방식 크로마토그래피 또는 음이온 교환기능과 양이온교환 기능의 혼합 방식 크로마토그래피임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
단계 b)에서 회수된 단백질을 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography) 및 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 크로마토그래피에 적재하여 정제하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 b)의 용출 용액의 전기전도도(conductivity)는 2~25 mS/m임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 b)의 평형 용액의 전기전도도(conductivity)는 2~25 mS/m임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 용출 용액 또는 평형 용액은 시트르산 나트륨, 염화나트륨, 황산나트륨, 인산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨 및 인산칼륨으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 단백질은 항체 또는 Fc 융합 단백질임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항의 방법을 이용한 정제 공정을 포함하는 단백질 제제의 제조 방법.