WO2020196938A1 - 불순물 제거능이 우수한 항체 정제용 레진 - Google Patents

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WO2020196938A1
WO2020196938A1 PCT/KR2019/003414 KR2019003414W WO2020196938A1 WO 2020196938 A1 WO2020196938 A1 WO 2020196938A1 KR 2019003414 W KR2019003414 W KR 2019003414W WO 2020196938 A1 WO2020196938 A1 WO 2020196938A1
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resin
antibody
protein
impurities
present
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PCT/KR2019/003414
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신용철
표쩌
최수림
박소영
박솔아
메자스로라
애브라햄존에릭
이드슈트룀알렉스
후앙샤오
에릭슨 뢰니쉬캇챠
우노존세실리아
하네스콕라스
Original Assignee
아미코젠주식회사
바이오웍스 테크놀로지 에이비
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Publication date
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum

Definitions

  • the present invention relates to a resin for purification of antibodies having excellent impurity removal ability, and more particularly, by substituting some amino acid residues of the residue of protein A, it has the ability to remove impurities such as host cell-derived protein (HCP) and host cell-derived DNA (HCD). It relates to a resin for excellent antibody purification.
  • HCP host cell-derived protein
  • HCD host cell-derived DNA
  • Monoclonal antibodies are secreted into the medium when genetically engineered animal cells are cultured, and various proteins secreted from the cells and proteins in the medium are mixed and present at a very low concentration. Therefore, removal of impurities other than the target monoclonal antibody is an important step in antibody production.
  • affinity chromatography using protein A an antibody affinity ligand capable of selectively recovering only monoclonal antibodies from a medium, is mainly used.
  • Protein A chromatography is essential for the production of biopharmaceutical antibodies because it is possible to recover almost completely antibodies in cell culture in one step.
  • the cell culture medium using an animal cell line contains not only antibodies, but also various impurities such as protein derived from host cells (HCP), DNA derived from homework cells (HCD), viruses, and endotoxins caused by microbial contamination. It is absolutely required. That is, starting with a “capture step” by protein A affinity chromatography, a "polishing step” to remove trace amounts of HCP, HCD, virus or endotoxin is required.
  • the desired protein After the desired protein has been precipitated, it can be separated from other HCP contaminants. However, precipitation of a therapeutic antibody can cause irreversible damage to the antibody. Techniques for specifically precipitating the protein of interest trap non-proteinaceous contaminants in the precipitate, and separation may be inefficient.
  • HCP can be precipitated away from the therapeutic antibody.
  • US7169908 describes the addition of a solution of ethacridine lactate to precipitate host cell impurities.
  • reagents such as ethacridine lactate is not suitable for the production of therapeutic proteins because it has been used as an abortion agent and can be harmful to patients if not completely removed.
  • cleaning cleaning-in-place, CIP
  • CIP cleaning-in-place
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a resin for antibody purification that has increased alkali resistance compared to the wild-type protein A7 and at the same time has a very excellent ability to remove impurities derived from host cells.
  • domain A of protein A or its functional it was found that when a protein in which Asparagine, the 28th amino acid was mutated to arginine (N28R), was used, the ability to remove impurities derived from host cells was remarkably improved, and a resin with increased alkali resistance could be produced. And completed the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a resin for antibody purification in which a protein in which asparagine, the 28th amino acid in the protein defined by SEQ ID NO: 1 or a functional variant thereof, is mutated to arginine (N28R) is immobilized. .
  • Another object of the present invention is (a) passing a sample containing an antibody through an adsorption column filled with the resin to bind the antibody to the adsorption column; (b) washing to leave only the bound antibody; And (c) separating and eluting the attached antibody from the washed adsorption column to recover the antibody.
  • the present invention is a protein in which asparagine, the 28th amino acid in the protein defined by SEQ ID NO: 1 or a functional variant thereof, is mutated (N28R) to arginine, thereby fixing impurities removal ability.
  • This improved antibody purification resin is provided.
  • the present invention comprises the steps of: (a) passing a sample containing an antibody through an adsorption column filled with the resin to bind the antibody to the adsorption column; (b) washing to leave only the bound antibody; And (c) recovering the antibody by separating and eluting the attached antibody from the washed adsorption column.
  • the present invention provides a resin for antibody purification in which a protein in which asparagine, which is the 28th amino acid in the protein defined by SEQ ID NO: 1 or a functional variant thereof, is mutated to arginine (N28R) is immobilized.
  • the antibody In order to purify the antibody, the antibody must be adsorbed on the resin and separated from the sample (i.e., the binding ability between the resin and the antibody should be excellent), and the impurities in the antibody eluate should be excellent (i.e., excellent impurity removal ability).
  • the protein defined by SEQ ID NO: 1 or a functional variant thereof, asparagine, the 28th amino acid is mutated to arginine (N28R) using a resin immobilized with an antibody.
  • arginine N28R
  • the antibody binding ability was better compared to that using a commercially available resin (Mabselect Sure, GE Healthcare), and in particular, the amount of host cell-derived impurities (HCP, HCD) in the purified antibody eluate was significantly reduced. .
  • protein is used interchangeably with “polypeptide” or “peptide”, and refers to a polymer of amino acid residues as commonly found in proteins in nature.
  • amino acids used herein refers to the following amino acids according to standard abbreviation regulations in the field of biochemistry:
  • amino acid position amino acid position
  • amino acid position amino acid position
  • amino acid indicated later amino acid indicated later.
  • N28R indicates that asparagine corresponding to position 28 of the natural polypeptide is substituted with arginine.
  • amino acid indicated after the'slash (/)' mark means'or'.
  • the protein of SEQ ID NO: 1 refers to the A domain of protein A having high homology as a cell surface protein of staphylococcus.
  • the mutant protein comprises the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 1 or is a functional variant thereof. “Functional variant” includes all similar sequences containing one or more additional mutations at amino acid positions that do not affect the improved chemical stability of the mutant protein or affinity for the antibody in the context of an increased pH value.
  • the protein may further include a mutation selected from the group consisting of N18H, D36V, N43Y/L and N52S in order to increase alkali resistance in addition to N28R, and preferably may further include an N43Y mutation.
  • the protein may be used in the form of a multimer including two or more repeating units.
  • the mutant proteins of the present invention are protein ligands that specifically bind to Fc fragments of antibodies such as IgG, IgA, IgD, IgE and IgM, and their affinity is maintained for a longer period in alkaline conditions than the parent molecule, and furthermore, host cells
  • the affinity with the derived impurities is very high, and the amount of impurities in the antibody eluate can be significantly reduced.
  • the antibody may specifically be a monoclonal antibody, and the term "monoclonal antibody” refers to an antibody that can be produced by a single antibody-forming cell, and recognizes one antigenic determinant.
  • the antibody of the present application is not limited thereto, and may include all therapeutic antibodies commonly used in the art.
  • the antibody is a concept that includes both the full-length antibody and the form of the antibody fragment, and the antibody fragment includes all of Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, and the like.
  • the Fv includes both a double disulfide Fv (dsFv) and a short chain Fv (scFv) form.
  • Fd refers to the heavy chain portion contained in the Fab fragment. It means that it is constructed using only some of the fragments essential for binding to an antigen, such as Fv, scFv, and Fab, and is widely used as a protein therapeutic because it specifically binds to a target and exhibits drug efficacy.
  • the Fab without Fc is known to have no effect on the therapeutic effect depending on the type of sugar because no sugar or glycosylation exists.
  • unlike antibodies there is not a large difference in molecular weight from impurities, so it is difficult to separate them using chromatography in the purification process.
  • the "impurity” includes any substance other than the desired antibody, examples of which include subtypes, dimers, multimers, host-derived DNA, host-derived proteins, endotoxins, etc., but are limited thereto no.
  • the shape of the resin may be in the form of particles, and such particles may be porous or non-porous.
  • the particulate resin may be used as a packed bed or in a suspended form. Suspension forms include those known as expanded beds and soft suspensions, allowing the particles to move freely. In the case of monoliths, packed beds and fluidized beds, the separation procedure generally follows a conventional chromatography method with a concentration gradient. In the case of definite suspensions, the batch method is used.
  • the resin is a filler.
  • the resin may be in the form of chips, capillaries, or filters.
  • the resin is preferably 20 to 200 ⁇ m, when the resin is a synthetic polymer, more preferably 20 to 80 ⁇ m, more preferably 30 to 60 ⁇ m, and when the resin is polysaccharide, more preferably Has a particle diameter (volume average particle diameter) of 50 to 200 ⁇ m, more preferably 60 to 150 ⁇ m. If the particle diameter is less than 20 ⁇ m, the column pressure becomes high under high flow rate, and thus it cannot withstand practical use. When the particle diameter exceeds 200 ⁇ m, the amount of the antibody binding to the resin (binding capacity) may drop.
  • particle size in this invention is a volume average particle diameter obtained by a laser diffraction scattering type particle size distribution measuring apparatus.
  • the resin is preferably porous and has a specific surface area of 50 to 150 m 2 /g, more preferably 80 to 130 m 2 /g.
  • the specific surface area is less than 50 m 2 /g, the binding capacity may be lowered.
  • the specific surface area exceeds 150 m 2 /g, the strength of the resin decreases, so the resin is destroyed under high flow rates and the column pressure increases. There are cases.
  • the "specific surface area” in the present invention is a value obtained by dividing the surface area of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter by the dry weight of the particles.
  • the resin is preferably 100 to 1400 nm, when the resin is a synthetic polymer, more preferably 100 to 400 nm, more preferably 200 to 300 nm, and when the resin is polysaccharide, more preferably 500 To 1400 nm, more preferably 800 to 1200 nm.
  • the "volume average pore diameter" in the present invention is a volume average pore diameter of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter.
  • the particle diameter, specific surface area, and pore diameter distribution in the above ranges are satisfied, the balance between the gap between the particles serving as the flow path of the solution to be purified and the relatively large pore diameter within the particles, and the binding surface area of the molecules to be purified is optimized, The binding capacity is maintained at a high level.
  • the material of the resin is, for example, a polymer having a hydrophilic surface, for example, on the outer surface (and also on the inner surface if present), a hydroxy group (-OH), a carboxyl group (-COOH), and an aminocarbonyl group. (-CONH 2 , or N substituted), amino group (-NH 2 , or substituted), oligo or a polymer having a polyethyleneoxy group.
  • the polymer is, in one embodiment, a synthetic polymer such as polymethacrylate, polyacrylamide, styrene-divinylbenzene copolymer. Such synthetic polymers are readily prepared by known methods (see, for example, the method described in J. MATER.
  • the polymer in another embodiment is a polysaccharide such as dextran, starch, cellulose, pullulan, and agarose. Such polysaccharides are easily produced by a known method (see, for example, the method described in Japanese Patent No. 4081143). Alternatively, a commercial item such as Sepharose (GE Healthcare Bioscience) is also used. In other embodiments, inorganic resins such as silica and zirconium oxide may be used.
  • the resin in the present invention may be selected from the group consisting of agarose, sepharose, cellulose, dextran, polyacrylate, and polystyrene.
  • a general method of immobilizing the protein to the resin can be used.
  • the carboxyl group is activated by N-hydroxysuccinic acid imide to react with the amino group of the ligand, and a resin having an amino group or carboxyl group is used, such as a water-soluble carbodiimide.
  • a method of forming an amide bond by reacting with a carboxy group or an amino group of the protein in the presence of a dehydration condensing agent a method of reacting with an amino group of the protein by activating it with a cyanogen halide such as cyanobromide using a resin having a hydroxyl group, or A method of tosylation or tresylation of a hydroxyl group to react with the amino group of the ligand, and a method of introducing an epoxy group into the resin by bisepoxide, epichlorohydrin, etc., and reacting the amino group or hydroxyl group or thiol group of the protein, having an epoxy group And a method of reacting the protein with an amino group, a hydroxyl group, or a thiol group using a resin.
  • the alcoholic hydroxyl group which is a ring-opening epoxy group generated by ring opening of the epoxy group, hydrophilizes the surface of the resin, prevents non-specific adsorption of proteins, etc., and at the same time improves the toughness of the resin in water to prevent destruction of the resin under high velocity. do. Therefore, when the remaining epoxy groups that are not bound to the protein are present in the resin after the protein is immobilized, it is preferable to open the remaining epoxy groups.
  • a method of ring-opening the epoxy group in the resin for example, a method of stirring the resin at room temperature or heating with an acid or alkali in an aqueous medium may be mentioned.
  • the epoxy group may be ring-opened with a blocking agent having a mercapto group such as mercaptoethanol and thioglycerol, or a blocking agent having an amino group such as monoethanolamine.
  • the most preferable ring-opening epoxy group is a ring-opening epoxy group obtained by ring-opening an epoxy group contained in a resin with thioglycerol.
  • Thioglycerol is less toxic than mercaptoethanol as a raw material, and the epoxy ring-opening group to which thioglycerol is added has the advantage of not only lowering non-specific adsorption but also increasing the amount of dynamic binding than the ring-opening group by a blocking agent having an amino group.
  • molecules (spacers) of any length may be introduced between the resin and the protein.
  • the spacer include a polymethylene chain, a polyethylene glycol chain, and a sugar.
  • the present invention also includes the steps of: (a) passing a sample containing an antibody through an adsorption column filled with the resin of any one of claims 1 to 4 to bind the antibody to the adsorption column; (b) washing to leave only the bound antibody; And (c) recovering the antibody by separating and eluting the attached antibody from the washed adsorption column.
  • a sample containing an antibody such as a column filled with the resin, is flowed under conditions in which the antibody is adsorbed to the protein.
  • the resin may be washed with a neutral buffer containing a salt such as NaCl.
  • step (a) may be performed at pH 6.5 to pH 8.0.
  • impurities derived from host cells other than the antibody may bind to the resin.
  • the impurities are eluted with the antibody during the antibody elution process, thus requiring an additional purification process.
  • it may cause a decrease in the life of the ion exchange resin used in the sub-process.
  • the cationicity of the resin surface was increased by amino acid substitution. This can exhibit the effect of remarkably reducing the amount of impurities eluted with the antibody in the subsequent elution process because the binding force with impurities derived from host cells is relatively strong compared to the commercially available resins currently available commercially.
  • a pH gradient buffer solution or an appropriate buffer solution having a pH of 2.0 to 5.0 is flowed, and the antibody adsorbed on the resin is eluted. By recovering this eluate, the antibody can be purified from the sample.
  • Antibodies isolated using this purification method may mean that the purity is 88% or more, specifically, purity 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% It may be more than, 97% or more, or 98% or more, but is not limited thereto.
  • the term "purity" refers to a pure antibody from which impurities have been removed. For example, if the purity is 92%, it means that the remaining 8% are impurities.
  • the purity may simply represent the purity of the material separated from the elution solution, but the% of the final purity may vary depending on the purity of the loaded sample.
  • the present invention provides a resin for antibody purification with excellent impurity removal ability, thereby omitting a sub-process for removing impurities during the antibody purification process or reducing the burden of impurities to be processed in the sub-process, thereby reducing the number of times of use of the lower affinity resin. There is an effect that can be increased.
  • Figure 2 is a graph comparing the host cell-derived protein (HCP) removal ability of the resin (BW Sure) and the commercially available resin (Mabselect Sure) according to the present invention. Injecting 20ml and 100ml of CHO cell culture solution, the amount of HCP contained in the eluate purified through the resin (BW Sure) of the present invention and the commercially available resin (Mabselect Sure) was analyzed.
  • HCP host cell-derived protein
  • FIG. 3 is a graph comparing host cell-derived DNA (HCD) removal ability of resin (BW Sure) and commercially available resin (Mabselect Sure) according to the present invention. Injecting 20 ml and 100 ml of CHO cell culture solution, the amount of HCD contained in the purified eluate through the resin (BW Sure) of the present invention and the commercially available resin (Mabselect Sure) was analyzed.
  • HCD host cell-derived DNA
  • a tetrameric gene substituted with N28R/N43Y was synthesized in the B domain of protein A derived from staphylococcus aureus based on a prior patent (Korea 10-1857953) (Cosmogenetech, Korea). To this synthetic gene, a 6*His gene at the C-terminus and NdeI and XhoI restriction enzyme recognition sequences were added to both ends, respectively.
  • the synthesized gene was prepared by inserting into the NdeI and XhoI restriction enzyme recognition sites of pET29a(+) vector (Stratagene, USA). In detail, it proceeded as follows. The synthesized gene and vector were digested with restriction enzymes NdeI and XhoI (Invitrogen, USA), and then conjugated at 16° C. for 12 to 16 hours using T4 DNA ligase (Roche, Germany), and the gene was electroporated. Was transformed into E. coli DH5-alpha strain. The prepared plasmid was transformed into final E. coli BL21 (DE3) to produce a production strain.
  • a colony of the production strain was inoculated into 5 mL of a TB liquid medium containing 10 ug/ml of Kanamycin antibiotic, followed by shaking culture at 37°C and 200 rpm for 16 hours.
  • main culture was performed at 37°C and 200 rpm.
  • IPTG isopropyl-aD-thio-galactopyranoside
  • the culture solution was collected by centrifugation (4° C., 5000 rpm, 30 minutes), and then suspended in a 20 mL PBS buffer (pH 7.4) solution and crushed for 30 minutes with an ultrasonic grinder at low temperature. Then, centrifugation was performed again (4° C., 10000 rpm, 30 minutes) to recover only the supernatant.
  • Protein A purification proceeded as follows. To the chromatography column filled with 5 mL of WorkBeads 40 Ni-NTA (Bio-Works, Sweden), pour 25 mL of binding buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, pH 8.0). Equilibration proceeded. The 20 mL of the protein supernatant and 20 mL of the binding buffer were mixed, and then flowed on an equilibrated column to bind the protein to the resin.
  • binding buffer 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, pH 8.0.
  • washing buffer 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, pH 8.0
  • elution buffer 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 300 mM Imidazole, pH 8.0
  • Protein A resin was prepared by coupling the protein purified in the above Example to WorkBeads 40/10000ACT (Bio-Works, Sweden). In detail, 10 ml of resin was washed twice with DW, and then suspended in a phosphorylation buffer (pH 8.5) and 100 mg of purified protein was added to prepare a total reaction solution of 20 ml. The mixture was slowly stirred at 37° C. overnight to proceed with a coupling reaction. After the reaction was over, the reaction solution was completely removed through a vacuum filter, and the coupled resin was washed twice with DW. Next, 1 M ethanolamine-HCl (pH 9.5) was added and stirred slowly overnight to deactivate the unbound activated ligand. The prepared resin was named BW Sure.
  • Binding buffer PBS, pH 7.4
  • Elution buffer 100 mM glycine-HCl, pH 2.7
  • the antibody binding capacity of BW Sure and Mabselect Sure at 2.4 min RT was 40.2 and 29.35 mg IgG/ml resin, respectively, and the antibody binding capacity of BW Sure was affected by the flow rate. Regardless of the overall, it was determined to be better than Mabselect Sure (Fig. 1).
  • the antibody was purified from the CHO cell culture medium through the resin, and the amount of host cell-derived impurities (HCP, HCD) in the purified eluate was analyzed.
  • the antibody culture solution was provided by the Osong Advanced Medical Industry Promotion Foundation's New Drug Development Support Center, and for accurate analysis, the animal cell culture solution (sample) was injected with 20 ml, 70%, or 100 ml, which is 15% of the previously analyzed antibody binding capacity (DBC) of BW Sure. And then purified twice.
  • DBC antibody binding capacity
  • Binding buffer 50 mM sodium phosphate, pH 7.4
  • Elution buffer 100 mM glycine-HCl, pH 2.7
  • HCP ELISA kits (Cygnus Technologies, USA) were used to measure the concentration of host cell-derived protein (HCP). The experiment was conducted according to the method recommended by the manufacturer. 50ul of elute was added to the well plate, followed by 100ul of secondary antibody conjugated with HRP (HorseRadish Peroxidase). The reaction solution was shaken at room temperature at about 500 rpm for 3 hours to induce a binding reaction, and the reaction solution was carefully discarded and washed 4 times. After adding 100ul of the substrate TMB (3,3',5,5'-tetrametylbenzidine) for 30 minutes, the reaction was stopped by adding 0.5M sulfuric acid, and the HCP concentration was analyzed by measuring the color development (OD450).
  • HRP HexeRadish Peroxidase
  • a PicoGreen kit (Promega, USA) was used. The experiment was conducted according to the method recommended by the manufacturer. A quantification curve was obtained using the DNA provided in the kit, and the elute was diluted with TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) and measured. The PicoGreen reagent and the solution were mixed well in a 1:1 ratio and reacted at room temperature for 5 minutes, and then sample fluorescence was analyzed using a fluorescent microplate reader (excitation ⁇ 480 nm, emission ⁇ 520 nm).

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Abstract

본 발명은 불순물 제거능이 우수한 항체 정제용 레진에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단백질 A의 잔기의 일부 아미노산 잔기를 치환하여 숙주세포 유래 단백질 (HCP), 숙주세포 유래 DNA (HCD)와 같은 불순물 제거능이 우수한 항체 정제용 레진에 관한 것이다. 본 발명에 따른 레진은 숙주세포 유래의 불순물 제거능이 매우 뛰어나, 이를 통해 항체 정제 과정 중 불순물을 제거하기 위한 하위 공정을 생략하거나 하위 공정에서 처리해야 할 불순물의 부담을 줄여 하위 친화성 레진의 사용횟수를 증가시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

불순물 제거능이 우수한 항체 정제용 레진
본 발명은 불순물 제거능이 우수한 항체 정제용 레진에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단백질 A의 잔기의 일부 아미노산 잔기를 치환하여 숙주세포 유래 단백질 (HCP), 숙주세포 유래 DNA (HCD)와 같은 불순물 제거능이 우수한 항체 정제용 레진에 관한 것이다.
단클론항체(monoclonal antibody)는 유전자 조작된 동물세포의 배양 시, 배지 중으로 분비되며, 세포 자체에서 분비되는 여러 단백질들과 배지 내의 단백질 들이 섞여 매우 낮은 농도로 존재하게 된다. 따라서 목적 단클론항체 이외의 불순물 제거가 항체생산에서 중요한 단계이다. 단클론항체 분리 정제공정은 배지로부터 단클론항체만 선택적으로 회수할 수 있는 항체친화성 리간드(antibody affinity ligand)인 단백질 A를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)가 주로 사용되고 있다.
단백질 A 크로마토그래피(Protein A chromatography)는 1 단계로 세포 배양액에 있는 항체를 거의 완전하게 회수가 가능하므로 바이오 의약품 항체 생산에 핵심적으로 사용되고 있다. 그러나 동물 세포주를 이용한 세포 배양액에는 항체뿐만 아니라 숙주 세포 유래의 단백질 (HCP), 숙제 세포 유래의 DNA (HCD), 바이러스, 미생물 오염에 의한 독소 (endotoxin) 등 다양한 불순물도 포함되어 이를 제거하는 공정이 반드시 요구된다. 즉, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 "포획 단계" (Capture step)로 시작하여 미량의 HCP, HCD, 바이러스 또는 내 독소를 제거하기 위한 "연마 단계" (polishing step)가 필요하다.
이러한 단계로서 종래에는 사용되는 방법의 예로는 다음의 것들이 포함된다:
목적 단백질을 침전시킨 후 다른 HCP 오염물로부터 분리할 수 있다. 그러나, 치료 항체의 침전은 항체에 되돌릴 수 없는 손상을 야기시킬 수 있다. 목적 단백질을 특이적으로 침전시키는 기술은 침전물에 비단백질성 오염물을 포집시켜, 분리가 비효율적일 수 있다.
대안적으로, HCP는 치료 항체와 떨어져 침전시킬 수 있다. US7169908은 숙주 세포 불순물을 침전시키기 위해 에타크리딘 락테이트 용액을 첨가하는 것을 기술하고 있다. 그러나, 이러한 에타크리딘 락테이트 등의 시약 사용은 이것이 낙태제로서 사용되었고 완전하게 제거되지 않으면 환자에 해로울 수 있기 때문에 치료 단백질 생산에는 적합하지 않다.
이러한 방법들이 숙주 세포 오염물로부터 항체를 정제하는데 도움을 주기도 하였지만, 후속 하위 공정들을 용이하게 하기 위해 항체의 특성에 부정적인 영향을 주지 않으면서 미생물 숙주 세포계로부터 HCP, HCD 등과 같은 불순물의 양을 줄이는 개선 방법을 제공해야 한다는 요구가 여전히 존재한다.
한편, 항체 정제 후에는 레진에 남아있는 핵산, 지질, 단백질, 미생물과 같은 다양한 오염물질을 제거하기 위한 세정(cleaning-in-place, CIP)을 실시한다. 일반적으로 레진의 세정제 중 가장 광범위하게 사용되는 물질이 NaOH이다. 그러나 단백질 기반 정제용 레진은 알칼리에 취약하기 때문에 NaOH를 사용하기 힘들다. 단백질 A는 비교적 알칼리 조건에서도 안정하기 때문에 NaOH로 세척을 하나, 좀 더 세척율을 높이기 위하여 알칼리 조건에서도 안정한 단백질 A를 개발하기 위한 단백질 개량 연구들이 진행되어 왔다.
이에, 본 발명자는 야생형의 단백질 A7와 비교하여 알칼리 내성이 증가되고, 동시에 숙주 세포 유래의 불순물 제거능이 매우 우수한 항체 정제용 레진을 개발하기 위하여 예의 노력을 기울인 결과, 단백질 A의 도메인 A 또는 이의 기능적 변이체에 있어서, 28번쨰 아미노산인 아스파라긴(Asparagine)이 아르기닌(Arginine)으로 돌연변이(N28R)된 단백질을 이용할 경우 숙주 세포 유래의 불순물 제거능이 현저히 향상되면서 알칼리 내성이 증가된 레진을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에서 28번째 아미노산인 아스파라긴(Asparagine)이 아르기닌(Arginine)으로 돌연변이(N28R)된 단백질이 고정된 항체 정제용 레진을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 상기 레진으로 충전된 흡착 칼럼에 항체를 포함하는 시료를 통액시켜 상기 흡착 칼럼에 항체를 결합시키는 단계; (b) 세척하여 결합된 항체만 남기는 단계; 및 (c) 세척된 흡착 칼럼으로부터 부착된 항체를 분리 용출시켜 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에서 28번째 아미노산인 아스파라긴(Asparagine)이 아르기닌(Arginine)으로 돌연변이(N28R)된 단백질이 고정되어 불순물 제거능이 향상된 항체 정제용 레진을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 상기 레진이 충전된 흡착 칼럼에 항체를 포함하는 시료를 통액시켜 상기 흡착 칼럼에 항체를 결합시키는 단계; (b) 세척하여 결합된 항체만 남기는 단계; 및 (c) 세척된 흡착 칼럼으로부터 부착된 항체를 분리 용출시켜 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 본 발명은 서열번호 1로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에서 28번째 아미노산인 아스파라긴(Asparagine)이 아르기닌(Arginine)으로 돌연변이(N28R)된 단백질이 고정된 항체 정제용 레진을 제공한다.
항체를 정제하기 위해서는 항체가 레진에 흡착되어 시료로부터 분리되어야 하며(즉, 레진과 항체와의 결합능이 우수하여야 하며), 가급적 항체 용출액 내의 불순물이 우수하여야 한다(즉, 우수한 불순물 제거능).
본 발명의 일실시예에 따르면, 서열번호 1로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에서 28번째 아미노산인 아스파라긴(Asparagine)이 아르기닌(Arginine)으로 돌연변이(N28R)된 단백질이 고정된 레진을 이용하여 항체를 정제한 결과, 시판중인 레진(Mabselect Sure, GE Healthcare)을 이용한 것과 비교해 항체 결합능이 더 우수하였으며, 특히 정제된 항체 용출액 내 숙주세포 유래의 불순물(HCP, HCD)의 양이 현저히 저감된 것으로 확인되었다.
본 명세서에서 용어 "단백질"은 "폴리펩타이드(polypeptide)" 또는 “펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다:
A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.
본 명세서에 표기되는 "(아미노산일문자)(아미노산위치)(아미노산일문자)"는 천연형 폴리펩타이드의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 예를 들면, N28R은 천연형 폴리펩타이드의 28번에 해당하는 아스파라긴이 아르기닌으로 치환된다는 것을 가리킨다. 또한 후행 표기된 아미노산에서 '사선(/)'표시는 '또는'을 의미한다.
본 발명에서 상기 서열번호 1의 단백질은 포도상 구균의 세포 표면 단백질로서 높은 상동성을 지니고 있는 단백질 A의 A 도메인을 의미한다. 본 발명에서 상기 돌연변이 단백질은 서열번호 1에 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이의 기능적 변이체이다. “기능적 변이체”는 증가된 pH 값의 환경에서 돌연변이 단백질의 향상된 화학적 안정성 또는 항체에 대한 친화성에는 영향을 주지 않는 아미노산 위치에서 하나 이상의 추가 변이를 포함하는 모든 유사한 서열을 포함한다.
본 발명에서 상기 단백질은 N28R 이외에도 알칼리 내성을 증가시키기 위하여 N18H, D36V, N43Y/L 및 N52S로 이루어진 군에서 선택된 돌연변이를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 N43Y 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질은 반복 단위를 둘 이상 포함하는 다량체의 형태로 사용이 될 수도 있다.
본 발명의 상기 돌연변이 단백질들은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM과 같은 항체의 Fc 단편에 특이적으로 결합하는 단백질 리간드이며, 모분자보다 알칼리 조건에서 더 장기간 친화성이 유지되고, 더 나아가 숙주세포 유래의 불순물과의 친화성이 매우 높아 항체 용출액 내 불순물의 양을 현저히 저감시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 항체는 구체적으로, 단클론 항체일 수 있으며, 상기 "단클론항체(monoclonal antibody)"란 용어는 단일 항체 형성세포가 생성할 수 있는 항체를 말하며, 1개의 항원 결정기를 인식한다. 본 출원의 항체는 이에 제한되지는 않으며, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 치료용 항체를 모두 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체는 전장항체 및 항체 절편의 형태를 모두 포함하는 개념으로, 항체절편은 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd 등을 모두 포함한다. 상기 Fv는 이중디설파이드 Fv(dsFv) 및 단쇄 Fv(scFv) 형태를 모두 포함한다. Fd는 Fab 절편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. Fv, scFv 및 Fab와 같이 항체 중 항원과의 결합에 필수적인 일부 절편만을 사용하여 구성되는 것을 의미하며, 표적과 특이적으로 결합해 약효를 나타내기 때문에 단백질 치료제로 많이 사용되고 있다. 또한, Fc가 없는 Fab는 당체나 당화가 존재하지 않기 때문에 당의 종류에 따라 치료효과에 영향이 없는 것으로 알려져 있다. 그러나, 항체와 달리 불순물들과 분자량 차이가 크지 않아 정제 공정에서 크로마토그래피를 이용한 분리가 어렵다.
본 발명에서 상기 "불순물"은 목적하는 항체 이외의 어떠한 물질도 포함되며, 그 예로는 아형, 이량체, 다량체, 숙주 유래 DNA, 숙주 유래 단백질, 내독소 등을 들 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 레진의 형상은 입자의 형태일 수 있고, 이러한 입자는 다공성일 수도 있고 비다공성일 수도 있다. 입자상의 레진은 충전상으로서 사용할 수도 있고, 현탁 형태로 사용할 수도 있다. 현탁 형태에는 유동층(expanded bed) 및 순연한 현탁물로서 알려진 것이 포함되고, 입자가 자유롭게 운동할 수 있다. 모노리스(monolith), 충전상 및 유동층의 경우, 분리 절차는 일반적으로 농도 구배에 의한 종래의 크로마토그래피법에 따른다. 순연한 현탁물의 경우에는, 회분법이 이용된다. 바람직하게는, 해당 레진은 충전제이다. 또는, 레진은 칩, 모세관 또는 필터와 같은 형태일 수도 있다.
본 발명에서 상기 레진은, 바람직하게는 20 내지 200 ㎛, 레진이 합성 중합체인 경우, 보다 바람직하게는 20 내지 80 ㎛, 더욱 바람직하게는 30 내지 60 ㎛, 레진이 다당인 경우, 보다 바람직하 게는 50 내지 200 ㎛, 더욱 바람직하게는 60 내지 150 ㎛의 입경(부피 평균 입경)을 갖는다. 입경이 20 ㎛ 미만이면, 고유속하에서 칼럼 압력이 높아져, 실용에 견딜 수 없다. 입경이 200 ㎛를 초과하면, 항체가 레진에 결합하는 양(결합 용량)으로 떨어지는 경우가 있다. 또한, 본 발명에서의 「입경」이란, 레이저 회절 산란식 입도 분포 측정 장치에 의해 얻어지는 부피 평균 입경이다.
또한, 본 발명에서 상기 레진은, 바람직하게는 다공질이고, 50 내지 150 m 2/g, 보다 바람직하게는 80 내지 130 m 2/g의 비표면적을 갖는다. 여기서, 비표면적이 50 m 2/g 미만이면, 결합 용량이 떨어지는 경우가 있고, 한편 150 m 2/g을 초과하면, 레진의 강도가 떨어지기 때문에 고유속하에서 레진이 파괴되어, 칼럼 압력이 상승하는 경우가 있다. 본 발명에서의 「비표면적」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000 nm의 세공이 갖는 표면적을 입자의 건조 중량으로 나눈 값이다.
본 발명에서 상기 레진은 바람직하게는 100 내지 1400 nm, 레진이 합성 중합체인 경우, 보다 바람직하게는 100 내지 400 nm, 더욱 바람직하게는 200 내지 300 nm, 레진이 다당인 경우, 보다 바람직하게는 500 내지 1400 nm, 더욱 바람직하게는 800 내지 1200 nm의 부피 평균 세공 직경을 갖는다. 여기서, 부피 평균 세공 직경이 100 nm 미만이면, 고유속하의 결합 용량 저하가 현저해지는 경우가 있고, 한편 1400 nm를 초과하면, 유속에 관계없이 결합 용량이 저하되는 경우가 있다. 본 발명에서의 「부피 평균 세공 직경」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000 nm의 세공의 부피 평균 세공 직경이다.
상기 범위의 입경, 비표면적 및 세공 직경 분포를 만족시키는 경우, 정제 대상 용액의 유로가 되는 입자간의 간극 및 입자 내의 비교적 큰 세공 직경과, 정제 대상 분자의 결합 표면적의 균형이 최적화되어, 고유속하의 결합 용량이 높은 수준으로 유지된다.
본 발명에서 상기 레진의 재질로는, 예를 들면 친수성 표면을 갖는 중합체로, 예를 들면 외표면에(및 존재하는 경우에는 내표면에도) 히드록시기(-OH), 카르복시기(-COOH), 아미노카르보닐기(-CONH 2, 또는 N 치환형), 아미노기(-NH 2, 또는 치환형), 올리고 또는 폴리에틸렌옥시기를 갖는 중합체이다. 중합체는 한 실시 형태에서는, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체와 같은 합성 중합체이다. 이러한 합성 중합체는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다(예를 들면, 문헌 [J. MATER. CHEM1991, 1(3), 371-374]에 기재된 방법을 참조함). 또는, 도요펄(도소사)과 같은 시판품도 사용된다. 다른 실시 형태에서의 중합체는 덱스트란, 전분, 셀룰로오스, 풀루란, 아가로스 등의 다당류이다. 이러한 다당류는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다(예를 들면 일본 특허 제4081143호에 기재된 방법을 참조함). 또는, 세파로스(GE 헬스케어 바이오사이언스사)와 같은 시판품도 사용된다. 그 밖의 실시 형태에서는 실리카, 산화지르코늄 등의 무기 레진일 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 상기 레진은 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아크릴 레이트 및 폴리스틸렌으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
한편, 레진과 상기 단백질의 결합 방법으로는, 단백질을 레진에 고정화하는 일반적 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 카르복시기를 갖는 레진을 이용하여, 이 카르복시기를 N-히드록시숙신산이미드에 의해 활성화시켜 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 아미노기 또는 카르복시기를 갖는 레진을 이용하여, 수용성 카르보디이미드 등의 탈수 축합제 존재하에서 상기 단백질의 카르복시기 또는 아미노기와 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 방법, 수산기를 갖는 레진을 이용하여, 브롬화시안 등의 할로겐화시안으로 활성화시켜 상기 단백질의 아미노기와 반응시키는 방법, 또는 레진의 수산기를 토실화 또는 트레실화하여 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 및 비스에폭시드, 에피클로로히드린 등에 의해 에폭시기를 레진에 도입하고, 상기 단백질의 아미노기 또는 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법, 에폭시기를 갖는 레진을 이용하여 상기 단백질의 아미노기 또는 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법 등을 들 수 있다.
에폭시기가 개환하여 생성되는 개환 에폭시기인 알코올성 수산기는 레진 표면을 친수화하고, 단백질 등의 비특이 흡착을 방지함과 동시에, 수중에서 레진의 인성을 향상시켜 고유속하의 레진의 파괴를 방지하는 역할을 한다. 따라서, 상기 단백질을 고정화시킨 후 레진 중에 상기 단백질과 결합하지 않은 나머지 에폭시기가 존재하는 경우, 해당 나머지 에폭시기를 개환시키는 것이 바람직하다. 레진 중 에폭시기의 개환 방법으로는, 예를 들면 수용매 중에서, 산 또는 알칼리에 의해 가열 또는 실온에서 상기 레진을 교반하는 방법을 들 수 있다. 또한, 메르캅토에탄올, 티오글리세롤 등의 메르캅토기를 갖는 블록킹제나 모노에탄올아민 등의 아미노기를 갖는 블록킹제로 에폭시기를 개환시킬 수도 있다. 가장 바람직한 개환 에폭시기는, 레진에 포함되는 에폭시기를 티오글리세롤에 의해 개환시켜 얻어지는 개환 에폭시기이다. 티오글리세롤은, 원료로서 메르캅토에탄올 등보다 독성이 낮고, 티오글리세롤이 부가된 에폭시 개환기는, 아미노기를 갖는 블록킹제에 의한 개환기보다 비특이 흡착이 낮을 뿐 아니라, 동적 결합량이 높아진다는 이점을 갖는다.
필요에 따라 레진과 상기 단백질 사이에 임의의 길이의 분자(스페이서)를 도입할 수도 있다. 스페이서의 예로는 폴리메틸렌쇄, 폴리에틸렌글리콜쇄, 당류 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 레진으로 충전된 흡착 칼럼에 항체를 포함하는 시료를 통액시켜 상기 흡착 칼럼에 항체를 결합시키는 단계; (b) 세척하여 결합된 항체만 남기는 단계; 및 (c) 세척된 흡착 칼럼으로부터 부착된 항체를 분리 용출시켜 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서는, 상기 레진을 충전한 칼럼 등에 항체를 포함하는 시료를 상기 단백질에 항체가 흡착하는 조건으로 흘린다. 상기 (a) 단계에서는, 시료 중 항체 이외의 물질의 대부분은, 리간드에 흡착되지 않고 칼럼을 통과한다. 이 후, 상기 (b) 단계에서 흡착컬럼에 약하게 결합된 일부 불순물을 제거하기 위해, 레진을 NaCl 등의 염을 포함하는 중성의 완충액으로 세정할 수 있다.
한편, 상기 상기 (a) 단계는 pH 6.5 내지 pH 8.0에서 수행될 수 있다.
상기 (a) 단계에서 일반적인 레진의 경우, 항체 이외에 숙주세포로부터 유래한 불순물들이 레진에 결합할 수도 있고, 이 경우 항체 용출과정에서 상기 불순물들이 항체와 함께 용출되어 추가적인 정제공정을 필요로 할 뿐만 아니라, 하위 공정에서 사용되는 이온교환 레진의 수명을 감소시키는 원인이 되기도 한다.
반면에, 본원발명에서 제공하는 항체 정제용 레진의 경우에는 아미노산 치환에 의해 레진표면의 양이온성이 증가하였다. 이는 현재 상업적으로 이용 가능한 시판 레진과 비교하였을 때 숙주세포 유래의 불순물들과의 결합력이 상대적으로 강하기 때문에 이후 용출과정에서 항체와 함께 용출되는 불순물의 양이 현저하게 저감되는 효과가 발휘될 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 pH 구배 완충용액 또는 pH 2.0 내지 5.0의 적절한 완충액을 흘리고, 레진에 흡착된 항체를 용출시킨다. 이 용출액을 회수함으로써, 시료로부터 항체를 정제할 수 있다.
본 정제 방법을 이용하여 분리된 항체는 순도가 88% 이상인 것을 의미할 수 있으며, 구체적으로는 순도 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 "순도"는 불순물이 제거된 순수한 항체를 의미하는 것으로, 일 예로 순도가 92%라고 하면 나머지 8%가 불순물인 것을 의미한다. 또한, 순도는 용출용액에서 분리된 물질의 순도를 단순히 나타내는 것일 수 있으나, 로딩한 시료의 순도가 몇 %인지에 따라서도 최종 순도의 %가 달라질 수 있다.
본 발명은 불순물 제거능이 우수한 항체 정제용 레진을 제공하며, 이를 통해 항체 정제 과정 중 불순물을 제거하기 위한 하위 공정을 생략하거나 하위 공정에서 처리해야 할 불순물의 부담을 줄여 하위 친화성 레진의 사용횟수를 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 레진(BW Sure)과 시판 레진(Mabselect Sure)의 유체 흐름속도(flow rate)에 따른 레진의 항체결합능(Dynamic binding capacity, DBC)을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 레진(BW Sure)과 시판 레진(Mabselect Sure)의 숙주세포유래 단백질(HCP) 제거능을 비교한 그래프이다. 동물세포(CHO cell) 배양액 20ml과 100ml을 주입하여 본 발명의 레진(BW Sure)과 시판 레진(Mabselect Sure)을 통해 정제된 용출액에 포함되어 있는 HCP의 양을 분석하였다.
도 3은 본 발명에 따른 레진(BW Sure)과 시판 레진(Mabselect Sure)의 숙주세포유래 DNA(HCD) 제거능을 비교한 그래프이다. 동물세포(CHO cell) 배양액 20ml과 100ml을 주입하여 본 발명의 레진(BW Sure)과 시판 레진(Mabselect Sure)을 통해정제된 용출액에 포함되어 있는 HCD의 양을 분석하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 돌연변이 단백질 A 제조
스타필로코쿠스 아우레우스 ( staphylococcus aureus) 유래 단백질 A의 B 도메인에 선행 특허(대한민국 10-1857953)를 바탕으로 N28R/N43Y로 치환된 사량체 유전자를 합성하였다 (Cosmogenetech사, 한국). 이 합성 유전자에는 C 말단에 6*His 유전자와, 양 말단에는 각각 NdeI, XhoI 제한효소 인식서열이 첨가되었다.
합성된 유전자를 pET29a(+) 벡터 (Stratagene사, 미국)의 NdeI과 XhoI 제한효소 인식부위에 삽입하여 제조하였다. 자세하게는 하기와 같이 진행하였다. 합성된 유전자와 벡터를 제한효소 NdeI과 XhoI (Invitrogen사, 미국)로 절단한 후, T4 DNA 리가제 (Roche사, 독일)를 이용하여 16℃에서 12~16시간 동안 접합시키고 전기천공법으로 유전자를 대장균 DH5-alpha균주에 형질전환하였다. 제조된 플라스미드는 최종 대장균 BL21(DE3)에 형질전환되어 생산균주가 제작되었다.
단백질을 생산하기 위해 10 ug/ml의 카나마이신(Kanamycin) 항생제가 함유된 TB 액체배지 5 mL에 생산균주 콜로니를 접종한 후, 37℃, 200 rpm 조건으로 16시간 진탕배양하였다. TB　액체배지 500 mL이 함유된 2000 mL 삼각 플라스크에 상기 배양액 1%(v/v)를 접종한 후, 37℃, 200 rpm으로 본배양을 진행하였다. 배양액이 약 OD 600=0.6이 될 때에, 최종농도가 0.5 mM이 되도록 IPTG(isopropyl-a-D-thio-galactopyranoside)를 첨가하고 18시간 동안 추가 배양하였다. 이 배양액을 원심분리(4℃, 5000 rpm, 30분)를 통해 균체를 회수한 후, 20 mL의 PBS 버퍼(pH 7.4) 용액에 현탁하여 저온에서 초음파 분쇄기로 30분 동안 파쇄하였다. 그 다음 다시 원심분리(4℃, 10000 rpm, 30분)하여 상등액만을 회수하였다.
단백질 A 정제는 다음과 같이 진행되었다. 5mL의 WorkBeads 40 Ni-NTA (Bio-Works사, 스웨덴)이 충진되어 있는 크로마토그래피 컬럼에 25 mL의 결합버퍼 (50 mM NaH 2PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, pH 8.0)를 흘려주어 평형화를 진행하였다. 상기 20 mL의 단백질 상등액과 20 mL의 결합 버퍼를 섞은 다음 평형화된 컬럼에 흘려주어 레진에 단백질을 결합시켰다. 세척을 위해 25 mL의 세척버퍼 (50 mM NaH 2PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, pH 8.0) 흘려주어 비특이적으로 결합된 단백질을 제거한 뒤, 마지막으로 20 mL의 용출버퍼 (50 mM NaH 2PO 4, 300 mM NaCl, 300 mM Imidazole, pH 8.0)을 흘려주어 목적단백질인 단백질 A를 회수하였다. 회수된 단백질은 PD10 컬럼 (GE Healthcares사, 스웨덴)을 이용하여 탈염(desalting)하였다.
실시예 2 : 항체정제용 단백질 A 레진 제조
상기 실시예에서 정제한 단백질을 WorkBeads 40/10000ACT (Bio-Works사, 스웨덴) 에 커플링하여 단백질 A레진을 제조하였다. 자세하게는 10 ml의 레진을 DW로 2회 세척한 다음, 인산화버퍼 (pH 8.5)로 부유화하고 정제한 단백질 100 mg을 넣어 총 20 ml의 반응액을 준비하였다. 밤새 37℃에서 천천히 교반을 하여 커플링(coupling) 반응을 진행하였다. 반응이 끝난 후에는 진공필터을 통해 반응액을 완전히 제거하고 커플링된 레진을 DW로 2회 세척하였다. 다음으로는 1 M ethanolamine-HCl (pH 9.5)를 넣고 천천히 밤새 교반하여 비결합된 활성화 리간드를 비활성화(deactivation)하였다. 제조된 레진은 BW Sure로 명명되었다.
실시예 3 : BW Sure의 항체결합능 분석
BW Sure 레진의 성능을 분석하기 위하여 산업용 항체 생산에 널리 사용되고 있는 Mabselect Sure (GE Healthcare사, 스웨덴)와 항체결합능을 비교하였다. 정제조건은 다음과 같다.
Resin: BW Sure
Mabselect Sure
Columns volume: 3.42 ml (6.6 x 100 mm)
Sample: 1 mg/ml human polyclonal IgG in PBS, pH 7.4
Binding buffer: PBS, pH 7.4
Elution buffer: 100 mM glycine-HCl, pH 2.7
CIP: 5 CV 0.5 M NaOH at 2.4 min RT
Flow rate: 2.4, 4.8, 6 and 10 min RT
System: AKTA TM system
흐름속도에 따른 정제된 항체의 양을 분석한 결과, 2.4 min RT에서 BW Sure와 Mabselect Sure의 항체결합능은 각각 40.2, 29.35mg IgG/ml resin으로 나타났으며, BW Sure의 항체결합능이 흐름속도에 상관없이 전체적으로 Mabselect Sure 보다 더 우수한 것으로 판단되었다 (도 1).
실시예 4 : BW Sure의 HCP, HCD 제거능 분석
BW Sure 레진의 불순물 제거능을 평가하기 위하여 동물세포(CHO cell) 배양액에서 해당 레진을 통해 항체를 정제하고, 정제된 용출액내 숙주세포 유래 불순물(HCP, HCD)양을 분석하였다. 항체배양액은 오송첨단의료산업진흥재단 신약개발지원센터에서 제공받았고 정확한 분석을 위해서 동물세포 배양액(샘플)은 BW Sure의 앞서 분석된 항체결합능(DBC)의 15%인 20ml, 70%인 100ml를 주입하여 2회 정제하였다. 대조군으로 Mabselect Sure를 사용하였고, 정제조건은 다음과 같다.
Sample: 20 mL clarified CHO-cell extract
100 mL clarified CHO-cell extract
Columns volume: 3.42 ml (6.6 x 100 mm)
Binding buffer: 50 mM sodium phosphate, pH 7.4
Elution buffer: 100 mM glycine-HCl, pH 2.7
Flow rate: 1.7 mL/min, 0.6 mL/min, and 0.9 mL/min (equilibration, sample load, and elution)
Gradient: Step, 0-100% elution buffer, 10 column volumes (CV)
System: AKTA TM system
숙주세포 유래 단백질(HCP) 농도를 측정하기 위하여 HCP ELISA kits (Cygnus Technologies사, 미국)를 사용하였다. 실험은 제조사에서 추천하는 방법에 따라 진행하였다. 용출액(elute)을 well plate에 50ul씩 첨가하고, 이어서 HRP(HorseRadish Peroxidase)가 접합된 2차 항체를 100ul씩 첨가하였다. 실온에서 3시간 약 500rpm으로 흔들어 결합 반응을 유도하고, 조심스럽게 반응액을 버린 후 세척을 4회 진행하였다. 기질 TMB (3,3’,5,5’-tetrametylbenzidine) 100ul를 첨가하여 30분 동안 발색시킨 후, 0.5M 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 발색(OD450)을 측정하여 HCP의 농도를 분석하였다. 실험결과, 20 ml의 항체 배양액을 정제했을 경우에는 BW Sure와 Mabslect Sure에는 각각 667 ng/ml, 8016 ng/ml로 분석되었고, 100 ml의 항체 배양액을 정제했을 경우에는 각각 2009 ng/ml, 10938 ng/ml로 분석되었다 (도 2).
HCD를 정량하기 위해 PicoGreen kit (Promega, 미국)를 사용하였다. 실험은 제조사에서 추천하는 방법에 따라 진행하였다. 키트에 제공된 DNA를 이용하여 정량곡선을 구하고, 용출액(elute)을 TE버퍼(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)로 희석하여 측정하였다. PicoGreen reagent과 용축액을 1:1 비율로 잘 섞어 5분간 상온에서 반응시킨후, 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 (excitation ~480 nm, emission ~520 nm) 시료 형광을 분석하였다. 실험결과, 20 ml의 항체 배양액을 정제했을 경우에는 BW Sure와 Mabslect Sure에는 각각 4 ng/ml, 114 ng/ml로 분석되었고, 100 ml의 항체 배양액을 정제했을 경우에는 각각 12 ng/ml, 80 ng/ml로 분석되었다 (도 3).
두 결과를 종합하였을 때에, BW Sure가 상용화된 Mabslect Sure에 비해 세포배양액에서 유래되는 불순물 (HCP, HCD)의 제거능이 더 우수한 것으로 판단되었다.

Claims (7)

  1. 서열번호 1로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에서 28번째 아미노산인 아스파라긴(Asparagine)이 아르기닌(Arginine)으로 돌연변이(N28R)된 단백질이 고정되어 불순물 제거능이 향상된 항체 정제용 레진.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 N18H, D36V, N43Y/L 및 N52S로 이루어진 군에서 선택된 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 정제용 레진.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 반복 단위를 둘 이상 포함하는 다량체인 것을 특징으로 하는 항체 정제용 레진.
  4. 제1항에 있어서, 상기 레진은 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아크릴 레이트 및 폴리스틸렌으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 정제용 레진.
  5. (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 레진으로 충전된 흡착 칼럼에 항체를 포함하는 시료를 통액시켜 상기 흡착 칼럼에 항체를 결합시키는 단계;
    (b) 세척하여 결합된 항체만 남기는 단계; 및
    (c) 세척된 흡착 칼럼으로부터 부착된 항체를 분리 용출시켜 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계는 pH 6.5 내지 pH 8.0에서 수행되는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 (c) 단계는 pH 구배 완충용액 또는 pH 2.0 내지 pH 5.0의 완충용액을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법.
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