JPH02180900A - 免疫グロブリンｍの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫グロブリンＭの精製方法に関する。

［従来の技術］ 従来、試料中より抗体を精製する方法としてはいくつか
知られている０例えば、トランスフェリン、アルブミン
等の夾雑タンパク質及び脂質等が混在する腹水や血清の
試料においては、硫酸アンモニウム等の塩を用いた塩析
によりタンパク質画分を分別沈殿し、タンパク質の溶解
度の差を利用しである程度の部分精製を行なうことがで
きる６通常、５０％飽和硫酸アンモニウム水溶液により
ほぼ１００％の抗体が回収され、夾雑タンパク質もある
程度除去できる。さらに高純度の抗体を得るために、非
特異的抗体精製法や特異的抗体精製法による精製が行、
なわれる、非特異的抗体精製法としては、上記の抗体画
分を低塩濃度の緩衝液に透析しジエチルアミノエチル（
以下、ＤＥＡＥと言う）基を有する親木性樹脂あるいは
プロティンＡを固定した樹脂を用いて抗体をクロマトグ
ラフィーで精製する方法がある。また、特異的抗体精製
法としては、不溶性の支持体に固定化された抗原に抗体
を特異的にかつ可逆的に吸着させた後、ジオキサン等の
有機溶媒、エチレングリコール、カオトロピック・イオ
ン等で疎水的相互作用を減少させることにより、あるい
は尿素、塩酸グアニジン等の変性剤により抗体を抗原か
ら遊離させ溶出する方法がある。

このような方法は免疫グロブリンＧクラスの抗体の精製
には有効であるが、免疫グロブリンＭ（以下、ＩｇＭと
言う）のように真性グロブリンの性質を有するものは一
般にイオン強度の低い緩衝液では不可逆的な沈殿を生ず
るので、ＤＥＡＥによるイオン交換クロマトグラフィー
を比較的高塩濃度の緩衝液で透析した後に開始する必要
があり夾雑タンパク質の除去が困難である。

また、プロティンＡによる精製では、プロティンＡ固定
化カラムが高価なために一度に多量の抗体を処理するこ
とが困難であるため、通常アガロースやアクリルアミド
のような比較的軟質なゲルを用いたゲルろ過により精製
が行なわれている。ところがこのようなゲルを用いたゲ
ルろ過ではＩｇＭの分子量は約９０万と大きいために排
除限界を越えておりボイド・ボリュームに溶出されてし
まい他のタンパク質との分離が困難であるという欠点が
ある。さらに、軟質ゲルにおいて排除限界なＩｇＭが分
子篩に掛かるように上げた場合、ゲル強度が著しく減少
しクロマトグラフィーを行なうときの流速が得られず時
間がかかり非効率的である。

［発明が解決しようとする問題点］ ゛従って１本発明の目的は、効率良く高純度にＩｇＭを
精製する方法を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、ＩｇＭ精製法に関して鋭意研究の結果、
！！水性シリカゲルを基材とする高速液体ゲルろ過クロ
マトグラフィーによりＩｇＭを高効率に純度良く精製す
ることができることを見出しこの発明を完成した。

すなわち、本発明はクロマトグラフィーにより免疫グロ
ブリンＭを精製する方法において、親水性シリカゲルを
基材とする高速液体ゲルろ過クロマトグラフィーによる
ことを特徴とする免疫グロブリンＭの精製方法を提供す
る。

［発明の詳細な説明］ 上述のように、本発明の方法では、親水性シリカゲルを
基材とする高速液体ゲルろ過クロマトグラフィーにより
ＩｇＭを精製する。

本発明の方法において用いることができる親水性シリカ
ゲルは１表面に水酸基が結合していてタンパク質、酵素
等に対し吸着性が低いものが好ましい、また、機械的強
度が高いものが好ましい、親水性シリカゲルの分画範囲
は、ＩｇＭの分子量９０万を含んでいる必要がある。上
記親水性シリカゲルの好ましい具体例としては１例えば
。

ＴＳに−Ｇｅｌ　Ｇ４０００ＳＷ　　（商品名、東ソー
株式会社製）を挙げることができる。

高速液体ゲルろ過クロマトグラフィーの条件は、従来の
高速液体ゲルろ過クロマトグラフィーと同様である。す
なわち、流速３〜４　　ｍ１７分で。

リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等の通常の緩衝液を
用いて実施すればよい。

本発明の方法により、精製することができる試料は、Ｉ
ｇＭを含む試料であれば特に限定されないが、ＩｇＭを
含む腹水や血清等を硫酸アンモニウム等を用いた塩析に
よりＩｇＭ含有画分を沈殿させたものを精製する場合に
特に威力を発揮する。すなわち、ＩｇＭを含む腹水や血
清等を通常５０％飽和硫酸アンモニウム水溶液で塩析し
、遠心分離して沈殿物を集め、上演を除去した後、沈殿
に例えばＰＢＳ等を加えて沈殿を再溶解する。この操作
で腹水中の夾雑タンパク質、特にアルブミンの多くは沈
殿せずに上清に溶解したままで残る。それに対してＩｇ
Ｍはほぼ１００％沈殿として回収できる。このようにし
て部分的に精製したＩｇＭを本発明の方法でさらに精製
すると、高純度なＩｇＭが効率良く得られる。

［実施例１ 以下１本発明を実施例を挙げてさらに具体的に説明する
。ただし、本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。

宜」０ｉ上 結腸癌に対するモノクローナル抗体（ＩｇＭ）を産生ず
るマウス・バイプリドーマμｇをブリンスクン処理した
マウスに腹腔内投与した。投与後約ｌＯ日月のマウスか
らＩｇＭを含んだ腹水的５−１を得た。得られた腹水５
雪ｌに１００％飽和硫酸アンモニウム水溶液５＠ｌを氷
上で撹拌しながら滴下した０次に、　４５００回転で２
０分間遠心分離した後、上清を除去し沈殿物を得た。沈
殿物はリン酸緩衝化生理食塩水１０＋ｓｌを加えて再び
溶解した。このようにして得られた抗体画分は、　ＴＳ
に−Ｇｅｌ　Ｇ４０００ＳＷを用いてゲルろ過を行なっ
た。ゲルろ過の条件は。

カラムサイズ：２１．５ｃｍ　ｘ　６０ｃ諺、溶出液ニ
リン酸緩衝化生理食塩水、流速：　４　ｍｌ／ｓｉｎで
行なった。

その溶出パターンの結果を図に示した。

ビーク２が免疫グロブリンのピークである。ビークｌ及
びビーク３から５は、夾雑タンパク質のピークである。

さらに、それぞれのピークについて５ＯＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行なった。その結果、免疫グロ
ブリンＭの単一バンドのみが検出された。

［発明の効果〕 本発明により効率良く高純度の免疫グロブリンＭを得る
ことができる免疫グロブリンＭの精製方法が提供された
。。

【図面の簡単な説明】

図は２本発明の方法によるクロマトグラムを示す図であ
る。 軸 ６４１１品　（’、、）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. クロマトグラフィーにより免疫グロブリンＭを精製する
   方法において、親水性シリカゲルを基材とする高速液体
   ゲルろ過クロマトグラフィーによることを特徴とする免
   疫グロブリンＭの精製方法。