JPH09504532A - クロマトグラフィー法による第８因子を含むウィルス不活性化分画の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 クロマトグラフィー法により第８因子を含むウィルス不活性化分画を製造する方法であって、寒冷沈降物又は血漿を原料とし、続いて任意で酸化アルミニウム処理を行い、寒冷沈降物の溶解後にメンブレンクロマトグラフィーを用いる分離工程を少なくとも一回行う方法。上記分画はウィルス不活性化処理を行い、好ましくはさらに低温殺菌工程に付す。

Description

【発明の詳細な説明】 クロマトグラフィー法による 第８因子を含むウィルス不活性化分画の製造方法 本発明はクロマトグラフィー法により第８因子を含むウィルス不活性化分画を 製造する方法、及び本発明の方法により得ることができる第８因子を含む分画に 関する。 第８因子は血液凝固において重要な役割を演じる生命物質である。従って、第 ８因子の投与によって血液凝固障害を治療することができる。そのため投与可能 な第８因子製剤の必要性は大きい。天然の材料から濃縮度の高い形態の第８因子 を単離しようと非常に多くの試みがなされてきた。例えば寒冷沈降物から第８因 子を精製するクロマトグラフィー法が既に知られている。寒冷沈降物とは低温で 血漿を処理することにより得られる分画のことである。EP 367 840 B1は、予備 寒冷沈降せずに血漿から第８因子を単離するクロマトグラフィー法に関するもの である。イオン交換基で修飾された親水性クロマトグラフィー材料によるクロマ トグラフィー分離によって第８因子を含有する分画が分離される。EP 0 238 701 は超高純度の感染性抗血友病因子の製造方法に関するもので、この方法では、前 処理済分画は、エタノール沈殿によってフィブリノーゲン、グロブリン、アルブ ミン類及び他の干渉成分から遊離された寒冷沈降物である。欧州特許出願 88 10 8 458.6 は寒冷沈降物分画をウィルス不活性化した後のイオン交換剤によるクロ マトグラフィー分離を記載している。EP 0 173 242A は、炭水化物のみをベース とする（但し、この炭水化物マトリックスは DEAE 基により修飾されている）陰 イオン交換材料によるクロマトグラフィーによって第８因子調製品を得る方法を 記載している。特に、DEAE セファロース及び DEAE セルロースが有用であると 記載されている。GB-A-1,178,958に、ECTEOLA セルロースカラムを用いた第８因 子の精製が記載されている。この修飾セルロースはエピクロロヒドリン及びトリ エタノールアミンの反応によって導入された塩基性置換基を含む。上述の先行技 術はバッチ式プロセスの形態のクロマトグラフィー分離又はカラムクロマトグラ フィーのいずれかを利用している。これらの方法ではかなり良好な結果が得られ るものの、生物学的に貴重な第８因子の収率を高めることが経済的及び倫理的理 由からさらに求められている。 このため本発明の基礎にある技術的課題は、先行技術から派生した、収率及び 生物活性が改善された第８因子調製品が得られる方法を提供することにある。 驚くべきことにこの課題は、寒冷沈降物又は血漿を原料とし、続いて任意で酸 化アルミニウム処理を行い、かつ寒冷沈降物の溶解後にメンブレンクロマトグラ フィーを用いた分離工程を使用する方法によって解決される。 本発明の方法は市販の寒冷沈降物又は血漿を用いて行うことができる。好まし くは解凍した寒冷沈降物を、第８因子を予め濃縮する目的でサンプルをさらに予 備精製するように酸化アルミニウムで処理する。 好ましくは、メンブレン中又はメンブレン上に配置されている材料による実際 のクロマトグラフィー精製に先立って、ウィルス不活性化を行う。このウィルス 不活性化は EP 131 740 A1に記載された方法に従って、生体適合性有機溶媒（洗 フェート）で処理することにより行われる。コラン酸ナトリウム/TNBP でも良好 な結果が得られる。好ましくは、洗剤は最大 15 重量% までの量で使用する。し かしながら、ウィルス不活性化はメンブレンクロマトグラフィーによる分離の後 に行ってもよい。 サンプル中の第８因子を精製するためのクロマトグラフィー分離工程は、イオ ン交換基により修飾されたベース材料、特に陰イオン交換剤、又は免疫アフィニ ティリガンドにより修飾された材料のいずれかによって行ってもよい。上記の材 料はメンブレン中に配置されていることが重要である。好ましくは、これらのメ ンブレンは修飾セルロース又はプラスチックファイバーのようなベース材料でで きている。多孔性ポリ（グリシジル メタクリレート）及び／又は同様の構造を 持つ他の多孔性親水性ポリマー並びに親水化されたポリスチレンでできたメンブ レン及びコンパクトディスクが特に有用である。 第一の例では、分離に適したメンブレンはセルロース製の積層薄膜又はプラス チックファイバーのいずれかからなるものであり、或いは第二の例では、シリカ ゲル又はポリマー担体でできたコンパクトディスクからなる。これらのメンブレ ン又はディスクのベース材料には対応する陰イオン交換基又は免疫アフィニティ リガンドが備えられている。特に第四アミン又はジエチルアミノエチル基のよう な陰イオン交換基がイオン交換基として考えられる。適当な陽イオン交換剤は原 則的に、スルホン酸又はリン酸基で修飾された材料のような弱酸性又は強酸性の 陽イオン交換剤である。 イオン交換基はいわゆるスペーサーを用いて又は用いずにベース材料ファイバ ーに結合させることができる。スペーサーを備えた材料はテンタクル（触手）材 料とも呼ばれる。対応するスペーサー及びリガンドがDE 42 04 694に述べられて いる。例えば、グルコサミン残基もスペーサーとして作用しうる。DEAE又は第四 アミンのような陰イオン交換基が、多孔性ポリ（グリシジル メタクリレート） 又は上記の他の材料でできたメンブレンに結合していてもよい。陰イオン交換基 の結合は、メンブレンを形成する材料に直接なされるか、又はグルコサミン残基 等のスペーサーを介してなされることもある。 本発明の方法の別の態様では、第８因子に対して高いアフィニティを持つ固定 化された物質によるアフィニティメンブレンクロマトグラフィーを使用する。特 に、モノクローナル及び／若しくはポリクローナル抗体、又は第８因子結合性抗 体フラグメントが適している（免疫アフィニティメンブレンクロマトグラフィー ）。好ましくはこれらの抗体はヒト又はマウスに由来するものである。 第８因子に対してアフィニティを持つ物質は化学反応性基によって担体に固定 化される。好ましくはこの反応性基は担体材料に直接作用するよりもむしろスペ ーサーの末端に作用する。第８因子に対する物質の固定化は、トシル、トレシル 、ヒドラジド等のような反応性基における結合を介して行われる。類似の方法は 、フィリップス（T.M.Phillips）の「アフィニティクロマトグラフィー」（「ク ロマトグラフィー」（E．Heftmann，ed），5th ed．Elsevier，Amsterdam 1992 ）により知られている。 プロテインＡ又はプロテインＧリガンドを持つメンブレン上に抗体を予め吸着 させておいてもよい。その後共有結合架橋を行うことによって、抗体の溶出（カ ラムの浸出）を防ぐことができる。プロテインＡ又はプロテインＧメンブレン上 に抗体を架橋させるには遊離の担体の場合と同様の操作を用いることができる。 プロテインＡ又はプロテインＧに固定化させる利点は、抗体が分子の不変セグメ ント（F_c）においてのみ固定化されることにある。従って、抗原結合部分（F_ab ）は遊離のまま維持され、第８因子との相互作用は妨けられない。 別の態様では、疎水性相互作用を確実にさせる材料を第８因子の分離に使用す る。使用される疎水性材料は非環状及び／又は環状アルキル鎖、例えばC₁ないし C₁₈アルキル鎖、及び芳香族物質である。疎水性相互作用を行う適当な材料とし ては好ましくは疎水性勾配をもつものが挙げられる。疎水性は、例えばヒドロキ シ基、アミノ基、シアノ基等のプロトン性極性又は非プロトン性極性基のような 極性基を導入することによって勾配をつけることができる。好ましくは、それぞ れの分離条件に応じて適合させる。 ウィルス不活性化は熱処理により行ってもよい。好ましくは、第８因子を含む 溶出サンプルを一回目のメンブレンクロマトグラフィー工程に続いて低温殺菌工 程に付す。対応する操作は P 43 18 435.9に提唱されている。そこでは第８因子 が濃縮された分画を安定化剤の存在下でジ−又はトリ−アルキルリン酸及び任意 で湿潤剤と接触させて、さらに、同時に又は続いて 55 ℃から 67 ℃の範囲の昇 温下で５ないし 30 時間処理する。ウィルス不活性化の２つの方法、洗剤による 処理及び加熱処理を組み合わせると有利にできる。 低温殺菌工程に使用した化学物質を除去するために、二回目のメンブレンクロ マトグラフィーを続いて行ってもよい。好ましくは、添加した安定化剤の分離を 、スペーサーを介してクロマトグラフィー担体材料の表面に配置されているDEAE 又は第四アンモニア化合物で修飾されたメンブレンによって行う。加えて、対応 するリガンドをスペーサーを用いずに担体材料の表面上に配置することも可能で ある。選択された条件下では安定化剤がこの陰イオン交換材料によって抑制され ることはないが、第８因子はクロマトグラフィー材料上に吸着される。 その後、徐々に高い塩濃度を示す水性溶媒系で第８因子を溶出する。 こうして得られた第８因子を含む分画を通常の方法により濃縮し、添加物を加 え（filled）、任意で凍結乾燥する。 好ましくは、一回目のメンブレンクロマトグラフィー分離工程において、低イ オン強度の溶液からの第８因子を使用する。好ましくは、この水性系は０ないし 150 mM塩化ナトリウム溶液に対応するイオン強度を持つ。このようなイオン強 度では、第８因子は依然としてクロマトグラフィー材料に吸着されているが、結 合力のより弱い不純物は同じイオン強度の水性系で洗い出すことができる。 本発明の方法の他の態様では、吸着された物質の精製を 200ないし 400 mM 塩 化ナトリウム溶液に対応するイオン強度の水性系で行うことができる。その後、 第８因子の脱着及びこの分画の溶出を 500ないし1500 mM 塩化ナトリウム溶液に 対応するイオン強度の水性系で、pH 値を４ないし９の範囲に維持しながら行う 。陽イオン交換クロマトグラフィーを行う場合は、好ましくは pH ＜６で行うが 、陰イオン交換クロマトグラフィーは逆に約６よりも高い pH 値で行う。 第８因子の精製を免疫アフィニティメンブレンクロマトグラフィーで行う場合 は、陰イオン交換材料を用いる上記の方法とは異なり、カオトロピック試薬又は 高濃度の塩溶液で溶出を行う。好ましくは、第８因子に高いアフィニティを持つ 物質と第８因子自身の間の結合を分裂させるのに十分な濃度のカオトロピック試 薬又は塩で溶出を行う。それぞれの溶出系における上記材料の濃度は第８因子と 対応する結合成分の間のアフィニティの強さに依存する。好ましくは、あまり高 くないアフィニティを持つ抗体を免疫アフィニティリガンドとして使用する。そ の結果として、変性能の低い水性溶液で溶出を行うことができる。好ましくは、 上記免疫アフィニティメンブレンからの第８因子の溶出に、１から６、とりわけ ２から４ Mの尿素濃度を持つ水性溶液又は対応する高濃度の塩溶液を使用する。 疎水性相互作用クロマトグラフィーの場合、例えば高濃度の硫酸アンモニウム （最高濃度 ４ M）又は塩化ナトリウム（最高濃度 ５ M）のようなイオン強度の 非常に高い水性溶液としてサンプルを使用する。特に、イオン強度のより低い塩 溶液で漸次又は連続的に溶出を行う。有機溶媒を含む水性溶液、とりわけ希アル コール溶液を疎水性相互作用メンブレンクロマトグラフィーにおいてサンプルを 溶出するための低イオン強度の溶液として使用してもよい。 驚くべきことに本発明の操作により第８因子の迅速且つ混入のない精製が確実 になされ、同時に第８因子は高純度及び高収率で得られる。さらに、この方法で 得られる第８因子の特異的活性は非常に高く、それは本発明の方法における活性 因子の変性が低いことによるものと考えられる。よって、本発明の方法を介して 得ることができる第８因子含有分画も本発明の対象である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヨジク ジュロ オーストリア、ヴィーン Ａ―1020、ホフ ェネデルガゼ ６／１／38

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．クロマトグラフィー法により第８因子を含むウィルス不活性化分画を製造す る方法であって、寒冷沈降物又は血漿を原料とし、続いて任意で酸化アルミニウ ム処理を行い、寒冷沈降物の溶解後にメンブレンクロマトグラフィーを用いた分 離工程を少なくとも一回行う方法。 ２．前記分離工程がメンブレン中又はメンブレン上に配置されているイオン交換 材料、特に陰イオン交換材料により行われる、請求の範囲１に記載の方法。 ３．ウィルス不活性化が前記分画をジ−又はトリ−アルキルリン酸及び非イオン 性界面活性剤で処理することによって行われる、請求の範囲１及び／又は２に記 載の方法。 ４．ウィルス不活性化が低温殺菌工程、及び任意でそれに続くメンブレンクロマ トグラフィーを用いた追加の分離工程により行われる、請求の範囲１ないし３の いずれかに記載の方法。 ５．前記メンブレンクロマトグラフィーが第８因子に対して高いアフィニティを 持つ材料により行われる、請求の範囲１ないし４のいずれかに記載の方法。 ６．第８因子に対して高いアフィニティを持つ材料が高分子量及び／又は低分子 量のリガンドにより修飾されている、請求の範囲１ないし５のいずれかに記載の 方法。 ７．前記材料が第８因子に対する抗体で修飾されている、請求の範囲６に記載の 方法。 ８．第８因子に対して高いアフィニティを持つ修飾された材料が第８因子に対し て高いアフィニティを持つ固定化リガンドを備えている、請求の範囲５ないし７ のいずれかに記載の方法。 ９．クロマトグラフィー材料が分離すべき第８因子と疎水性相互作用をすること ができるか、又は疎水性相互作用を媒介する適当なリガンドを備えている、請求 の範囲１ないし８のいずれかに記載の方法。 10．精製すべきサンプルを、０ないし 150 mM 塩化ナトリウムに対応する低いイ オン強度を持つ水性系によりイオン交換材料を含むメンブレンに適用し、任意で 200ないし 400 mM 塩化ナトリウム溶液に対応するイオン強度のより高い水性系 で洗浄し、その後 pH 値を４ないし９に維持しながら、500ないし1,500mM塩化ナ トリウム溶液に対応する高いイオン強度の水性系で溶出する、請求の範囲１ない し９のいずれかに記載の方法。 11．精製すべきサンプルを、第８因子に対する抗体に第８因子を結合させること ができる溶液からメンブレンに適用し、第８因子が吸着されたアフィニティメン ブレンを任意で洗浄し、その後、例えば１ないし６ M尿素に対応する濃度のカオ トロピック試薬、又は対応するより高濃度の塩溶液で溶出する、請求の範囲１な いし10のいずれかに記載の方法。 12．精製すべきサンプルを、非常に高いイオン強度を持つ溶液をから表面上に疎 水性リガンドを備えたメンブレンに適用し、より低いイオン強度を持つ溶媒系で 溶出する、請求の範囲１ないし10のいずれかに記載の方法。 13．第８因子を含む溶出分画を濃縮し、添加物を加え、及び／又は凍結乾燥する 、請求の範囲１ないし12のいずれかに記載の方法。 14．前記ウィルス不活性化が最大 15 重量% の洗剤で処理することによって行わ れる、請求の範囲１ないし13のいずれかに記載の方法。 15．請求の範囲１ないし14のいずれかに記載の方法を使用して得られる第８因子 を含む分画。