CZ290186B6 - Způsob výroby frakce s inaktivovanými viry obsahující faktor VIII chromatografickými metodami a frakce připravitelná tímto způsobem - Google Patents

Abstract

Zp sob v²roby frakce s inaktivovan²mi viry obsahuj c faktor VIII chromatografick²mi metodami, p°i n m se vych z z kryoprecipit tu nebo krevn plazmy a po p° padn m zpracov n hydroxidem hlinit²m se po rozpu t n kryoprecipit tu prov d inaktivace vir p soben m di- nebo trialkylfosf tu a neiontov ho povrchov aktivn ho inidla na tuto frakci, po n n sleduje alespo jeden separa n stupe za pou it membr nov chromatografie s vylou en m afinitn ch membr nov²ch syst m skl daj c ch se z dut²ch vl ken. Krom inaktivace vir se p°ednostn prov d t p° davn pasterizace.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby frakce s inaktivovanými viry obsahující faktor VIII chromatografíckými metodami a dále také frakce obsahující faktor VIII, kterou je možno získat způsobem podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Faktor VIII je životně důležitá látka, která hraje důležitou úlohu při srážení krve. Poruchy srážlivosti krve je tedy možno léčit podáváním faktoru VIII. Proto existuje velká potřeba farmaceutických přípravků obsahujících faktor VIII, které by byly vhodné pro podávání pacientům. Byla učiněna řada pokusů o izolaci faktoru VIII ve vysoce obohacené formě z přírodních zdrojů. Jsou již známy chromatografícké metody purifíkace faktoru VIII z kryoprecipitátů. Kryoprecipitát je frakce, kterou lze získat zpracováním plazmy za chladu. EP367 840 81 se týká chromatografického způsobu izolace faktoru VIII z krevní plazmy bez předběžné kryoprecipitace. Frakce obsahující faktor VIII se odděluje chromatografíckou separací na hydrofilním chromatografickém materiálu, kteiý je modifikován skupinami vyměňujícími ionty. EP 0 238 701 se týká způsobu výroby ultračistého infekčního antihemofilického faktoru, při němž jsou předběžně upravené frakce tvořeny kryoprecipitátem zbaveným fibrinogenu, globulinu, albuminů a jiných rušivých složek srážením ethanolem. V EP-A-0 343 275 je popsána chromatografická separace pomocí ionexů, jíž se podrobuje frakce kryoprecipitátů po inaktivaci virů. V EP-A-0 173 242 A je popsán způsob získávání přípravků obsahujících faktor VIII chromatografíí na anexových materiálech, které jsou výhradně založeny na uhlohydrátech, přičemž uhlohydrátová matrice je modifikována skupinami DEAE. Jako užitečné materiály jsou popsány zejména DEAE Sepharose a DEAE celulóza.

Ve WO-A-90/05018 je popsán způsob čištění látek filtrací přes dutá vlákna, na nichž jsou zakotveny afínitní skupiny.

V EP-A-0 286 323 je popsán způsob čištění polypeptidů na imunoafinitní matricí.

EP-A-0 303 064 se týká čištění preparátů faktoru VIII chromatografíí na fosfolipidové matrici.

EP-A-0 233 620 se týká ve vodě nerozpustného porézního gelu a použití tohoto gelu při způsobu čištění faktoru VIII.

EP-A-0 567 448 popisuje způsob výroby vysoce čistého, z hlediska virů bezpečného, přípravku faktoru VIII chromatografíckým čištěním, zpracováním tenzidy a tepelným zpracováním přípravku faktoru VIII v pevném stavu.

V GB-A-1 178 958 je popsána purifíkace faktoru VIII za použití sloupců ECTEOLA celulózy. Tato modifikovaná celulóza obsahuje bazické substituenty zavedené reakcí s epichlorhydridem a triethanolaminem. Podle výše popsaného dosavadního stavu techniky se chromatografická separace provádí buď za použití diskontinuálních procesů nebo za použití sloupcové chromatografie. Přestože se těmito metodami dosahuje poměrně dobiých výsledků, stále existuje z ekonomických a z etických důvodů potřeba zvýšit výtěžky biologicky cenného faktoru VIII.

-1 CZ 290186 B6

Úkolem tohoto vynálezu je tedy vyřešit technický problém spočívající ve vyvinutí způsobu, který vychází z dosavadního stavu techniky, ale umožňuje zlepšenou přípravu faktoru VIII, pokud se týče výtěžků a biologické účinnosti.

Podstata vynálezu

S překvapením byl tento problém vyřešen způsobem, při němž se vychází z kryoprecipitátu nebo krevní plazmy a po případném zpracování hydroxidem hlinitým se po rozpuštění kryoprecipitátu provádí separační stupeň za použití membránové chromatografie.

Způsob podle vynálezu se může provádět za použití obchodně dostupného kryoprecipitátu nebo krevní plazmy. Roztavený kryoprecipitát se přednostně zpracovává hydroxidem hlinitým za účelem další předběžné purifíkace vzorku, kterou se předběžně zvýší koncentrace faktoru VIII.

Inaktivace virů se přednostně provádí před vlastní chromatografickou purifikací na materiálech, které jsou uspořádány v nebo na membránách, inaktivace virů se přitom provádí způsobem popsaným vEP 131740 AI pomocí zpracování biokompatibilními organickými rozpouštědly (detergenty), směsí Tritonu^ X-100 a tri-n-butylfosfátu (TNBP), přednostně směsí Tweenu^ aTNBP. Dobrých výsledků se dosahuje také za použití směsi cholátu sodného a TNBP. Detergentů se přednostně používá v množstvích do 15 % hmotnostních, inaktivace virů se však může také provádět až po separaci membránovou chromatografií.

Chromatografický separační stupeň pro purifikací faktoru VIII ve vzorku se může provádět buď na základních materiálech modifikovaných skupinami vyměňujícími ionty, zejména na anexech nebo za použití materiálů modifikovaných imunoafmitními ligandy. Přitom je rozhodující, že uvedené materiály musí být uspořádány do podoby membrán. Tyto membrány přednostně sestávají ze základního materiálu, jako je modifikovaná celulóza nebo plastové vlákno. Vhodné jsou zejména membrány a také kompaktní disky vyrobené z porézních poly(glycidylmethakrylátů) a/nebo jiných porézních hydrofilních polymerů s podobnou strukturou a také z hydrofilizovaného polystyrenu.

V prvním případě se membrána vhodná pro dělení skládá buď ze souboru na sebe položených tenkých fólií z celulózy nebo plastových vláken a ve druhém případě je tvořena kompaktními disky ze silikagelu nebo polymemích nosičů. Základní materiály membrán nebo disků jsou opatřeny odpovídajícími skupinami vyměňujícími anionty nebo imunoafmitními ligandy. Jako ionexové skupiny přicházejí v úvahu zejména skupiny vyměňující anionty, jako jsou skupiny kvatémích aminů nebo diethylaminoethylskupiny. Vhodnými katexy jsou zejména v podstatě slabě a silně kyselé měniče kationtů, jako jsou materiály, které jsou modifikovány sulfonovými skupinami nebo skupinami kyseliny fosforečné.

Skupiny vyměňující ionty mohou být připojeny k vláknům základního materiálu prostřednictvím tzv. mezemíků (spacerů), nebo bez nich. Materiály obsahující spacery se také označují názvem tentaklové (tykadlové) materiály. Odpovídající spacery a ligandy jsou uvedeny v DE 42 04 694. Jako spacer může také například sloužit glukosaminový zbytek. Skupiny vyměňující anionty, jak jsou DEAE nebo skupiny kvatémích aminů, mohou být také připojeny k membránám zhotoveným z porézního poly(glycidylmethakrylátu) nebo jiných výše uvedených materiálů. Skupiny vyměňující anionty mohou být přitom připojeny buď přímo k membránotvomému materiálu nebo také prostřednictvím spaceru, například glukosaminového zbytku.

Podle dalšího provedení způsobu podle vynálezu se používá afmitní membránové chromatografie s imobilizovanými látkami, které vykazují vysokou afinitu vůči faktoru VIII. K. tomuto účelu se hodí zejména monoklonální a/nebo polyklonální protilátky nebo fragmenty protilátek vázajících

-2CZ 290186 B6 faktor VIII (imunoafinitní membránová chromatografie). Protilátky jsou přednostně humánního nebo murinního původu.

Látky vykazující afinitu vůči faktoru VIII se na nosičích imobilizují prostřednictvím chemicky reaktivních skupin. Takové reaktivní skupiny přednostně atakují konec spaceru a nikoliv přímo nosičový materiál. Imobilizace látek pro faktor VIII se provádí prostřednictvím vazby k reaktivním skupinám jako je tosylová, tresylová nebo hydrazidová skupina aj. Odpovídající postupy jsou známy z T. M. Phillips Afinity Chromatography v Chromatography (E. Heftmann ed.), 5. vydání. Elsevier. Amsterdam 1992.

Protilátky je také možno předadsorbovat na membrány nesoucí ligandy proteinu A nebo proteinu G. Následujícím kovalentním zesíťováním se může zabránit eluci protilátek (vyluhování ze sloupce). Pro zesíťování protilátek na membránách s proteinem A nebo proteinem G se může použít podobného postupu jako v případě volných nosičů. Výhodou imobilizace na proteinu A nebo proteinu G je, že protilátky jsou imobilizovány výhradně na konstantním segmentu molekuly (F_c). Část vázající antigen (F_ab) tedy zůstává volná a není bráněno její interakci s faktorem VIII.

Podle jiného přednostního provedení se pro separaci faktoru VIII používá materiálů, které jsou schopny zajistit hydrofobní interakci. Jako hydrofobních materiálů se používá acyklických a/nebo cyklických alkylových řetězců, například alkylových řetězců s 1 až 18 atomy uhlíku, a aromatických látek. Vhodné materiály poskytující hydrofobní interakci přednostně zahrnují látky s odstupňovanou hydrofobicitou. Hydrofobicitu je možno odstupňovat zavedením polárních skupin, jako jsou protické polární nebo aprotické polární skupiny, například hydroxyskupiny, aminoskupiny a kyanoskupiny. Přednostně se toto odstupňování hydrofobicity provádí s ohledem na příslušné separační podmínky.

Inaktivace virů se také může provádět zpracováním teplem. Přednostně se přitom postupuje tak, že se eluovaný vzorek obsahující faktor VIII zpracovává v pasterizačním stupni po prvním membránovém chromatografickém stupni. Odpovídající postup je navržen vDE 4318435. Přitom se frakce obohacené faktorem VIII uvádějí do styku s di- nebo trialkylfosfáty a popřípadě se smáčedly za přítomnosti stabilizátorů a současně nebo následně se na ně působí po dobu 5 hodin až 30 hodin zvýšenými teplotami v rozmezí od 55 do 67 °C. Může být výhodné kombinovat obě tyto metody inaktivace virů, tj. zpracování detergenty a působení tepla.

Pro odstranění chemikálií použitých v pasterizačním stupni může následovat druhá membránová chromatografie. Oddělování přidaných stabilizátorů se přednostně provádí pomocí membrány modifikované DEAE nebo kvatémími amoniovými sloučeninami, které jsou uspořádány na povrchu chromatografického nosičového materiálu za použití spacerů. Odpovídající ligandy je možno uspořádat na povrchu nosičového materiálu také bez použití spacerů. Za zvolených podmínek nejsou stabilizátory tímto anexovým materiálem retardovány, kdežto faktor VIII se adsorbuje na chromatografickém materiálu.

Potom se faktor VIII eluuje vodným rozpouštědlovým systémem s postupně vzrůstajícími koncentracemi soli.

Frakce obsahující faktor VIII, která se takto získá, se zkoncentruje, naplní do vhodných nádob a popřípadě konvenčními způsoby lyofilizuje.

V prvním membránovém chromatografickém separačním stupni se faktor VIII přednostně aplikuje z roztoku o nízké iontové síle. Vodný systém má přednostně iontovou sílu, která odpovídá roztoku chloridu sodného o 0 až 150mM koncentraci. Při takové iontové síle se faktor VIII ještě adsorbuje na chromatografickém materiálu, zatímco nečistoty, které se vážou slaběji, je možno vymýt za použití vodného systému se stejnou iontovou silou.

-3 CZ 290186 B6

Podle dalšího provedení způsobu podle vynálezu se purifikace adsorbovaného materiálu může provádět za použití vodného systému s iontovou silou odpovídající 200 až 400mM roztoku chloridu sodného. Desorpce faktoru VIII a eluce této frakce se potom provádějí vodným systémem o iontové síle odpovídající 500 až 1500mM roztoku chloridu sodného, přičemž hodnota pH se udržuje v rozmezí od 4 do 9. Pokud se provádí katexová chromatografie, přednostně probíhá při pH nižším než 6, zatímco anexová chromatografie se provádí spíše při vyšších hodnotách pH, nad 6.

Pokud se purifikace faktoru VIII provádí imunoafinitní membránovou chromatografií, potom se na rozdíl od výše popsaného způsobu za použití anexových materiálů provádí eluce chaotropickými činidly nebo vysoce koncentrovanými solnými roztoky. Přednostně se eluce provádí s takovými koncentracemi chaotropických činidel nebo solí, které postačují pro rozbití vazby mezi látkou s vysokou afinitou k faktoru VIII a faktorem VIII. Koncentrace uvedených látek v konkrétně použitých elučních systémech závisí na intezitě afinity mezi faktorem VIII a odpovídající vazebnou složkou. Jako imunoafínitních ligandů se přednostně používá protilátek, které nemají příliš vysokou afinitu. V důsledku toho se eluce může provádět vodnými roztoky s nižší denaturační schopností. Přednostně se pro eluci faktoru VIII z imunoafinitní membrány používá vodných roztoků močoviny o 1 až 6M, zejména o 2 až 4M koncentraci, nebo odpovídajících vysoce koncentrovaných roztoků solí.

Při hydrofobní interakční chromatografii se vzorek aplikuje z vodného roztoku s velmi vysokou iontovou silou, například z vysoce koncentrovaného roztoku síranu amonného (až do koncentrace 4M) nebo chloridu sodného (až do koncentrace 5M). Eluce se zejména provádí postupně nebo kontinuálně solnými roztoky o nižší iontové síle. Jako roztoků o nižší iontové síle pro eluci vzorků při hydrofobní interakční membránové chromatografii se také může použít vodných roztoků s organickými rozpouštědly, zejména zředěných alkoholických roztoků.

Způsob podle vynálezu s překvapením zajišťuje rychlou a nekomplikovanou purifikaci faktoru VIII, který se získává současně s vysokou čistotou a ve vysokém výtěžku. Kromě toho specifická aktivita faktoru VIII, získaného tímto způsobem, je dosti vysoká, což lze vysvětlit nízkou denaturací aktivního faktoru při způsobu podle vynálezu. Předmětem vynálezu je tedy také frakce obsahující faktor VIII připravená způsobem podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn chromatogram získaný způsobem podle vynálezu, jak je popsán v příkladu 1.

Na obr. 2 je znázorněn chromatogram získaný způsobem podle vynálezu ve zmenšeném měřítku, jak je popsán v příkladu 2.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Separace faktoru VIII

Kryoprecipitát po zpracování hydroxidem hlinitým, vysrážení ainaktivaci virů působením detergentu v rozpouštědle se podrobí separaci pomocí anexové membrány (anex QA) uspořádané v podobě kompaktní porézní trubky o délce 53 mm a průměru 23 mm, jejíž vnitřní otvor je

-4CZ 290186 B6

I mm. Použije se těchto podmínek: pufr A: lOmM citran sodný, 120mM glycin, ImM chlorid vápenatý, pH 7,0; pufr B: pufr A obsahující navíc 1M chlorid sodný; vstřikovací objem 20 ml. Předběžná úprava trubky se provede směsí 88 % pufru A a 12 % pufru B. Průtoková rychlost v průběhu aplikace na anex je 6 ml/min, zatímco průtoková rychlost během eluce je 9 ml/min; zpětný tlak je 0, 8 MPa. Hodnoty relativní absorbance se vztahují k absorbanci změřené UV detektorem nastaveným na hodnotu 280 nm. Pořízený chromatogram je uveden na obr. 1.

Příklad 2

Obr. 2 ilustruje ve zmenšeném měřítku experimentální izolaci faktoru VIII zpracováním v anexové kompaktní porézní trubce (anex QA) o délce 53 mm, průměru 23 mm a vnitřním otvoru 1 mm. Frakce obsahující faktor VIII se upraví zpracováním hydroxidem hlinitým, srážením a zpracováním směsí detergentu a rozpouštědla za účelem inaktivace virů. Použije se těchto podmínek: pufr A: lOmM citran sodný, 120mM glycin, ImM chlorid vápenatý, pH 7,0; pufr B: pufr A obsahující navíc 1M chlorid sodný; vstřikovací objem 500 μΐ. Předběžná úprava trubky se provede směsí 88 % pufru A a 12 % pufru B. Průtoková rychlost v průběhu aplikace na anex je 6 ml/min, zatímco průtoková rychlost během eluce je 9 ml/min; zpětný tlak je 0,8 MPa. Píky č. 1 a 2 znázorněné na obr. 2 odpovídají kontaminačním proteinům, jako je transferrin algM; pík č. 3 odpovídá kontaminačním proteinům, převážně HSA a pík č. 4 odpovídá komplexu faktor VIII/vWF (von Willebrandtův faktor). Hodnoty relativní absorbance se vztahují k absorbanci změřené UV detektorem nastaveným na hodnotu 280 nm.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby frakce s inaktivovanými viry obsahující faktor VIII chromatografickými metodami, vyznačující se tím, že se v roztátém kryoprecipitátu nebo krevní plazmě po případném zpracování hydroxidem hlinitým inaktivují viry působením di- nebo trialkylfosfátu a neiontového povrchově aktivního činidla a potom se vzniklá frakce podrobí alespoň jedné separační operaci za použití membránové chromatografie na membránách nebo kompaktních discích z porézních hydrofílních polymerů, jako polyglycidylmethakrylátu nebo hydrofilizovaného polystyrenu.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se separační operace provádí na ionexovém materiálu, zejména anexovém materiálu, který je uspořádán v nebo na membráně.
3. 3. Způsob podle nároku 1 a/nebo 2, vyznačující se tím, že se další inaktivace viru provádí v pasterizačním stupni, po němž popřípadě následuje přídavná separační operace za použití membránové chromatografie.
4. 4. Způsob podle některého z nároku 1 a/nebo 3, vyznačující se tím, že se membránová chromatografie provádí na materiálu, který má vysokou afinitu k faktoru VIII.
5. 5. Způsob podle některého z nároku 1 a/nebo 4, vyznačující se tím, že materiál s vysokou afinitou k faktoru VIII je modifikován ligandy s vysokou a/nebo nízkou molekulovou hmotností.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že materiál je modifikován protilátkami proti faktoru VIII.

   -5CZ 290186 B6
7. 7. Způsob podle některého z nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že modifikovaný materiál s vysokou afinitou k faktoru VIII nese imobilizované ligandy s vysokou afinitou k faktoru VIII.
8. 8. Způsob podle některého z nároku 1 a/nebo 3, vyznačující se tím, že chromatografický materiál umožňuje hydrofobní interakci s faktorem VIII, který má být oddělen, nebo nese vhodné ligandy, které tuto hydrofobní interakci zprostředkovávají.

   ío
9. 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se vzorek, který má být purifikován nanáší ve vodném systému o nízké iontové síle odpovídající 0 až 150mM roztoku chloridu sodného na membránu obsahující ionexovou látku, popřípadě se promývá vodným systémem o vyšší iontové síle odpovídající 200 až 400mM roztoku chloridu sodného a potom se eluuje vodným systémem o vysoké iontové síle odpovídající 500 až 1500mM roztoku 15 chloridu sodného, přičemž hodnota pH se udržuje v rozmezí od 4 do 9.
10. 10. Způsob podle některého z nároků la3 až 7, vyznačující se tím, že se vzorek, který má být purifikován, nanáší z roztoku umožňujícího vazbu faktoru VIII k protilátkám proti faktoru VIII, afinitní membrána s adsorbovaným faktorem Vin se popřípadě promyje a potom

    20 eluuje chaotropickými činidly o koncentraci odpovídající například laž 6M močovině nebo odpovídající výše koncentrovanému roztoku soli.
11. 11. Způsob podle některého z nároků 1 a 3 a/nebo 8, vyznačující se tím, že se vzorek, který má být purifikován nanáší z roztoku o velmi vysoké iontové síle na membránu

    25 nesoucí na svém povrchu hydrofobní ligandy a eluuje se rozpouštědlovými systémy s nižší iontovou silou.
12. 12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11,vyznačující se tím, že se eluovaná frakce obsahující faktor VIII koncentruje, plní a/nebo lyofilizuje.
13. 13. Způsob podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se inaktivace virů provádí působením až 15 % hmotnostních detergentu.
14. 14. Frakce obsahující faktor VIII připravená způsobem podle některého z nároků 1 až 13.