JPS62191042A - 血液凝固第８因子吸着体およびそれを用いた血液凝固第８因子の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は血液凝固第■因子吸菅体および該吸着体を用い
た血液凝固第■因子の精製法に関する。

［従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕 血液凝固第■因子は抗血友病Ａ因子とも呼ばれ、従来よ
り血友病Ａ患者の出血の治療には欠乏している血液凝固
第■因子を投与する方法が一般に行なわれている。

しかしながら血液凝固第ＶＩＩＩ因子は血漿中に微量し
か存在せずまた不安定であることがらヒト血漿からの血
液凝固第ＶＩＩＩ因子の回収精製は容品でない。

現在のところ血友病Ａ患者への血液凝固第■因子の補充
にはクリオプレシピテートおよび第■因子濃縮製剤が用
いられている。

クリオプレシピテートは血漿の粗分画を用いるため第■
因子の回収率が高いという利点はあるが、アレルギー反
応が出やすくまた大量のフィブリノーゲンを含んでいる
ため血漿中のフィブリノーゲンの濃度が増加する、第Ｖ
ＩＩＩ因子の濃度が低いため大量の製剤を注入しなけれ
ばならないなどの欠点がある。

第■因子濃縮製剤はこれらの欠点がないため血友病Ａ患
者への補充用として優れているが、通常第■因子濃縮製
剤は米国特許第３．！１，０１８号明細書などに示され
ているようにコーン分画１１あるいはクリオプレシピテ
ートなどの第■因子粗製画分から、ポリエチレングリコ
ール沈殿分画法、グリシン沈殿分画法などを組合わせた
複雑な方法により製造されるため濃縮時の第ＶＩＩＩ因
子の回収率か約２０％と非常に低いという問題点がある
。

［問題点を解決するための手段〕 本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、排除限界分子量が
８０万〜１億の水不溶性多孔質ゲルであって少なくとも
その表面の一部に硫酸エステル基を有する吸着体を用い
ることによって斜上の問題点が解消され、体液中の血液
凝固第■因子を複雑な操作を用いることなく効率的、選
択的かつ高収率で吸着分離しうろことが見出された。

［実施例コ 本明細書でいう体液とは血液、血漿およびこれらからえ
られた分画成分その他の生体由来の液性成分で血液凝固
第■因子を含有するものであれぽいかなるものであって
もよい。

本発明に用いる水不溶性多孔質ゲルは、大きな径の連続
した細孔を有するものが好ましい。

すなわち血液凝固第■因子は分子量が少なくとも　１０
０万以上の巨大分子であり、これを吸着するためには第
■因子が容易にゲル内に侵入できることが必要である。

細孔径の測定方法には種々あり、水銀圧入法が最もよく
用いられているが、親水性ゲルのばあいには適用が難し
い。親水性ゲルの細孔径の目安として排除限界分子量が
よく用いられる。

排除限界分子量とは底置（たとえば波多野ト、ワ行、花
卉俊彦著、実験高速液体クロマトグラフィ、化学同人な
ど）に述べられているごとく、ゲル浸透クロマトグラフ
ィにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子の
うち最も小さい分子量を有する分子の分子量をいう。排
除限界分子量は対象とする化合物により異なることが知
られており、一般に球状蛋白質、デキストラン、ポリエ
チレングリコールなどについてよく調べられており、最
も類似している球状蛋白質（ビールスを含む）を用いて
えられた値を用いるのが適当である。

排除限界分子量の異なる種々の水不溶性多孔質ゲルを用
いて検討した結果、予想に反し排除限界分子量が第■因
子の分子ｍより小さい８０万程度のものでもある程度の
吸着能を示し、また細孔径の大きいものほど吸着能力が
大きいわけでなく、むしろ能力が低下したり第■因子以
外の蛋白が吸着されること、すなわち最適な細孔径の範
囲が存在することが明らかになった。すなわち８０万未
満の排除限界分子量を有する水不溶性多孔質ゲルを用い
たばあいは第■因子の吸着量は小さく実用に耐えないが
、排除限界分子量が８０万ないし２００万と第■因子の
分子量に近い水不溶性多孔質ゲルを用いてもある程度実
用に供しうる吸着体かえられた。一方、排除限界分子量
が大きくなるにつれて第ＶＩＩＩ因子の吸１１２は増加
するがやがて頭打ちとなり、排除限界分子量が１億以上
になると表面積が少なすぎ吸ｚ１量は目立って低下する
。

したがって本発明に用いる水不溶性多孔質ゲルの好まし
い排除限界分子量は８０万〜１億てあり、さらに好まし
くは　２００万〜５０００万である。

つぎに水不溶性多孔質ゲルの多孔構造については表面多
孔性よりも全多孔性が好ましく、空孔容積が２０％以上
であることが好ましい。水不溶性多孔質ゲルの形状は、
粒状、繊維状、膜状、ホローファイバー状など任意の形
状を選ぶことができる。粒子状の水不溶性多孔質ゲルを
用いるばあい、その粒子径は１〜５０００Ｊ！ｍである
のが望ましい。

本発明に使用する水不溶性多孔質ゲルは有機、無機いず
れであってもよいが、目的とする第■因子以外の血液成
分の吸着（いわゆる非特異吸６゛）が少ないものが望ま
しい。

本発明に使用する水不溶性多孔質ゲルの代表例としては
、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミドなど
の軟質ゲル、多孔質ガラス、多孔質シリカゲルなどの無
機多孔体、ポリメチルメタクリレ−１・、ポリビニルア
ルコール、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの
合成高分子、セルロースなどの天然高分子を原料とする
多孔質ポリマーハードゲルなどがあげられるがこれらに
限定されるわけではない。

水不溶性多孔質ゲルに硫酸エステル基を導入する方法は
種々あるが、硫酸エステル基含有化合物を水不溶性多孔
質ゲルに固定する方法、水不溶性多孔質ゲルが水酸基を
含有するばあいにクロルスルホン酸、濃硫酸などの試薬
を用いて直接硫酸エステル基を導入する方法などが代表
的な方法である。

硫酸エステル基含有化合物を固定する方法としては共有
結合を介する方法が安定性が高く、好ましい。

本発明に用いる硫酸エステル基含有化合物の代表例とし
ては、アルコール、糖、多価アルコール、炭水化物など
の水酸基含有化合物の硫酸エステルがあげられ、これら
の化合物のうち硫酸エステル基のほかに水不溶性多孔質
ゲルへの固定に利用できる官能基を有する化合物が好ま
しい。なかでも多価アルコールの部分硫酸エステル化物
、とりわけ糖類の硫酸エステル化物が硫酸エステル基と
固定に必要な官能基の双方を含んでいるうえに、生体適
合性、活性ともに高く好ましい。さらに硫酸エステル化
多糖類は容易に水不溶性多孔質ゲルに固定できることか
ら一層好ましい。

硫酸エステル基含有化合物の代表例として、エタノール
アミン、エチレングリコール、グリセリン、アニソール
、ペンタエリスリトール、ソルビトール、ポリビニルア
ルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレートなどの
アルコール、多価アルコールの硫酸エステル化物、グル
コース、キシロース、トレオース、ガラクトース、フコ
ース、ガラクトサミン、ウロン酸、グルクロン酸、アス
コルビン酸などの糖、炭水化物の硫酸エステル化物、ヘ
パリン、デキストラン酸、コンドロイチン硫酸、コンド
ロイチンポリ硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、キシ
ラン硫酸、カロニン硫酸、セルロース硫酸、キチン硫酸
、キトサン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギ
ニン硫酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カ
ラギーナン硫酸、硫酸化デンプン、ポリグルコース硫酸
、ラミナリン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メベ
サルフェートなどの硫酸エステル化多糖類などがあげら
れるが之れらに限定されるわけではない。

導入される硫酸イオンの量は、１ｍｌあたり０．０１　
μｓ＋ｏｌ　〜１０ｓｕａｏｌが望ましい。　０．１．
ｃｚ＋ｏｌ以下では吸着能力が充分でなく　、１０ｍｍ
ｏ１以上では非特異吸着が多すぎ実用に供することが困
難になる。

第■因子を含む溶液から本発明による吸着体を用いて第
■因子を分離するには、第■因子を含む溶液と吸着体と
を接触させて第■因子を吸着させたのち、未吸若成分を
洗浄してから第■因子を溶出させればよい。

吸着した第■因子を溶出する方法としては温度を高める
方法、ｐｌ＋を変化させる方法など種々あるがイオン強
度の高い水溶液により脱離する方法が後処理も簡便で好
ましい。吸着体の種類により第■因子以外の成分が吸着
するばあいには、イオン強度、ｐＩＩなどを連続的ある
いは段階的に変化させるいわゆるグラディエンド法によ
り第■因子を分離することもできる。

つぎに実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はもとよりこれらに限られるものではない。

実施例１ 多孔質セルロースゲルであるＣＫゲルＡ−８（チッソ■
製、球状蛋白質の排除限界分子量５Ｘ１０７、粒径４５
〜ｉ０５μｌ１ｌ）　ｌｏｍｌを取り、エタノール中で
臨界点乾燥により乾燥させた。乾燥ゲルをそれぞれｌｏ
ｍｌのよく脱水したピリジン中に懸濁させ氷冷した。こ
れにクロルスルホン酸２　ｍｌを攪拌下部下し、滴下終
了後１０分間攪拌をつづけた。

反応終了後ゲルを濾別し、ピリジン、水で洗浄して、表
面に硫酸イオンが導入されたセルロースゲルをえた。

実施例２ 多孔質セルロースゲルであるセルロファインＧＣＬ−２
０００（チッソ■製、球状蛋白質の排除限界分子Ｑ　３
　Ｘ　１０６）　１０ｍ１を水洗液吸引濾過し、これに
ジメチルスルホキサイド６　ｍｌ　、２Ｎ　Ｎａ０ＩＩ
２．６ｍｌ、エピクロルヒドリン　１．５ｍｌを加え、
４０℃で２時間攪拌した。反応後ゲルを濾別、水洗して
エポキシ基の導入されたセルロースゲルをえた。

これに濃アンモニア水６　ｍｌを加え、４０℃で２時間
反応させてアミノ化セルロースゲルをえた。

えられたゲル２ｇに、分子量約５０００のデキストラン
硫酸ナトリウム４ｇを０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８
，０）　８　ｍｌに溶解した液を加え室温でＩｃ時間振
盪した。反応後ＮａＣＮＢ［ｌ３２０ｍｇを加え室温で
３０分間攪拌後、４０℃で４時間加熱したのちゲルを濾
別水洗してデキストラン硫酸の固定されたセルロースゲ
ルをえた。

参考例 セルロースゲルをセルロファインＧＣ７００（チッソ■
製、球状蛋白質の排除限界分子量４　Ｘ　１０５、粒径
４５〜１０５μｍ）にかえたほかは実施例１と同様にし
て表面に硫酸イオンが導入されたセルロースゲルをえた
。

実施例３ 実施例１．２および参考例で合成した各ゲル１ｍｌを試
験管にとり、これにクエン酸添加ヒト血漿６ｍｌを加え
攪拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。

吸着後の血漿中の第■因子、ＩＩＤＬコレステロール、
フィブリノーゲンの濃度を第１表に示す。

第　　１　　表 第１表に示された結果から明らかなように、本発明によ
る吸着体（実施例１および２）か排除限界分子量が４０
万のセルロースゲルを用いたもの（参考例）に比べて第
■因子に対してすぐれた吸若能を示すことがわかる。

実施例４ 実施例１でえられた吸着体１ｍｌをポリプロピレン製カ
ラムに充填し、これにヒト血漿３　ｍｌを流した。つぎ
に生理食塩液１０ｍ１を流して未吸着成分を洗浄したの
ち、食塩濃度を０．１５Ｍから２Ｈまで連続的に変化さ
せた液を流してカラムから流出（グラディエンド溶出）
した液をフラクションコレクターで分取した。

各フラクションにつき総蛋白、第■因子、フィブリノー
ゲンの濃度を測定した。第■囚子、フィブリノーゲンは
酵素免疫法てｈｌす定した。結果を第１図に示す。

第１図の結果から、血液凝固箱■因子は高塩濃度で溶出
され、他の成層蛋白、とくにフィブリノーゲンと分離し
て溶出されることかわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１でえられた本発明の吸ｊＳ体を充填
したカラムにヒト血漿を流したのち０．１５Ｍから２Ｍ
の食塩濃度でグラディエンド溶出したばあいの各フラク
ションにおける食塩濃度、総蛋白、第ＶＩＩＩ因子およ
びフィブリノーゲンの濃度をあられすグラフである。 第１　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　排除限界分子量が８０万〜１億の水不溶性多孔質ゲ
   ルであって少なくともその表面の一部に硫酸エステル基
   を有することを特徴とする血液凝固第VIII因子吸着体。 ２　水不溶性多孔質ゲルが水酸基含有化合物より構成さ
   れてなる特許請求の範囲第１項記載の吸着体。 ３　硫酸エステル基が、水酸基含有水不溶性多孔質ゲル
   の水酸基を硫酸エステル化することにより導入された特
   許請求の範囲第２項記載の吸着体。 ４　硫酸エステル基含有化合物が共有結合により水不溶
   性多孔質ゲルに固定されてなる特許請求の範囲第１項記
   載の吸着体。 ５　硫酸エステル基含有化合物が硫酸化多糖である特許
   請求の範囲第４項記載の吸着体。 ６　血液凝固第VIII因子を含む溶液を、排除限界分子量
   が８０万〜１億の水不溶性多孔質ゲルであって少なくと
   もその表面の一部に硫酸エステル基を有することを特徴
   とする血液凝固第VIII因子吸着体で処理して血液凝固第
   VIII因子を吸着したのち、血液凝固第VIII因子を溶出し
   て回収することを特徴とする血液凝固第VIII因子の精製
   法。