JPS6388129A - 血液凝固第９因子吸着体およびそれを用いた血液凝固第９因子の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は血液凝固第ＩＸ因子吸着体および該吸着体を用
いた血液凝固第ＩＸ因子の精製法に関する。

［従来の技術および発明が解決しようとする問題点コ 血液凝固第ＩＸ因子はクリスマス（ＣＩＩＲＩ　ＳＴＭ
ＡＳ）因子とも呼ばれ、従来より血友病Ｂ患者の出血の
治療には欠乏している血液凝固第■因子を投与する方法
が一般に行なわれている。

しかしながら血液凝固第■因子は血漿中に微量しか存在
せずまた不安定であることからヒト血漿からの血液凝固
第■因子の回収精製は容易でない。

現在のところ血友病Ｂ患者への血液凝固第■。

因子の補充には第■因子濃縮製剤が用いられている。

通常第■因子濃縮製剤は、クエン酸バリウムまたは硫酸
バリウムによる吸着、硫酸アンモニア分画、ＤＥＡＥ−
セファデックスクロマトグラフィー、ヘパリンアガロー
スまたはベンツアミジンセファロースによるアフィニテ
ィークロマトグラフィーなどを組合わせた複雑な方法に
より製造されているため（Ｓ、Ｐ、Ｂａｊａｊらの「ブ
リパラティブ・バイオケミストリー（Ｐｒｅｐａｒａｔ
ｉｖｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、ＩＩ（４）巻、
　３９７〜４１２頁、１９８１年Ｊ　、Ｂ、０ｓｔｅｒ
ｕｄらの「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー、ザ（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ’　Ｂｌｏｌｏｇｌｃ
ａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｈｅ）　、２５３（１７
）巻、５９４６〜５９５１頁、１９７８年」など参照）
時間もかかり、それによる蛋白の損失も避けられない。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、排除限界分子量が
５万以上の水不溶性多孔質ゲルであって少なくともその
表面の一部に硫酸エステル基を有する吸着体を用いるこ
とによって叙上の問題点が解消され、体液中の血液凝固
第■因子を複雑な操作を用いることなく効率的、選択的
かつ高収率で吸着分離しうろことが見出された。

すなわち、本発明は排除限界分子量が５万以上の水不溶
性多孔質ゲルであって少なくともその表面の一部に硫酸
エステル基を有することを特徴とする血液凝固第■因子
吸着体、および血液凝固第■因子を含む溶液を、該吸着
体で処理して血液凝固第■因子を吸着したのち、血液凝
固第■囚子を溶出して回収することを特徴とする血液凝
固第■因子の精製法に関する。

［実施例コ 本明細書でいう体液とは血液、血漿およびこれらからえ
られた分画成分その他の生体由来の液性成分で血液凝固
第■因子を含有するものであればいかなるものであって
もよい。

本発明に用いる水不溶性多孔質ゲルは、適当な径の連続
した細孔を多数有するものが好ましい。すなわち血液凝
固第■因子は分子量が５７０００の小分子であり、これ
を吸着するためには第■因子が容易にゲル内に侵入でき
ることが必要である。

細孔径の測定方法には種々あり、水銀圧入法が最もよく
用いられているが、親水性ゲルのばあいには適用が難し
い。親水性ゲルの細孔径の目安として排除限界分子量が
よく用いられる。

排除限界分子量とは成書（たとえば波多野博行、花卉俊
彦著、実験高速液体クロマトグラフィ、化学同人など）
に述べられているごとく、ゲル浸透クロマトグラフィに
おいて細孔内に侵入できない（排除される）分子のうち
最も小さい分子量を有する分子の分子量をいう。排除限
界分子量は対象とする化合物により異なることが知られ
ており、一般に球状蛋白質、デキストラン、ポリエチレ
ングリコールなどについてよく調べられており、最も類
似している球状蛋白質（ビールスを含む）を用いてえら
れた値を用いるのが適当である。

排除限界分子量の異なる種々の水不溶性多孔質ゲルを用
いて検討した結果、予想に反し排除限界分子量が第■因
子の分子量より小さい５万程度のものでもある程度の吸
着能を示し、また細孔径の大きいものほど吸着能力が大
きいわけでなく、むしろ能力が低下したり第■囚子以外
の蛋白が吸着されること、すなわち最適な細孔径の範囲
が存在することが明らかになった。すなわち５万未満の
排除限界分子量を存する水不溶性多孔質ゲルを用いたば
あいは第■因子の吸着量は小さく実用に耐えないが、排
除限界分子量が５万ないし１２万と第■因子の分子量に
近い水不溶性多孔質ゲルを用いてもある程度実用に供し
うる吸着体かえられた。一方、排除限界分子量が大きく
なるにつれて第■囚子の吸着量は増加するがやがて頭打
ちとなり、排除限界分子量が１億以上になると表面積が
少なすぎ吸着量は目立って低下する。

したがって本発明に用いる水不溶性多孔質ゲルの好まし
い排除限界分子量は５万以上であり、さらに好ましくは
１０万以上２００万以下である。′つぎに水不溶性多孔
質ゲルの多孔構造については表面多孔性よりも全多孔性
が好ましく、空孔容積が２０％以上であることが好まし
い。水不溶性多孔質ゲルの形状は、粒状、繊維状、膜状
、ホローファイバー状など任意の形状を選ぶことができ
る。粒子状の水不溶性多孔質ゲルを用いるばあい、その
粒子径は１〜５０００ｕｍであるのが望ましい。

本発明に使用する水不溶性多孔質ゲルは有機、無機いず
れであってもよいが、目的とする第■因子以外の血液成
分の吸着（いわゆる非特異吸着）が少ないものが望まし
い。

本発明に使用する水不溶性多孔質ゲルの代表例としては
、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミドなど
の軟質ゲル、多孔質ガラス、多孔質シリカゲルなどの無
機多孔体、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアル
コール、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの合
成高分子、セルロースなどの天然高分子を原料とする多
孔質ポリマーハードゲルなどがあげられるがこれらに限
定されるわけではない。

中でも多孔質セルロースゲルは、非特異成層が少なく好
ましい。

水不溶性多孔質ゲルに硫酸エステル基を導入する方法は
種々あるが、硫酸エステル基含有化合物を水不溶性多孔
質ゲルに固定する方法、水不溶性多孔質ゲルが水酸基を
含有するばあいにクロルスルホン酸、濃硫酸などの試薬
を用いて直接硫酸エステル基を導入する方法などが代表
的な方法である。

硫酸エステル基含有化合物を固定する方法としては共有
結合を介する方法が安定性が高く、好ましい。

本発明に用いる硫酸エステル基含有化合物の代表例とし
ては、アルコール、糖、多価アルコール、炭水化物など
の水酸基含有化合物の硫酸エステルがあげられ、これら
の化合物のうち硫酸エステル塙のほかに水不溶性多孔質
ゲルへの固定に利用できる官能基を何する化合物が好ま
しい。なかでも多価アルコールの部分硫酸エステル化物
、とりわけ糖類の硫酸エステル化物が硫酸エステルノ、
（と固定に必要な官能基の双方を含んでいるうえに、生
体適合性、活性ともに高く好ましい。さらに硫酸エステ
ル化多糖類は容易に水不溶性多孔質ゲルに固定できるこ
とから一層好ましい。

硫酸エステル基含有化合物の代表例として、エタノール
アミン、エチレングリコール、グリセリン、アニソール
、ペンタエリスリトール、ソルビトール、ポリビニルア
ルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレートなどの
アルコール、多価アルコールの硫酸エステル化物、グル
コース、キシロース、トレオース、ガラクトース、フコ
ース、ガラクトサミン、ウロン酸、グルクロン酸、アス
コルビン酸などの糖、炭水化物の硫酸エステル化物、ヘ
パリン、デキストラン酸、コンドロイチン硫酸、コンド
ロイチンポリ硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、キシ
ラン硫酸、カロニン硫酸、セルロース硫酸、キチン硫酸
、キトサン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギ
ニン硫酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カ
ラギーナン硫酸、硫酸化デンプン、ポリグルコース硫酸
、ラミナリン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メペ
サルフエートなどの硫酸エステル化多糖類などがあげら
れるがこれらに限定されるわけではない。

導入される硫酸イオンの量は、１　ｍｌあたり０．０１
　μａ＋ｏｌ　〜１０ｍｍｏｌが望ましい。　０．１μ
ｍｏｌ以下では吸着能力が充分でな（，１０ｍｍｏ１以
上では非特異成性が多すぎ実用に供することが困難にな
る。

第■因子を含む溶液から本発明による吸着体を用いて第
■因子を分離するには、第■因子を含む溶液と吸青体と
を接触させて第■因子を吸着させたのち、未吸着成分を
洗浄してから第■因子を溶出させればよい。

吸着した第■因子を溶出する方法としては、ｐＨを変化
させる方法など種々あるがイオン強度の高い水溶液によ
り脱離する方法が後処理も簡便で好ましい。吸着体の種
類により第■因子以・外の成分が吸着するばあいには、
イオン強度、ｐＨなどを連続的あるいは段階的に変化さ
せるいわゆるグラディエンド法により第■因子を分離す
ることもできる。

つぎに実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はもとよりこれらに限られるものではない。

実施例１ 多孔質セルロースゲルであるＣＫゲルＡ−３（チッソ■
製、球状蛋白質の排除限界分子Ｑ　５　Ｘ　１０７、粒
径４５〜１０５μｍ　）　１０ｍ１を取り、エタノール
中で臨界点乾燥により乾燥させた。乾燥ゲルをそれぞれ
ｌｏｍｌのよく脱水したピリジン中に懸濁させ氷冷した
。これにクロルスルホン酸２　ｍｌを攪拌下層下し、滴
下終了後１０分間攪拌をつづけた。

反応終了後ゲルを濾別し、ピリジン、水で洗浄して、表
面に硫酸イオンが導入されたセルロースゲルをえた。

実施例２ 多孔質セルロースゲルであるセルロファインＧＣＬ−２
０００（チッソ■製、球状蛋白質の排除限界分子ｍ　３
　Ｘ　１０６）　１０ｍ１を水洗後吸引濾過し、これに
ジメチルスルホキサイド６　ｍｌ、　２Ｎ　ＮａＯＨ２
，８ｍｌ、エピクロルヒドリン　１．５ｍｌを加え、４
０℃で２時間攪拌した。反応後ゲルを濾別、水洗してエ
ポキシ基の導入されたセルロースゲルをえた。

これに濃アンモニア水６ｍｌを加え、４０℃で２時間反
応させてアミノ化セルロースゲルをえた。

えられたゲル２ｇに、分子量約５０００のデキストラン
硫酸ナトリウム４ｇを０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８
，０）　８　ｍｌに溶解した液を加え室温で１６時間振
盪した。反応後ＮａＣＮＢＨｘ　２０Ｂを加え室温で３
０分間攪拌後、４０°Ｃで４時間加熱したのちゲルを濾
別水洗してデキストラン硫酸の固定されたセルロースゲ
ルをえた。

実施例３ セルロースゲルをセルロファインＧＣ７００（チッソ■
製、球状蛋白質の排除限界分子ｍ　４　Ｘ　１０５、粒
径４５〜１０５μｍ）にかえたほかは実施例１と同様に
して表面に硫酸イオンが導入されたセルロースゲルをえ
た。

実施例４ セルロースゲルをセルロファインＧＣ２００１１（チソ
■製、球状蛋白質の排除限界分子ｍ　１．２Ｘ１０５、
粒径４５〜１０５μｍ）にかえたほかは実施例１と同様
にして、表面に硫酸イオンが導入されたセルロースゲル
をえた。

２考例 セルロースゲルをセルロファインＧＣＬ−９０（チソ■
製、球状蛋白質の排除限界分子Ｑ　３．５Ｘ１０４、粒
径４５〜１０５μｍ）にかえたほかは実施例１と同様に
して、表面に硫酸イオンが導入されたセルロースゲルを
えた。

実施例５ 実施例１．４および参考例で合成したゲルを各々１ｍｌ
試験管にとり、これにクエン酸添加ヒト血漿６　ｍｌを
加え、１５分おきに攪拌しながら２５度で２時間インキ
ュベートした。吸着後の血漿中の第■因子の活性をＡ　
ＰＴＴ法により測定した。

その結果を第１表に示す。

第　　１　　表 実施例６ 実施例１でえられたゲル２５ｍ１をポリカーボネート製
カラムに充填し、これにヒト血漿３５ｍ１を流した。つ
ぎに生理食塩水１２５　ｍｌを流して未吸着蛋白を洗浄
したのち、０．３８ＭＮａＣｌを流し、吸着蛋白を溶出
させた。主な溶出蛋白部分に、アプライした量の２２％
の第■因子が認められた。

なお、比活性（第■因子活性／蛋白量）は約５倍に高め
られた。

第１表に示された結果から明らかなように、本発明によ
る吸着体（実施例１および４）が排除限界分子量が３，
５万のセルロースゲルを用いたもの（参考例）に比べて
第■因子に対してすぐれた吸着能を示すことがわかる。

［発明の効果］ 本発明の吸着体および該吸着体を用いた第■因子の精製
法によれば、簡単にしかも効率よく第■因子を精製する
ことができるという効果を奏する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　排除限界分子量が５万以上の水不溶性多孔質ゲルで
   あって少なくともその表面の一部に硫酸エステル基を有
   することを特徴とする血液凝固第IX因子吸着体。 ２　水不溶性多孔質ゲルが水酸基含有化合物より構成さ
   れてなる特許請求の範囲第１項記載の吸着体。 ３　硫酸エステル基が、水酸基含有水不溶性多孔質ゲル
   の水酸基を硫酸エステル化することにより導入された特
   許請求の範囲第２項記載の吸着体。 ４　硫酸エステル基含有化合物が共有結合により水不溶
   性多孔質ゲルに固定されてなる特許請求の範囲第１項記
   載の吸着体。 ５　硫酸エステル基含有化合物が硫酸化多糖である特許
   請求の範囲第４項記載の吸着体。 ６　血液凝固第IX因子を含む溶液を、排除限界分子量が
   ５万以上の水不溶性多孔質ゲルであって少なくともその
   表面の一部に硫酸エステル基を有することを特徴とする
   血液凝固第IX因子吸着体で処理して血液凝固第IX因子を
   吸着したのち、血液凝固第IX因子を溶出して回収するこ
   とを特徴とする血液凝固第IX因子の精製法。