JP2002327001A

JP2002327001A - 糖類、粒子、化合物、細胞接着因子の選択的吸着方法、及び癌転移抑制方法

Info

Publication number: JP2002327001A
Application number: JP2001132753A
Authority: JP
Inventors: Takashi Komai; 喬駒井; Keiichi Miyamoto; 啓一宮本
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 2001-04-27
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2002-11-15

Abstract

(57)【要約】【課題】自己免疫疾患の原因物質とされる細胞性フィブ
ロネクチン（ＥＤＡ（＋）ＦＮ）の患者の体内からの除
去において、より選択性の高いＥＤＡ（＋）ＦＮ親和性
物質の提供、および癌細胞の転移を抑制する化合物及び
方法の提供。【解決手段】ジェランなどのグルコースとグルクロン酸
とラムノースの存在比が２モル：１モル：１モルの多糖
を硫酸エステル化し、グルコースの６位、ラムノースの
２位および３位の水酸基が硫酸エステル化され、且つそ
の他の水酸基少なくとも１個が未修飾である糖類とす
る。該糖類を不溶性粒子化、または不溶性担体に固定化
した化合物を用いてＥＤＡ（＋）ＦＮを吸着除去する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は硫酸化された糖類、
及びそれを不溶化した粒子、及び硫酸化された糖類を固
定化した化合物、細胞接着因子の吸着方法、及び癌細胞
転移抑制方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】慢性関節リュウマチ、全身性エリトマト
−デス、強直性脊髄炎等の自己免疫疾患疾患の治療には
ノセ（アーテフィシャルオルガン（Artif.Org） 4,20
5-2071980）らの考案したクリオフィルトレーション治
療法が行われており、その治療効果が報告されている。
その後、クリオゲルの性質について研究が進みその主成
分が細胞性フィブロネクチン（EDA(+)FN）、フィブリノ
ーゲン（FbN）、ヘパリンであることが判明した（梅本
他ブラッド、コアギュレーション、フィブリノリシス
（Blood,Coagul.Fibrinolysis）. 4,127-131 1993）。E
DA(+)FNは血漿性フィブロネクチン（ｐＦＮ）とほとん
ど同じ構造であるが、エクストラドメインA（EDA）、エ
クストラドメインB（EDB）、IIICSと言われる領域が追
加されている事が特徴である。

【０００３】とくにEDA(+)FNは慢性関節リュウマチなど
の自己免疫疾患の患者に適応されるクリオフィルトレー
ション療法で除去されるクリオプレシピテーションの原
因物質であると言われている。（駒井喬、清水智研、宮
下警一、宮本啓一、鴇田昌之、小林直之、坂下栄治人
口臓器２６（１）ｐｐ１９５−１９９（１９９７））健
常人の血漿中には通常血漿性フィブロネクチン（ｐFN）
が存在しており、EDA(+)FNは非常に少ない物質である、
しかし自己免疫疾患の患者の血漿中には多く存在してお
り、病因物質であると考えられる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしクリオフィルト
レーション治療法は血球−血漿分離、血漿冷却、クリオ
ゲル分離、血漿加熱の複数の工程が必要であった。また
血漿の冷却によってできるクリオゲルは病因物質のみな
らず、正常成分の他の物質も同時に沈殿するため、クリ
オゲルを分離除去すると体内よりアルブミンなどの正常
成分が多量に除かれてしまう欠点があった。そのため、
治療後アルブミン製剤の人体への供給が必要であった。

【０００５】また、上記の知見よりヘパリン固定化粒子
を用いた、EDA(+)FNの除去剤が開発された（特許第２７
９６６４５号）が、自己免疫疾患には関与しないと考え
られる正常な成分である血液凝固阻害タンパク質である
ATIIIも同時に吸着してしまい、血漿中の血液凝固系の
バランスを崩す欠点があった。また、ヘパリン固定化粒
子を用いた方法によれば、フィブロネクチンを除去でき
るが、血漿性フィブロネクチン、ATIIIなども同時に除
去され、EDA(+)FNの選択除去はできなかった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者は、上
記欠点を解決するために鋭意研究を行った。その結果、
グルコースとグルクロン酸とラムノースの存在比が２モ
ル：１モル：１モルで、グルコースの６位、ラムノース
の２位および３位の水酸基が硫酸エステル化され、且つ
その他の水酸基は少なくとも１個が未修飾である糖類で
あれば、ＥＤＡ（+）ＦＮを選択的に吸着することを見
出した。該糖類はまた、ＥＤＡ（+）ＦＮの除去と同時
に癌の転移を抑制することを見出した。即ち、本発明
は、体内からＥＤＡ（+）ＦＮの除去、及び癌の転移を
抑制する化合物および方法を提供することを目的とす
る。

【０００７】本発明は下記の構成を有する。（１）グルコースとグルクロン酸とラムノースの存在比
が２モル：１モル：１モルで、グルコースの６位、ラム
ノースの２位および３位の水酸基が硫酸エステル化さ
れ、且つその他の水酸基は少なくとも１個が未修飾であ
る糖類。

【０００８】（２）グルコースの６位が７０％以上硫酸
化され、ラムノースの２位および３位の水酸基が５０％
以上硫酸エステル化された前記第１項記載の糖類。

【０００９】（３）下記式１で示される繰り返し単位を
有する糖類。式１（RはOH、あるいはOSO₃Hであり、少なくとも１ヶ所はOH
基である。）

【００１０】（４）ジェランを硫酸化することにより得
られる前記第１〜３のいずれか１項記載の糖類。

【００１１】（５）前記第１〜４のいずれか１項記載の
糖類を不溶化させてなる粒子。

【００１２】（６）前記第１〜４のいずれか１項記載の
糖類を不溶性担体に固定化してなる化合物。

【００１３】（７）不溶性担体の形状が球状粒子である
前記第６項記載の化合物

【００１４】（８）0.9以上の真球度を有する前記第７
項記載の化合物。

【００１５】（９）不溶性担体が球状セルロース粒子で
ある前記第７記載の化合物。

【００１６】（１０）50〜3000μｍの範囲の平均粒径を
有する前記第７〜９のいずれか１項記載の化合物。

【００１７】（１１）50万〜500万の範囲の排除限界分
子量を有する前記９または１０記載の化合物。

【００１８】（１２）80万〜300万の範囲の排除限界分
子量を有する前記９または１０記載の化合物。

【００１９】（１３）不溶性担体の形状が中空糸である
前記第６項記載の化合物。

【００２０】（１４）不溶性担体の形状が膜である前記
第６項記載の化合物。

【００２１】（１５）前記第５項記載の粒子、または前
記第６〜１４のいずれか１項記載の化合物を用いた細胞
接着因子の選択的吸着方法。

【００２２】（１６）細胞接着因子が細胞性フィブロネ
クチンである前記第１５項記載の細胞接着因子の選択的
吸着方法。

【００２３】（１７）前記第５項記載の粒子、または前
記第６〜１４のいずれか１項記載の化合物を用いた癌細
胞転移抑制方法。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本願第１の発明はグルコースとグルクロン酸とラムノー
スの存在比が２モル：１モル：１モルで、グルコースの
６位、ラムノース２位および３位の水酸基が硫酸エステ
ル化され、且つその他の水酸基は少なくとも１個が未修
飾である糖類である。具体的には構造式１の繰り返し構
造を含む糖類が挙げられる。

【００２５】前記式１の両末端の基は特に限定されない
が、具体的には、H、OHなどが挙げられる。式１で示さ
れる繰り返し単位の繰り返し数は５０〜１００の範囲が
好ましい。また、本発明の糖類は化学合成されたもので
あっても、微生物の発酵産物であっても構わない。

【００２６】本発明の糖類の基本骨格を有するものとし
て、シュードモナスエロデア（Pseudomonas elodea）
が生産する多糖類を脱アセチル処理後精製したジェラン
（gellan CAS 71010-52-1）が挙げられる。ジェランは
グルコース、ラムノース、ウロン酸が主成分である多糖
類で、安価に大量に入手することが可能であるから、本
発明に好ましく使用する事ができる。本発明に用いるジ
ェランは分子量（MW）６４６以上のものであることが好
ましい。

【００２７】また、微生物が発酵する糖類で、ジェラン
と類似の構造をもつ物として、アルカリジェン（Alcali
genes）族の生産するウェラン（welan）（米国特許４，
３４２，８６６号）、またはラムサン（rhamsan）（米
国特許４，４０１，７６０号）が挙げられる。

【００２８】本発明の糖類の硫酸化方法は通常知られて
いる方法が利用できる。例えば、カミデケンジ等（ポ
リマージャーナル（Polymer Journal） Vol.15,No 4
pp309-321）の方法のように、ジメチルホルムアミド（D
MF）中で、DMF-SO₃複合体を作用させる事で調製でき
る。また同様な方法としてジオキサン‐SO₃複合体、ト
リメチルアミン‐SO_３複合体、ピリジン‐SO_３複合体な
どの無水硫酸複合体を作用させる方法が適応可能であ
る。

【００２９】本願第２の発明は、本願第１の発明である
糖類を不溶化させてなる粒子である。不溶化、及び粒子
化の方法は従来既知の方法を使用することができる。例
えば、不活性の分散媒中に本願第１の発明である硫酸化
糖類の水溶液、および架橋剤を添加し、撹拌しながら懸
濁重合させることにより、硫酸化糖類を不溶性粒子化す
る事ができる。

【００３０】本発明に用いる架橋剤としては、ヘキサメ
チレンイソシアネート等の２官能性試薬、ジグリシジル
エーテル等のジエポキシ、一端がハロゲン化されたエピ
クロロヒドリン等を挙げることができる。その中でもエ
ポキシ化合物は容易に開環し、安価であることから好ま
しい架橋剤であり、エポキシ化合物の中でも、エピクロ
ロヒドリンは本発明により好ましく使用することができ
る。

【００３１】本願第３の発明は、本願第１の発明である
糖類を不溶性担体に固定化した化合物である。本発明に
おいて不溶性担体とは、担体を構成する成分が非水溶
性、あるいは水溶性の物質を架橋反応などの処理を行う
ことにより不溶性とした物質からなる担体で、具体的に
は、架橋アガロース、セルロース、およびポリアクリル
アミドなどを挙げることができる。

【００３２】また、本発明に使用する不溶性担体の形状
は、球状粒子、中空糸、膜など、特に限定されるもので
はないが、その中でも球状粒子である場合には、製造、
取り扱いが容易であり、担体あたりに結合するリガンド
量も多く、本発明に好ましく使用することができる。

【００３３】中空糸状の担体とは内部に連続または不連
続の空洞を持つ繊維状の担体を示すもので、紡糸液に発
泡剤を添加、または特殊な口金などを用いて内部に空洞
を形成させたものである。膜状の担体とは市販のメンブ
ランフィルターのように平板状で多孔を有し、一定の範
囲の排除限界分子量を持つもののことである。

【００３４】本発明の化合物は、真球度が高いものであ
ることが好ましい。真球度が高いとカラム等に充填した
場合、均一に充填することが容易である。

【００３５】本発明で云うところの真球度とは、粒子の
最短径（短径）と最長径（長径）との比（短径／長径）
であり、この値が１．０に近づくほど真球度が高いこと
を示す。本発明の化合物の真球度は、０．９以上である
ことが好ましく、より好ましくは０．９５以上である。

【００３６】形状が球状粒子である不溶性担体の中で
も、球状セルロース粒子は、安価で生体適合性が高く、
強度も大きく、カラム耐圧性が良好で、さらにオートク
レーブも可能なことから、本発明に好ましく使用するこ
とができる。

【００３７】本発明の化合物のうち、不溶性担体として
球状セルロースを用いた場合の該化合物の平均粒子径
は、カラム充填時の取り扱いやすさの点から５０〜３０
００μｍであることが好ましい。より好ましくは２００
〜５００μｍである。該化合物の平均粒子径がこの範囲
であればカラム内の液の流れをより安定化できる。

【００３８】また、該化合物の排除限界分子量（ポリエ
チレンオキサイドを標準物質として測定）は、５０万〜
５００万であることが好ましく、より好ましくは８０万
〜３００万である。ポリエチレンオキサイドによる排除
限界分子量がこの範囲であればカラム内における血液成
分の物理的な付着などの問題を抑制できる。

【００３９】多孔性の不溶性担体の製造方法は特に限定
されるものではないが、球状セルロース粒子の場合を例
に説明する。例えば、特開昭５３−８６７４９号記載の
ように、セルロース酢酸エステルを有機溶媒中に溶解
し、この溶液を水性媒体中に懸濁させることによってセ
ルロース酢酸エステルを球状化し、次いで有機溶媒を蒸
発させてセルロースエステル粒子を得、これをケン化後
セルロース粒子とすることによって、本発明に好まし
い、多孔性球状セルロース粒子を得ることができる。

【００４０】本発明の糖類の不溶性担体への固定化方法
は、例えば「実験と応用アフィニティークロマトグラフ
ィー」（千畑一郎、土佐哲也、松尾雄志著、講談社サイ
エンティフィック，ｐｐ７１〜７６）に示された、エポ
キシ活性化担体と該糖類の水酸基をエーテル結合で固定
化する方法が挙げられる。

【００４１】あるいは、「セルロファインアフィニティ
ークロマトグラフィー（カタログ）」（チッソ株式会
社，PP４）に示された、アミノ基を有する単体に該糖類
の還元末端を還元的アミノ化反応で固定化する方法も挙
げられる。また同じくアミノ基を有する担体へ本発明の
該糖類のカルボキシル基をカルボジイミド類などの縮合
剤を用いてアミド結合で固定化する方法も可能である。

【００４２】本発明の糖類が不溶性担体に固定化された
化合物は、次に示す方法によっても製造可能である。上
記の固定化方法を用いて、硫酸化される前の糖類を固定
化しておき、固定化の後に前述した硫酸化方法によって
本発明の糖類としても良い。

【００４３】本願第４の発明は、本発明の糖類を不溶性
担体に固定化した化合物を用いた細胞接着因子の選択吸
着方法である。本発明の細胞接着因子として、具体的に
は細胞性フィブロネクチンを挙げることができる。本発
明の糖類を固定化した化合物であれば、EDA(+)FNを選択
的に吸着させ溶出させることが可能である。具体的な吸
着方法の形態は、特に限定されるものではないが、本発
明の化合物をカラムに充填し、体外循環治療装置のオン
ライン回路中に組み込まれて行う形態であることが好ま
しい。

【００４４】より具体的には、患者の体内から取り出さ
れ、抗凝固剤としてヘパリンを加えられた血液、或いは
血球と分離された血漿成分が、体外循環装置のＥＤＡ
（+）ＦＮを取り除くカラムを通り、ＥＤＡ（+）ＦＮが
取り除かれた状態の血液を患者の体内に戻す形態である
ことが好ましい。吸着後、溶出、回収されたEDA(+)FN
は、研究用の試薬として使用可能である。また、細胞を
接着させるため、創傷の治療剤の成分、細胞培養に有効
に用いることができる。

【００４５】本願第５の発明は、本願第２の発明の粒子
および第３の発明の化合物を用いた癌細胞転移抑制方法
である。EDA(+)FNは細胞が表面に接着したり、増殖する
際には不可欠な物質である。また、癌細胞が転移する際
の足がかりとなっている。そのため、EDA（＋）FNを血
液中から除去することは癌の転移防止になる。本発明の
硫酸化糖固定化担体を使用すれば、前述したようにEDA
(+)FNを高選択的に吸着除去するため、癌転移抑制の目
的に好ましく使用可能である。

【００４６】また、血管新生を誘導し、癌や慢性関節リ
ウマチなど種々の疾患の発症、悪化に関連されていると
される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）はヘパリン結合性
増殖因子であり、本願第１の発明の糖類との親和性を有
しており、VEGFをEDA（＋）FN同様に本願第２の発明の
粒子および第３の発明の化合物で吸着することにより、
癌をはじめとする疾患の悪化を抑制することができる。

【００４７】

【実施例】以下、本発明について実施例及び比較例を用
いて詳細の説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものでは無い。１．化合物の調製実施例１ジメチルホルムアミド（DMF）１００ｇにジェランガム
（和光純薬製）を１ｇ加え３０℃で１時間膨潤させ、次
いでクロルスルホン酸１．７ｇを加え２０分間７０℃に
保ち攪拌した。その後５０℃で５時間攪拌した後、２M
のNaOHで中和した。この反応液にアセトンを沈殿物が生
成するまで添加して、沈殿物を回収しこの沈殿物を水に
溶解後、純水で透析した。透析後、凍結乾燥して硫酸化
ジェラン（GS）を得た。このものを元素分析した結果S
含有量はおよそ２５％であった。

【００４８】上記方法で得られた硫酸化ジェラン（GS）
５０ｍｇを４０％エタノール水溶液２０ｍｌに溶解し
た。そこにアミノセルロファイン（チッソ株式会社製）
７．５ｍｌを加え攪拌し分散させ、Ｎ−エトキシカルボ
ニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（N-Et
hoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline）（EED
Q）（和光純薬製）を１００ｍｇ添加し３０℃で７２時
間攪拌した。反応後ゲルを４０％エタノール水溶液で洗
浄した後、純水２０ｍｌに分散させた。そこに、無水酢
酸１ｇを加えて、残存するアミノ基をブロックした。反
応後、純水で洗浄しGS固定化化合物を得た。元素分析の
結果より担体１ｇ当たりおよそ75μmolのS含量であっ
た。

【００４９】比較例１硫酸化ジェランの替わりに、ヘパリン（サイエンティフ
ィックプロテインラボラトリーズ（SCIENTIFIC PROTE
IN LABORATORIES, INC製））５０ｍｇを使用して実施例
２の方法に従って、ヘパリン固定化化合物を得た。元素
分析の結果より化合物１ｇあたり28μmolのS含量であっ
た。

【００５０】２．粒子の調製実施例２流動パラフィン（ナカライテスク（株）製、試薬１級）
１０００ｍｌ中に、硫酸化ジェランアルカリ水溶液３０
ｍｌを添加・撹拌し、液滴を形成させたのち、エピクロ
ロヒドリン（ナカライテスク（株）製、試薬特級）５ｇ
を添加し、５０℃で１６時間撹拌して不溶性の球状粒子
を得た。

【００５１】３．硫酸エステル化状況の確認実施例３実施例１のGSを０．２Mトリフルオロ酢酸中８０℃で部
分加水分解したのち２MのNaOHで中和した。この反応液
にアセトンを沈殿が生成するまで添加して、沈殿を回収
し水に溶解後、純水で透析した。透析後、凍結乾燥し低
分子化GSを得た。このものについてNMR分析を行った結
果、グルコースの６位とラムノースの２位、３位が硫酸
エステルとなっている事を確認した。

【００５２】４．ＥＤＡ（+）ＦＮの吸着試験実施例４クエン酸採血正常血漿に精製ＥＤＡ（＋）ＦＮを1.2μ
ｇ/ｍｌの濃度で添加し、塩化カルシウム（10ｍＭ）、
及びフサン（鳥居薬品工業）を10μｇ/ｍｌの濃度で添
加した後、ヘパリンを３unit/ｍｌの濃度で添加し、吸
着試験用の血漿を得た。実施例１と比較例１で調製した
GS固定化化合物及びヘパリン固定化化合物をそれぞれ0.
5ｍｌずつを試験用血漿6.25ｍｌ中に添加し、30℃で4時
間インキュベートした。その後試験液を25℃、2000rpm
で5分間遠心分離し、化合物と上清を分離した。その
後、上清中の各蛋白濃度（ｐFN、EDA(+)FN、ATIII）を
測定し、次式より吸着率を測定した。吸着率（％）＝（（初期濃度−上清濃度）/初期濃度）
×１００その結果、ヘパリン固定化化合物はｐＦＮの吸着率が１
１％、ＥＤＡ（＋）ＦＮの吸着率が7５％、ＡＴIIIの吸
着率が７３％であった。またＧＳ固定化化合物の場合、
ｐＦＮの吸着率が７．７％、ＥＤＡ（＋）ＦＮの吸着率
が６６％、ＡＴIIIの吸着率が６．９％であり、ヘパリ
ン固定化化合物と比較して特にＡＴIIIの吸着が抑えら
れていた。

【００５３】

【発明の効果】本発明の糖類はＥＤＡ（+）ＦＮを選択
的に吸着する事が可能である。また該糖類を不溶化した
粒子、または該糖類を不溶性担体に固定した化合物を用
いることにより、ATIIIなどの血中の他の有用成分の吸
着を抑えてEDA(+)FNをより選択的に吸着できる。さら
に、癌転移を促進する因子の除去も可能であり、癌転移
を抑制できる。また、ジェランを原料とすることによ
り、安価に本発明の化合物が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4C077 AA09 BB03 CC01 MM02 NN04 NN06 NN16 NN18 PP01 4C090 AA02 AA09 BA70 BA97 BB12 BB16 BB22 BB36 BB54 BB63 BB84 BB95 BC20 DA22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グルコースとグルクロン酸とラムノースの
存在比が２モル：１モル：１モルで、グルコースの６
位、ラムノースの２位および３位の水酸基が硫酸エステ
ル化され、且つその他の水酸基は少なくとも１個が未修
飾である糖類。
【請求項２】グルコースの６位が７０％以上硫酸化さ
れ、ラムノースの２位および３位の水酸基が５０％以上
硫酸エステル化された請求項１記載の糖類。
【請求項３】下記式１で示される繰り返し単位を有する
糖類。式１（RはOH、あるいはOSO₃Hであり、少なくとも１ヶ所はOH
基である。）
【請求項４】ジェランを硫酸化することにより得られる
請求項１〜３のいずれか１項記載の糖類。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項記載の糖類を
不溶化させてなる粒子。
【請求項６】請求項１〜４のいずれか１項記載の糖類を
不溶性担体に固定化してなる化合物。
【請求項７】不溶性担体の形状が球状である請求項６記
載の化合物。
【請求項８】0.9以上の真球度を有する請求項７記載の
化合物。
【請求項９】不溶性担体が球状セルロース粒子である請
求項６記載の化合物。
【請求項１０】50〜3000μｍの範囲の平均粒径を有する
請求項７〜９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１１】50万〜500万の範囲の排除限界分子量を
有する請求項９または１０記載の化合物。
【請求項１２】80万〜300万の範囲の排除限界分子量を
有する請求項９または１０記載の化合物。
【請求項１３】不溶性担体の形状が中空糸である請求項
６記載の化合物。
【請求項１４】不溶性担体の形状が膜である請求項６記
載の化合物。
【請求項１５】請求項５記載の粒子、または請求項６〜
１４のいずれか１項記載の化合物を用いた細胞接着因子
の選択的吸着方法。
【請求項１６】細胞接着因子が細胞性フィブロネクチン
である請求項１５記載の細胞接着因子の選択的吸着方
法。
【請求項１７】請求項５記載の粒子、または請求項６〜
１４のいずれか１項記載の化合物を用いた癌細胞転移抑
制方法。