JPH07113797A - ヘパリン親和性物質の分離、精製用充填剤 - Google Patents
ヘパリン親和性物質の分離、精製用充填剤Info
- Publication number
- JPH07113797A JPH07113797A JP5280042A JP28004293A JPH07113797A JP H07113797 A JPH07113797 A JP H07113797A JP 5280042 A JP5280042 A JP 5280042A JP 28004293 A JP28004293 A JP 28004293A JP H07113797 A JPH07113797 A JP H07113797A
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- JP
- Japan
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- sulfated
- cyclodextrin
- immobilized
- affinity substance
- heparin affinity
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- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、ヘパリン親和性物質の分離、精製
用充填剤を提供することにある。 【構成】 硫酸化シクロデキストリン類を水系溶媒ある
いは有機溶媒に不溶性の担体に固定化した充填剤、その
充填剤を含有するカラム、およびこれらを用いてクロマ
トグラフィー法によりヘパリン親和性物質を分離精製す
ることを特徴とするものである。 【効果】 本発明は、ヘパリン親和性物質を選択的に分
離、精製、濃縮あるいは定量するのに有用である。
用充填剤を提供することにある。 【構成】 硫酸化シクロデキストリン類を水系溶媒ある
いは有機溶媒に不溶性の担体に固定化した充填剤、その
充填剤を含有するカラム、およびこれらを用いてクロマ
トグラフィー法によりヘパリン親和性物質を分離精製す
ることを特徴とするものである。 【効果】 本発明は、ヘパリン親和性物質を選択的に分
離、精製、濃縮あるいは定量するのに有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、硫酸化シクロデキスト
リン類を固定化した充填剤およびヘパリン親和性物質を
クロマトグラフィーの手法により分離精製する方法に関
するものである。
リン類を固定化した充填剤およびヘパリン親和性物質を
クロマトグラフィーの手法により分離精製する方法に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】ヘパリンは、食用獣の肝、肺、あるいは
腸粘膜から得られたムコ多糖で、ウロン酸とグルコサミ
ンが交互に１，４結合し、ウロン酸の７０〜９０％はイ
ズロン酸で残りがグルクロン酸であり、グルコサミンの
アミノ基の大部分は硫酸化され、一部がアセチル化さ
れ、ごく一部が置換されておらず、グルクロン酸はβ結
合し、グルコサミンとイズロン酸はα結合している化合
物として知られている。
腸粘膜から得られたムコ多糖で、ウロン酸とグルコサミ
ンが交互に１，４結合し、ウロン酸の７０〜９０％はイ
ズロン酸で残りがグルクロン酸であり、グルコサミンの
アミノ基の大部分は硫酸化され、一部がアセチル化さ
れ、ごく一部が置換されておらず、グルクロン酸はβ結
合し、グルコサミンとイズロン酸はα結合している化合
物として知られている。
【０００３】すでにヘパリンを固定化した充填剤を含有
するカラムによるクロマトグラフィーは、酸性線維芽細
胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因
子、軟骨由来成長因子、骨由来成長因子、血小板由来成
長因子、腫瘍増殖因子−α、腫瘍増殖因子−β、上皮成
長因子、腫瘍壊死因子−α、インスリン様成長因子−
１、インスリン様成長因子−２、インターロイキン−
１、インターロイキン−２、インターフェロン−α、イ
ンターフェロン−γおよびオステオゲニン等の成長因子
類、アンチトロンビン〓、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロ
トロンビン、第ＸＩ因子、第Ｘ〓因子および第Ｘ〓a因
子等の凝固因子類、リゾチーム、トロンビン、エンドヌ
クレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラー
ゼ、ＤＮＡリガーゼ、トリレトロウイルス逆転写酵素お
よびプロコラーゲン（タイプ〓）Ｎ−プロテイナーゼ等
の酵素類、β−リポタンパク質等のリポタンパク質類、
ビトロネクチン等の細胞接着因子類、リポタンパク質リ
パーゼ等のリパーゼ類、補体因子類、あるいはエストロ
ゲンレセプターおよびアンドロゲンレセプター等のステ
ロイドレセプター類等の分離精製に有効であることが知
られている。
するカラムによるクロマトグラフィーは、酸性線維芽細
胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因
子、軟骨由来成長因子、骨由来成長因子、血小板由来成
長因子、腫瘍増殖因子−α、腫瘍増殖因子−β、上皮成
長因子、腫瘍壊死因子−α、インスリン様成長因子−
１、インスリン様成長因子−２、インターロイキン−
１、インターロイキン−２、インターフェロン−α、イ
ンターフェロン−γおよびオステオゲニン等の成長因子
類、アンチトロンビン〓、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロ
トロンビン、第ＸＩ因子、第Ｘ〓因子および第Ｘ〓a因
子等の凝固因子類、リゾチーム、トロンビン、エンドヌ
クレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラー
ゼ、ＤＮＡリガーゼ、トリレトロウイルス逆転写酵素お
よびプロコラーゲン（タイプ〓）Ｎ−プロテイナーゼ等
の酵素類、β−リポタンパク質等のリポタンパク質類、
ビトロネクチン等の細胞接着因子類、リポタンパク質リ
パーゼ等のリパーゼ類、補体因子類、あるいはエストロ
ゲンレセプターおよびアンドロゲンレセプター等のステ
ロイドレセプター類等の分離精製に有効であることが知
られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヘパリ
ンは中性では安定であるもののｐＨが６より低くなると
分解すること、グリコサミノグリカンの混合物であり均
一な物質ではないため構造については確定的でなく、ム
コ多糖であるため構成の単糖の数が多く５×１０3〜２
０×１０3程度の広い分子量分布を示すことから構成成
分の量比や広範囲にわたり分子量にばらつきがあるこ
と、さらにヘパリンを固定化した充填剤を含有するカラ
ムに通液できるｐＨは通常５〜１０であるため許容ｐＨ
範囲が狭いこと等の問題がある。
ンは中性では安定であるもののｐＨが６より低くなると
分解すること、グリコサミノグリカンの混合物であり均
一な物質ではないため構造については確定的でなく、ム
コ多糖であるため構成の単糖の数が多く５×１０3〜２
０×１０3程度の広い分子量分布を示すことから構成成
分の量比や広範囲にわたり分子量にばらつきがあるこ
と、さらにヘパリンを固定化した充填剤を含有するカラ
ムに通液できるｐＨは通常５〜１０であるため許容ｐＨ
範囲が狭いこと等の問題がある。
【０００５】これらのことから、クロマトグラフ用の充
填剤としての使用性および汎用性を充分に保有し、さら
にヘパリン親和性物質を選択的に分離精製、濃縮あるい
は定量する機能を保有し、より広範囲のｐＨに安定でし
かも分子量の均一化がより容易であることにおいて極め
て効果的であり、ヘパリンよりも有利に置き換え得る物
質を固定化した充填剤を作製し、この充填剤そのものに
よる、あるいはこの充填剤を含有するカラムによる新規
でかつ有効性の高いクロマトグラフィーの手法が望まれ
る。そこで、このような機能特性を有する充填剤を作製
し、この充填剤そのものを用いたバッチモードクロマト
グラフィーによる、あるいはこの充填剤を含有するカラ
ムを用いたカラムクロマトグラフィーによるヘパリン親
和性物質の分離精製方法、充填剤、およびこの充填剤を
含有するカラムを提供する目的で鋭意検討を進めてき
た。
填剤としての使用性および汎用性を充分に保有し、さら
にヘパリン親和性物質を選択的に分離精製、濃縮あるい
は定量する機能を保有し、より広範囲のｐＨに安定でし
かも分子量の均一化がより容易であることにおいて極め
て効果的であり、ヘパリンよりも有利に置き換え得る物
質を固定化した充填剤を作製し、この充填剤そのものに
よる、あるいはこの充填剤を含有するカラムによる新規
でかつ有効性の高いクロマトグラフィーの手法が望まれ
る。そこで、このような機能特性を有する充填剤を作製
し、この充填剤そのものを用いたバッチモードクロマト
グラフィーによる、あるいはこの充填剤を含有するカラ
ムを用いたカラムクロマトグラフィーによるヘパリン親
和性物質の分離精製方法、充填剤、およびこの充填剤を
含有するカラムを提供する目的で鋭意検討を進めてき
た。
【０００６】
【問題を解決するための手段】本発明者らは、この目的
を達成するために鋭意検討した結果、硫酸化シクロデキ
ストリン類を水系溶媒あるいは有機溶媒に不溶性の担体
に固定化した充填剤、あるいはこの充填剤を含有するカ
ラムを用いてヘパリン親和性物質を分離精製させること
により、本発明を完成した。すなわち、本発明は、硫酸
化シクロデキストリン類を水系溶媒あるいは有機溶媒に
不溶性の担体に固定化した充填剤、これらの充填剤を含
有するカラムおよびこれらを用いてクロマトグラフィー
法によりヘパリン親和性物質を分離精製することを特徴
とするものである。本発明で用いられる硫酸化シクロデ
キストリン類としては、硫酸化α−シクロデキストリ
ン、硫酸化β−シクロデキストリン、硫酸化γ−シクロ
デキストリン、硫酸化ヒドロキシプロピル−α−シクロ
デキストリン、硫酸化ヒドロキシプロピル−β−シクロ
デキストリン、硫酸化ヒドロキシプロピル−γ−シクロ
デキストリン等のシクロデキストリンの硫酸エステル誘
導体またはそれらの塩が挙げられ、異なる硫酸エステル
化度の混合物あるいは単一の硫酸エステル化度のいずれ
のものを用いてもよい。
を達成するために鋭意検討した結果、硫酸化シクロデキ
ストリン類を水系溶媒あるいは有機溶媒に不溶性の担体
に固定化した充填剤、あるいはこの充填剤を含有するカ
ラムを用いてヘパリン親和性物質を分離精製させること
により、本発明を完成した。すなわち、本発明は、硫酸
化シクロデキストリン類を水系溶媒あるいは有機溶媒に
不溶性の担体に固定化した充填剤、これらの充填剤を含
有するカラムおよびこれらを用いてクロマトグラフィー
法によりヘパリン親和性物質を分離精製することを特徴
とするものである。本発明で用いられる硫酸化シクロデ
キストリン類としては、硫酸化α−シクロデキストリ
ン、硫酸化β−シクロデキストリン、硫酸化γ−シクロ
デキストリン、硫酸化ヒドロキシプロピル−α−シクロ
デキストリン、硫酸化ヒドロキシプロピル−β−シクロ
デキストリン、硫酸化ヒドロキシプロピル−γ−シクロ
デキストリン等のシクロデキストリンの硫酸エステル誘
導体またはそれらの塩が挙げられ、異なる硫酸エステル
化度の混合物あるいは単一の硫酸エステル化度のいずれ
のものを用いてもよい。
【０００７】塩としては水溶性の金属塩、例えばナトリ
ウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩またはトリメチル
アンモニウム塩等が挙げられる。本発明で用いられる硫
酸化シクロデキストリン類におけるスルホニル基の数
は、１ないし１分子中に存在し得る水酸基の数と同数の
範囲内にあればよい。本発明で用いられる硫酸化シクロ
デキストリン類は、これ自身の形で固定化用担体に化学
結合するか、あるいはこの一部分に導入基を施しこの導
入基を介して固定化用担体に化学結合することができ、
この導入基としては、アミノ基、カルボキシル酸あるい
はメルカプト基等が挙げられ、適宜選択して用いること
ができる。
ウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩またはトリメチル
アンモニウム塩等が挙げられる。本発明で用いられる硫
酸化シクロデキストリン類におけるスルホニル基の数
は、１ないし１分子中に存在し得る水酸基の数と同数の
範囲内にあればよい。本発明で用いられる硫酸化シクロ
デキストリン類は、これ自身の形で固定化用担体に化学
結合するか、あるいはこの一部分に導入基を施しこの導
入基を介して固定化用担体に化学結合することができ、
この導入基としては、アミノ基、カルボキシル酸あるい
はメルカプト基等が挙げられ、適宜選択して用いること
ができる。
【０００８】本発明で用いられる固定化用担体として
は、例えば、有機合成高分子系、シリカゲル系、アガロ
ース系、デキストラン系、セルロース系、ポリアクリル
アミド系、シリカビーズ系、ガラス系、金属系、ケイソ
ウ土、セライト、アルミナ、チャーコール等が挙げら
れ、適宜選択して用いることができる。硫酸化シクロデ
キストリン類の固定化用担体への固定化方法としては、
共有結合方法が好ましく、固定化条件としては、温度は
４〜５０℃、特に２０〜４５℃が好ましく、ｐＨは２〜
１４が好ましく、時間は２〜９６時間、特に８〜２４時
間が好ましく、溶液は１Ｍ以下の炭酸塩、ホウ酸塩、リ
ン酸塩、あるいは水酸化ナトリウムを含む水系緩衝液お
よび水溶液、あるいはこれらに水溶性有機溶媒を混合し
てもよく、それぞれ適宜選択して用いることができる。
は、例えば、有機合成高分子系、シリカゲル系、アガロ
ース系、デキストラン系、セルロース系、ポリアクリル
アミド系、シリカビーズ系、ガラス系、金属系、ケイソ
ウ土、セライト、アルミナ、チャーコール等が挙げら
れ、適宜選択して用いることができる。硫酸化シクロデ
キストリン類の固定化用担体への固定化方法としては、
共有結合方法が好ましく、固定化条件としては、温度は
４〜５０℃、特に２０〜４５℃が好ましく、ｐＨは２〜
１４が好ましく、時間は２〜９６時間、特に８〜２４時
間が好ましく、溶液は１Ｍ以下の炭酸塩、ホウ酸塩、リ
ン酸塩、あるいは水酸化ナトリウムを含む水系緩衝液お
よび水溶液、あるいはこれらに水溶性有機溶媒を混合し
てもよく、それぞれ適宜選択して用いることができる。
【０００９】固定化用担体の形状は、球状、板状、ある
いは破砕状等が挙げられるが、特に球状のものが好まし
く、その粒子径は、０．５〜１０００μｍまた、好まし
くは５〜５００μｍである。孔径としては、３×１０4
オングストローム以下のものを用い、好ましくは５０〜
４０００オングストロームのものを用いるとよい。固定
化用担体を活性化処理する際は、エポキシ活性化処理、
臭化シアン活性化処理、スルホニルクロリドによる活性
化処理、カルボネート活性化処理あるいはカルボニルイ
ミダゾールによる活性化処理等が挙げられるが、特にエ
ポキシ活性化処理が好ましい。
いは破砕状等が挙げられるが、特に球状のものが好まし
く、その粒子径は、０．５〜１０００μｍまた、好まし
くは５〜５００μｍである。孔径としては、３×１０4
オングストローム以下のものを用い、好ましくは５０〜
４０００オングストロームのものを用いるとよい。固定
化用担体を活性化処理する際は、エポキシ活性化処理、
臭化シアン活性化処理、スルホニルクロリドによる活性
化処理、カルボネート活性化処理あるいはカルボニルイ
ミダゾールによる活性化処理等が挙げられるが、特にエ
ポキシ活性化処理が好ましい。
【００１０】本発明で用いられる硫酸化シクキストリン
類を固定化した充填剤における硫酸化シクロデキストリ
ン類の固定化量は担体の湿潤体積１ｍｌに対して１０-9
〜１ｇあればよく、適宜選択して用いることができる。
本発明で得られた充填剤を用い、カラム処理あるいはバ
ッチ処理し、ヘパリン親和性物質を分離精製することが
でき、カラムの材質としては、ステンレススチール製、
ガラス製、ポリマー製等が挙げられる。
類を固定化した充填剤における硫酸化シクロデキストリ
ン類の固定化量は担体の湿潤体積１ｍｌに対して１０-9
〜１ｇあればよく、適宜選択して用いることができる。
本発明で得られた充填剤を用い、カラム処理あるいはバ
ッチ処理し、ヘパリン親和性物質を分離精製することが
でき、カラムの材質としては、ステンレススチール製、
ガラス製、ポリマー製等が挙げられる。
【００１１】本発明において分離精製されるヘパリン親
和性物質としては、例えば、酸性線維芽細胞成長因子、
塩基性線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、軟骨由来
成長因子、骨由来成長因子、血小板由来成長因子、腫瘍
増殖因子−α、腫瘍増殖因子−β、上皮成長因子、腫瘍
壊死因子−α、インスリン様成長因子−１、インスリン
様成長因子−２、インターロイキン−１、インターロイ
キン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−
γおよびオステオゲニン等の成長因子類、アンチトロン
ビン〓、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン、第Ｘ
Ｉ因子、第Ｘ〓因子、第Ｘ〓a因子等の凝固因子類、リ
ゾチーム、トロンビン、エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡお
よびＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、トリレトロ
ウイルス逆転写酵素、プロコラーゲン（タイプ〓）Ｎ−
プロテイナーゼ等の酵素類、β−リポタンパク質等のリ
ポタンパク質類、ビトロネクチン等の細胞接着因子類、
リポタンパク質リパーゼ等のリパーゼ類、補体因子類あ
るいはエストロゲンレセプターおよびアンドロゲンレセ
プター等のステロイドレセプター類等をはじめ、天然源
由来のもの、人工的に合成されたもの、あるいは組み換
えＤＮＡ技術により製造されたもの等を挙げることがで
きる。分離精製の条件としては、温度は４〜８０℃が好
ましく、ｐＨは２〜１２が好ましく、流速は１０-3〜１
０3ｃｍ／分の線速度が好ましく、溶離液は０〜５Ｍの
塩濃度のｐＨ２〜１２の適当な水系溶媒、あるいはこれ
らに８０％以下の水溶性有機溶媒を混合した水系溶媒が
好ましく、それぞれ適宜選択して用いることができる。
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する
和性物質としては、例えば、酸性線維芽細胞成長因子、
塩基性線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、軟骨由来
成長因子、骨由来成長因子、血小板由来成長因子、腫瘍
増殖因子−α、腫瘍増殖因子−β、上皮成長因子、腫瘍
壊死因子−α、インスリン様成長因子−１、インスリン
様成長因子−２、インターロイキン−１、インターロイ
キン−２、インターフェロン−α、インターフェロン−
γおよびオステオゲニン等の成長因子類、アンチトロン
ビン〓、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン、第Ｘ
Ｉ因子、第Ｘ〓因子、第Ｘ〓a因子等の凝固因子類、リ
ゾチーム、トロンビン、エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡお
よびＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、トリレトロ
ウイルス逆転写酵素、プロコラーゲン（タイプ〓）Ｎ−
プロテイナーゼ等の酵素類、β−リポタンパク質等のリ
ポタンパク質類、ビトロネクチン等の細胞接着因子類、
リポタンパク質リパーゼ等のリパーゼ類、補体因子類あ
るいはエストロゲンレセプターおよびアンドロゲンレセ
プター等のステロイドレセプター類等をはじめ、天然源
由来のもの、人工的に合成されたもの、あるいは組み換
えＤＮＡ技術により製造されたもの等を挙げることがで
きる。分離精製の条件としては、温度は４〜８０℃が好
ましく、ｐＨは２〜１２が好ましく、流速は１０-3〜１
０3ｃｍ／分の線速度が好ましく、溶離液は０〜５Ｍの
塩濃度のｐＨ２〜１２の適当な水系溶媒、あるいはこれ
らに８０％以下の水溶性有機溶媒を混合した水系溶媒が
好ましく、それぞれ適宜選択して用いることができる。
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する
【００１２】
【参考例１】 硫酸化β−シクロデキストリンナトリウ
ム塩の合成 １０．０ｇのβ−シクロデキストリンを５００ｍｌのジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解後、この溶液に３
０ｇの（ＣＨ3）3ＮＳＯ3を加えて７０℃で１６時間攪
拌した。この反応混合物を室温に冷却し、ＤＭＦをデカ
ントして捨て１ｌのアセトンを添加した。析出した結晶
を濾取し、風乾した。風乾した結晶は、１００ｍｌの水
を加えて溶解し、続いて１５０ｍｌの３０％酢酸ナトリ
ウム水溶液を添加し室温で４時間攪拌後、その溶液に
１．５ｌのエタノールを加えた。一晩放置後析出した結
晶を濾取し、その結晶を１５０ｍｌの水で溶解後、室温
で５時間透析膜を用いて透析した。透析膜中の溶液は、
約１５０ｍｌまで５０℃で減圧濃縮を行い、１ｌのエタ
ノールを加えて析出する結晶を濾取し、６０℃で減圧乾
燥することにより、２０．５ｇの白色粉末が得られた。
得られた硫酸化β−シクロデキストリンナトリウム塩化
合物の元素分析から得られた硫黄の含量は１４．９５％
であり、マススペクトルから得られた硫酸基の平均置換
度は１０．７であった。また粉末Ｘ線回折パターンはア
モルファスのパターンを示した。
ム塩の合成 １０．０ｇのβ−シクロデキストリンを５００ｍｌのジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解後、この溶液に３
０ｇの（ＣＨ3）3ＮＳＯ3を加えて７０℃で１６時間攪
拌した。この反応混合物を室温に冷却し、ＤＭＦをデカ
ントして捨て１ｌのアセトンを添加した。析出した結晶
を濾取し、風乾した。風乾した結晶は、１００ｍｌの水
を加えて溶解し、続いて１５０ｍｌの３０％酢酸ナトリ
ウム水溶液を添加し室温で４時間攪拌後、その溶液に
１．５ｌのエタノールを加えた。一晩放置後析出した結
晶を濾取し、その結晶を１５０ｍｌの水で溶解後、室温
で５時間透析膜を用いて透析した。透析膜中の溶液は、
約１５０ｍｌまで５０℃で減圧濃縮を行い、１ｌのエタ
ノールを加えて析出する結晶を濾取し、６０℃で減圧乾
燥することにより、２０．５ｇの白色粉末が得られた。
得られた硫酸化β−シクロデキストリンナトリウム塩化
合物の元素分析から得られた硫黄の含量は１４．９５％
であり、マススペクトルから得られた硫酸基の平均置換
度は１０．７であった。また粉末Ｘ線回折パターンはア
モルファスのパターンを示した。
【００１３】
【実施例１】ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６
５０Ｍ（東ソー株式会社製）１．０ｇに水１０ｍｌを加
えて膨潤させた後、水１００ｍｌで洗浄し、その湿重量
１．０ｇを秤量し、それに参考例１で調製した硫酸化β
−シクロデキストリンナトリウム塩１２０ｍｇを０．０
５Ｎ ＮａＯＨ水溶液４ｍｌに溶解した溶液を加え４５
℃で１８時間振盪攪拌後、蒸留水１００ｍｌ、３Ｍ Ｎ
ａＣｌ水溶液１００ｍｌ、蒸留水１００ｍｌで洗浄し、
１Ｍ エタノールアミン１０ｍｌを加え１６時間放置
し、蒸留水１００ｍｌで洗浄することにより、湿潤体積
１ｍｌに対して硫酸化β−シクロデキストリンが１．１
ｍｇ固定化された硫酸化β−シクロデキストリン固定化
充填剤を製造した。
５０Ｍ（東ソー株式会社製）１．０ｇに水１０ｍｌを加
えて膨潤させた後、水１００ｍｌで洗浄し、その湿重量
１．０ｇを秤量し、それに参考例１で調製した硫酸化β
−シクロデキストリンナトリウム塩１２０ｍｇを０．０
５Ｎ ＮａＯＨ水溶液４ｍｌに溶解した溶液を加え４５
℃で１８時間振盪攪拌後、蒸留水１００ｍｌ、３Ｍ Ｎ
ａＣｌ水溶液１００ｍｌ、蒸留水１００ｍｌで洗浄し、
１Ｍ エタノールアミン１０ｍｌを加え１６時間放置
し、蒸留水１００ｍｌで洗浄することにより、湿潤体積
１ｍｌに対して硫酸化β−シクロデキストリンが１．１
ｍｇ固定化された硫酸化β−シクロデキストリン固定化
充填剤を製造した。
【００１４】
【実施例２】７ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ（ファル
マシアバイオテク株式会社製）をガラスフィルター上に
て蒸留水５００ｍｌで洗浄後、テトラヒドロホウ酸ナト
リウム１０ｍｇを含む１ＭＮａＯＨ水溶液５ｍｌと１，
４−ブタンジオール−ジグリシジルエーテル５ｍｌから
なる混合液に加え、２３℃で１０時間ゆっくり攪拌後、
蒸留水５００ｍｌで洗浄することによりエポキシ活性化
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂを得た。得られたエポキシ活性
化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂを３ｍｌとり、蒸留水１００
ｍｌで洗浄し、それに参考例１で調製した硫酸化β−シ
クロデキストリンナトリウム塩１２０ｍｇを０．００５
Ｎ ＮａＯＨ水溶液４ｍｌに溶かした溶液を加え４０℃
で１６時間振盪攪拌後、蒸留水１００ｍｌ、３Ｍ Ｎａ
Ｃｌ水溶液１００ｍｌ、０．１Ｍ酢酸水溶液１００ｍ
ｌ、および蒸留水１００ｍｌで洗浄し、１Ｍエタノール
アミン１０ｍｌを加え１６時間放置し、蒸留水１００ｍ
ｌで洗浄することにより、湿潤体積１ｍｌに対して硫酸
化β−シクロデキストリンが１．１ｍｇ固定化された硫
酸化β−シクロデキストリン固定化充填剤を製造した。
マシアバイオテク株式会社製）をガラスフィルター上に
て蒸留水５００ｍｌで洗浄後、テトラヒドロホウ酸ナト
リウム１０ｍｇを含む１ＭＮａＯＨ水溶液５ｍｌと１，
４−ブタンジオール−ジグリシジルエーテル５ｍｌから
なる混合液に加え、２３℃で１０時間ゆっくり攪拌後、
蒸留水５００ｍｌで洗浄することによりエポキシ活性化
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂを得た。得られたエポキシ活性
化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂを３ｍｌとり、蒸留水１００
ｍｌで洗浄し、それに参考例１で調製した硫酸化β−シ
クロデキストリンナトリウム塩１２０ｍｇを０．００５
Ｎ ＮａＯＨ水溶液４ｍｌに溶かした溶液を加え４０℃
で１６時間振盪攪拌後、蒸留水１００ｍｌ、３Ｍ Ｎａ
Ｃｌ水溶液１００ｍｌ、０．１Ｍ酢酸水溶液１００ｍ
ｌ、および蒸留水１００ｍｌで洗浄し、１Ｍエタノール
アミン１０ｍｌを加え１６時間放置し、蒸留水１００ｍ
ｌで洗浄することにより、湿潤体積１ｍｌに対して硫酸
化β−シクロデキストリンが１．１ｍｇ固定化された硫
酸化β−シクロデキストリン固定化充填剤を製造した。
【００１５】
【実施例３】シリカ２０ｇを５００ｍｌの三頸丸底フラ
スコに入れ、減圧下１５０℃で４時間加熱し、乾燥し、
冷却後減圧を解除し、直ちに塩化カルシウム管付き還流
冷却器と攪拌器を装着し、脱水トルエン３００ｍｌ，３
−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン２０ｍ
ｌ、脱水トリエチルアミン０．５ｍｌを加え、攪拌下１
６時間還流後ガラスフィルター上でトルエン、アセト
ン、エーテル各１ｌで順次洗浄し減圧乾燥することによ
りエポキシ活性化シリカを得た。上記で得られたエポキ
シ活性化シリカ１．０ｇに水１０ｍｌを加えて膨潤させ
た後、水１００ｍｌで洗浄し、その湿重量１．０ｇを秤
量し、それに参考例１で調製した硫酸化β−シクロデキ
ストリンナトリウム塩１２０ｍｇを０．００５ＮＮａＯ
Ｈ水溶液４ｍｌに溶かした溶液を加え４０℃で１６時間
振盪攪拌後、蒸留水１００ｍｌ、３Ｍ ＮａＣｌ水溶液
１００ｍｌ、蒸留水１００ｍｌで洗浄し、１Ｍ エタノ
ールアミン１０ｍｌを加え４時間放置し、蒸留水１００
ｍｌで洗浄することにより、湿潤体積１ｍｌに対して硫
酸化β−シクロデキストリンが１．１ｍｇ固定化された
硫酸化β−シクロデキストリン固定化充填剤を製造し
た。
スコに入れ、減圧下１５０℃で４時間加熱し、乾燥し、
冷却後減圧を解除し、直ちに塩化カルシウム管付き還流
冷却器と攪拌器を装着し、脱水トルエン３００ｍｌ，３
−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン２０ｍ
ｌ、脱水トリエチルアミン０．５ｍｌを加え、攪拌下１
６時間還流後ガラスフィルター上でトルエン、アセト
ン、エーテル各１ｌで順次洗浄し減圧乾燥することによ
りエポキシ活性化シリカを得た。上記で得られたエポキ
シ活性化シリカ１．０ｇに水１０ｍｌを加えて膨潤させ
た後、水１００ｍｌで洗浄し、その湿重量１．０ｇを秤
量し、それに参考例１で調製した硫酸化β−シクロデキ
ストリンナトリウム塩１２０ｍｇを０．００５ＮＮａＯ
Ｈ水溶液４ｍｌに溶かした溶液を加え４０℃で１６時間
振盪攪拌後、蒸留水１００ｍｌ、３Ｍ ＮａＣｌ水溶液
１００ｍｌ、蒸留水１００ｍｌで洗浄し、１Ｍ エタノ
ールアミン１０ｍｌを加え４時間放置し、蒸留水１００
ｍｌで洗浄することにより、湿潤体積１ｍｌに対して硫
酸化β−シクロデキストリンが１．１ｍｇ固定化された
硫酸化β−シクロデキストリン固定化充填剤を製造し
た。
【００１６】
【実施例４】実施例１で得られた硫酸化β−シクロデキ
ストリン固定化充填剤をカラム（内径４．６ｍｍ、長さ
５０ｍｍ）に充填し、硫酸化β−シクロデキストリン固
定化充填剤含有カラムを製造した。
ストリン固定化充填剤をカラム（内径４．６ｍｍ、長さ
５０ｍｍ）に充填し、硫酸化β−シクロデキストリン固
定化充填剤含有カラムを製造した。
【００１７】
【試験例１】実施例４で得られたカラムを用い、２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化後、２０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した濃度
が１００μｇ／ｍｌのヘパリン親和性物質であるリゾチ
ーム溶液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで連続的に送液し、
カラムからの溶出液を波長２８０ｎｍで前端分析を行
い、対照として同カラムを用い３Ｍ ＮａＣｌを含む２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化後、
３Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に溶解した濃度が１００μｇ／ｍｌのリゾチ
ーム溶液についても同様に行い、両者のブレイクスルー
カーブの差より固定化された硫酸化β−シクロデキスト
リン１ｍｇ当りのリゾチームの保持量を求めた。また、
ヘパリンが固定化されているＴＳＫｇｅｌ Ｈｅｐａｒ
ｉｎ−５ＰＷ充填剤（東ソー株式会社製）を含有した実
施例４で得られるカラムを用いて比較実験を行った。そ
の結果を表１に示した。
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化後、２０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した濃度
が１００μｇ／ｍｌのヘパリン親和性物質であるリゾチ
ーム溶液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで連続的に送液し、
カラムからの溶出液を波長２８０ｎｍで前端分析を行
い、対照として同カラムを用い３Ｍ ＮａＣｌを含む２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化後、
３Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に溶解した濃度が１００μｇ／ｍｌのリゾチ
ーム溶液についても同様に行い、両者のブレイクスルー
カーブの差より固定化された硫酸化β−シクロデキスト
リン１ｍｇ当りのリゾチームの保持量を求めた。また、
ヘパリンが固定化されているＴＳＫｇｅｌ Ｈｅｐａｒ
ｉｎ−５ＰＷ充填剤（東ソー株式会社製）を含有した実
施例４で得られるカラムを用いて比較実験を行った。そ
の結果を表１に示した。
【００１８】 表１ ──────────────────────────────────── 固定化リガンド リガンド固定化量 リガンド１ｍｇ当りの （ｍｇ／ｍｌゲル） リゾチーム保持量（ｍｇ ） ──────────────────────────────────── 硫酸化β−シクロデキストリン １．１ ５．５ ヘパリン ５〜６ ３．３〜４．０ ──────────────────────────────────── 表１に示すように、硫酸化β−シクロデキストリン固定
化充填剤含有カラム中の硫酸化β−シクロデキストリン
は、ヘパリン固定化充填剤含有カラム中のヘパリンより
もヘパリン親和性物質を高容量保持できた。
化充填剤含有カラム中の硫酸化β−シクロデキストリン
は、ヘパリン固定化充填剤含有カラム中のヘパリンより
もヘパリン親和性物質を高容量保持できた。
【００１９】
【試験例２】実施例４で得られたカラムを用い、２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により、流速１ｍ
ｌ／ｍｉｎ、温度２５℃でカラムを平衡化した後、１５
０μｇの塩基性線維芽細胞成長因子、１５０μｇのリゾ
チームおよび１５０μｇのアルブミンを含む溶液１５０
μｌあるいは１５０μｇの塩基性線維芽細胞成長因子、
１５単位のトロンビンおよび１５０μｇのアルブミンを
含む溶液１５０μｌをそれぞれ通液し、非保持成分を２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
除去した後、３Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い保持成分をＮａＣｌの濃
度勾配により溶出させ波長２８０ｎｍでＨＰＬＣ法によ
り分離した。その結果を図１に示した。
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により、流速１ｍ
ｌ／ｍｉｎ、温度２５℃でカラムを平衡化した後、１５
０μｇの塩基性線維芽細胞成長因子、１５０μｇのリゾ
チームおよび１５０μｇのアルブミンを含む溶液１５０
μｌあるいは１５０μｇの塩基性線維芽細胞成長因子、
１５単位のトロンビンおよび１５０μｇのアルブミンを
含む溶液１５０μｌをそれぞれ通液し、非保持成分を２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
除去した後、３Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い保持成分をＮａＣｌの濃
度勾配により溶出させ波長２８０ｎｍでＨＰＬＣ法によ
り分離した。その結果を図１に示した。
【００２０】硫酸化β−シクロデキストリンを固定化し
た充填剤を含有するカラムは、ヘパリン親和性物質の塩
基性線維芽細胞成長因子、リゾチームおよびトロンビン
と非ヘパリン親和性物質のアルブミンを含む溶液からヘ
パリン親和性物質のみ親和性を示し、ヘパリン親和性物
質と非ヘパリン親和性物質との分離精製のみならず、さ
らにヘパリン親和性物質の各々の物質も分離精製でき
た。
た充填剤を含有するカラムは、ヘパリン親和性物質の塩
基性線維芽細胞成長因子、リゾチームおよびトロンビン
と非ヘパリン親和性物質のアルブミンを含む溶液からヘ
パリン親和性物質のみ親和性を示し、ヘパリン親和性物
質と非ヘパリン親和性物質との分離精製のみならず、さ
らにヘパリン親和性物質の各々の物質も分離精製でき
た。
【００２１】
【発明の効果】本発明は、ヘパリン親和性物質を選択的
に分離、精製、濃縮あるいは定量するのに有用である。
に分離、精製、濃縮あるいは定量するのに有用である。
【００２２】
【図１】試験例２における硫酸化β−シクロデキストリ
ンを固定化した充填剤含有カラムに対するヘパリン親和
性物質の親和性と分離精製を示すクロマトグラムであ
る。
ンを固定化した充填剤含有カラムに対するヘパリン親和
性物質の親和性と分離精製を示すクロマトグラムであ
る。
Claims (3)
- 【請求項１】硫酸化シクロデキストリン類を固定化用担
体に固定化してなることを特徴とする分離、精製用充填
剤。 - 【請求項２】硫酸化シクロデキストリン類を固定化した
請求項１記載の充填剤を含有することを特徴とするカラ
ム。 - 【請求項３】硫酸化シクロデキストリン類を固定化した
請求項１記載の充填剤を用いるヘパリン親和性物質の分
離、精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5280042A JPH07113797A (ja) | 1993-10-13 | 1993-10-13 | ヘパリン親和性物質の分離、精製用充填剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5280042A JPH07113797A (ja) | 1993-10-13 | 1993-10-13 | ヘパリン親和性物質の分離、精製用充填剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07113797A true JPH07113797A (ja) | 1995-05-02 |
Family
ID=17619493
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5280042A Pending JPH07113797A (ja) | 1993-10-13 | 1993-10-13 | ヘパリン親和性物質の分離、精製用充填剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07113797A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11100402A (ja) * | 1997-07-25 | 1999-04-13 | Beckman Coulter Inc | 毛管電気泳動を用いる、荷電シクロデキストリン類での薬学的化合物のキラル分離 |
| WO2009123073A1 (ja) * | 2008-03-31 | 2009-10-08 | 株式会社環境工学 | シクロデキストリン複合材料およびその製造方法 |
| JP2014028973A (ja) * | 2013-10-15 | 2014-02-13 | Aomori Prefectural Industrial Technology Research Center | シクロデキストリン複合材料およびその製造方法 |
| WO2019198280A1 (ja) * | 2018-04-12 | 2019-10-17 | 株式会社島津製作所 | 馬尿酸類分析用の分離カラム、馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフ、及び馬尿酸類の分析方法 |
-
1993
- 1993-10-13 JP JP5280042A patent/JPH07113797A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11100402A (ja) * | 1997-07-25 | 1999-04-13 | Beckman Coulter Inc | 毛管電気泳動を用いる、荷電シクロデキストリン類での薬学的化合物のキラル分離 |
| JP4503715B2 (ja) * | 1997-07-25 | 2010-07-14 | ベックマン・コールター・インコーポレーテッド | 毛管電気泳動を用いる、荷電シクロデキストリン類での薬学的化合物のキラル分離 |
| WO2009123073A1 (ja) * | 2008-03-31 | 2009-10-08 | 株式会社環境工学 | シクロデキストリン複合材料およびその製造方法 |
| JP2009242556A (ja) * | 2008-03-31 | 2009-10-22 | Aomori Prefectural Industrial Technology Research Center | シクロデキストリン複合材料およびその製造方法 |
| JP2014028973A (ja) * | 2013-10-15 | 2014-02-13 | Aomori Prefectural Industrial Technology Research Center | シクロデキストリン複合材料およびその製造方法 |
| WO2019198280A1 (ja) * | 2018-04-12 | 2019-10-17 | 株式会社島津製作所 | 馬尿酸類分析用の分離カラム、馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフ、及び馬尿酸類の分析方法 |
| JP2019184457A (ja) * | 2018-04-12 | 2019-10-24 | 株式会社島津製作所 | 馬尿酸類分析用の分離カラム、馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフ、及び馬尿酸類の分析方法 |
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