JP6253059B2 - エンドトキシン吸着材 - Google Patents
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Description
[1]
以下の特徴(1)〜(4)を有する、シクロデキストリンのポリマー:
(1)下記式1に示すN/C=6〜15である;
N/C(モル%)=窒素含有量(モル)÷炭素含有量(モル)×100 ・・・(式1)
(2)シクロデキストリンの水酸基の一部がウレタン結合を形成している;
(3)水に不溶性である;
(4)陰イオン交換容量が0.1meq/g未満である。
[2]
シクロデキストリンと架橋剤を反応させることを含む、前記ポリマーの製造方法であって、
前記架橋剤が、分子当たり、1またはそれ以上のイソシアネート基と、水酸基と反応しうる1またはそれ以上の官能基を有する化合物である、方法。
[3]
前記水酸基と反応しうる官能基がイソシアネート基である、前記方法。
[4]
基材と、該基材に固定化された前記ポリマーとを含む、エンドトキシン吸着材。
[5]
前記ポリマーを基材へ固定化することを含む、前記エンドトキシン吸着材の製造方法。
[6]
基材、シクロデキストリン、および架橋剤を反応させることを含む、前記エンドトキシン吸着材の製造方法であって、
前記架橋剤が、1またはそれ以上のイソシアネート基と、水酸基と反応しうる1またはそれ以上の官能基を有する化合物である、方法。
[7]
前記水酸基と反応しうる官能基がイソシアネート基である、前記方法。
[8]
前記ポリマーまたは前記吸着材と、マイナスチャージを示す目的物質およびエンドトキシンを含有する溶液を接触させることを含む、エンドトキシンを除去する方法。
[9]
前記ポリマーまたは前記吸着材と、マイナスチャージを示す目的物質およびエンドトキシンを含有する溶液とを接触させることを含む、エンドトキシンの除去されたマイナスチャージを示す目的物質を含有する溶液の製造方法。
[10]
前記マイナスチャージを示す目的物質が核酸である、前記方法。
[11]
前記核酸がDNAである、前記方法。
[12]
前記核酸がRNAである、前記方法。
(1)炭素原子に対して、モル比で6%〜15%の窒素原子を含有する;
(2)シクロデキストリンの水酸基の一部がウレタン結合を形成している;
(3)水に不溶性である;
(4)実質的に陰イオン交換能を示さない。
N/C(モル%)=窒素含有量(モル)÷炭素含有量(モル)×100 ・・・(式1)
膨潤度(wet−mL/dry−g)=測定体積(mL)/乾燥重量(g) ・・・(式3)
<1−1>実施例1〜18のCDポリマーの合成
架橋剤としてエピクロロヒドリン(クロロメチルオキシラン(CMO)ともいう)を用いた以外は、実施例1〜18のCDポリマーの合成と同様の手順で、比較例1〜3のCDポリマーを合成した。用いたCDの種類と添加量および架橋剤の種類と添加量を表3に示す。
上記で得られたCDポリマーにおけるイソシアネート基の導入量は、CDポリマーを減圧乾燥した後、元素分析により求めた。CDは窒素原子を有していないため、測定された窒素分は架橋剤のイソシアネート基に由来するものである。結果を表4に示す。
上記で得られたCDポリマーの陰イオン交換容量は、pH滴定法によって定量した。まずCDポリマー5mlをガラスフィルター上に移し、メタノール、アセトン、およびエーテルで順に洗浄後、24時間減圧乾燥した。得られた乾燥CDポリマー0.5gを秤量し、100mlの三角フラスコに入れ、0.1N−塩酸水溶液を正確に25ml加えた。2時間攪拌後、反応液を100mlのメスフラスコにろ取し、蒸留水で100mlに定容した。この希釈液から25mlを分取し、0.05N−水酸化ナトリウムを用い、フェノールフタレインを指示薬として滴定した。滴定は3回繰り返し、平均値を陰イオン交換容量の算出に用いた。陰イオン交換容量(AEC)は下記式2により求めた。結果を表5に示す。併せて、市販のET吸着材であるセルファインETクリーンL(JNC株式会社製)およびデトキシゲル(Detoxi-Gel;サーモフィッシャー/ピアス製)の陰イオン交換容量も示す。
AEC(meq/g)=(0.1×fHCl×VHCl−0.05×fNaOH×VNaOH×100/25)÷W ・・・(式2)
fHCl:0.1N-塩酸水溶液のファクター
fNaOH:0.05N-水酸化ナトリウム水溶液のファクター
VHCl:0.1N-塩酸の添加量(ml)
VNaOH:0.05N-水酸化ナトリウム水溶液の滴定量(ml)
W:乾燥CDポリマーの重量(g)
体積として3mL−6mL程度の量のCDポリマーを10mLメスシリンダーに入れた。体積値が安定するまで、静置とタッピングを繰り返し、その体積を測定した。次に、体積を測定したメスシリンダー中のCDポリマーを20mLのビーカーに全て回収し、80℃で16時間以上放置し水分を蒸発させてCDポリマーを乾燥させた後に、CDポリマーの乾燥重量を測定した。膨潤度を下記式3により求めた。結果を表5に示す。
膨潤度(wet−mL/dry−g)=測定体積(mL)/乾燥重量(g) ・・・(式3)
<5−1>ETフリー化
ET吸着量の測定に供するCDポリマーおよび市販のET吸着材のETフリー化を以下の手順で行った。上記で得られたCDポリマー、ならびに市販のET吸着材であるデトキシゲル(サーモフィッシャー/ピアス製)およびセルファインETクリーンL(JNC株式会社製)のそれぞれを5−10g秤量し、滅菌済みのガラスフィルター上で洗浄液(0.2M NaOHを含む95%エタノール溶液)50mLで5回洗浄を繰り返した。次に、洗浄後のサンプルを100mL用フラスコに入れ、洗浄液を50mL添加し、25℃、1時間、200rpmで撹拌した。次に、撹拌後のサンプルをガラスフィルター上で再び洗浄液25mLで5回洗浄し、さらに、注射用蒸留水を用いてろ液が中性になるまで洗浄を繰り返した後、イオン強度0.05のリン酸バッファー(pH6)で平衡化し、ETフリー化済みの吸着材として以降の実験に用いた。
E.coli O55-B5株由来LPSを所定量含むイオン強度0.05のリン酸バッファー(pH6)をサンプル溶液として用いて、以下の手順でET吸着除去試験を行った。上記で得られたETフリー化済みの吸着材0.1gを20mL三角フラスコに入れ、サンプル液を2mL加え、4℃、200rpmで1時間撹拌した。得られた懸濁溶液をシリンジで吸い取り、0.8μmメンブランフィルターでろ過した。得られたろ過液中の残存エンドキシン濃度を定量した。ET濃度の測定は、市販のキット(リムルスES−IIテスト和光、和光純薬製)を用いて行った。
サンプル溶液として、E.coli O55-B5株由来LPSを15EU/mL、鮭白子由来DNAを50mg/mL含むイオン強度が0.05から0.8のリン酸バッファー(pH6)を用いて、<5−2>と同様の手順でET吸着除去試験を行った。得られた処理液(ろ過液)中の残存エンドキシン濃度および残存DNA濃度を定量し、イオン強度とETの選択的吸着量の関係を調べた。ET濃度の測定は、<5−2>と同様に行った。DNA濃度は、260nmの吸光度に基づいて測定した。
サンプル溶液として、E.coli O55-B5株由来LPSを15EU/mL、鮭白子由来DNAを50mg/mL含むイオン強度が0.05でpHが4から9の緩衝液(下記)を用いて、<5−2>と同様の手順でET吸着除去試験を行った。得られた処理液(ろ過液)中の残存エンドキシン濃度および残存DNA濃度を定量し、pHとETの選択的吸着量の関係を調べた。ET濃度の測定は、<5−2>と同様に行った。DNA濃度は、260nmの吸光度に基づいて測定した。
<用いた緩衝液>
pH4、5 酢酸緩衝液(CH3COOH−CH3COONa)
pH6、7 リン酸緩衝液(Na2HPO4−NaH2PO4)
pH8、9 トリス緩衝液(Tris−HCl)
多孔質シリカゲル20g(粒径30μm、平均細孔径1300Å)を、3−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン20gおよびトリエチルアミン5mLに懸濁し、8時間還流させた。冷却後、シリカゲルをトルエン400mL、メタノール400mL、純水1L、アセトン400mL、およびメタノール400mLの順で洗浄し、80℃で真空乾燥して、エポキシ導入シリカゲルを26g得た。エポキシ導入シリカゲル20gを、0.7%過酸化水素水900mL及びアセトニトリル100mLに懸濁し、6時間還流させた。冷却後、シリカゲルをトルエン400mL、メタノール400mL、純水1L、アセトン400mL、メタノール400mLの順で洗浄し80℃で真空乾燥して、ジオール含有シリカゲル15gを得た。70mlのDMF溶液に5gのγCDを徐々に加えて溶解させた。得られたCD溶液を500mLの三つ口フラスコに入れ、70℃で10分撹拌した。同フラスコに架橋剤であるHMDI2.5gを加えた後、70℃、200rpmで30分間撹拌した。その後、ジオール含有シリカ10gを加え、70℃、200rpmで4時間攪拌した。得られた生成物をガラスフィルター(G3)上に移し、純水を用いてDMF臭が完全になくなるまで洗浄および吸引ろ過を繰り返し、実施例19の吸着材を得た。吸着材は95%メタノール中に保存した。
特開昭53−86749に記載の方法で製造されたセルロース粒子(平均粒径およそ100μm、排除限界分子量およそ2500−3500)20g湿重量(乾燥重量で約10g)を80℃で乾燥させ、乾燥セルロース粒子を得た。70mlのDMF溶液に5gのγCDを徐々に加えて溶解させた。得られたCD溶液を500mLの三つ口フラスコに入れ、70℃で10分撹拌した。同フラスコに架橋剤であるHMDI4gを加えた後、70℃、200rpmで30分間撹拌した。その後、乾燥セルロース粒子10gを加え、70℃、200rpmで4時間攪拌した。得られた生成物をガラスフィルター(G3)上に移し、純水を用いてDMF臭が完全になくなるまで洗浄および吸引ろ過を繰り返し、実施例20の吸着材を得た。吸着材は95%メタノール中に保存した。
70mlのDMF溶液に5gのγCDを徐々に加えて溶解させた。得られたCD溶液を500mLの三つ口フラスコに入れ、70℃で10分撹拌した。同フラスコに架橋剤であるHMDI4gを加えた後、70℃、200rpmで30分間撹拌した。その後、セファデックッスG−25(粒径およそ85−260μm、排除限界分子量5000以上、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)10g(乾燥重量)を加え、70℃、200rpmで4時間攪拌した。得られた生成物をガラスフィルター(G3)上に移し、純水を用いてDMF臭が完全になくなるまで洗浄および吸引ろ過を繰り返し、実施例21の吸着材を得た。吸着材は95%メタノール中に保存した。
特開昭55−44312に記載の方法で製造されたセルロース粒子(平均粒径およそ100μm、排除限界分子量200万以上)100g湿重量(乾燥重量で約10g)に、γCD10gを溶解させた純水100mLを加えて、よく混合した。得られた懸濁液をエバポレーターで減圧乾固させて、乾燥物を得た。この乾燥物19gに200mLのジオキサンを加えて、30℃で1時間、200rpmで攪拌した。その後、温度を80℃に上昇させ、架橋剤としてHMDI9gを加えて、更に4時間攪拌した。得られた生成物をガラスフィルター(G3)上に移し、純水を用いてDMF臭が完全になくなるまで洗浄および吸引ろ過を繰り返し、実施例22の吸着材を得た。吸着材は95%メタノール中に保存した。
実施例2のCDポリマー0.1gを乳鉢で粉砕して粒径がおよそ0.1〜1μmのCDポリマー粒子を調製し、DMF50mLに懸濁した。得られた懸濁液をNo5Cのろ紙(φ6cm)がセットされたフィルターホルダー(テフロン(登録商標)製)に循環し、ろ紙にCDポリマー粒子を保持させた。循環液にほとんどCDポリマー粒子がなくなった後に、温度を80℃に上昇させ、架橋剤としてHMDI1gを加え、4時間循環を継続した。液の循環を中止し、メタノール100mL、純水100mLを順次流して洗浄し、実施例23の吸着材を得た。吸着材は95%メタノール中に保存した。
<11−1>カラムクロマトグラフィーによるET除去
10mL容量のカラムに実施例19〜22の吸着材のそれぞれを1mL充填し、洗浄液(0.2M NaOHを含む95%エタノール水溶液)を10mL通液させ、その後3時間洗浄液に浸漬した。その後、洗浄液をさらに10mL通液した後、注射用蒸留水を50mL通液した。次いで、ETフリーの0.2Mリン酸バッファー(pH7)を5mL通液しカラムを平衡化した。
実施例23の吸着材(CDポリマーの固定化されたろ紙)をセットしたフィルターホルダーに洗浄液(0.2M NaOHを含む95%エタノール水溶液)を10mL通液させ、その後3時間洗浄液に浸漬した。その後、洗浄液をさらに10mL通液した後、注射用蒸留水を50mL通液した。次いで、ETフリーの0.2Mリン酸バッファー(pH7)を5mL通液し平衡化した。
Claims (10)
- 基材と、該基材に固定化された以下の特徴(1)〜(4)を有する、シクロデキストリンのポリマーとを含む、エンドトキシン吸着材。
(1)下記式1に示すN/C=6〜15である;
N/C(モル%)=窒素含有量(モル)÷炭素含有量(モル)×100 ・・・(式1)
(2)シクロデキストリンの水酸基の一部がウレタン結合を形成している;
(3)水に不溶性である;
(4)陰イオン交換容量が0.1meq/g未満である。 - 以下の特徴(1)〜(4)を有する、シクロデキストリンのポリマーを基材へ固定化することを含む、請求項1に記載のエンドトキシン吸着材の製造方法。
(1)下記式1に示すN/C=6〜15である;
N/C(モル%)=窒素含有量(モル)÷炭素含有量(モル)×100 ・・・(式1)
(2)シクロデキストリンの水酸基の一部がウレタン結合を形成している;
(3)水に不溶性である;
(4)陰イオン交換容量が0.1meq/g未満である。 - 基材、シクロデキストリン、および架橋剤を反応させることを含む、請求項1に記載のエンドトキシン吸着材の製造方法であって、
前記架橋剤が、1またはそれ以上のイソシアネート基と、水酸基と反応しうる1またはそれ以上の官能基を有する化合物である、方法。 - 前記水酸基と反応しうる官能基がイソシアネート基である、請求項3に記載の方法。
- 請求項1に記載の吸着材と、マイナスチャージを示す目的物質およびエンドトキシンを含有する溶液を接触させることを含む、エンドトキシンを除去する方法。
- 請求項1に記載の吸着材と、マイナスチャージを示す目的物質およびエンドトキシンを含有する溶液とを接触させることを含む、エンドトキシンの除去されたマイナスチャージを示す目的物質を含有する溶液の製造方法。
- 前記マイナスチャージを示す目的物質が核酸である、請求項5または6に記載の方法。
- 前記核酸がDNAである、請求項7に記載の方法。
- 前記核酸がRNAである、請求項7に記載の方法。
- 前記溶液のpHが4〜6である、請求項5〜9のいずれか一項に記載の方法。
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