JP3291123B2 - 分離剤の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、分離剤の製造方法に関
し、詳しくは光学活性異性体分離用の分離剤の製造方法
に関する。更に詳しくは、多糖またはその誘導体と多孔
質担体とをシラン処理剤によって化学結合させた分離剤
を製造するにあたり、多孔質担体の反応性水酸基のモル
数に対して、該多孔質担体に結合したシラン処理剤のモ
ル数の割合、すなわちシラン処理剤の被覆率を３０％以
上８０％以下にすることを特徴とする分離剤の製造方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】これ
まで、セルロースやアミロースなどの多糖やその誘導体
をシリカゲル等の多孔質担体に化学結合させた化合物は
知られているが、多糖のもつ構造をなるべく壊すことな
く、シリカゲル等の多孔質担体に結合させようとする場
合、多糖側の架橋点をなるべく少なくする必要があっ
た。しかし、このような目的で表面処理シリカゲルと多
糖とを結合させる架橋剤を少なくしたり、あるいは特願
平５−１３５１７０号明細書、同５−２５７５３８号明
細書に記載されているように、多糖の還元末端のみを利
用して表面処理シリカゲルに化学結合させようとした場
合、当然反応性が低下し、高い結合量を得ることができ
ないという問題点があった。特に上記特許出願書類に記
載された、多糖の還元末端のみを利用して表面処理シリ
カゲルに化学結合させる場合、多糖側の反応部位が多糖
の末端１ヶ所のみであるため、反応性が低く、高い結合
量が得られないという問題点があった。高い結合量が得
られないと、生成物を分離剤として利用した場合、実用
的な分離が行われなかったり、分離の対象であるサンプ
ルの負荷量が低いという問題が生じる。

【０００３】そこで、本発明者らは鋭意研究を重ねた結
果、反応溶液中で表面処理シリカゲルと、例えば多糖を
結合させる場合、表面に存在するシラン処理剤を減らし
ておくこと、つまり未反応のシラノール基を多く残すこ
とにより、多糖をシラン処理剤の官能基と効率よく結合
できることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて
完成したのである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は多糖
またはその誘導体と多孔質担体とをシラン処理剤によっ
て化学結合させた分離剤を製造する方法において、多孔
質担体の反応性水酸基のモル数に対して、シラン処理剤
被覆率が３０％以上８０％以下であることを特徴とする
分離剤の製造方法を提供するものである。

【０００５】以下に本発明を詳細に説明する本発明に用
いられる親水性ポリマーである多糖またはその誘導体と
しては、通常、合成多糖，天然多糖及び多糖誘導体のい
ずれも用いられ、例えばα−１，４−グルカン（アミロ
ース）、β−１，４−グルカン（セルロース）、α−
１，６−グルカン（デキストラン）、β−１，６−グル
カン（プスツラン）、α−１，３−グルカン、β−１，
３−グルカン（カードラン，シゾフィラン）、α−１，
２−グルカン、β−１，２−グルカン、β−１，４−キ
トサン、β−１，４−Ｎ−アセチルキトサン（キチ
ン）、β−１，４−ガラクタン（ガラクタン）、α−
１，６−ガラクタン、β−１，２−フラクタン（イヌリ
ン）、β−２，６−フルクタン、β−１，３−キシラ
ン、β−１，４−キシラン、β−１，４−マンナン、α
−１，６−マンナン、プルラン、アガロース、澱粉等が
好ましいものとして挙げられる。これら多糖の平均重合
度は、通常３以上であり、上限は特に制限されないが、
取扱いの点から通常は１０００以下が好ましい。

【０００６】次に、多孔質担体とは、多孔質無機担体及
び多孔質有機担体のことであり、多孔質無機担体として
は、シリカゲル，珪藻土，ヒドロキシアパタイト，アル
ミナ，酸化チタン，マグネシア等があり、これらの中で
はシリカゲルが好ましい。なお、本発明に用いるシリカ
ゲルの粒径は１〜１０００μｍ、好ましくは２〜１００
μｍであり、平均孔径は１０Å〜１００μｍ、好ましく
は５〜５００ｎｍである。一方、多孔質有機担体として
は、表面の極性が高い担体があり、具体的には、キチ
ン，キトサン，セルロース等の多糖を用いた担体やビニ
ルアルコール単位と架橋性単量体単位からなる共重合体
などがある。

【０００７】本発明において、多糖またはその誘導体と
の親和性をよくするために、表面処理を行ったシリカゲ
ルを用いることは特に好適である。表面処理は、有機シ
ラン化合物等のシラン剤を用いたシラン化処理やプラズ
マ重合による方法が一般的である。シリカゲルのシラン
化処理の具体例について説明すると、シリカゲルをアミ
ノプロピル基等の官能基を持つ有機シラン化合物で表面
処理する。この際、シリカゲルの表面に存在する反応性
シラノール基(reactive silanol groups) のモル数に対
するシリカゲル表面を被覆するシラン処理剤のモル数の
割合、すなわちシラン処理剤被覆率を３０〜８０％、好
ましくは４０〜８０％に抑えるようにする。なお、使用
したシリカゲルの表面に存在するシラノール基のうち反
応性シラノール基は、Journal of Chromatography,(199
1) 1d-8d, M. OKAMOTO et alの方法に基づき約３μｍｏ
ｌ／ｍ^２として評価した。このようにして得られた表面
処理シリカゲルは未反応のシラノール基が多く残るた
め、極性の高い表面となり、溶液中の多糖などの親水性
ポリマーを優位に吸着できるため、反応性が高くなると
考えられる。

【０００８】この表面処理量を抑えた表面処理シリカゲ
ルに多糖またはその誘導体を結合させる方法としては、
例えば特願平５−１３５１７０号明細書に記載の方法で
得られたラクトン化アミロースをＤＭＳＯ中に溶解して
シリカゲルの表面のアミノ基とアミド結合させる方法を
そのまま用いることができる。表面処理量を抑えた表面
処理シリカゲルは、公知の方法によりシリカゲルに添加
するシラン処理剤の量を調節することにより容易に調製
できる。一般的にはシラン処理剤で表面処理する場合、
シラノール基をできるだけ無くすような研究は多く行わ
れてきたが、本発明のように、シラン処理したシリカゲ
ルになるべく少ない架橋点で親水性ポリマーを結合させ
ようとする場合は、今までとは逆にシラノール基をでき
るだけ残すようにシラン処理剤での表面処理量を減らし
た方が良いことが明らかとなった。

【０００９】なお、未反応のシラノール基の影響を無く
すために、常法によりエンドキャッピング処理を施すこ
ともできる。本発明に用いる担体の形状は特に制限され
ず、円筒状，角柱状，粒状，膜状などが好適な形状であ
り、特に多孔質膜を使用することにより、クロマト用に
適した分離剤を得ることができる。

【００１０】表面処理シリカゲルと多糖またはその誘導
体との結合様式としては、通常、エーテル、チオエーテ
ル、エステル、アミド、ウレタン、チオウレタン、ウレ
ア、チオウレアなどの結合のほかにアミノ基のアルキレ
ーションなどの結合様式をとることができ、使用したシ
ラン処理剤の官能基等により適宜選択することができ
る。

【００１１】次に、シラン処理剤としては、上記の結合
様式をとりうるシラン処理剤またはその誘導体が用いら
れる。シラン処理剤は、シランカップリング剤として市
販されているものやアミノ基を持つように合成されたも
のなど任意に用いることができる。市販されているもの
の中では、(1) アミノ基を含むもの、(2) ビニル基を含
むもの、(3) 水酸基を含むもの、(4) ハロゲン基を含む
もの、(5) メルカプタン基を含むもの、(6) イソシアネ
ート基を含むもの、(7) エポキシ基を含むもの、(8) チ
オシアネート基を含むもの等の下記の一般式で示される
ものが用いられるが、好ましくはアミノ基を有するもの
が使用され、還元末端をラクトン化した場合や還元末端
を還元剤存在下で還元してアミノ化を行う場合は、第１
級アミンを持つものが好ましい。また、シラン処理剤と
多糖またはその誘導体を結合する際、ポリマー側を下記
のシラン処理剤の官能基と結合するように誘導体化して
おいてもよい。

【００１２】

【化１】

【００１３】

【化２】

【００１４】

【化３】

【００１５】

【化４】

【００１６】

【化５】

【００１７】

【化６】

【００１８】

【化７】

【００１９】

【化８】

【００２０】上記のシラン処理剤において、ｎ_１は１〜
３までの整数が好ましく、Ｒ^１は水素原子または炭素数
が１〜２０程度のアルキル基またはそれから誘導される
基を、Ｒ^２は炭素数が１〜２０程度のアルキル基、置換
アルキル基、フェニル基、置換フェニル基等が共有結合
したものを示す。また、Ｘは少なくとも１個は炭素数が
１〜１０までのアルコキシ基またはハロゲン原子、好ま
しくは塩素原子を示し、Ｙはハロゲン原子を示す。

【００２１】本発明の方法において、多糖またはその誘
導体と多孔質担体とをシラン処理剤によって化学結合さ
せるには、公知の方法を適用すればよく、例えば特願平
５−１３５１７０号明細書記載の方法で行うことができ
る。

【００２２】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ 表面処理シリカゲルの合成 予め活性化（１８０℃、２時間真空乾燥）しておいたシ
リカゲル（ＹＭＣ社製、平均孔径３０ｎｍ、粒径５μ
ｍ、表面積１７０ｍ^２/ｇ）３ｇにドライベンゼン１２
ｍｌおよびドライピリジン0.６ｍｌを添加し、３−アミ
ノプロピルトリエトキシシラン0.０４８ｍｌを加えて９
０℃で１２時間反応させた。このようにして得た表面処
理シリカゲルを、メタノール，アセトン，ヘキサンで洗
浄した後、６０℃で２時間真空乾燥した。同様にして、
３−アミノプロピルトリエトキシシランの添加量だけを
それぞれ0.１ｍｌ，0.２４ｍｌ，0.４８ｍｌ，１ｍｌに
変えて表面処理量の異なるシリカゲルを調製した。これ
ら表面処理シリカゲルを３−Ｉ，３−II, ３−III, ３
−IV, ３−Ｖとし、パーキンエルマー２４００ＣＨＮ元
素分析装置を用いて元素分析を行った。

【００２３】セルロースの結合 セルロース（メルク社製、カラムクロマト用）１０ｇ，
ＬｉＣｌ１０ｇおよびＤＭＡ１３４ｍｌを５００ｍｌの
３ツ口フラスコ中にて８０℃で溶解した。また、ＮａＢ
Ｈ_３ＣＮ１ｇをＤＭＳＯ３４ｍｌに溶解した溶液を調製
した。先に調製した各種表面処理シリカゲル2.９ｇを減
圧下でよく乾燥させた後に、セルロース溶液２４ｍｌと
ＮａＢＨ_３ＣＮ溶液4.８ｍｌを加え、さらに氷酢酸３０
μｌを添加し、８０℃で５日間反応させた。得られたセ
ルロース結合シリカゲルをＬｉＣｌ／ＤＭＡ溶液で洗浄
し、メタノール，アセトン，ヘキサンで洗浄し、６０℃
で２時間真空乾燥した。上記の方法で得た５種類のセル
ロース結合シリカゲルの元素分析を行い、糖の結合量を
調べ、この結果を第１表に示した。

【００２４】

【表１】第１表

【００２５】表面処理（Ｃ％）：３−アミノプロピルト
リエトキシシランで表面処理したシリカゲルの炭素含量
（元素分析値）。 シラン処理剤被覆率：多孔質担体の表面に存在する全反
応性ＯＨ基のモル数（ここで使用したシリカゲルの反応
性シラノール基は３μｍｏｌ／ｍ^２として計算）に対す
る、元素分析から算出された多孔質担体の表面に存在す
るシラン剤のモル数（この場合、元素分析のＣ，Ｎ比に
よりシラン処理剤１分子中３個のエトキシ基のうち平均
で１個が残っているとした）の割合である。 セルロース結合量：アミノプロピル基を有するよう表面
処理したシリカゲルに結合したセルロースの炭素含量
（元素分析から算出）。

【００２６】応用例１ 実施例１で得た分離剤を0.４６×２５ｃｍのステンレス
スチール製カラムにスラリー充填法にて充填した。充填
装置は京都クロマト社製のＰＳ１０，ＰＳ−２０オート
パッキングシステムを用いた。このカラムを用いて光学
分割能を評価したところ、弱いが光学分割能を示した。

【００２７】応用例２ この例では、さらに光学分割能を向上させるため、以下
の操作をした。セルロース結合量の多かった３−IIのシ
リカゲルを用いて合成したセルロース結合表面処理シリ
カゲルをドライＤＭＡ−ＬｉＣｌ９ｍｌ，ピリジン３ｍ
ｌ中に分散させ、この反応液に３，５−ジメチルフェニ
ルイソシアネート２ｍｌを添加し、８０℃で１４時間攪
拌した後、溶液中に過剰のイソシアナート基が残存して
いることをＩＲスペクトルにおいて２２７０ｃｍ^−１に
Ｃ＝Ｎ間の伸縮振動を認めることにより確認した。

【００２８】この反応液中の糖結合表面処理シリカゲル
をテトラヒドロフラン，メタノール，アセトン，ヘキサ
ンで洗浄し、６０℃で２時間真空乾燥した。この化合物
についてＩＲスペクトル分析および元素分析を行った結
果、ＩＲスペクトルにおいて１７１０ｃｍ^−１にカルボ
ニル基の伸縮振動（第２級カーバミン酸エステルのＣ＝
Ｏの吸収）が認められ、さらに元素分析値よりＣは１2.
２５％であり、シリカゲルへの結合を確認し、この化合
物（光学分割用分離剤、シリカ孔径３０ｎｍ，理論段数
=6600 ，ｔ_０=6.00）をクロマト用分離剤とした。

【００２９】応用例３ 光学分割用カラムの作製と光学分割能 応用例２で得た分離剤を0.４６×２５ｃｍのステンレス
スチール製カラムにスラリー充填法にて充填した。充填
装置は京都クロマト社製のＰＳ１０，ＰＳ−２０オート
パッキングシステムを用いた。このカラムを用いて光学
分割能を評価した。なお、高速液体クロマトグラフシス
テムはウォーターズ５１０ポンプおよび４８６ＵＶ検出
器等を用い、溶離液はヘキサン：ＩＰＡ＝９０：１０を
用い、流速0.５ｍｌ／ｍｉｎ、室温で行った。

【００３０】結果を第２表に示した。この表から分かる
ように、本発明の分離剤はｋ_１値，α値共に高い分離特
性を示した。さらに、本発明により得られた光学分割用
カラムの耐溶媒性を調べるためテトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）溶液を流速１ｍｌ／ｍｉｎで２００時間流した後
の光学分割能を調べたが、変化は認められず、優れた耐
溶媒性を確認できた。

【００３１】

【表２】第２表 △ :旋光度検出器で分離が認められたが、ＵＶ検出器で
は認められなかった。 (+): 右旋性の化合物が先に溶出したことを示す。 (-): 左旋性の化合物が先に溶出したことを示す。

【００３２】実施例２ 表面処理シリカゲルの合成 予め活性化（１８０℃、２時間真空乾燥）しておいたシ
リカゲル（富士シリシア化学社製、平均孔径４５ｎｍ、
粒径５μｍ、表面積６４ｍ^２/ｇ）３ｇにドライベンゼ
ン１２ｍｌおよびドライピリジン0.６ｍｌを添加し、３
−アミノプロピルトリエトキシシラン0.１ｍｌを加えて
９０℃で１２時間反応させた。このようにして得た表面
処理シリカゲルをメタノール，アセトン，ヘキサンで洗
浄した後、６０℃で２時間真空乾燥した。同様にして、
３−アミノプロピルトリエトキシシランの添加量だけを
それぞれ0.３ｍｌ，0.５ｍｌ，0.９ｍｌに変えて表面処
理量の異なるシリカゲルを調製した。これら表面処理シ
リカゲルを４−Ｉ，４−II, ４−III, ４−IVとし、パ
ーキンエルマー２４００ＣＨＮ元素分析装置を用いて元
素分析を行った。

【００３３】セルロースの結合 セルロース（メルク社製、カラムクロマト用）１０ｇ，
ＬｉＣｌ１０ｇおよびＤＭＡ１３４ｍｌを５００ｍｌの
３ツ口フラスコ中にて８０℃で溶解した。また、ＮａＢ
Ｈ_３ＣＮ１ｇをＤＭＳＯ３４ｍｌに溶解した溶液を調製
した。上記表面処理シリカゲルの合成で調製した４種
の表面処理シリカゲル2.９ｇを減圧下でよく乾燥させた
後に、セルロース溶液２４ｍｌとＮａＢＨ_３ＣＮ溶液4.
８ｍｌを加え、８０℃で５日間反応させた。このように
して得られたセルロース結合シリカゲルをＬｉＣｌ／Ｄ
ＭＡ溶液で洗浄し、メタノール, アセトン, ヘキサンで
洗浄し、６０℃で２時間真空乾燥した。

【００３４】上記の方法で得た４種類のセルロース結合
シリカゲルの元素分析を行い、糖の結合量を調べた。そ
の結果を第３表に示した。

【００３５】

【表３】第３表

【００３６】表面処理（Ｃ％）：３−アミノプロピルト
リエトキシシランで表面処理したシリカゲルの炭素含量
（元素分析値）。 シラン処理剤被覆率：多孔質担体の表面に存在する全反
応性ＯＨ基のモル数（ここで使用したシリカゲルの反応
性シラノール基は３μｍｏｌ／ｍ^２として計算）に対す
る、元素分析から算出された多孔質担体の表面に存在す
るシラン剤のモル数（この場合、元素分析のＣ，Ｎ比よ
りシラン処理剤１分子中３個のエトキシ基のうち平均で
１個が残っているとした）の割合である。 セルロース結合量：アミノプロピル基を有するよう表面
処理したシリカゲルに結合したセルロースの炭素含量
（元素分析から算出）。

【００３７】実施例３ 表面処理シリカゲルの合成 予め活性化（１８０℃、２時間真空乾燥）しておいたシ
リカゲル（富士シリシア化学社製、平均孔径５４ｎｍ、
粒径５μｍ、表面積５７ｍ^２/ｇ）３ｇにドライベンゼ
ン１２ｍｌとドライピリジン0.６ｍｌを添加し、３−
（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラ
ン0.１ｍｌを加えて９０℃で１２時間反応させた。得ら
れた表面処理シリカゲルをメタノール，アセトン，ヘキ
サンで洗浄した後、６０℃で２時間真空乾燥した。同様
にして、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリ
メトキシシランの添加量だけをそれぞれ0.３ｍｌ，0.５
ｍｌ，0.９ｍｌ，1.５ｍｌに変えて表面処理量の異なる
シリカゲルを調製した。これら表面処理シリカゲルを５
−Ｉ，５−II, ５−III, ５−IV，５−Ｖとし、元素分
析を行った。

【００３８】ラクトン化アミロースの合成 特願平５−１３５１７０号明細書に記載した方法と同様
な方法で合成したマルトペンタオースグルカノートカリ
ウム0.６４ｇとグルコース１燐酸（Ｇ１Ｐ）３8.５ｇを
５８０ｍｌの滅菌超純水、ＤＭＳＯ２５２ｍｌに溶解
し、ｐＨ６に調整し、その中にポテト由来の粗ホスホリ
ラーゼを１３２０単位添加した後、４５℃で約５時間静
置した。糖鎖の伸長は、反応溶液の一部をサンプリング
し、トリクロロ酢酸で酵素を失活させた後、Fiske-Subb
arow法で遊離の燐酸量を定量することにより追跡した。
反応溶液を湯浴中で処理して酵素を失活させ濾過した
後、濃塩酸の添加によりｐＨ１まで酸性にすることで、
グルカナート塩をラクトンに変換させた。その後、１０
０％エタノールを反応液量と同量添加し、生成糖を沈澱
させた。さらに５０％エタノール，１００％エタノー
ル，ジエチルエーテル（またはヘキサン）で洗浄し、６
０℃で２時間真空乾燥して5.９ｇのラクトン化アミロー
スを得た。この化合物についてゲル濾過液体クロマトグ
ラフィー分析を行い、アミロース標準試薬（中埜酢店
製）による標準曲線より算出した平均重合度は１２３で
あった。また、燐酸定量から算出した平均重合度は９０
であった。

【００３９】前記の表面処理シリカゲルの合成で得ら
れた５種類の表面処理シリカゲル2.９ｇに、先に得たア
ミロースラクトン１ｇをドライＤＭＳＯ９ｍｌに溶解し
たものを加え、８０℃で１２時間アミド結合させた。得
られた表面処理シリカゲルをガラスフィルターＧ４を用
いて濾過し、残渣をＤＭＳＯ，メタノール，アセトン，
ヘキサンで洗浄し、未結合のラクトン化アミロース等を
除き、６０℃で２時間真空乾燥した。この５種類の糖結
合シリカゲルの元素分析を行い、糖の結合量を調べ、結
果を第４表に示した。

【００４０】

【表４】第４表

【００４１】表面処理（Ｃ％）：３−（２−アミノエチ
ルアミノプロピル）トリメトキシシランで表面処理した
シリカゲルの炭素含量（元素分析値）。 シラン処理剤被覆率：多孔質担体の表面に存在する全反
応性ＯＨ基のモル数（ここで使用したシリカゲルの反応
性シラノール基は３μｍｏｌ／ｍ^２として計算）に対す
る、元素分析から算出された多孔質担体の表面に存在す
るシラン剤のモル数（この場合、元素分析のＣ，Ｎ比よ
りシラン処理剤１分子中３個のメトキシ基のうち平均で
１個が残っているとした）の割合である。ラクトン化ア
ミロース結合量：アミノエチルアミノプロピル基を有す
るよう表面処理したシリカゲルに結合したラクトン化ア
ミロースの炭素含量（元素分析から算出）。

【００４２】

【発明の効果】本発明によれば、多糖またはその誘導体
と多孔質担体とをシラン処理剤によって化学結合させた
分離剤を製造する際に、未反応のシラノール基を多く残
すようにシラン処理剤の量を調整することにより、多糖
またはその誘導体をシラン処理剤の官能基に効率よく結
合させ、分離能の優れた分離剤を製造することができ
る。したがって、この分離剤は光学活性異性体の分離の
ために好適に使用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−218249（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−255129（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−181960（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−71170（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) B01J 20/00 - 20/34

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 多糖またはその誘導体と多孔質担体とを
   シラン処理剤によって化学結合させた分離剤を製造する
   方法において、シラン処理剤被覆率が３０％以上８０％
   以下であることを特徴とする分離剤の製造方法。
2. 【請求項２】 多孔質担体が、シリカゲルである請求項
   １記載の分離剤の製造方法。
3. 【請求項３】 分離剤が、光学活性異性体分離用の分離
   剤である請求項１記載の分離剤の製造方法。