JP7002712B2 - エンドトキシンの検出方法および検出装置 - Google Patents

Description

本発明はエンドトキシンの検出方法及び検出装置に関し、より詳しくは、電気化学的測定によりエンドトキシンを検出するエンドトキシンの検出方法および検出装置に関する。

透析液を用いるオンライン血液透析濾過または血液濾過を行う血液透析装置においては、透析液を介して血液中にエンドトキシンが混入することがあってはならず、そのために、透析液回路にエンドトキシンを捕捉するフィルタを備えて、透析液を清浄化することが要求されている。
ここで、エンドトキシンとは、大腸菌やサルモネラ菌をはじめとするグラム陰性菌の外膜を構成している毒性物質の総称であり、その本体はリポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）であり、大きくは多糖部分とリピドＡと呼ばれる脂質部分から構成されている。エンドトキシンは、極微量でも血液中に混入すると、発熱作用、ショック死、血管内血液凝固、または敗血症を引き起こすため、医薬品や医療機器などのエンドトキシン汚染は重要な管理事項となっている。
このようなエンドトキシンの検出方法としては、カブトガニの血球抽出液からなる試薬を用いるリムルス試験が一般的であり、これによれば非常に高感度にエンドトキシンを検出することができる。しかしながら、用いる試薬が高価であり、また透析液に含まれるエンドトキシンを検出する場合には、透析液の成分が検出に影響しないように千倍にも希釈しなければならず、血液透析装置の設置環境において容易に検査できるものではなかった。
これに対し特許文献１においては、エンドトキシンの電気化学的濃度測定方法が提案されている。

特開２０１６－１５１４８２号公報

前述したようにエンドトキシンは多糖部分と脂質部分から構成されるが、糖に関しては単糖類や少糖類（二糖類）は電気化学的測定が可能であるが、多糖類については、一般的に電気化学的な活性が低いものとされている。また、脂質部分については、電気化学的な活性を示さないばかりか、電極の表面に吸着されて測定感度を低下させる要因となる。
このようなエンドトキシンの電気化学的測定について、特許文献１の方法においては、まず、担体にエンドトキシンを捕捉させ、ここへ重金属化合物部位を有するエンドトキシン認識プローブを作用させて、エンドトキシンに捕捉させる。その時、担体に捕捉されたエンドトキシンの量に応じて、エンドトキシン認識分子プローブが捕捉されるため、プローブが捕捉された担体に酸溶液を添加して、プローブ中から重金属を重金属イオンとして溶出させ、重金属イオンを含有している溶出液を所定の緩衝液に添加して、重金属イオンの電気化学測定が可能な作用電極を用いて溶出液中の重金属イオン濃度を定量するようにしている。
このような特許文献１の方法によれば、電気化学的にエンドトキシンの濃度測定を行うことができる。しかしながら、エンドトキシンに捕捉される重金属化合物部位を有するエンドトキシン認識プローブを準備することが必須であり、容易に検査を実施するのは困難であった。また、エンドトキシン認識プローブの重金属を介した間接的な測定であり、エンドトキシンを直接的に検出しておらず、測定誤差が生じる可能性があった。
本発明の目的は、電気化学的測定により高感度かつ安価にエンドトキシンを検出することができるエンドトキシンの検出方法および検出装置を提供することである。

上述した事情に鑑み、請求項１に記載した本発明は、電気化学的測定によりエンドトキシンを検出するエンドトキシンの検出方法において、
エンドトキシンを吸着する吸着材に被検査液を接触させてエンドトキシンを吸着させ、
上記エンドトキシンが吸着した吸着材に塩基性溶液を接触させてエンドトキシンを吸着材から離脱させるとともに、加水分解によりエンドトキシンを構成する多糖を単糖に分解し、
上記離脱したエンドトキシンから生じた単糖を含む塩基性溶液に対して電気化学的測定を行うことを特徴とするものである。
また、請求項３に記載した本発明は、電気化学的測定によりエンドトキシンを検出するエンドトキシンの検出装置において、
エンドトキシンを吸着する吸着材と、エンドトキシンを離脱させる塩基性溶液を供給する供給手段と、電気化学的測定を行う測定手段とを備え、
被検査液を上記吸着材に接触させてエンドトキシンを吸着させた後、上記塩基性溶液を吸着材に接触させてエンドトキシンを離脱させるとともに、加水分解によりエンドトキシンを構成する多糖を単糖に分解し、離脱したエンドトキシンから生じた単糖を含む塩基性溶液を電気化学的測定することを特徴とするものである。

このような構成によれば、電気化学的測定により高感度かつ安価にエンドトキシンを検出することができる。

本発明のエンドトキシンの検出装置を備えた透析システムの構成図。 本発明のエンドトキシンの検出装置を備えた血液透析装置の構成図。 本発明のエンドトキシンの検出装置の構成図。 トリプルパルスアンペロメトリー（ＴＰＡ）の電圧波形を示す図。 本発明のエンドトキシンの検出方法による検出実験の結果を示す電流値のグラフ。 図５の実験結果に基づく電流値とエンドトキシンの量の関係を示すグラフ。

以下、図示実施例について本発明を説明すると、図１は透析システム１を示し、ＲＯ水供給装置２から供給されるＲＯ水を配管３を介して透析液供給装置４に送り、透析液供給装置４で作製した透析液を配管５を介して血液透析装置６に供給するようになっている。
図２は血液透析装置６の構成の一部を示し、配管５を介して供給される透析液は、供給通路７を流通してダイアライザ８に供給され、ダイアライザ８から排出通路９に排出される。ダイアライザ８には血液回路１０が接続されており、人体から脱血された血液が動脈通路１０Ａからダイアライザ８に送られ、老廃物や余分な水分が除去されて静脈通路１０Ｂから人体に返血される。
供給通路７には透析液中のエンドトキシンを捕捉する捕捉フィルタ１１が二段で備えられており、二段目の捕捉フィルタ１１とダイアライザ８の間には、供給通路７と血液回路１０を繋ぐ補液通路１２が接続されている。この補液通路１２によって、供給通路７から血液回路１０へ透析液をオンラインで供給できるようになっている。

図１および図２において、１５が本発明に係るエンドトキシンの検出装置を示し、開閉弁Ｖ１を備えた引込通路１６を介して、検出装置１５の内部に被検査液を引き込むようになっている。
図１に示す透析システム１においては、ＲＯ水供給装置２から透析液供給装置４にＲＯ水を送る配管３に引込通路１６を接続し、被検査液としてＲＯ水を抽出して検査するようになっているとともに、透析液供給装置４から血液透析装置６に透析液を送る配管５に引込通路１６を接続して、被検査液として透析液を抽出して検査するようになっている。
さらに、図２に示す血液透析装置６においては、二段目の捕捉フィルタ１１とダイアライザ８の間の供給通路７に引込通路１６を接続して、被検査液として捕捉フィルタ１１を通過した後の清浄化された透析液を抽出して検査するようになっている。また、ダイアライザ８に接続された排出通路９に引込通路１６を接続して、被検査液としてダイアライザ８を通過した使用済透析液を抽出して検査するようになっている。

図３は検出装置１５の内部構成を示しており、被検査液を引き込む引込通路１６には、開閉弁Ｖ１の下流側に被検査液を引き込むためのポンプＰが設けられ、ポンプＰの下流側にはエンドトキシンを選択的に吸着する吸着材１７が、筒状のカラムに充填された状態で設けられ、さらにその下流側には開閉弁Ｖ２が設けられている。そして、吸着材１７と開閉弁Ｖ２の間に測定回路１８の流入通路１８Ａが接続されるとともに、開閉弁Ｖ２の下流側に流出通路１８Ｂが接続されており、流入通路１８Ａには開閉弁Ｖ３が設けられ、流入通路１８Ａと流出通路１８Ｂの間には、三電極方式により電気化学的測定を行う測定セル１９が設けられている。なお、エンドトキシンを選択的に吸着する吸着材１７に関しては、例えばＷＯ２０１３／１８０１７６号公報等により公知である。

測定セル１９には流路１９Ａが形成されており、流路１９Ａに臨ませて作用電極２０Ａ、対極２０Ｂ、参照電極２０Ｃが設けられ、これら電極２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃは、制御部２１に備えられたポテンショスタット２１Ａに接続されており、これにより電気化学的測定を行う測定手段が構成されている。測定セル１９に備える電極としては、作用電極２０Ａは金、対極２０Ｂは白金、参照電極２０Ｃは銀／酸化銀とするのが一般的であるが、本実施例では作用電極２０Ａは金ナノ粒子を修飾させた炭素芯から構成し、参照電極２０Ｃとしてはステンレス製のチューブを採用している。
ポテンショスタット２１Ａは、作用電極２０Ａと対極２０Ｂの間に電圧を印加するとともに電流を測定し、参照電極２０Ｃの電位を基準として作用電極２０Ａの電位を規制する働きをする。制御部２１はポテンショスタット２１Ａが測定した電流値に基づいてエンドトキシンを検出して含有量を求め、検査結果を記録ならびに集計するとともに、内蔵した表示部に表示または血液透析装置６等の透析システム１を構成する機器に出力する。

引込通路１６には、さらに開閉弁Ｖ１とポンプＰの間に、洗浄水としてＲＯ水供給装置２からＲＯ水を供給する洗浄水通路２２が接続されて、洗浄水の供給手段が備えられるとともに、溶液容器２３から水酸化ナトリウム溶液や水酸化カリウム溶液等の塩基性溶液を供給する溶液通路２４が接続されて、塩基性溶液の供給手段が備えてられており、洗浄水通路２２には開閉弁Ｖ４が設けられ、溶液通路２４には開閉弁Ｖ５が設けられている。
塩基性溶液は、吸着材１７に選択的に吸着されたエンドトキシンを離脱させる作用を有しているが、同時にエンドトキシンを加水分解して、エンドトキシンを構成する多糖の一部を単糖に分解する作用を有している。本発明では、この分解された単糖を電気化化学的測定により検出することにより、エンドトキシンを検出するようにしている。

以上のように構成される検出装置１５において、ポンプＰや各開閉弁Ｖ１～５の作動は制御部２１により制御されるようになっている。以下において、検出装置１５の動作ならびにエンドトキシンの検出方法について説明する。
本発明の検出装置１５による検出方法は、被検査液を吸着材１７に接触させて吸着材１７にエンドトキシンを吸着させる吸着工程と、吸着材１７に塩基性溶液を接触させて吸着されたエンドトキシンを離脱させる離脱工程と、離脱されたエンドトキシンを含む塩基性溶液に対して電気化学的測定を行ってエンドトキシンを検出する検査工程とから構成される。

吸着工程では、ポンプＰを停止し各開閉弁Ｖ１～Ｖ５を閉鎖した状態から、開閉弁Ｖ１、Ｖ２を開放するとともにポンプＰを作動させて、被検査液を引込通路１６に引き込んで吸着材１７を充填したカラムに通過させる。被検査液がエンドトキシンに汚染されて場合には、吸着材１７に接触する間にエンドトキシンが吸着材１７に吸着される。吸着材１７と接触した後の被検査液は、開放状態の開閉弁Ｖ２を経て装置外部に排出される。

続く離脱工程では、まず開閉弁Ｖ１を閉鎖するとともに開閉弁Ｖ４を開放して、洗浄水としてＲＯ水を供給し吸着材１７を洗い流す。これにより吸着材１７に付着しているエンドトキシン以外の物質を洗い流し、エンドトキシンだけが吸着した状態とする。ここで洗い流される物質としては、透析液に含まれるタンパク質や糖類があり、後に行う電気化学的測定において誤って検出されることを防止している。吸着材１７を通過したＲＯ水は、開放状態の開閉弁Ｖ２を経て装置外部に排出される。なお、被検査液がＲＯ水など測定に影響を及ぼす物質を含まない場合は、この洗い流す操作を省略できる。
その後、開閉弁Ｖ４を閉鎖し開閉弁Ｖ５を開放して、塩基性溶液を吸着材１７に接触させるとともに、開閉弁Ｖ２を閉鎖して開閉弁Ｖ３を開放し、塩基性溶液を測定回路１８の流入通路１８Ａに流入させる。これによりエンドトキシンが吸着材１７から離脱されて、エンドトキシンを含む塩基性溶液が測定セル１９の流路１９Ａを流通する。測定セル１９を通過した塩基性溶液は、流出通路１８Ｂから引込通路１６に流出して装置外部に排出される。この離脱工程において、エンドトキシンは塩基性溶液の加水分解作用により、多糖の一部が単糖に分解される。

検査工程は、塩基性溶液が測定セル１９を通過する間に、ポテンショスタット２１Ａによって作用電極２０Ａと対極２０Ｂの間に電圧を印加し、その際の電流を測定することで実行される。塩基性溶液により加水分解されてエンドトキシンから生じた単糖が作用電極２０Ａの表面で酸化反応を起こし、それにより作用電極２０Ａと対極２０Ｂの間で電流が発生する。この電流量は反応した単糖の濃度に比例するため、電流値を測定することにより単糖を検出することができ、これに基づいてエンドトキシンを検出することができる。
しかしながら、エンドトキシンは多糖の他に脂質部分を有しており、この脂質部分が作用電極２０Ａに吸着されて感度低下を引き起こし、検出の再現性を悪化させるという問題がある。そこで、本発明においては、トリプルパルスアンペロメトリー（ＴＰＡ）という電気化学的測定手法を用いることで吸着される脂質を除去し、高感度かつ高い再現性を実現している。すなわち、トリプルパルスアンペロメトリーは、３つの異なる電位が連続的に切り換わることを一周期（１パルス）として、これを複数回印加して電気化学的測定を行う手法であり、図４に示すように、測定電位（Ｅ３）から高い電位（Ｅ１）に切り換えることで、測定時の酸化反応により作用電極２０Ａに付着した酸化生成物とともに、吸着された脂質を酸化させて剥離し（クリーニング）、続いて測定電位（Ｅ３）より低い電位（Ｅ２）に切り換えて作用電極２０Ａを還元し（再活性化）、その後測定電位（Ｅ３）に切り換えるサイクルを繰り返すようになっており、これにより作用電極２０Ａへの酸化生成物の蓄積を回避し、また作用電極２０Ａに吸着された脂質を除去することで検出感度の低下を防止し、常に高感度でかつ高い再現性によるエンドトキシンの検出を実現することができる。

図５は本発明に係る検出装置１５を用いた、エンドトキシン検出実験の結果であり、横軸を時間、縦軸を電流値として時間経過に伴う電流値の変化を表している。この実験では塩基性溶液として１モルの水酸化カリウム溶液を用い、この水酸化カリウム溶液にエンドトキシンを添加して電気化学的測定を行ったものであり、水酸化カリウム溶液１ｍＬあたりのエンドトキシン量を、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２５μｇと増加させながら、トリプルパルスアンペロメトリー（ＴＰＡ）により電流値を測定している。トリプルパルスアンペロメトリー（ＴＰＡ）の各電位は、Ｅ１：＋０．８Ｖ、Ｅ２：－０．４Ｖ、Ｅ３：＋０．３Ｖに設定している。この実験の結果から、エンドトキシン量の増加に伴って、測定される電流値が高くなることが分かる。これは、エンドトキシンを構成する多糖の一部が塩基性溶液により単糖に加水分解されて、その単糖が電気化学的活性を示したものと推測される。
図６は図５の実験結果に基づくエンドトキシン量と電流値の関係を示すもので、横軸をエンドトキシン量、縦軸を電流値としており、ほぼ比例していることが見て取れる。すなわち、電気化学的活性を示す単糖が、エンドトキシンの多糖の一部が分解したものであっても十分な再現性を有していることを示しており、これに基づいて測定された電流値からエンドトキシン量を求める検量線を引くことができる。

以上の実施例においては、本発明に係る検出装置１５を透析システム１ならびに血液透析装置６に接続して構成した場合について説明したが、検出装置１５を単体で設置するようにしてもよい。この場合には、サンプリングした被検査液をシリンジやバッグ等の容器に収容させ、これら容器から先端を開放させた引込通路１６に流入させるようにする。

１５‥検出装置
１７‥吸着材
１９‥測定セル（測定手段）
２１Ａ‥ポテンションスタット（測定手段）
２３‥溶液容器（供給手段）
２４‥溶液通路（供給手段）

Claims (3)

1. 電気化学的測定によりエンドトキシンを検出するエンドトキシンの検出方法において、
   エンドトキシンを吸着する吸着材に被検査液を接触させてエンドトキシンを吸着させ、
   上記エンドトキシンが吸着した吸着材に塩基性溶液を接触させてエンドトキシンを吸着材から離脱させるとともに、加水分解によりエンドトキシンを構成する多糖を単糖に分解し、
   上記離脱したエンドトキシンから生じた単糖を含む塩基性溶液に対して電気化学的測定を行うことを特徴とするエンドトキシンの検出方法。
2. 上記被検査液が透析液であり、上記エンドトキシンが吸着した吸着材に塩基性溶液を接触させる前に、吸着材を洗浄水で洗い流すことを特徴とする請求項１に記載のエンドトキシンの検出方法。
3. 電気化学的測定によりエンドトキシンを検出するエンドトキシンの検出装置において、
   エンドトキシンを吸着する吸着材と、エンドトキシンを離脱させる塩基性溶液を供給する供給手段と、電気化学的測定を行う測定手段とを備え、
   被検査液を上記吸着材に接触させてエンドトキシンを吸着させた後、上記塩基性溶液を吸着材に接触させてエンドトキシンを離脱させるとともに、加水分解によりエンドトキシンを構成する多糖を単糖に分解し、離脱したエンドトキシンから生じた単糖を含む塩基性溶液を電気化学的測定することを特徴とするエンドトキシンの検出装置。

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