CN101351562A

CN101351562A - 内毒素分析

Info

Publication number: CN101351562A
Application number: CNA2006800500383A
Authority: CN
Inventors: G·拉森; P·-A·尼格伦
Original assignee: GL BIOTEKNIK HB
Current assignee: GL BIOTEKNIK HB
Priority date: 2005-11-02
Filing date: 2006-11-02
Publication date: 2009-01-21
Also published as: AU2006309357A1; EP1951893A1; CA2628242A1; US7998697B2; US20090098590A1; EP1951893B1; JP2009514524A; DE602006016978D1; WO2007053107A1; ATE481500T1

Abstract

本发明涉及检测内毒素存在或不存在的方法，其特征是使OmpT蛋白与疑似含内毒素的样本接触，并分析该OmpT蛋白的蛋白酶活性。本发明还涉及使用本发明的方法检测败血症发作的方法和用于进行该方法的试剂盒。

Description

内毒素分析

发明领域

本发明涉及内毒素分析领域。

发明背景

内毒素分析

内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜中存在的脂多糖(LPS)。内毒素包括下列组分：脂质部分(所谓的类脂A)、核心寡糖(构成所述大分子的骨架)和O-抗原(由各种重复寡糖残基构成)。正是类脂A赋予了该分子的毒性。

内毒素是强热原，进入机体的血液或组织后会导致如发热、脑膜炎和血压迅速下降。当革兰阴性菌裂解或分裂时，其外膜的组分如内毒素被释放到环境中，导致环境污染。这种污染难以防止，因为内毒素是普遍存在、稳定和小得足以通过常规除菌滤器。

因此，对将被导入患者机体内的药物制剂和医疗设备进行内毒素污染的检测是非常重要的。目前优选的检测内毒素的方法基于鲎(Limulus polyphemus)血变形细胞的裂解物。一种可供选择的方法是兔热原性测试，将怀疑含有内毒素的样本注入兔体同时监测兔的体温。

鲎(Limulus)变形细胞裂解物(LAL)法由4个反应步骤组成，见图1。它基于终止于肽凝固蛋白原裂解的酶激活步骤的级联。这样会产生不溶性裂解产物-凝固素，其通过离子相互作用而凝聚。如果形成足量的凝固素，就会出现混浊，继而产生凝胶血块。裂解凝固蛋白原的凝血酶也裂解含有与凝固蛋白原中相似裂解位点的其它肽。业已利用这一点构建了带有这种裂解位点和生色团对硝基苯胺(pNA)的肽。对该肽的裂解导致pNA的释放，pNA是黄色并在405纳米处有光吸收。pNA的释放可以用显色测定来测量。LAL方法的更多描述见FDA指南(1987)和ANST/AAMI标准ST72：2002。

LAL方法的主要缺点是：有若干物质会干扰该方法的不同步骤，必须小心以避免这些物质的干扰。这些物质的实例包括肝素、酵母和霉菌的细胞壁物质和纤维素物质。

LAL方法的另一个缺点是：裂解物的组分很快降解，因此裂解物的保存期限有限。生产该裂解物还包括从活鲎抽取血液。有约10～15％的鲎不能经受住这种处理，据估计，每年有20000～37500只鲎死于这种处理。此外，作为从自然界分离的任何产品，不同批次裂解物的提取组分是不同的，从而影响该方法的重复性。

Chaby R在Cellular and Molecular Life Sciences，vol.61(2004)pp1697-1713综述了若干LPS结合分子。作者承认了正在尝试寻找内毒素检测试剂。但是，即使Chaby注意到OmpT的酶活性需要LPS的连接，该作者也没有提示可以将OmpT的这种特性用于内毒素的检测方法中。

因此，非常需要更快、更便宜、更可靠和动物友好的内毒素分析方法。还需要在该方法使用的更稳定的试剂。

外膜蛋白酶T

外膜蛋白酶T即OmpT，是大肠杆菌(E.coli)外膜的一个组分。它被命名为丝氨酸肽酶家族S18-omptin。已有提示OmpT与泌尿系统疾病有关，因为在大肠杆菌的临床分离物中发现了OmpT基因。还提示OmpT参与抗微生物肽的降解，该抗菌肽由泌尿系统上皮细胞分泌。不过，OmpT的总的生物学功能还有待阐明。最近已发现其活性依赖于脂多糖(Kramer，R.A(2000)，Brandenburg，K.等(2005))。但是，这些出版物没有揭示可以通过测量OmpT活性来检测样品中的LPS。

发明概述

本发明基于以下认识：在内毒素检测的新的改进的分析方法中可以利用脂多糖对OmpT的激活作用。

在第一方面，本发明涉及检测内毒素存在情况的方法，其中使纯OmpT蛋白与疑似含有内毒素的样本接触，然后分析该OmpT蛋白的蛋白酶活性。所述活性表明样本中存在内毒素，缺乏活性表明不存在内毒素。

在优选实施方案中，通过加入一种报告肽来分析OmpT蛋白活性，其中该肽能被激活的OmpT裂解，并在裂解时产生可检测信号。该报告肽优选产生颜色或荧光信号。

在进一步的优选实施方案中，OmpT蛋白是从大肠杆菌纯化的天然OmpT、体外合成或重组生产的。重组宿主可以是细菌如大肠杆菌，或不产生内毒素的宿主有机体如毕赤酵母(Pichia pastoris)。

样本可以来自患者、医疗设备、水、空气、土壤或尘土或任何怀疑被内毒素污染的其他物质。

在第二方面，本发明涉及用于诊断败血症的诊断方法。

在第三方面，本发明涉及试剂盒，其包含用于进行第一和第二方面方法的试剂。

附图简述

图1是已知的用鲎变形细胞裂解物进行的内毒素分析的流程图。

图2是本发明分析方法的流程图。

定义

本申请中使用的所有术语具有本领域技术人员所掌握的通常含义。但是，为清楚起见，有少数术语定义如下。

内毒素是指天然存在于革兰氏阴性细菌外膜中并且在哺乳动物中显示毒性的脂多糖分子。在本申请中，在涉及到分子的理化性质(如它激活OmpT的能力)时，使用术语“脂多糖”或“LPS”；在涉及到该分子作为健康危害时，使用术语“内毒素”。术语“内毒素”还应该被解释为包括所述脂多糖中显示所述毒性特性的部分，如脂质A。

pNA是指对硝基苯胺。

IAA是指吲哚-3-乙酸。

Abz是指邻氨基苯甲酰基。

纯OmpT蛋白应被解释为意指OmpT蛋白制剂，其基本上不含影响其蛋白酶活性的组分。特别是，纯OmpT蛋白不含LPS。

本文件中使用的报告肽是与活性OmpT接触时产生可检测信号的肽、多肽或蛋白质。

发明详述

依据本发明的方法基于纯化OmpT与革兰氏阴性细菌脂多糖之间的相互作用。外膜蛋白酶OmpT是一种具底物专一性的蛋白酶，在两个连续的碱性氨基酸间裂解肽。OmpT蛋白的活性还依赖于脂多糖的存在。因此，本发明方法的最广泛方面涉及一种方法，其中，使纯化OmpT蛋白与疑似含有内毒素的样本接触，并检测该OmpT蛋白的活性。

本方法的物理实施方案可以是若干形式的任意一种。OmpT蛋白可以被固定在固相支持体(如微量滴定板)上，或它可以是在溶液中。

OmpT活性检测优选通过加入肽(以下称为“报告肽”，其包含OmpT裂解位点)并分析该报告肽是否被OmpT裂解来进行。该报告肽可以在使样本与OmpT蛋白接触之前、之后或同时加入到OmpT蛋白或样本中。该报告肽应该被构建为包含OmpT裂解位点和信号基团，所述信号基团在该报告肽被OmpT裂解时产生可检测信号。该活性测定法的反应方案见图2。

目前已知的或怀疑的OmpT裂解位点有：Arg-Arg，Lys-Lys，Lys-Arg，Arg-Lys，Arg-Ser，Arg-Val，Arg-Met，Arg-Ala，Lys-Ala，Lys-Gln和Lys-Thr(Kramer，A，(2001))。

信号基团可以是能产生可检测信号的任何基团。如有必要，该报告肽应包括猝灭基团，猝灭从信号基团发出的信号直到肽被裂解。目前优选的是显色基团和荧光基团，如对硝基苯胺或邻氨基苯甲酰。

报告肽的一个实例是Abz-Ala-Arg-Arg-Ala-Tyr(NO₂)-NH₂。用325nm波长光激发Abz基团，产生在430nm有最大发射的荧光信号。该荧光由Tyr(NO₂)基团猝灭，直到这些基团由于报告肽的裂解而被分开。

报告肽的另一个实例是IAA-Arg-Arg-pNA。OmpT对该肽的裂解产生IAA-Arg，后者再被氨肽酶M裂解产生IAA。可用分光光度法在405nm处检测IAA。

OmpT蛋白可以来自任何可得到的来源，只要它具有所需特性，即，它应该因LPS的存在而被激活和应该具有特异性蛋白酶活性。优选地，OmpT蛋白是来自大肠杆菌的OmpT(UniProt Knowledgebase，登录号P09169)，但是可能任何源自其它革兰氏阴性细菌的该蛋白的同源物都可用于在本发明。OmpT蛋白可以从天然产生OmpT的有机体分离，或它可以是重组产生的，优选地是用不产生LPS的有机体(如毕赤酵母)产生。它也可以通过无细胞合成在体外被合成。

待分析的样本可能包含干扰分析的物质。一类这种干扰物质是裂解报告肽的蛋白酶，在测定中不论有无内毒素的存在都给出阳性结果。在本发明的一个实施方案中，在测定中抑制这些蛋白酶。它们可以通过物理手段(如加热、改变pH值或电荷)、或化学手段(如添加蛋白酶抑制剂)来抑制。但这些抑制剂并不抑制OmpT的蛋白酶活性。

待分析样本可以有很多不同的来源。它可来自个体(如血液、血浆或一些其它器官的捐赠者)，或正经历自体输血的患者。它也可来自欲接触患者体液或内部器官的医疗器械，如手术器械和植入式装置。它可来自药用组合物。此外，它还可来自空气、尘土、土壤或怀疑有污染力或被环境污染的固体材料，如因潮湿损坏的建筑物。

在一方面，本发明涉及作为败血症发作的早期标志的内毒素的检测。在该方面，使来自怀疑有发生败血症风险的患者的血液样本用第一方面的方法检查。

另一方面，本发明涉及到试剂盒，其包含用于进行内毒素检测方法的必需部分。这种试剂盒优选包括纯OmpT蛋白制剂和报告肽。它可进一步包括：取样装置(如药签、刮刀(spatulas)、注射器或空气过滤器)、取样装置用的洗涤液、稀释样品用的缓冲溶液和/或进行检测用的小瓶。

实施例

来自大肠杆菌的OmpT蛋白酶的生产

(下面的纯化程序是对由Kramer A(2001)修改的Sugimura和Nishihara(1988)所述方法的改进)。

培养：为了从天然大肠杆菌的外膜中纯化天然OmpT，在适宜大小的生物反应器中，在最适于表达OmpT的pH值和温度条件下培养表达野生型OmpT和其信号序列的细胞，至达到所需OmpT量所必需的细胞量。培养可在分批或补料分批条件下，在复合培养基中进行，也可以在添加葡萄糖的无机盐培养基(salts medium)中进行。

收获：细胞培养物通过离心(2500rmp，15分钟)收获，然后用缓冲液A(50mM Tris/HCl，pH 7.5)洗涤沉淀，并再次离心。然后将沉淀悬浮于缓冲液A中。

细胞破碎：此后，通过弗氏压碎器或其它的细胞匀浆方法的剪切力破碎细胞。未破碎的细胞通过离心(1000g，10分钟)被去除。通过离心(36000g，40分钟)收集全细胞膜部分。

纯化：用缓冲液A洗涤沉淀，并再次离心(36000g，40分钟)。在4℃，在振摇期间用含0.1％十二烷基肌氨酸钠的缓冲液A洗涤沉淀1小时，以分离内膜和外膜。经超离心(36000g，40分钟)收集沉淀。在室温下于摇床上用含TritonX-100和5mM EDTA的缓冲液A处理1小时，从膜中提取OmpT。在超速离心(36000g，40分钟)后，将上清液施加到经缓冲液B(10mM DodMe₂NPrSO₃，20mM Tris/HCl，pH 7.5)平衡的DEAE-纤维素柱。用含NaCl(线性梯度至0.5M)的700ml缓冲液B洗脱所吸附的蛋白质。通过SDS-PAGE分析各级分，通过比色法分析活性。含纯OmpT的组分经合并，用缓冲液B透析，储存在-20℃。

重组OmpT的生产

在标准的PCR扩增中使用一套引物并以大肠杆菌染色体DNA为模板，通过PCR分离编码大肠杆菌OmpT蛋白酶的基因。将所产生的PCR产物克隆到合适的表达载体中。在这个载体中，该OmpT或者是非融合的，或者融合到合适的亲和配偶体，以提高有效纯化的可能性，及/或以支持将OmpT蛋白共价偶联到表面的可能性。然后，蛋白质可以在不同的宿主中生产，这些宿主可以基于不天然产生任何有污染性LPS加以选择。

如果所述蛋白质业已在大肠杆菌中被过度表达，则它可以在细胞质、大肠杆菌的周质或外膜中产生，后二者利用信号序列来产生。也可使用来自其他有机体的几个信号。为了最大限度地提高外膜的产量，使用天然信号；为了增强在周质中的产量，要避免使用外膜信号，而使用周质蛋白序列(如用于转运MalE的信号或甚至OmpA，后者有不干扰外膜的记录)。

无亲和融合配偶体的纯化：对于细胞质定位的蛋白质组分的纯化，通过或者收获全细胞或者选择性去除外膜和周质来进行。对于纯化，使用上述用于提取天然OmpT的程序的部分。对于产物的周质定位而言，遵循相同的策略，但收集外膜和周质级分。

为了使OmpT在膜中富集，遵循所建议的用于天然OmpT纯化的方法。

使用亲和配偶体的纯化：如果使用了亲和配偶体，则可以将全细胞提取物添加到纯化柱，如利用膨胀床吸附(EBA)的原理，其中柱子适合于吸附所用的融合标记。

OmpT活性之报告肽底物的生产

对OmpT的蛋白水解活性的检测最好用基于FRET的分析来进行。报告肽可以通过常规固相多肽化学，用使荧光团和猝灭基团位点以对于蛋白酶解位点而言特异性的定位偶联的方法来生产。蛋白酶解位点选自那些易于被OmpT裂解的位点。目前已知的裂解位点有：Arg-Arg、Lys-Lys、Lys-Arg、Arg-Lys、Arg-Ser、Arg-Val、Arg-Met、Arg-Ala、Lys-Ala、Lys-Gln和Lys-Thr。分析通过HPLC分析/MS进行。

报告肽也可以商业途径购买(如得自Bachem，瑞士)。

用表面固定化OmpT蛋白酶进行的内毒素分析

将重组或天然OmpT蛋白酶悬浮在允许吸附到塑料表面(如聚苯乙烯)的合适缓冲液中。可替代地，用亲和融合标记的OmpT蛋白酶蛋白质，这种固定化可以通过生物特异性相互反应来实现，如通过EDC/NHS激活的表面共价偶联至伯胺或通过其它合适的偶联化学来实现。在表面沉积完成后，加入LPS样本，它激活OmpT蛋白酶。最后，加入报告肽，这在样本中存在内毒素的情况下，就会导致OmpT裂解该报告肽。

报告信号的检测和定量通过波谱分析进行，所述分析可以或者单独对每一样本，或者扫描多平行形式。该分析在最适pH和温度下进行，参数可由本领域技术人员容易地调整。

用溶液中OmpT蛋白酶进行的内毒素分析

将重组或天然OmpT蛋白酶与疑似含内毒素之样本一起悬浮于合适缓冲液中，让蛋白酶功能激活。然后，加入报告肽，在样本中存在内毒素的情况下，就会导致OmpT裂解该报告肽。

报告信号的检测如上所述进行。分析在最适pH和温度下进行，参数可由本领域技术人员容易地调整。

参考文献

American National Standards Institute(2002)，ANSI/AAMIST72：2002，Bacterial endotoxins-Test methodologies，routine monitoring，and alternatives to batch testing(细菌内毒素-试验方法、例行监测和批次测试的可替代物)

Brandenburg，K.(2005)等，Eur.Biophys.J.，vol.34，pp.28-41

Chaby，R.(2004)，Cellular and Molecular Life Sciences，vol.61 pp1697-1713

Food and Drug Administration(1987)，Guideline on validation of theLimulus Amebocyte Lysate test as an end-product endotoxin test forhuman and animal parenteral drugs，biological products，and medicaldevices.(作为人类和动物胃肠外药物、生物制品和医疗器械用的终产物内毒素检测的鲎变形细胞裂解物试验的验证指南)

Kramer，R.A.(2000)等，Eur.J.Biochem.，vol 267，pp 885-893

Kramer A(2001)PhD thesis University of Utrecht，NL，ISBN90-393-2791-2

Sugimura and Nishihara(1988)，Purification，characterisation andprimary structure of Escherichia coli protease VII with specificity forpaired basic residues：the identity of protease VII and OmpT(对成对的碱性残基具有专一性的大肠杆菌蛋白酶VII的纯化、表征和一级结构：蛋白酶VII和OmpT的同一性).J Bact 170：5625-5632

Claims

1.检测内毒素存在或不存在的方法，其特征是使OmpT蛋白与疑似含内毒素的样本接触，并分析该OmpT蛋白的蛋白酶活性。

2.权利要求1的方法，其中蛋白酶活性通过加入包含OmpT裂解位点的报告肽来分析，其中所述报告肽在裂解时产生可检测的信号。

3.权利要求1或2的方法，其中OmpT蛋白是来自大肠杆菌的纯化的OmpT。

4.权利要求1或2的方法，其中OmpT蛋白是重组产生或体外合成的。

5.权利要求1-4的任一方法，其中样本选自：患者样本、药用组合物、医用器械、水、空气、土壤和尘土。

6.用于检测败血症发作的方法，其中来自患者的血液、血浆或血清样本经过权利要求1-4的任一方法处理。

7.用于进行权利要求1-6的任一方法的试剂盒，其包含：OmpT蛋白、报告肽和任选的合适缓冲液、小瓶和/或取样装置。