JPH11166931A - 生体成分の量的あるいは質的異常を検出する方法 - Google Patents
生体成分の量的あるいは質的異常を検出する方法Info
- Publication number
- JPH11166931A JPH11166931A JP33523997A JP33523997A JPH11166931A JP H11166931 A JPH11166931 A JP H11166931A JP 33523997 A JP33523997 A JP 33523997A JP 33523997 A JP33523997 A JP 33523997A JP H11166931 A JPH11166931 A JP H11166931A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substance
- antibody
- measured
- solid phase
- amount
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】生体中の微量物質の生理活性を特異的に捕らえ
る方法を提供する。 【解決手段】検体中の測定対象とする生理活性物質を、
その物質と特異的に結合する抗体を用いて固相上に捕捉
し、捕捉された物質に対して、（１）生理活性の測定、
及び、（２）免疫学的手段による物質量の測定を行な
い、得られた測定値を関連づけることにより生体成分の
量的あるいは質的異常を検出する方法。
る方法を提供する。 【解決手段】検体中の測定対象とする生理活性物質を、
その物質と特異的に結合する抗体を用いて固相上に捕捉
し、捕捉された物質に対して、（１）生理活性の測定、
及び、（２）免疫学的手段による物質量の測定を行な
い、得られた測定値を関連づけることにより生体成分の
量的あるいは質的異常を検出する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は生体成分の測定法に
関するものであり、医学、生化学、分子生物学などの様
々な分野における微量の生理活性成分の検出に利用可能
な方法である。
関するものであり、医学、生化学、分子生物学などの様
々な分野における微量の生理活性成分の検出に利用可能
な方法である。
【０００２】
【従来の技術】生体成分を検出する方法には様々なもの
がある。例えば抗原性を有する物質であれば、この物質
中の特定の成分に対して親和性を有する抗体を作成する
ことが可能であり、そのような抗体を使用して特定の生
体成分を高感度で測定することが可能である。このよう
な方法はイムノアッセイと呼ばれ、生体成分の検出に広
く用いられている。
がある。例えば抗原性を有する物質であれば、この物質
中の特定の成分に対して親和性を有する抗体を作成する
ことが可能であり、そのような抗体を使用して特定の生
体成分を高感度で測定することが可能である。このよう
な方法はイムノアッセイと呼ばれ、生体成分の検出に広
く用いられている。
【０００３】イムノアッセイでは抗原抗体反応でとらえ
た成分を様々な方法で検出することによって、その成分
の存在を明らかにすることができる。そのような検出の
ための標識物質としてはラジオアイソトープや酵素、蛍
光色素や発光試薬などが使用されている。
た成分を様々な方法で検出することによって、その成分
の存在を明らかにすることができる。そのような検出の
ための標識物質としてはラジオアイソトープや酵素、蛍
光色素や発光試薬などが使用されている。
【０００４】試料中の抗原濃度を測定するイムノアッセ
イ法として最も一般的な方法はサンドイッチ法と呼ばれ
ている。これは２種類の抗体を使用し、片方を何らかの
固相に結合し、もう片方に何らかの標識を行ったものを
用意する。固相の抗体と標識物を結合した抗体は試料中
の抗原と反応して抗原を挟み込んだサンドイッチのよう
な形で固相に結合することになる。固相に結合できなか
った標識抗体を除去した後、固相に残存した標識体の量
を測定することによって試料中の抗原濃度を知ることが
できる。
イ法として最も一般的な方法はサンドイッチ法と呼ばれ
ている。これは２種類の抗体を使用し、片方を何らかの
固相に結合し、もう片方に何らかの標識を行ったものを
用意する。固相の抗体と標識物を結合した抗体は試料中
の抗原と反応して抗原を挟み込んだサンドイッチのよう
な形で固相に結合することになる。固相に結合できなか
った標識抗体を除去した後、固相に残存した標識体の量
を測定することによって試料中の抗原濃度を知ることが
できる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】この原理を利用した測
定キットは現在数多く販売されており、臨床検査の分野
ではなくてはならない方法となっている。しかしながら
試料中の抗原が何らかの生理活性を有する場合、このサ
ンドイッチイムノアッセイでその抗原を測定することに
は問題が生じてくる。
定キットは現在数多く販売されており、臨床検査の分野
ではなくてはならない方法となっている。しかしながら
試料中の抗原が何らかの生理活性を有する場合、このサ
ンドイッチイムノアッセイでその抗原を測定することに
は問題が生じてくる。
【０００６】ヒトの血中蛋白のあるものは特定の生理活
性を有しており、その活性の低下が疾病を招くことが良
くあることは広く知られている。また先天的にある生理
活性成分を持っていないヒトが存在する。そのようなヒ
トでは生まれながらにして何らかの障害を持っており、
このような病気を遺伝病と呼んでいる。しかしながらこ
のような遺伝病の患者であっても、その活性を欠損して
いる生理活性成分がイムノアッセイでは正常のヒトと同
程度存在していると測定されることが良くある。これは
正常人の生理活性成分とほとんど同じ構造をとっている
が、ごく１部の構造が遺伝的に変化したためにその成分
が生理活性を全くかあるいはほとんど持たなくなったと
いう可能性を示している。このような場合、患者血清の
中には正常人とほぼ同じ構造を持っていて、抗体では正
常人と区別できないが、生理活性としては正常と著しく
異なる物質が存在しており、このような患者は従来のイ
ムノアッセイでは見つけることができない。このような
例の典型としてATIII（抗トロンビンIII）異常症があげ
られる。この病気は血液凝固の阻止因子の１つであるAT
IIIの遺伝子が１塩基変化したために、ATIIIを構成する
アミノ酸が１つだけ変異したために起きる疾患である。
この患者血清中のATIIIは正常人と構造的にはほとんど
同じであるにも関わらず、わずかな変異によって生理活
性がほとんどないために病気になってしまうというもの
である。このようなATIII患者は従来の免疫学的手段に
よる測定では検出することができない。
性を有しており、その活性の低下が疾病を招くことが良
くあることは広く知られている。また先天的にある生理
活性成分を持っていないヒトが存在する。そのようなヒ
トでは生まれながらにして何らかの障害を持っており、
このような病気を遺伝病と呼んでいる。しかしながらこ
のような遺伝病の患者であっても、その活性を欠損して
いる生理活性成分がイムノアッセイでは正常のヒトと同
程度存在していると測定されることが良くある。これは
正常人の生理活性成分とほとんど同じ構造をとっている
が、ごく１部の構造が遺伝的に変化したためにその成分
が生理活性を全くかあるいはほとんど持たなくなったと
いう可能性を示している。このような場合、患者血清の
中には正常人とほぼ同じ構造を持っていて、抗体では正
常人と区別できないが、生理活性としては正常と著しく
異なる物質が存在しており、このような患者は従来のイ
ムノアッセイでは見つけることができない。このような
例の典型としてATIII（抗トロンビンIII）異常症があげ
られる。この病気は血液凝固の阻止因子の１つであるAT
IIIの遺伝子が１塩基変化したために、ATIIIを構成する
アミノ酸が１つだけ変異したために起きる疾患である。
この患者血清中のATIIIは正常人と構造的にはほとんど
同じであるにも関わらず、わずかな変異によって生理活
性がほとんどないために病気になってしまうというもの
である。このようなATIII患者は従来の免疫学的手段に
よる測定では検出することができない。
【０００７】ATIII異常症以外にもこのような病気は数
多く知られており、イムノアッセイが捕らえにくいもの
としてあげられている。このような物質の生理活性が特
殊なものであれば、その生理活性のみを測定することに
よってその異常を検出することができるが、特有の生理
活性のみを測定できるような物質は少ない。前述のATII
Iもプロテアーゼ・インヒビターとしての生理活性を有
しているが、血中のATIII活性のみを特異的に捕らえる
ことは困難である。このようなことから、生体中の微量
物質の生理活性を特異的に捕らえる方法が望まれてい
る。
多く知られており、イムノアッセイが捕らえにくいもの
としてあげられている。このような物質の生理活性が特
殊なものであれば、その生理活性のみを測定することに
よってその異常を検出することができるが、特有の生理
活性のみを測定できるような物質は少ない。前述のATII
Iもプロテアーゼ・インヒビターとしての生理活性を有
しているが、血中のATIII活性のみを特異的に捕らえる
ことは困難である。このようなことから、生体中の微量
物質の生理活性を特異的に捕らえる方法が望まれてい
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】生体中の生理活性を有す
る成分が何らかの理由で、抗原性を維持しながらその生
理活性に変化が生じている場合、従来のイムノアッセイ
あるいは単純な生理活性測定法ではその異常を検出でき
なかった。そこで我々は鋭意研究した結果、同じ固相を
使用して検体中の生理活性物質を固相に捕捉した後、捕
捉された物質に対して、その物質の生理活性の測定と、
その物質量の測定を組み合わせて行ない、その両方の結
果を比較することによって、ある異常な検体が生理活性
物質の量的な異常であるのか、あるいは生理活性物質の
質的な異常であるのかを容易に知ることのできるアッセ
イシステムを見いだし、本発明を完成した。
る成分が何らかの理由で、抗原性を維持しながらその生
理活性に変化が生じている場合、従来のイムノアッセイ
あるいは単純な生理活性測定法ではその異常を検出でき
なかった。そこで我々は鋭意研究した結果、同じ固相を
使用して検体中の生理活性物質を固相に捕捉した後、捕
捉された物質に対して、その物質の生理活性の測定と、
その物質量の測定を組み合わせて行ない、その両方の結
果を比較することによって、ある異常な検体が生理活性
物質の量的な異常であるのか、あるいは生理活性物質の
質的な異常であるのかを容易に知ることのできるアッセ
イシステムを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、検体中の測定対象と
する生理活性物質を、その物質と特異的に結合する抗体
を用いて固相上に捕捉し、捕捉された物質に対して、
（１）生理活性の測定、及び、（２）免疫学的手段によ
る物質量の測定を行ない、得られた測定値を関連づける
ことにより生体成分の量的あるいは質的異常を検出する
ことを特徴とする。
する生理活性物質を、その物質と特異的に結合する抗体
を用いて固相上に捕捉し、捕捉された物質に対して、
（１）生理活性の測定、及び、（２）免疫学的手段によ
る物質量の測定を行ない、得られた測定値を関連づける
ことにより生体成分の量的あるいは質的異常を検出する
ことを特徴とする。
【００１０】またこの生理活性の測定と、免疫学的な抗
原量としての検出を、１つの固相に結合した生理活性物
質について、連続してあるいは同時に行うこともでき
る。
原量としての検出を、１つの固相に結合した生理活性物
質について、連続してあるいは同時に行うこともでき
る。
【００１１】さらに、生理活性の測定と、免疫学的な抗
原量の測定とを、予めその生理活性物質を均一に結合し
ておいた別々の固相、例えばマイクロタイタープレート
の複数のウエル上で別々に、連続してあるいは同時に行
うことも可能である。
原量の測定とを、予めその生理活性物質を均一に結合し
ておいた別々の固相、例えばマイクロタイタープレート
の複数のウエル上で別々に、連続してあるいは同時に行
うことも可能である。
【００１２】本発明の方法を実施するには、まず検体中
の測定対象とする生理活性物質を、その物質と特異的に
結合する抗体を用いて固相上に捕捉する。たとえば、固
相に固定化した抗体に検体中の生理活性物質を反応させ
ることによって目的物質を固相に結合することができ
る。固相に使用する抗体を選択することによって、この
ように固相に結合した後も生理活性をそのまま、あるい
はある程度維持させておくことは可能である。まず初め
に、固相に結合した目的物質の生理活性を測定してお
き、その後この物質の抗原量を標識した２次抗体を使用
することによって免疫学的に検出することができる。
の測定対象とする生理活性物質を、その物質と特異的に
結合する抗体を用いて固相上に捕捉する。たとえば、固
相に固定化した抗体に検体中の生理活性物質を反応させ
ることによって目的物質を固相に結合することができ
る。固相に使用する抗体を選択することによって、この
ように固相に結合した後も生理活性をそのまま、あるい
はある程度維持させておくことは可能である。まず初め
に、固相に結合した目的物質の生理活性を測定してお
き、その後この物質の抗原量を標識した２次抗体を使用
することによって免疫学的に検出することができる。
【００１３】標準物質として正常の生理活性を有する物
質を利用して、あらかじめその生理活性量と抗原量の関
係を調べておき、この標準物質の生理活性量と抗原量と
の関係と比較することにより、検体中の生理活性物質が
正常の物質と同じ活性を有しているのか、あるいは何ら
かの異常が生じてその活性が変化しているかを知ること
ができる。例えば、検体中の測定対象とする物質が、免
疫学的手段で測定した物質量に比較して生理活性をもっ
ていないならば、これは上述したような物質中に変異が
存在すること、すなわち生体成分の質的異常を示唆す
る。また、検体中の測定対象とする物質を免疫学的手段
で測定した物質量が正常検体と比べて極めて少ないか、
多い場合には生体成分の量的異常を示唆する。
質を利用して、あらかじめその生理活性量と抗原量の関
係を調べておき、この標準物質の生理活性量と抗原量と
の関係と比較することにより、検体中の生理活性物質が
正常の物質と同じ活性を有しているのか、あるいは何ら
かの異常が生じてその活性が変化しているかを知ること
ができる。例えば、検体中の測定対象とする物質が、免
疫学的手段で測定した物質量に比較して生理活性をもっ
ていないならば、これは上述したような物質中に変異が
存在すること、すなわち生体成分の質的異常を示唆す
る。また、検体中の測定対象とする物質を免疫学的手段
で測定した物質量が正常検体と比べて極めて少ないか、
多い場合には生体成分の量的異常を示唆する。
【００１４】もし、目的物質が標識された２次抗体を反
応させた後までその生理活性を維持しているのであれ
ば、生理活性の測定と抗原量測定を同時におこなうこと
ができる。
応させた後までその生理活性を維持しているのであれ
ば、生理活性の測定と抗原量測定を同時におこなうこと
ができる。
【００１５】その時は、たとえば生理活性の測定で用い
られる吸収波長と標識物質の測定で用いられる吸収波長
が異なるように標識物質を選択するとか、片方を比色
で、もう片方については蛍光量を測定するといったよう
に、互いの測定に悪影響を及ぼさないように適当な標識
物質を選択することによって２種類の測定を同時におこ
なうことができる。
られる吸収波長と標識物質の測定で用いられる吸収波長
が異なるように標識物質を選択するとか、片方を比色
で、もう片方については蛍光量を測定するといったよう
に、互いの測定に悪影響を及ぼさないように適当な標識
物質を選択することによって２種類の測定を同時におこ
なうことができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明で用いられる固相は、当分
野で公知のもの、たとえば試験管やマイクロプレート等
が使用できる。
野で公知のもの、たとえば試験管やマイクロプレート等
が使用できる。
【００１７】固相に結合させる抗体は、測定対象とする
生理活性物質と特異的に反応するものであれば、ポリク
ローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であって
も良く、あるいはこれらの抗体を酵素処理して得られる
抗体断片であってもよい。このような抗体の作製にあた
っては、常法（例えば、新生化学実験講座、タンパク質
Ｉ)に従い、測定対象とする生理活性物質を動物に免疫
し、生体内に産生される抗体を採取することにより得る
ことができる。また、特定疾患の検出、測定のために市
販されている抗体を入手することもできる。
生理活性物質と特異的に反応するものであれば、ポリク
ローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であって
も良く、あるいはこれらの抗体を酵素処理して得られる
抗体断片であってもよい。このような抗体の作製にあた
っては、常法（例えば、新生化学実験講座、タンパク質
Ｉ)に従い、測定対象とする生理活性物質を動物に免疫
し、生体内に産生される抗体を採取することにより得る
ことができる。また、特定疾患の検出、測定のために市
販されている抗体を入手することもできる。
【００１８】また、サンドイッチ法で用いる固相に結合
する抗体と、標識抗体に使用する抗体とは同じものであ
っても、異なっているものであってもよいが、モノクロ
ーナル抗体を使用する場合には異なっている方が好まし
い。。
する抗体と、標識抗体に使用する抗体とは同じものであ
っても、異なっているものであってもよいが、モノクロ
ーナル抗体を使用する場合には異なっている方が好まし
い。。
【００１９】固相への抗体の結合法は、従来用いられて
いる方法がそのまま使用できる。例えば、物理吸着法、
化学結合法等により結合させることができる。また、ビ
オチン−アビジンのような特異結合を利用して結合させ
ることもできる。
いる方法がそのまま使用できる。例えば、物理吸着法、
化学結合法等により結合させることができる。また、ビ
オチン−アビジンのような特異結合を利用して結合させ
ることもできる。
【００２０】サンドイッチ法で用いる標識抗体として
は、当業界で公知の方法により標識した抗体を用いるこ
とができ、標識としては、ＨＲＰ（ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ）などのペルオキシダーゼの他に、ア
ルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵
素が好ましい。
は、当業界で公知の方法により標識した抗体を用いるこ
とができ、標識としては、ＨＲＰ（ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ）などのペルオキシダーゼの他に、ア
ルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵
素が好ましい。
【００２１】前述したATIII異常症においては、固相に
抗ATIII抗体を結合し、そこに検体を加え、検体中のATI
IIを結合させる。このような固相に対して、片や標識抗
体を反応させて固相に結合したATIIIを抗原として捕ら
えるとともに、もう片方の固相でATIIIの生理活性を測
定することによって、検体中のATIII分子が正常な活性
を有しているのかいないのかを調べることができる。正
常な検体では抗原として捕らえたATIII分子とその生理
活性量には相関があるが、異常なATIII分子を有してい
る検体では、抗原としてのATIII分子は検出できてもATI
IIの生理活性は検出できないことになる。この方法を使
用することによって、従来イムノアッセイでは検出でき
なかった突然変異による機能を失った蛋白を産生してい
る患者を的確かつ迅速に診断できるようになる。
抗ATIII抗体を結合し、そこに検体を加え、検体中のATI
IIを結合させる。このような固相に対して、片や標識抗
体を反応させて固相に結合したATIIIを抗原として捕ら
えるとともに、もう片方の固相でATIIIの生理活性を測
定することによって、検体中のATIII分子が正常な活性
を有しているのかいないのかを調べることができる。正
常な検体では抗原として捕らえたATIII分子とその生理
活性量には相関があるが、異常なATIII分子を有してい
る検体では、抗原としてのATIII分子は検出できてもATI
IIの生理活性は検出できないことになる。この方法を使
用することによって、従来イムノアッセイでは検出でき
なかった突然変異による機能を失った蛋白を産生してい
る患者を的確かつ迅速に診断できるようになる。
【００２２】またこの方法はサンドイッチ法だけではな
く競合法にも利用可能である。目的とする生理活性物質
の分子量が小さく、サンドイッチを形成できないような
場合は、目的物質に対する抗体を固定化した固相を用
い、試料中の目的物質と反応させてそれを固定化する。
洗浄後まず固定化されたハプテンの生理活性を測定して
から、洗浄して、標識ハプテンを添加して抗体と結合し
たハプテンと競合反応を行うことができる。
く競合法にも利用可能である。目的とする生理活性物質
の分子量が小さく、サンドイッチを形成できないような
場合は、目的物質に対する抗体を固定化した固相を用
い、試料中の目的物質と反応させてそれを固定化する。
洗浄後まず固定化されたハプテンの生理活性を測定して
から、洗浄して、標識ハプテンを添加して抗体と結合し
たハプテンと競合反応を行うことができる。
【００２３】生理活性の測定にあたっては、測定対象と
する生理活性物質の種類に応じた種々の測定方法を用い
ることができる。例えば、測定対象物が酵素である場
合、その酵素によって何らかのシグナルが発生するよう
な酵素基質を用いることによりその酵素の量を測定する
ことができる。
する生理活性物質の種類に応じた種々の測定方法を用い
ることができる。例えば、測定対象物が酵素である場
合、その酵素によって何らかのシグナルが発生するよう
な酵素基質を用いることによりその酵素の量を測定する
ことができる。
【００２４】例えば、アルカリフォスファターゼという
酵素はモノリン酸エステルを加水分解するという酵素活
性を有しているため、その酵素活性の測定には、例え
ば、ｐ−ニトロフェノールフォスフェイトを基質として
用いると酵素によってリン酸が加水分解されてできるｐ
−ニトロフェノールの黄色い色を吸光度計で測定するこ
とによってその酵素活性を知ることができる。また２−
メチルウンベリフェロンリン酸という基質を使用すると
酵素によってリン酸が切断されて生じる２−メチルウン
ベリフェロンが蛍光を発するのでその蛍光を測定するこ
とによって酵素の活性を知ることができる。
酵素はモノリン酸エステルを加水分解するという酵素活
性を有しているため、その酵素活性の測定には、例え
ば、ｐ−ニトロフェノールフォスフェイトを基質として
用いると酵素によってリン酸が加水分解されてできるｐ
−ニトロフェノールの黄色い色を吸光度計で測定するこ
とによってその酵素活性を知ることができる。また２−
メチルウンベリフェロンリン酸という基質を使用すると
酵素によってリン酸が切断されて生じる２−メチルウン
ベリフェロンが蛍光を発するのでその蛍光を測定するこ
とによって酵素の活性を知ることができる。
【００２５】またＡＭＰＰＤという基質を使用してアル
カリフォスファターゼの活性を測定する場合、この基質
は酵素によって分解されることにより化学発光を起こす
ので、その発光量を測定することで酵素の活性をとらえ
ることができる。このようにある特定酵素の活性を測定
しようとする場合、その酵素の反応が加水分解反応であ
れば、その酵素によって加水分解されることにより何ら
かのシグナル、吸収や蛍光や発光が生じるような物質を
用いることによってその酵素の活性を測定することがで
きる。加水分解活性ではない酵素においてもその酵素が
働くことにより何らかの変化が生じるような基質を用い
ることによってその酵素の活性をとらえることができ
る。
カリフォスファターゼの活性を測定する場合、この基質
は酵素によって分解されることにより化学発光を起こす
ので、その発光量を測定することで酵素の活性をとらえ
ることができる。このようにある特定酵素の活性を測定
しようとする場合、その酵素の反応が加水分解反応であ
れば、その酵素によって加水分解されることにより何ら
かのシグナル、吸収や蛍光や発光が生じるような物質を
用いることによってその酵素の活性を測定することがで
きる。加水分解活性ではない酵素においてもその酵素が
働くことにより何らかの変化が生じるような基質を用い
ることによってその酵素の活性をとらえることができ
る。
【００２６】また測定対象物が酵素阻害物質である場合
も同様な方法で測定が可能である。酵素阻害物質という
のはある酵素の活性を低下させるものであるから、その
阻害物質が阻害を示す酵素の活性を測定することによっ
て阻害物質の量を測定することができる。酵素活性の測
定は前述の通りである。
も同様な方法で測定が可能である。酵素阻害物質という
のはある酵素の活性を低下させるものであるから、その
阻害物質が阻害を示す酵素の活性を測定することによっ
て阻害物質の量を測定することができる。酵素活性の測
定は前述の通りである。
【００２７】この原理を用いることによって生理活性を
有する蛋白の生理活性と抗原性の両方を同時に調べるこ
とができるとともに、同じ生理活性を有する異なる蛋白
を弁別して測定することもできる。前者の例としては前
述のATIII以外にも、トロンビンやプラスミン、プラス
ミンインヒビターなどへの応用が考えられる。後者の例
としては組織特異的なアイソザイムの弁別測定が挙げら
れる。例えばALP（アルカリフォスファターゼ）におい
ては各組織で異なるALPが発現しており、それぞれは蛋
白としては異なるが同じ酵素反応を示している。あるア
イソザイムに遺伝的な異常が生じたとき、従来ではその
特定は困難であったが、この方法を用いることにより、
組織特異的抗体を固相に用いることにより、どの組織由
来の酵素に異常が生じているかを簡単に判定することが
できる。この方法を用いることにより従来では判定が困
難であったアイソザイム異常の検査が手軽にできるよう
になった。
有する蛋白の生理活性と抗原性の両方を同時に調べるこ
とができるとともに、同じ生理活性を有する異なる蛋白
を弁別して測定することもできる。前者の例としては前
述のATIII以外にも、トロンビンやプラスミン、プラス
ミンインヒビターなどへの応用が考えられる。後者の例
としては組織特異的なアイソザイムの弁別測定が挙げら
れる。例えばALP（アルカリフォスファターゼ）におい
ては各組織で異なるALPが発現しており、それぞれは蛋
白としては異なるが同じ酵素反応を示している。あるア
イソザイムに遺伝的な異常が生じたとき、従来ではその
特定は困難であったが、この方法を用いることにより、
組織特異的抗体を固相に用いることにより、どの組織由
来の酵素に異常が生じているかを簡単に判定することが
できる。この方法を用いることにより従来では判定が困
難であったアイソザイム異常の検査が手軽にできるよう
になった。
【００２８】以下の実施例においては、ATIII異常症の
検出について本発明をさらに詳しく説明するが、本発明
の範囲はこれに限定されない。当業者であれば、本明細
書の記載に基づき種々の変更や修飾をなしうることが理
解できるであろう。
検出について本発明をさらに詳しく説明するが、本発明
の範囲はこれに限定されない。当業者であれば、本明細
書の記載に基づき種々の変更や修飾をなしうることが理
解できるであろう。
【００２９】ATIII分子の異常症は何例かが知られてお
り、その多くは点突然変異が生じた結果、ATIII分子の
アミノ酸が１残基置換したことによってその生理活性が
消失したり、著しく低下したりすることによって生じる
疾患である。
り、その多くは点突然変異が生じた結果、ATIII分子の
アミノ酸が１残基置換したことによってその生理活性が
消失したり、著しく低下したりすることによって生じる
疾患である。
【００３０】
【実施例】実施例１：抗ATIII抗体結合プレートの調製 マイクロプレート（ヌンク社マキシソープTM）にバイオ
デザイン社の抗ATIII抗体AT3-15を10μg/mlにpH 7.0, 5
0mM PBSで調製し、それを100μl／ウエルで分注し、4℃
で一晩置き抗体を固相化した。その後1%のBSA溶液(PBS)
を各ウェルに300μlずつ分注し、ウェル内をブロッキン
グした。
デザイン社の抗ATIII抗体AT3-15を10μg/mlにpH 7.0, 5
0mM PBSで調製し、それを100μl／ウエルで分注し、4℃
で一晩置き抗体を固相化した。その後1%のBSA溶液(PBS)
を各ウェルに300μlずつ分注し、ウェル内をブロッキン
グした。
【００３１】実施例２：HRP標識抗ATIII抗体の調製 IIC社の抗ATIIIヤギ抗体をアフニティークロマトグラフ
ィーを用いて精製した。
ィーを用いて精製した。
【００３２】SIGMA社のHRP10mgを0.3M炭酸ナトリウム0.
5mlに溶解し、0.2mlのジニトロベンゼンを加える。次に
0.06Mメタヨウ素酸ナトリウム液0.5mlを加え、最後に0.
16Mエチレングリコールを0.5ml加えた。
5mlに溶解し、0.2mlのジニトロベンゼンを加える。次に
0.06Mメタヨウ素酸ナトリウム液0.5mlを加え、最後に0.
16Mエチレングリコールを0.5ml加えた。
【００３３】この液を透析膜(スペクトロポアTM)に入
れ、0.05M炭酸緩衝液（pH9.5）に対して透析をおこなっ
てアルデヒド化HRPを得た。
れ、0.05M炭酸緩衝液（pH9.5）に対して透析をおこなっ
てアルデヒド化HRPを得た。
【００３４】このようにして得られた精製抗体10mgとア
ルデヒド化HRP10mgとを混合して４℃で一晩静置後、フ
ァルマシア社製のセファクリルTMS-200カラムを用いて
分離し、酵素標識抗体を得た。
ルデヒド化HRP10mgとを混合して４℃で一晩静置後、フ
ァルマシア社製のセファクリルTMS-200カラムを用いて
分離し、酵素標識抗体を得た。
【００３５】実施例３：ATIIIの生理活性と抗原活性の
連続測定 実施例１で調製したマイクロプレートに種々の濃度でAT
IIIを含む試料100μlを分注し37℃で１時間反応させ
る。
連続測定 実施例１で調製したマイクロプレートに種々の濃度でAT
IIIを含む試料100μlを分注し37℃で１時間反応させ
る。
【００３６】プレートを0.05% TweenTM20を含む50mM PB
S（pH7.0）で洗浄後、第一化学薬品工業（株）製のテス
トチームATIIIオートTM試薬を使用し、トロンビン試薬7
0μlを分注し、37℃で５分間反応した後基質液20μlを
分注し37℃での415nmの吸光度の変化を10分間測定し
た。
S（pH7.0）で洗浄後、第一化学薬品工業（株）製のテス
トチームATIIIオートTM試薬を使用し、トロンビン試薬7
0μlを分注し、37℃で５分間反応した後基質液20μlを
分注し37℃での415nmの吸光度の変化を10分間測定し
た。
【００３７】その後同様に0.05% TweenTM20 50mM PBS(p
H7.0)でウェルを洗浄後、適当に0.1%BSA-50mM PBS(pH7.
0)で希釈したHRP標識抗ATIII抗体を100μl分注し37℃で
１時間反応後、ウェルを洗浄後10mMオルトフェニレンジ
アミン（OPD）を含む基質液（40mM pH7.0リン酸緩衝
液、10mM OPD、0.02%過酸化水素水）100μlを分注して3
7℃で30分間酵素活性を測定した。吸光度の測定は405nm
で行った。
H7.0)でウェルを洗浄後、適当に0.1%BSA-50mM PBS(pH7.
0)で希釈したHRP標識抗ATIII抗体を100μl分注し37℃で
１時間反応後、ウェルを洗浄後10mMオルトフェニレンジ
アミン（OPD）を含む基質液（40mM pH7.0リン酸緩衝
液、10mM OPD、0.02%過酸化水素水）100μlを分注して3
7℃で30分間酵素活性を測定した。吸光度の測定は405nm
で行った。
【００３８】酵素活性と抗原量の測定値をプロットした
グラフを作成した。横軸にテストチームATIIIオートTM
を用いて測定した415nmの吸光度をとり、縦軸にOPDの発
色である405nmの吸光度値をとったグラフを作成した
（図1）。図に示すように、酵素活性と抗原量との間に
良好な相関関係が得られた。
グラフを作成した。横軸にテストチームATIIIオートTM
を用いて測定した415nmの吸光度をとり、縦軸にOPDの発
色である405nmの吸光度値をとったグラフを作成した
（図1）。図に示すように、酵素活性と抗原量との間に
良好な相関関係が得られた。
【００３９】実施例４：各種検体の測定値 正常なATIII分子を有するヒト血清30検体と、異常なATI
II分子を有するヒト血清２検体を上記と同様の方法で測
定し、その結果を標準物質のグラフ（図１）にプロット
した（図2）。
II分子を有するヒト血清２検体を上記と同様の方法で測
定し、その結果を標準物質のグラフ（図１）にプロット
した（図2）。
【００４０】正常な検体では全てが標準物質の検量線付
近にその値がプロットされたが、異常な検体では、抗原
量としては十分検出されているにも関わらず、ATIIIの
生理活性がほとんどないことから、標準曲線から大きく
はずれたところにプロットされる結果となった。
近にその値がプロットされたが、異常な検体では、抗原
量としては十分検出されているにも関わらず、ATIIIの
生理活性がほとんどないことから、標準曲線から大きく
はずれたところにプロットされる結果となった。
【００４１】このことにより、突然変異によって生理活
性を失ったような異常な蛋白を含む検体を確実に捕ら
え、その原因を明らかにするうえで本法は非常に有用な
方法であることが示された。
性を失ったような異常な蛋白を含む検体を確実に捕ら
え、その原因を明らかにするうえで本法は非常に有用な
方法であることが示された。
【００４２】
【発明の効果】本発明によると、従来は判別困難であっ
た生体中の微量な生理活性物質の質的異常又は量的異常
を容易に、かつ確実に知ることができる。特に、本発明
の方法を用いると、遺伝子の突然変異によって生理活性
を失ったタンパクを産生する患者を的確に診断すること
ができる。従って、本発明の方法は種々の遺伝病の診断
に極めて有用である。本発明の方法はまた、タンパク物
質としては異なるが、同じ酵素反応を触媒する組織特異
的なアイソザイムの弁別にも利用することができる。
た生体中の微量な生理活性物質の質的異常又は量的異常
を容易に、かつ確実に知ることができる。特に、本発明
の方法を用いると、遺伝子の突然変異によって生理活性
を失ったタンパクを産生する患者を的確に診断すること
ができる。従って、本発明の方法は種々の遺伝病の診断
に極めて有用である。本発明の方法はまた、タンパク物
質としては異なるが、同じ酵素反応を触媒する組織特異
的なアイソザイムの弁別にも利用することができる。
【図１】テストチームAT IIIオートTMを用いて415nmの
吸光度で測定したAT IIIの生理活性と、405nmの吸光度
で測定したAT IIIの抗原量との関係を示すグラフであ
る。
吸光度で測定したAT IIIの生理活性と、405nmの吸光度
で測定したAT IIIの抗原量との関係を示すグラフであ
る。
【図２】正常検体（○）及び異常検体（▲）の生理活性
と抗原量を測定し、図１にプロットしたグラフである。
と抗原量を測定し、図１にプロットしたグラフである。
Claims (3)
- 【請求項１】検体中の測定対象とする生理活性物質を、
その物質と特異的に結合する抗体を用いて固相上に捕捉
し、捕捉された物質に対して、（１）生理活性の測定、
及び、（２）免疫学的手段による物質量の測定を行な
い、得られた測定値を関連づけることにより生体成分の
量的あるいは質的異常を検出する方法。 - 【請求項２】前記（１）の測定を行なった後の試料に対
して、前記（２）の測定を行う請求項１記載の生体成分
の量的あるいは質的異常を検出する方法。 - 【請求項３】前記生理活性物質が酵素またはその阻害剤
である請求項１あるいは２記載の生体成分の量的あるい
は質的異常を検出する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33523997A JPH11166931A (ja) | 1997-12-05 | 1997-12-05 | 生体成分の量的あるいは質的異常を検出する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33523997A JPH11166931A (ja) | 1997-12-05 | 1997-12-05 | 生体成分の量的あるいは質的異常を検出する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11166931A true JPH11166931A (ja) | 1999-06-22 |
Family
ID=18286311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33523997A Pending JPH11166931A (ja) | 1997-12-05 | 1997-12-05 | 生体成分の量的あるいは質的異常を検出する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11166931A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005118842A1 (ja) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Sysmex Corporation | 酵素活性測定方法および酵素活性測定用カラム |
| JP2007074975A (ja) * | 2005-09-14 | 2007-03-29 | Sysmex Corp | 組織性質判定装置 |
| JPWO2005116241A1 (ja) * | 2004-05-31 | 2008-04-03 | シスメックス株式会社 | 哺乳動物細胞の性質判定方法及びこれを用いた癌の診断方法 |
-
1997
- 1997-12-05 JP JP33523997A patent/JPH11166931A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005116241A1 (ja) * | 2004-05-31 | 2008-04-03 | シスメックス株式会社 | 哺乳動物細胞の性質判定方法及びこれを用いた癌の診断方法 |
| JP4787153B2 (ja) * | 2004-05-31 | 2011-10-05 | シスメックス株式会社 | 癌の再発のしやすさの試験方法及び抗癌剤に対する感受性の試験方法 |
| US8921057B2 (en) | 2004-05-31 | 2014-12-30 | Sysmex Corporation | Method of assessing properties of mammalian cells, and method of diagnosing cancer using the same |
| WO2005118842A1 (ja) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Sysmex Corporation | 酵素活性測定方法および酵素活性測定用カラム |
| JPWO2005118842A1 (ja) * | 2004-06-01 | 2008-04-03 | シスメックス株式会社 | 酵素活性測定方法および酵素活性測定用カラム |
| JP2007074975A (ja) * | 2005-09-14 | 2007-03-29 | Sysmex Corp | 組織性質判定装置 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3517652B2 (ja) | 中枢神経系の損傷を検出するためのアッセイ | |
| US11255855B1 (en) | COVID-19 spike-ACE2 binding assay for drug and antibody screening | |
| EP1238284B1 (en) | Diagnostic assay for stroke | |
| WO2006123789A1 (ja) | 酵素分析方法 | |
| EP1295127B1 (en) | Inter-alpha-trypsin as a marker for sepsis | |
| JP4197393B2 (ja) | ＩｇＡ腎症の検査法 | |
| EP1418432A1 (en) | Method, assay, and kit for quantifying hiv protease inhibitors | |
| US6242197B1 (en) | Use of urinary trypsin inhibitor for the diagnosis of the onset of AIDS | |
| EP2579040A2 (en) | Qualitative and quantitative analytical method for analyzing the activity type of an enzyme that is activated by proteolysis | |
| JPWO1999050663A6 (ja) | ＩｇＡ腎症の検査法 | |
| JP2020503279A (ja) | ジカウイルス感染用の血清学的アッセイ | |
| CN106366199A (zh) | 一种肌钙蛋白i单克隆抗体磁微粒及其制备方法和检测试剂盒 | |
| JPH11166931A (ja) | 生体成分の量的あるいは質的異常を検出する方法 | |
| US9921225B2 (en) | Phenyl glyoxal probes | |
| JPH07140144A (ja) | アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の測定方法および抗原抗体複合体の測定方法 | |
| JPH0580053A (ja) | ヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法 | |
| EP0398292B1 (en) | Diagnostic composition for rheumatoid arthritis | |
| AU667370B2 (en) | Process for the detection of complexed cathepsin G and alpha-1-antichymotrypsin | |
| AU4855793A (en) | Methods and kits for evaluating risk of developing periodontitis | |
| WO2023068249A1 (ja) | Ｉ型コラーゲン架橋ｎ－テロペプチドの測定試薬、その調製方法、及びそれを用いた免疫測定方法 | |
| US4778755A (en) | Immunoassay method | |
| JP3768165B2 (ja) | 抗カルパスタチン抗体の測定法及び測定キット | |
| JP2006250862A (ja) | 妊娠中毒症の検知方法及び検知キット | |
| WO2011143412A1 (en) | Methods for the detection and monitoring of acute myocardial infarction | |
| EP1382692A2 (en) | Enzymatic assay of HIV protease inhibitors |