JPWO2005118842A1

JPWO2005118842A1 - 酵素活性測定方法および酵素活性測定用カラム

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Publication number: JPWO2005118842A1
Application number: JP2006514084A
Authority: JP
Inventors: 中山　智; 智中山; 加奈子長岡; 小林　弘典; 弘典小林; 英幹石原
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2004-06-01
Filing date: 2005-05-27
Publication date: 2008-04-03
Also published as: WO2005118842A1; CN1961077A; EP1767648A1; US20110136131A1; EP1767648A4

Abstract

迅速に、良好な反応効率で酵素活性測定を行うことができる方法を提供する。本発明は、(1) 水に不溶性の支持体と、前記支持体に固定化され、測定対象となる酵素を認識する抗体とからなる充填剤を充填したカラムに、測定対象となる酵素を含む試料を導入して前記抗体によって酵素を捕捉する工程、(2) 前記酵素の基質を前記カラムに導入して前記抗体に捕捉された酵素と前記基質とを反応させる工程、および(3) 前記反応により得られる生成物を検出する工程からなる酵素活性測定方法である。

Description

本発明は、酵素、特にサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法および酵素活性測定用カラムに関する。

酵素活性の測定は、従来、酵素と基質との反応による基質の減少量または生成物の増加量を分析することにより行われている。生体試料のように、測定しようとする酵素の他にも種々の阻害酵素などの夾雑物が存在する試料中で、特定の酵素の活性について測定するには、阻害酵素などの夾雑物が目的とする酵素反応に及ぼす影響を除くために、測定対象となる酵素を精製する工程が必要である。この工程は、例えば免疫沈降のように測定対象である酵素に特異的な抗体を水に不溶性の支持体に固定化して、この支持体と該酵素を含む試料とを混合することにより、目的の酵素を試料から単離することが行われている。

このような免疫沈降を行った後に酵素反応を行う酵素活性の測定方法として、細胞増殖を調節する細胞周期調節因子であるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれるリン酸化酵素群の活性を測定する方法が開示されている(特許文献1)。

ＣＤＫは、通常、細胞内では不活性型単体として細胞質に存在し、ＣＤＫ自体がリン酸化等の活性化を受けて細胞内の核内に移動する。核内では、ＣＤＫは核内に存在するサイクリン分子と結合してＣＤＫとサイクリンの複合体（以下、活性型ＣＤＫと称する）となり、細胞周期の様々な段階において、細胞周期の進行を正に調節する。このように、サイクリンとＣＤＫとは密接に関係しているが、サイクリン遺伝子の発現の亢進と、種々の癌の進行度や悪性度とが相関していることが知られている(非特許文献1)ことから、それぞれの種類のＣＤＫの活性を測定すると、細胞周期の制御に関連した疾患の種類や悪性度の良い指標となり得ることが期待される。

特許文献1におけるＣＤＫの活性測定方法は、生体試料と、抗ＣＤＫ抗体と、プロテインAビーズとを混合して免疫沈降させた後、ＣＤＫの基質となる基質タンパク質とアデノシン5'−O−(3−チオトリホスフェート) (ATP-γS)をＣＤＫの存在下に反応させて、基質タンパク質にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質または標識酵素を結合させて基質タンパク質を標識し、標識した基質タンパク質の量を測定することによりＣＤＫ活性を測定するものである。

ところで、その他の酵素活性の測定方法として、水に不溶性の支持体にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を固定化させた酵素活性測定用充填剤を充填したカラムに、NAD要求酵素とその酵素の基質とを導入して、得られる生成物を定量することにより酵素活性を測定する方法(特許文献2)、基質を固定化した充填剤を充填したカラムに試料を注入して、酵素と基質との反応により基質を分解させて、カラムから流出する液中の基質分解生成物を定量することにより酵素活性を測定する方法(特許文献3)、ビオチン−アビジンの結合を介して基質が固定化された支持体を充填した酵素活性測定用カラムに、活性測定対象酵素を導入し、得られる基質分解物を定量することによる酵素活性測定方法(特許文献4)などが知られている。
米国特許出願公開第２００２／０１６４６７３号明細書特開平５−３２８９９６号公報米国特許第５６５４１５２号明細書特許第２８１０１３８号公報 Wataru Yasui, 2000, Sysmex Journal International, Vol. 10, No.2; 85-92

従来のＣＤＫ活性の測定方法は、測定に長時間を要することから、多くの検体について検査することが困難であるので、より短時間で簡便にＣＤＫ活性の測定を行うことができる酵素活性測定方法が求められていた。

本発明は、(1) 水に不溶性の支持体と、前記支持体に固定化され、測定対象となる酵素を認識する抗体とからなる充填剤を充填したカラムに、測定対象となる酵素を含む試料を導入して前記抗体によって酵素を捕捉する工程、
(2) 前記酵素の基質を前記カラムに導入して前記抗体に捕捉された酵素と前記基質とを反応させる工程、および
(3) 前記反応により得られる生成物を検出する工程
からなる酵素活性測定方法である。

また本発明は、(1) 水に不溶性の支持体を充填したカラムに測定対象となる酵素を認識する抗体を導入することにより前記支持体に前記抗体を固定化する工程、
(2) 前記カラムに、測定対象となる酵素を含む試料を導入して前記抗体により該酵素を捕捉する工程、
(3) 前記酵素の基質を前記カラムに導入して前記抗体に捕捉された酵素と前記基質とを反応させる工程、および
(4) 前記反応により得られる生成物を検出する工程
からなる酵素活性測定方法である。
さらに本発明は、水に不溶性の支持体と、前記支持体に固定化され、リン酸化酵素を認識する抗体とからなる充填剤を充填した酵素活性測定用カラムでもある。

本発明の酵素活性測定方法は、上記の支持体と抗体とからなる充填剤をカラムに充填し、該抗体に測定対象となる酵素を捕捉させるので、試料中の目的酵素が少量であっても迅速に該酵素を捕捉することができ、また該カラムに基質を導入するので、簡便に効率よく酵素反応を行うことができる。
さらに本発明の酵素活性測定方法によりＣＤＫ活性を測定すると、従来の免疫沈降法を用いる場合に比べて反応時間を大幅に短縮することができるので、迅速な検査を可能にする。

図1は、本発明の酵素活性測定方法に用いることができるカラムの好ましい形態である。図1−1は、図1のカラムをリザーバー、カラム本体および底部に分けた図である。図2は、実施例1および比較例1で得られた、ＣＤＫ2活性を比較したグラフである。図3は、カラムを用いた酵素活性測定方法により測定された、試料中のタンパク質量に対するＣＤＫ2活性のグラフである。図4は、従来の免疫沈降法を用いた酵素活性測定方法により測定された、試料中のタンパク質量に対するＣＤＫ2活性のグラフである。図5は、カラムを用いた酵素活性測定法を用いて、20μgのタンパク質を含む試料のＣＤＫ活性を測定した結果である。

符号の説明

１リザーバー
２カラム本体
３底部
４接触部
５接触部

本発明の酵素活性測定方法において測定対象とする酵素としては、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、セリン/スレオニンキナーゼ(例えばＰＫＢ、ＰＫＣなど)、チロシンキナーゼ(例えばＳｒｃ、Ａｂｌなど)のようなリン酸化酵素；ＭＭＰ(マトリクスメタロプロテアーゼ)、カスパーゼのようなプロテアーゼなどが挙げられる。本発明の酵素活性測定方法は、特にリン酸化酵素の測定を好適に行うことができる。該リン酸化酵素としては、ＣＤＫが好ましい。
ＣＤＫとしては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６およびＣＤＫ７が挙げられる。
上記の酵素を認識する抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよく、組換え技術により得られたものであってもよい。

本発明の酵素活性測定方法は、カラムを用いて行うものである。カラムの形状は、酵素反応の反応効率を向上させるように適宜選択することができる。つまり、カラムに充填された充填剤と、カラムに導入される試料中の分子との衝突効率に応じて、さらにカラムの加工性、本カラムを用いるシステムへの適用性などを考慮して、カラムの形状(径、長さなど)を設定することが好ましい。これらの点から、カラムの径としては、0.3〜30 mmが好ましく、より好ましくは0.5〜20 mm、さらに好ましくは0.5〜15 mmである。カラムの長さは、5〜100 mmが好ましく、より好ましくは10〜80 mm、さらに好ましくは10〜50 mmである。

カラムの材質としては、測定対象となる酵素の活性測定条件下で分解されず、強度やタンパク質の吸着の問題がなく、酵素反応に悪影響を及ぼさないものであればよく、塩化ビニル(PVC)、ポリプロピレン(PP)などを用いることができる。カラムの強度が高く、加工が容易であり、熱伝導性が低くカラム内の温度を一定に保つことができる点で、PVC製のカラムを用いることが好ましい。また、タンパク質の吸着が低い点で、PP製のカラムを好適に用いることができる。

本発明において用いることができるカラムの好ましい形態を、図1および図1−1に示す。カラムは、図1−1に示すように、カラム本体2の上部に試料を蓄積することができるリザーバー1を有し、カラム本体2の下部に充填剤がもれてこないようにするための底部3を有することが好ましい。これらの部分を組み立てて、図1に示すようなカラムとして用いることができる。
リザーバー1とカラム本体2との接触部4、およびカラム本体2と底部3との接触部5には、それぞれ、メンブレンを用いることができる。メンブレンの材質としては、タンパク質の吸着が低く、カラムに液体を導入する際に破損しない程度の強度を有するものであればよく、ポリビニリデンフルオライド(PVDF)、ナイロン、ガラス繊維フィルタなどを用いることができる。中でもPVDFが好ましい。PVDFメンブレンとしては、市販品を用いることができ、例えばデュラポア(ミリポア社製)などが挙げられる。

本発明の酵素活性測定方法においては、充填剤がカラム本体2に充填されることとなる。本明細書において「充填剤」という用語は、水に不溶性の支持体に、測定対象となる酵素を認識する抗体が固定化されたものを意味する。

本発明の酵素活性測定方法において用いられる支持体は、通常、水に不溶性であるが、測定対象となる酵素の活性測定条件下で分解されず、酵素反応に悪影響を及ぼさないものであればよく、例えばセルロース、アガロース、デキストランなどの多糖類、シリカゲルなどを用いることができる。中でもアガロースを用いることが好ましい。
上記の支持体の形状としては、使用するカラムに充填することができるものであればよいが、後記のように試料中の酵素を充填剤に固定化した抗体に捕捉させる際に抗体が試料と接触する面積が大きくなることから、粒子または多孔質の支持体を用いることが好ましい。粒子の粒径としては0.01〜0.5 mmが好ましく、より好ましくは0.05〜0.4 mm、さらに好ましくは0.05〜0.2 mmである。
また、多孔質の支持体としては、カラム本体の形状に合わせて、例えば円筒形に成型されたものを用いることができる。多孔質の支持体としては、モノリス型シリカなどを用いることができる。

本発明の酵素活性測定方法において、支持体に抗体と結合可能な物質(以下、抗体結合物質という)を固定化し、ここに抗体を結合させた充填剤を用いてもよい。抗体結合物質としては、Fabフラグメント、Fcフラグメント、κ鎖などの抗体の部分を認識して結合する物質を挙げることができる。このような物質としては、プロテインA、プロテインG、プロテインL、プロテインLAなどを挙げることができ、中でもプロテインAまたはプロテインGであることが好ましい。プロテインAおよびプロテインGとしては、天然から得られたもの、もしくは遺伝子組換え技術により製造したもの、またはこれらを修飾して得られたものを用いることができる。該修飾としては、例えばアルブミン結合領域の除去、細胞壁結合領域の除去のような、抗体に対する認識の特異性を向上させるための修飾が挙げられる。

支持体に抗体結合物質を固定化する方法としては、反応性化合物を用いる方法が挙げられる。反応性化合物としては、p-ニトロフェニルクロロギ酸エステル、臭化シアン、N-ヒドロキシスクシンイミド、エポキシド類などを好適に用いることができる。この場合、支持体に反応性化合物が結合し、該反応性化合物に抗体結合物質が結合することにより、支持体に抗体結合物質を固定化することができる。

抗体結合物質と結合した支持体としては、市販の製品を用いることもできる。上記の抗体と結合可能な物質がプロテインAである場合、Protein A Sepharose FF、Protein A Sepharose HP (アマシャム社製)などを用いることができ、抗体と結合可能な物質がプロテインGである場合、Protein G Sepharose HP (アマシャム社製)などを用いることができる。

本発明の酵素活性測定方法のある好ましい形態においては、まず、測定対象となる酵素を認識する抗体と支持体とからなる充填剤をカラムに充填する。充填剤を得る方法としては、抗体を適当な緩衝液に溶解した溶液に、支持体を投入して、インキュベーションすることにより行うことができる。なお、支持体に予め抗体結合物質を固定化しておいてもよい。インキュベーションを行う温度としては、2〜10℃が好ましく、より好ましくは4〜6℃である。インキュベーション時間としては、20〜90分間が好ましく、より好ましくは40〜70分間である。
このようにして得られた充填剤を、固定化されなかった抗体を除去するために洗浄してもよい。洗浄を行う洗浄液は、固定化されなかった抗体を除去することができるものであればよく、少量のアルブミンや界面活性剤を含むものであってもよい。このような洗浄を行った後、該充填剤を適切な緩衝液に懸濁して、カラムに充填することができる。

支持体に固定化される抗体の量は、支持体の抗体結合容量、測定対象である酵素の種類などに応じて適宜選択することができる。通常、0.1〜100μgであり、好ましくは0.5〜50μg、より好ましくは0.7〜20μgである。

充填剤を前記のカラムに充填する方法としては、充填剤が、充填剤とカラムに導入される試料中の分子との衝突効率が良好になるように充填される方法であればよく、例えば粒子状の充填剤を適切な緩衝剤に懸濁し、一定の流速でカラムに充填する方法を用いることができる。粒子状の充填剤を充填する際の流速としては、充填剤の種類により適宜選択することができるが、10〜1000μl/分が好ましく、より好ましくは20〜700μl/分であり、さらに好ましくは50〜500μl/分である。
カラムに充填する充填剤の量としては、10μl〜15 mlが好ましく、より好ましくは15μl〜15 mlである。

また本発明の酵素活性測定方法の別の好ましい形態においては、支持体がカラムに充填される。上記のようにして充填剤をカラムに導入するのと同様の流速でカラムに支持体を充填した後、測定対象となる酵素を認識する抗体をカラムに導入する。このように測定対象となる酵素を認識する抗体を上記のカラムに導入して、該支持体に抗体を固定化する方法としては、該抗体を適切な緩衝剤に溶解し、所定量の抗体が支持体に固定化されるような流速でカラムに送液する方法が挙げられる。抗体の溶液の流速としては、5〜500μl/分が好ましく、より好ましくは10〜350μl/分であり、さらに好ましくは25〜250μl/分である。
カラムに充填する支持体の量としては、10μl〜15 mlが好ましく、より好ましくは15μl〜15 mlである。

支持体に抗体を固定化した後、カラム内に残存する、固定化されなかった抗体を除去するために、上記のような洗浄液を用いて洗浄を行ってもよい。洗浄液の流速としては、5〜500μl/分が好ましく、より好ましくは10〜200μl/分である。

このようにして得られた、水に不溶性の支持体と、該支持体に固定化され、リン酸化酵素を認識する抗体とからなる充填剤を充填した酵素活性測定用カラムは、本発明のひとつである。この酵素活性測定用カラムは、2〜10℃で保存することが可能であり、用時に以下の工程を行うことにより、酵素活性測定に用いることができる。

上記の操作により得られたカラムに、測定対象となる酵素を含む試料を導入して、上記の抗体に該酵素を捕捉させる。
測定対象となる酵素を含む試料は、目的酵素のみを含む精製された単一標品、または粗精製品であってもよいし、生体試料であってもよい。生体試料を用いる場合、分離クロマトグラフィーを用いて予め粗精製を行ってもよい。測定対象となる酵素がＣＤＫである場合、例えば生体試料中の生体細胞を化学的または物理的処理に付して、その細胞膜および核膜を破壊することにより試料を調製することができる。該処理としては、例えば界面活性剤、タンパク質分解酵素阻害剤および脱リン酸化酵素阻害剤を含有する緩衝液中、ワーリングブレンダーのような電動ホモジナイザー処理に付すか、シリンジで吸引排出するか、または超音波処理に付すことが好ましい。
試料をカラムに導入する際の流速は、5〜500μl/分が好ましく、より好ましくは10〜350μl/分であり、さらに好ましくは25〜250μl/分である。

カラムに試料を導入して酵素を捕捉させた後、カラム内に残存する捕捉されなかった酵素、および試料中に含まれる他の夾雑物を除去するために、洗浄を行うことが好ましい。測定対象となる酵素がＣＤＫである場合、洗浄液としては、後記の基質との反応性を向上させるために塩化マグネシウムを含むものであってよく、また酵素の安定化剤としてジチオスレイトール(DTT)を含むものであってもよい。
洗浄液の流速としては、5〜500μl/分が好ましく、より好ましくは10〜200μl/分である。
また、洗浄は、カラム内に残存する抗体に捕捉されなかった遊離の酵素や夾雑物が後記の酵素反応に悪影響を及ぼさないように、3〜30分間、好ましくは5〜15分間行うことが望ましい。

上記の酵素が捕捉されたカラムに、該酵素の基質を導入して酵素反応を行う。基質としては、測定対象とする酵素と接触して反応生成物を生じるものであればよい。該基質は1種であってもよいし、2種以上であってもよく、2種以上である場合にこれらを同時にカラムに導入してもよいし、別々に導入してもよい。
上記酵素反応は、基質を適当な緩衝液に溶解した基質溶液をカラムに導入することにより行うことができる。基質溶液の流速は、測定する酵素、用いる基質、カラムのサイズなどに応じて適宜選択することができるが、通常、0.1〜200μl/分であり、好ましくは0.5〜150μl/分、より好ましくは1〜100μl/分である。
基質溶液のpHおよび酵素反応を行う温度としては、測定する酵素および用いる基質に応じて、測定対象である酵素の反応条件が最適となるように選択することができる。例えば該酵素としてＣＤＫを測定する場合のpHは、6.5〜8.5が好ましく、より好ましくは7.0〜7.4である。また、反応温度としては25〜40℃が好ましく、より好ましくは37℃である。

該酵素としてＣＤＫを測定する場合、基質としては、基質タンパク質とアデノシン5'−O−(3−チオトリホスフェート) (ATP-γS)を用いることが好ましい。

上記に示したように、ＣＤＫがサイクリンと結合した活性型ＣＤＫは、通常、基質タンパク質のセリンまたはスレオニン残基にATP由来のモノリン酸基を導入するが、ATPの代わりにATP-γSを用いると、モノリン酸基の代わりにモノチオリン酸基が基質タンパク質のセリンまたはスレオニン残基に導入される。次いで基質タンパク質に導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子を、標識蛍光物質または標識酵素で標識することにより検出することができ、ＣＤＫ活性を測定することができる。

基質タンパク質としては、したがってセリンまたはスレオニン残基を有するものであればよい。ＣＤＫ１およびＣＤＫ２の活性を測定する場合はヒストンH1、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の活性を測定する場合にはRb (網膜芽細胞種タンパク質、Retinoblastoma protein)などを好ましく用いることができる。
元来分子内にシステイン残基を含む基質タンパク質、例えばRbについては、その残基をアラニンなどのチオール基を含まないアミノ酸残基に置換した基質タンパク質が用いられる。これは、活性型ＣＤＫの作用によりATP-γS由来のチオリン酸基が導入された基質タンパク質のチオリン酸の硫黄原子を標識蛍光物質または標識酵素で標識する際に、基質タンパク質内に元来存在するシステイン残基のチオール基が同時に標識されて測定誤差が生じないようにするためである。このようにアミノ酸残基を置換した基質タンパク質を得る方法としては、通常の遺伝子工学の手法を用いることができ、米国特許出願公開第２００２／０１６４６７３号明細書に記載の方法を特に好適に用いることができる。

上記のようにしてカラムに導入した基質溶液からの溶出液を回収し、溶出液中の反応生成物を検出する。
反応生成物の検出は、従来の酵素反応測定法において通常用いられる方法を用いて行うことができる。例えば、反応生成物が過酸化水素などである場合は電気化学的な変化、また反応生成物がパラニトロフェノール、ヌクレオチド、オリゴペプチドなどである場合は紫外吸収、蛍光、屈折率の変化を測定することにより、検出を行うことができる。
測定する酵素がＣＤＫである場合、反応生成物の検出は、米国特許出願公開第２００２／０１６４６７３号明細書に記載の方法を用いて行うことができる。

上記の各工程において、カラムへの各種溶液および懸濁液の送液は、シリンジなどを用いて手動で行ってもよいが、ポンプを用いて一定の流速で行うことが好ましい。

本発明の酵素活性測定方法は、その抗体が入手可能な酵素であれば測定することができ、試料中の酵素が低濃度であっても抗体が酵素を捕捉して微小空間で酵素反応を行うことができるので、反応効率が良好である。さらに、従来は多工程であった酵素反応を、カラムに送液する手法を用いることにより、簡便にすることができるものである。また、用いるカラムを小容量とすることができるので、カラム内の温度分布が小さく、均一の条件で酵素反応を行うことができる。

本発明を、以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
実施例１カラムを用いたＣＤＫ1および2の活性測定
(1) 試料の調製
可溶化溶液(0.1 w/v% NP-40(界面活性剤ノニデットP-40)、50mM Tris-HCl、pH7.4、5 mM EDTA、50 mMフッ化ナトリウム、1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、100μg/ml プロテアーゼ阻害剤カクテール(SIGMA社製))中で、慢性骨髄性白血病由来細胞株K-562を、1×10⁷細胞/5mlという条件下に、氷浴中で23G針をつけた5 mlのシリンジで10回吸引/排出を繰り返し、細胞を可溶化した。さらに不溶物を15000 rpmで5分間4℃で遠心除去して、試料を調製した。上澄み中に含まれる全蛋白質量をDC蛋白質キット（バイオ−ラッド社製）を用いて、ウシIgGを標準として測定した。

(2) カラムの作製
緩衝液1 (0.1% NP-40、50 mM Tris-HCl、pH 7.4) 500μlに、支持体としてProtein A Sepharose FF (アマシャム社製；セファロースに、抗体結合物質としてプロテインAが結合したもの) 20μlを加え、ポンプを用いて100μl/分の流速で内径1.13 mm、長さ20 mmのカラム(容積20.05 mm³)に支持体を充填した。この際、カラムには、図1に示す底部3の接触部5にのみメンブレン(デュラポア(ミリポア社製))を装着し、充填が終了した後、リザーバー1の接触部4に同様のメンブレンを装着した。なお、カラム本体2にリザーバー1および底部3を装着したカラム全長は、31.5 mmである。

(3) 酵素反応
緩衝液1で2μgのタンパク質を含むように希釈したポリクローナル抗ＣＤＫ1または2抗体(サンタクルツバイオテクノロジー社製)溶液100μlを、50μl/分の流速でカラムに送液して抗体を支持体にそれぞれ固定化した。この固定化に要した時間は、約6分間であった。
(1)で調製した、50μgのタンパク質を含む試料100μlを、50μl/分の流速でカラムに送液し、試料中のＣＤＫを捕捉させた。この段階に要した時間は約6分間であった。
次いで洗浄液(100 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、pH 7.4) 400μlを、50μl/分の流速で送液してカラムを洗浄した。洗浄に要した時間は約13分間であった。
このカラムに、基質混合溶液(ヒストンH1 10μg、5 mM ATP-γS、20 mM MgCl₂、0.1% Triton X-100、50 mM Tris-HCl、pH 7.4) 100μlを、10μl/分の流速で送液し、溶出液を回収した。この段階に要した時間は約8分間であった。

(4) 反応生成物の検出
溶出液36μlに150 mMトリス-HCl、pH 9.2、5 mM EDTAを含む結合緩衝液30μlを加えた。さらに、50 mM PEO-ヨードアセチルビオチン(Pierce社)溶液(50 mMのリン酸緩衝液pH 6.0)を20μl加えた後、90分間暗所室温でインキュベートした。その後、等量(86μl)のSDS-サンプルローディング緩衝液(0.125Mトリス-HCl、pH 6.8、4% SDS、10%β-メルカプトエタノール、25%グリセリン、ブロモフェノールブルー)を加え、5分間100℃で処理した。

得られたサンプルを用いて、20μl／レーンの条件でSDS-PAGEを行った(第一化学薬品、プレキャストゲル、4〜20%グラジエント、10 mm×10 mm)。SDS-PAGEの条件は、第一化学薬品の指示に従った(60 mA、40分)。SDS-PAGE後、ゲル内に展開されたタンパク質を電気的にPVDFメンブレンに転写した(10V、30分、Western Blot法)。得られたメンブレンを4 w/v%のBSAで30分間ブロックし、TBS-Tで5分間洗浄した。次にアビジンFITC (Pierce社) (TBS-Tで1000倍希釈）溶液中で37℃、30分間反応させた。反応後、メンブレンをTBS-Tで2回、水で1回洗浄し、乾燥させた。Molecular Imager (Bio-Rad社)で蛍光のバンドを視覚化し、バンドの強度をRFU(相対蛍光ユニット)として測定した。

比較例1 免疫沈降法を用いたＣＤＫ1および2の活性測定
(1) 試料の調製
実施例1の(1)と同様にして、試料を調製した。
(2) 免疫沈降反応
(1)で調製した、50μgのタンパク質を含む試料100μlに、2μgのポリクローナル抗ＣＤＫ1または2抗体(サンタクルツバイオテクノロジー社製)およびProtein A Sepharose FF (アマシャム社製) 20μlを添加して、4℃で60分間免疫沈降させた。
その後、セファロースのビーズを緩衝液1で2回、洗浄液で1回、緩衝液2 (100 mM Tris-HCl、pH 7.4)で1回、計4回の洗浄を行った。洗浄に要した時間は10分間であった。

(3) 酵素反応
次いで、基質混合溶液50μlを添加し、37℃で10分間振とうして酵素反応を行った。
(4) 反応生成物の検出
実施例1の(4)と同様にして、酵素活性を測定した。

図2に、実施例1および比較例1の方法で測定して得られたＣＤＫ2活性の値を比較したグラフを示す。図2から明らかなように、カラムを用いた本発明の酵素活性測定法により検出されたＣＤＫ2の酵素活性は、免疫沈降法を用いた酵素活性測定法により検出されたＣＤＫ2の活性とほぼ同じであった。また、次の表1に示すように、カラムを用いた酵素活性測定方法では、免疫沈降法を用いた酵素活性測定法に要した時間を半分以下に短縮することができた。

実施例2および比較例2
実施例1の(1)で調製した試料を、それぞれ10、20および50μgのタンパク質含量となるように希釈して、実施例1と同様の方法でＣＤＫ1および2の活性を測定した(実施例2)。また該試料を10、20、50および100μgのタンパク質含量となるように希釈し、比較例1と同様の方法でＣＤＫ1および2の活性を測定した(比較例2)。
実施例2および比較例2で得られた、タンパク質の量に対するＣＤＫ2活性のグラフを図3および図4に示す。
図3および図4から、カラムを用いた酵素活性測定法は、従来の免疫沈降法を用いた酵素活性測定法と同様に定量性があることがわかる。

さらに、20μgのタンパク質を含む試料について、実施例1と同様の方法で測定したＣＤＫ1および2の活性を図5に示す。
比較例1と同様の方法では、20μgのタンパク質を含む試料についてのＣＤＫ1の活性は検出限界以下であり測定できなかったが、図5からわかるように、カラムを用いた酵素活性測定法では検出可能であり、ＣＤＫ1活性測定の検出下限が向上できた。

実施例３カラムを用いたＣＤＫ1および2の活性測定
実施例1の(2) カラムの作製において、予めチューブ内で支持体としてのProtein A Sepharose FF (アマシャム社製)とポリクローナル抗ＣＤＫ1または2抗体(サンタクルツバイオテクノロジー社製)溶液とを混合してインキュベーションすることにより充填剤を作製した後、該充填剤をカラムに充填する以外は実施例1と同様にして、ＣＤＫ1および2の活性測定を行った。

本実施例でも実施例1と同様に、酵素活性測定に要する時間を短縮することができた。この実施例で得られたＣＤＫ2活性の値を測定すると、図2で得られたものとほぼ同様の結果が得られた。

本出願は、日本国特許出願第２００４−１６３３６７号(２００４年６月１日出願)に基づく優先権主張出願であり、この特許請求の範囲、明細書、図面および要約書の全ては、本明細書中に参照として組み込まれる。

本発明の酵素活性測定法は、迅速に効率よく酵素活性を測定できる方法である。この方法によりＣＤＫ活性を測定することにより、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮癌、脳腫瘍、骨肉種または骨髄腫瘍のような癌疾患を診断することができる。

Claims

(1) 水に不溶性の支持体と、前記支持体に固定化され、測定対象となる酵素を認識する抗体とからなる充填剤を充填したカラムに、測定対象となる酵素を含む試料を導入して前記抗体によって酵素を捕捉する工程、
(2) 前記酵素の基質を前記カラムに導入して前記抗体に捕捉された酵素と前記基質とを反応させる工程、および
(3) 前記反応により得られる生成物を検出する工程
からなる酵素活性測定方法。
(1) 水に不溶性の支持体を充填したカラムに測定対象となる酵素を認識する抗体を導入することにより前記支持体に前記抗体を固定化する工程、
(2) 前記カラムに、測定対象となる酵素を含む試料を導入して前記抗体により該酵素を捕捉する工程、
(3) 前記酵素の基質を前記カラムに導入して前記抗体に捕捉された酵素と前記基質とを反応させる工程、および
(4) 前記反応により得られる生成物を検出する工程
からなる酵素活性測定方法。
支持体が粒子である請求項1または2に記載の酵素活性測定方法。
測定対象となる酵素が、リン酸化酵素である請求項1〜3のいずれか1項に記載の酵素活性測定方法。
リン酸化酵素が、サイクリン依存性キナーゼである請求項4に記載の酵素活性測定方法。
水に不溶性の支持体と、前記支持体に固定化され、リン酸化酵素を認識する抗体とからなる充填剤を充填した酵素活性測定用カラム。
前記リン酸化酵素が、サイクリン依存性キナーゼである請求項6に記載の酵素活性測定用カラム。
長径が0.3〜30 mmであり、全長が5〜100 mmである請求項6または7に記載の酵素活性測定用カラム。