JP2002335997A - 細胞周期調節因子の活性の測定法とそれを用いた癌の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 放射性同位体を用いずに、細胞周期調節因子
を測定する方法を見出すこと。 【解決手段】 生体細胞からサイクリン依存性キナーゼ
／サイクリン複合体を測定するための試料を調製し、該
試料の存在下、サイクリン依存性キナーゼの基質となる
基質蛋白質とアデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホス
フェート）（ＡＴＰ−γＳ）を反応させて、該基質蛋白
質のセリンまたはスレオニン残基にモノチオリン酸基を
導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識
蛍光物質または標識酵素を結合させることによって該基
質蛋白質を標識し、該基質蛋白質を標識した標識蛍光物
質からの蛍光量を測定するか、または該基質蛋白質を標
識した標識酵素に、該標識酵素との反応によって光学的
に検出可能な物質が生じるような基質を作用させて、生
じた生成物の量を光学的に測定し、予め作製した検量線
をもとにサイクリン依存性キナーゼの活性値を蛍光量ま
たは生じた生成物の量から算出することを特徴とする細
胞周期調節因子の活性の測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は放射性物質を用い
ることのない細胞周期調節因子の活性の測定法とそれを
用いた癌の診断法に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞増殖は生命維持上、生物の基本的か
つ重要な特徴の一つである。細胞増殖は、１つの細胞が
２つの娘細胞に分裂することにより行われるが、体細胞
分裂の場合、細胞の成長、ＤＮＡの複製、染色体の分
配、細胞の分裂などからなる複数の連続反応により、細
胞分裂が起こっている。この連続反応の一連過程は細胞
周期と呼ばれる。細胞周期は、真核細胞の場合、４つの
時期に分けられる。すなわち、ＤＮＡ複製が起こるＳ
期、細胞の分裂が起こるＭ期、Ｍ期と次のＳ期までの間
の間隙であるＧ１期およびＳ期と次のＭ期までの間の間
隙であるＧ２期からなる。Ｇ１期は細胞が増殖へのシグ
ナルを受け、ＤＮＡ複製の準備や細胞の分裂に必要な代
謝、成長のための時期であり、Ｇ２期は分裂に入る準備
のための時期と考えられている。また、Ｇ１期には哺乳
類細胞ではＲ点（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｐｏｉｎ
ｔ）、酵母ではＳＴＡＲＴと呼ばれる移行点が実験的に
想定されている。一般に細胞は外界からの増殖シグナル
を受けて増殖する。これらのシグナルを細胞はＧ１期で
受け取り、細胞周期を進行させるが、Ｇ１期のある点を
過ぎると細胞は増殖シグナルがなくなっても、増殖を停
止することなくＳ→Ｇ２→Ｍ→Ｇ１と細胞周期を進行さ
せる。この点がＲ点またはＳＴＡＲＴであり、いわば細
胞が増殖方向に進行することを決定する時期であるとい
える。さらに、細胞は細胞周期を逸脱し、成長も増殖も
しない休止期（Ｇ０期）に入ることができる。実験的に
はこのような細胞は適当なシグナルを与えればＧ１期に
戻り、成長と分裂を再び誘導することができる。多細胞
生物体を構成する多くの非成長性、非増殖性の細胞はＧ
０期にあると考えられている。

【０００３】細胞内にあって、細胞周期調節因子は主に
２つ存在する。１つは、正の調節因子であるサイクリン
依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれるリン酸化酵素群で
あり、もう一つは負の調節因子であるＣＤＫ阻害因子
（ＣＤＫＩ）である。ＣＤＫは、通常細胞内では不活性
型単体として細胞質に存在し、ＣＤＫ自体がリン酸化等
の活性化を受けて細胞内の核内に移動する。核内では、
ＣＤＫは核内に存在するサイクリン分子と結合してＣＤ
Ｋとサイクリンの複合体（以下、活性型ＣＤＫと称す
る）となり、細胞周期の様々な段階において、細胞周期
の進行を正に調節する。一方、ＣＤＫＩはＣＤＫと結合
することにより、すなわちＣＤＫＩが活性型ＣＤＫまた
はＣＤＫ単体と結合することによりＣＤＫを不活性と
し、細胞周期活性を負に調節する。

【０００４】ＣＤＫは、現在、ＣＤＫ１、２、３、４、
５、６および７のタイプが知られ、それぞれ結合するサ
イクリンが異なる。すなわち、ＣＤＫ１はサイクリンＡ
またはＢと、ＣＤＫ２はサイクリンＡまたはＥと、ＣＤ
Ｋ４およびＣＤＫ６はサイクリンＤ１、Ｄ２またはＤ３
と結合して活性型となる。活性型ＣＤＫは、それぞれ特
異的な細胞周期の段階を制御する。細胞周期制御にかか
わるＣＤＫと、機能的に結合するサイクリンおよびこれ
ら活性型ＣＤＫが機能する段階を以下の表１に示す。

【０００５】

【表１】

【０００６】このように、異なる種類のＣＤＫが活性化
されることにより細胞周期が調節され、細胞増殖を調節
している。活性型ＣＤＫは基質蛋白質のセリンまたはス
レオニン残基をリン酸化する酵素である。ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ反応系においては、活性型ＣＤＫ１および２はヒス
トンＨ１を、活性型ＣＤＫ４および６はＲｂ（網膜芽細
胞腫蛋白質、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）を基質として良好に反応を行う。しかし、実際
の細胞周期制御における各活性型ＣＤＫの生理的基質
は、その一つがＲｂであると考えられているが、これ以
外に基質が存在するかどうかは未だ不明である。

【０００７】上記のように、ＣＤＫおよびサイクリンは
密接に関連しあって細胞周期を調節しているが、食道癌
ではサイクリンＤ１遺伝子の増幅が多くの症例において
認められ、胃癌や大腸癌ではサイクリンＤ１遺伝子の発
現亢進が多くの症例において示されている。一方、サイ
クリンＥの遺伝子の増幅は胃癌や大腸癌で認められてい
るが、食道癌では認められていない。胃および大腸での
サイクリンＥの過剰発現は、腺腫および腺癌の場合に有
意に高頻度であり、深部への侵潤、ステージの進行、転
移などの悪性度と有意な相関を示す。また、ＣＤＫ１の
発現およびキナーゼ活性は、正常粘膜組織においてと比
較して大部分の胃癌および大腸癌において著しく亢進し
ている。従って、サイクリン遺伝子の発現の亢進と、種
々の癌の進行度や悪性度と相関していることが知られて
いる（安井 弥、ＳｙｓｍｅｘＪｏｕｒｎａｌ Ｗｅ
ｂ．，１〜１０頁， ｖｏｌ．１， ２０００）。

【０００８】以上のことから、それぞれの種類のＣＤＫ
の活性を測定すると、細胞周期の制御に関連した疾患の
種類や悪性度の良い指標となり得ることが期待される。
すなわち、Ｒ点でＣＤＫ２の発現が低下し細胞周期を停
止させて細胞分裂が調節されるが、ＣＤＫ２の発現が高
まっていることはＲ点における細胞周期の停止不能、例
えば癌のような疾患の状態を意味すると予想される。ま
た、ＣＤＫ４または６の発現が高まっていると、ＣＤＫ
４または６と特異的に結合するサイクリンＤ１遺伝子の
発現亢進が見られる胃癌または大腸癌が予想され、癌の
種類を決定することが可能であると考えられる。

【０００９】通常、ＣＤＫの活性は放射性同位体を用い
て測定される。詳細には、抗ＣＤＫ抗体を用い細胞溶解
液から免疫沈降法により抽出された活性の不明なＣＤＫ
存在下に、基質蛋白質のセリンまたはスレオニン残基
に、³²Ｐ標識したアデノシン５’−Ｏ−（３−トリホス
フェート）（ＡＴＰ）を作用させて、³²Ｐ標識したＡＴ
Ｐ由来のモノリン酸基を導入し、基質蛋白質に取り込ま
れた³²Ｐ量をオートラジオグラフィーまたはシンチレー
ションカウンターで検出することによりリン酸化された
基質蛋白質の量が測定され、その基質蛋白質の量からＣ
ＤＫの活性が算出される。上記の方法は、³²Ｐという放
射性物質を使用するため、取り扱いや廃液処理等には注
意が必要である。

【００１０】

【解決しようとする課題】従って、放射性物質を使用せ
ずに鋭敏に細胞周期調節因子を測定する方法およびその
結果に基づいて癌を診断する方法を見出すことが、所望
されていた。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、生体細胞から
サイクリン依存性キナーゼ／サイクリン複合体を測定す
るための試料を調製し、該試料の存在下、サイクリン依
存性キナーゼの基質となる基質蛋白質とアデノシン５’
−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）
を反応させて、該基質蛋白質のセリンまたはスレオニン
残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオ
リン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質または標識酵素を結
合させることによって該基質蛋白質を標識し、該基質蛋
白質を標識した標識蛍光物質からの蛍光量を測定する
か、または該基質蛋白質を標識した標識酵素に、該標識
酵素との反応によって光学的に検出可能な物質が生じる
ような基質を作用させて、生じた生成物の量を光学的に
測定し、予め作製した検量線をもとにサイクリン依存性
キナーゼの活性値を蛍光量または生じた生成物の量から
算出することを特徴とする細胞周期調節因子の活性の測
定法を提供するものである。さらに、本発明は本発明の
細胞周期調節因子の活性の測定法により得られた結果に
基づいて、癌を診断する方法を提供する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の方法を実施するには、ま
ず試料が調製される。本発明においてサイクリン依存性
キナーゼ（ＣＤＫ）／サイクリン複合体を含有する試料
とは、１種類または複数種類のＣＤＫ／サイクリン複合
体を含有するものであってもよいが、１種類のＣＤＫ／
サイクリン複合体を含有するものが好ましい。本発明の
方法で用いる生体細胞から調製されたＣＤＫ／サイクリ
ン複合体（以下、活性型ＣＤＫと略す）を含有する試料
は、生体細胞の可溶化およびその可溶化液からの測定目
的の活性型ＣＤＫを含む試料の単離により調製される。
本発明で用いられるＣＤＫとは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、
ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６およびＣＤＫ
７が挙げられる。

【００１３】（１）細胞の可溶化 試料は、組織サンプル（バイオプシーサンプルや外科切
除サンプル等）のようなヒトを含む動物由来の生体細胞
から調製される。試料はＣＤＫ／サイクリン複合体の有
無を試験するためのものであり、試料中に存在する場合
にはその活性の度合いも測定されるものである。生体細
胞中、単体ＣＤＫは細胞質に存在し、サイクリンは核内
に存在する。単体ＣＤＫが核内に移行して核中でサイク
リンと結合して活性型ＣＤＫとなる。したがって、活性
型ＣＤＫを含む試料を調製するには、生体細胞を可溶化
させることにより、単体ＣＤＫはサイクリンと結合させ
る必要がある。生体細胞を可溶化させるために、生体細
胞はその細胞膜および核膜を化学的または物理的処理に
付して、破壊することにより行うことができる。具体的
には、例えば界面活性剤、蛋白質分解酵素阻害剤および
脱リン酸化酵素阻害剤を含有する緩衝液中、ワーリング
ブレンダー、シリンジで吸引排出するか、または超音波
処理に付すことが好ましい。

【００１４】界面活性剤は、細胞膜や核膜を破壊して細
胞内物質を取り出すために用いられる。ただし、活性型
ＣＤＫを分解させない程度の界面活性を有するものが用
いられる。その例としては、ノニデットＰ−４０、トリ
トンＸ−１００、デオキシコール酸、ＣＨＡＰＳが挙げ
られる。界面活性剤濃度は、１ｗ／ｖ％以下が好まし
い。

【００１５】蛋白質分解酵素阻害剤は、細胞膜や核膜が
破壊された細胞内物質が混在するときに蛋白質であるＣ
ＤＫやサイクリン分子が破壊されるのを防ぐために用い
られる。その例は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡのようなメタロ
プロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦ、トリプシンインヒビタ
ー、キモトリプシンのようなセリンプロテアーゼ阻害剤
および／またはヨードアセトアミド、Ｅ−６４のような
システインプロテアーゼ阻害剤の混合物や、シグマ社か
ら市販のプロテアーゼ阻害剤カクテルのようなそれら蛋
白質分解酵素阻害剤の予め混合された市販品が挙げられ
る。

【００１６】脱リン酸化酵素阻害剤は、蛋白質である活
性型ＣＤＫ自体のリン酸基が水解されて活性が変動する
のを防ぐために用いられる。その例として、セリン／ス
レオニン脱リン酸化酵素阻害剤としてはフッ化ナトリウ
ムが、チロシン脱リン酸化酵素阻害剤としてはオルトバ
ナジン酸ナトリウム（Ｎａ₃ＶＯ₄）が挙げられる。

【００１７】細胞可溶化液は、遠心分離やフィルターを
用いたろ過などに付され、不溶物が除去される。次に、
活性型ＣＤＫを含む試料を調製するにあたり、処理され
た生体細胞の可溶化液中の全蛋白質量を当業者に公知の
方法に従って測定しておくのが望ましい。全蛋白質量
は、例えば、ＤＣ蛋白質キット等を用いて、ウシＩｇＧ
を標準として測定される。

【００１８】（２）測定目的の活性型ＣＤＫを含む試料
の単離 活性測定用の目的の活性型ＣＤＫを含む試料は、そのよ
うにして得られた細胞可溶化液から調製される。活性型
ＣＤＫを含む試料の調製法には、例えば、免疫沈降法が
ある。免疫沈降法によれば、目的の各種ＣＤＫ１〜７の
いずれか一つに特異性を有する抗ＣＤＫ抗体が用いられ
る。

【００１９】より詳細には、所定量の蛋白質を含む細胞
可溶化液に、測定目的の活性型ＣＤＫに対応する抗ＣＤ
Ｋ抗体と、その抗ＣＤＫ抗体を捕捉するための材料とし
てプロテインＡ、プロテインＧまたは抗ウサギＩｇＧ抗
体をコートしたセファロースビーズの懸濁液（ビーズ含
量４〜６ｖ／ｖ％）を０〜１０℃で１〜２時間反応させ
る。これらビーズは不溶性なので、ビーズに結合した該
抗ＣＤＫ抗体とＣＤＫの複合体は不溶性となり沈降す
る。

【００２０】なお、免疫沈降法によると、細胞可溶化液
中のＣＤＫ群（ＣＤＫ単体、活性型ＣＤＫ、活性型ＣＤ
ＫとＣＤＫＩの複合体、およびＣＤＫとＣＤＫＩの複合
体を意味する）がすべて捕捉されるので、活性型ＣＤＫ
と共にＣＤＫ単体、活性型ＣＤＫとＣＤＫＩの複合体、
およびＣＤＫとＣＤＫＩの複合体のような不活性型ＣＤ
Ｋも調製する試料に含まれる。しかし、不活性型ＣＤＫ
はＡＴＰ−γＳ存在下に基質蛋白質のモノチオリン酸化
に関与しないので、不活性型ＣＤＫを含む活性型ＣＤＫ
の活性測定用試料を用いて本発明の方法を実施しても、
不活性型ＣＤＫの活性は測定されず、活性型ＣＤＫの活
性のみが測定されることとなる。

【００２１】次いで、沈降した活性型ＣＤＫと抗ＣＤＫ
抗体との複合体と結合したビーズを洗浄する。ビーズを
洗浄する洗浄用緩衝液には、後に活性型ＣＤＫの基質と
なる基質蛋白質と活性型ＣＤＫとにＡＴＰ−γＳが作用
するためにマグネシウムとコンプレックスを形成する必
要があるので、塩化マグネシウム、およびタンパクの高
次構造の安定化のために必要な酵素の安定化剤として例
えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む。さらに、ア
ルブミンや、少量の界面活性剤などを含まれてもよい。

【００２２】その後、測定目的の活性型ＣＤＫを含有す
る試料を用いて、その活性を測定する。本発明による方
法は、活性型ＣＤＫ存在下に基質蛋白質のセリンまたは
スレオニン残基をモノチオリン酸化することと、そのチ
オリン酸基を標識してその標識を測定することからな
る。なお、本発明の方法においては、ビーズに結合した
ＣＤＫ抗体と結合した状態の活性型ＣＤＫ抗体を、活性
型ＣＤＫとして用いて行ってもよい。

【００２３】（ｉ）活性型ＣＤＫ存在下に、ＣＤＫの基
質である基質蛋白質とアデノシン５’−Ｏ−（３−チオ
トリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）を反応させて、該
基質蛋白質のセリンまたはスレオニン残基にＡＴＰ−γ
Ｓ由来のモノチオリン酸基を導入すること。通常、活性
型ＣＤＫは、以下の式に示すように、基質蛋白質のセリ
ンまたはスレオニン残基にＡＴＰを作用させてＡＴＰ由
来のモノリン酸基を導入されるが、本発明の方法におい
ては、ＡＴＰの代わりにＡＴＰ−γＳを用いて、モノリ
ン酸基の代わりにモノチオリン酸基を基質蛋白質のセリ
ンまたはスレオニン残基に導入されるものである。

【００２４】モノチオリン酸化するには、該基質蛋白質
０．１〜１ｍｇ／ｍｌを含むｐＨ６．５〜８．５、好ま
しくは７．４の溶液に、２５〜４０℃、好ましくは３７
℃の温度で、該基質蛋白質１当量に対して１０〜１００
当量のＡＴＰ−γＳを、活性型ＣＤＫの存在下で、５分
間〜１時間、好ましくは１０分間反応させることにより
行う。測定試料には測定目的の活性型ＣＤＫのみなら
ず、上述のように不活性型も含まれているが、活性型Ｃ
ＤＫのみがチオリン酸基導入反応を触媒するので、本発
明の方法には不活性型は関与しない。

【００２５】

【化１】 基質蛋白質としては、活性型ＣＤＫ１およびＣＤＫ２に
対してはヒストンＨ１、活性型ＣＤＫ４およびＣＤＫ６
に対してはＲｂ（網膜芽細胞腫蛋白質、Ｒｅｔｉｎｏｂ
ｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。

【００２６】なお、本発明において、元来分子内にシス
テイン残基を含む基質蛋白質、例えばＲｂについては、
その残基をアラニンなどのチオール基を含まないアミノ
酸残基に置換した基質蛋白質が用いられる。これは、活
性型ＣＤＫの作用によりＡＴＰ−γＳ由来のチオリン酸
基が導入された基質蛋白質のチオリン酸の硫黄原子を標
識蛍光物質または標識酵素で標識する際に、基質蛋白質
内に元来存在するシステイン残基のチオール基が同時に
標識されて測定誤差が生じないようにするためである。

【００２７】元来分子内にシステイン残基を含む基質蛋
白質について、その残基をアラニンなどのチオール残基
を含まないアミノ酸残基に置換した基質蛋白質を製造す
る方法としては、ＰＣＲ法、部位点突然変異法による基
質蛋白質遺伝子の修飾およびその遺伝子の発現が挙げら
れる。具体的には、例えば、Ｒｂのようなシステイン残
基を含む基質蛋白質には、オリゴヌクレオチドプライマ
ーＲｂ−１（５’−ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＧ
ＣＡＧ ＴＡＴ ＧＣＴ ＴＣＣ−３’）、Ｒｂ−２
（５’ＧＣＴ ＧＴＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＣＡＴ ＣＴ
Ｇ ＡＴＴ ＴＡＴ−３’）、Ｒｂ−３（５’−ＡＴＧ
ＧＴＡ ＧＣＴ ＡＡＣ ＡＧＣ ＧＡＣ ＣＧＴ
ＧＴＧ−３’）およびＲｂ−７（５’−ＧＣＧ ＡＡＴ
ＴＣＡＡＴＣ ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＴＣ ＡＴＴ−
３’）を用いてクローニングすることにより得られる組
換えベクターから発現して得られる、システイン残基を
コードするヌクレオチドをアラニン残基をコードするヌ
クレオチドに置換した組換えＤＮＡを発現させてシステ
イン残基をアラニン残基に置換した基質蛋白質を製造す
る。

【００２８】（ｉｉ）該基質蛋白質の標識およびその標
識の量の測定 導入されたチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質また
は標識酵素を結合させることによって該基質蛋白質を標
識するには、チオリン酸基が導入された該基質蛋白質
０．１〜１ｍｇ／ｍｌを含むｐＨ７．５〜９．０、好ま
しくは８．５の溶液に、該基質蛋白質１当量に対して１
０〜１００当量の、チオール基と反応する官能基を持つ
標識蛍光物質または標識酵素を１０分〜２時間反応させ
ることにより行う。反応は、遊離のチオール、例えばβ
−ＭＥ（β−メルカプトエタノール）、ＤＴＴ（ジチオ
スレイトール）が添加されて停止される。

【００２９】標識蛍光物質で標識した該基質蛋白質の場
合、該標識蛍光物質からの蛍光量を測定し、予め作製し
たチオリン酸基を導入した既知量の基質蛋白質と蛍光量
との検量線に、得られた蛍光量をあてはめることにより
該基質蛋白質の量を算出する。その該基質蛋白質の量
を、試料中に含まれる活性型ＣＤＫの活性値とする。ま
たは、標識酵素で標識した該基質蛋白質の場合、該基質
蛋白質を標識した標識酵素に、該標識酵素との反応によ
って光学的に検出可能な物質が生じるような基質を作用
させて、生じた生成物の量を光学的に測定し、前記と同
様に予め作製した検量線に得られた測定値をあてはめる
ことにより試料中に含まれる活性型ＣＤＫの活性値を算
出する。ここで、光学的に検出可能な物質とは、蛍光や
吸光度等を測定することによってその存在を検出できる
ような物質をいう。

【００３０】チオリン酸基の硫黄原子に結合可能な標識
蛍光物質としては、フルオレセイン、クマリン、エオシ
ン、フェナントロリン、ピレン、ローダミンなどが挙げ
られる。そのうち、フルオレセインが好ましい。これら
の標識蛍光物質によりチオリン酸基の硫黄原子と結合す
るためには、チオール基と反応する官能基を持つ標識蛍
光物質、例えばアルキルハライド、マレイミド、アジリ
ジン部位を有する標識蛍光物質が使用される。

【００３１】チオール基と反応する官能基を持つ標識蛍
光物質としては、ヨードアセチル−ＦＩＴＣ（フルオレ
セインイソチオシアネート）、５−（ブロモメチル）フ
ルオレセイン、フルオレセイン−５−マレイミド、５−
ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）、６
−ヨードアセトアミドフルオレセイン（６−ＩＡＦ）、
４−ブロモメチル−７−メトキシクマリン、エオシン−
５−ヨードアセトアミド、エオシン−５−マレイミド、
エオシン−５−ヨードアセトアミド、Ｎ−（１，１０−
フェナントロリン−５−イル）ブロモアセトアミド、１
−ピレンブチリルクロリド、Ｎ−（１−ピレンエチル）
ヨードアセトアミド、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨード
アセトアミド（ＰＭＩＡ アミド）、１−ピレンメチル
ヨードアセテート（ＰＭＩＡ エステル）、ローダミン
レッドＣ２マレンイミドなどが挙げられる。このうち、
ヨードアセチル−ＦＩＴＣが好ましい。

【００３２】また、チオリン酸基の硫黄原子と反応する
官能基を有するビオチン、例えばヨードアセチルビオチ
ンと反応させた後に、ビオチンとアビジンの親和性を利
用してアビジンに標識蛍光物質が共有結合した分子を反
応させて、チオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質を導
入してもよい。チオリン酸基の硫黄原子に標識酵素を導
入する方法としては、ヨードアセチルビオチンを硫黄原
子に導入し、その後該ビオチン分子に親和性を持つアビ
ジン分子に酵素が共有結合した分子を反応させることに
よる方法がある。酵素としては、βガラクトシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼが挙げられ
る。そのうち、ペルオキシダーゼが好ましい。

【００３３】標識された該基質蛋白質の量の測定方法と
しては、標識蛍光物質からの蛍光量を測定するか、また
は標識酵素で標識された該基質蛋白質に、該標識酵素と
の反応によって光学的に検出可能な物質が生じるような
基質を作用させて、生じた生成物を光学的に測定する方
法がある。具体的には、標識蛍光物質を用いる場合、標
識蛍光物質をある特定の波長で励起させて、蛍光画像解
析装置で検出する。照射する光の波長は標識蛍光物質に
よって異なるが、具体的には、標識蛍光物質が、フルオ
レセインであるときは４８８ｎｍの波長を照射して励起
させる。

【００３４】標識酵素を用いる場合、標識酵素で標識さ
れた該基質蛋白質に、該標識酵素との反応によって蛍光
物質が生じるような基質を加えて、該標識酵素との反応
を起こさせて蛍光物質を生成させ、その蛍光物質を特定
の蛍光波長で励起させて、蛍光を検出する。標識酵素と
の反応により蛍光物質を生成する物質には、標識酵素が
ペルオキシダーゼであるときには、蛍光物質を生成する
ＥＣＬ−プラスが挙げられる。なお、基質は使用する標
識酵素に合わせて適宜選択することができる。

【００３５】標識蛍光物質または反応によって生成した
蛍光物質の量を測定し、予め作製した検量線にあてはめ
て、活性型ＣＤＫの活性値が算出される。標識された基
質蛋白質の反応液は、該標識された基質蛋白質の標識蛍
光物質の蛍光量または、標識酵素との反応によって生じ
た発光物質の蛍光量が検量線範囲に入る程度まで希釈す
る必要がある。具体的には、例えば、反応液は、１００
〜５００倍に希釈する。希釈剤としては、ＴＢＳ（５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）、水、塩化ナトリウム水溶液等が用いられる。
塩化ナトリウム水溶液の場合は、塩化ナトリウムの濃度
が１００〜５００ｍＭの範囲が好ましい。希釈した場合
には、活性型ＣＤＫの活性を算出する際に希釈倍率も考
慮に入れる。得られた活性型ＣＤＫの活性値は、調製し
た試料の全蛋白質量から取り出した所定量の蛋白質中に
含まれる量である。

【００３６】予め作製する検量線は、チオール基を導入
した既知量の基質蛋白質を用いて作製されるのが望まし
いが、その他、標識蛍光物質または標識酵素との反応に
対する挙動が、チオール基を導入した基質蛋白質と同様
であることが知られているビオチン化アクチン等が代わ
りに用いられてもよい。その際、活性型ＣＤＫの活性値
は、ビオチン化アクチン等の量から換算される必要があ
る。また、本発明は、本発明の方法により測定したＣＤ
Ｋ活性の結果により、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、食道
癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮
癌、脳腫瘍、骨肉種または骨髄腫瘍のような癌疾患を診
断する方法を提供する。

【００３７】

【実施例】方法例１（活性型ＣＤＫ１の測定の場合；ヒ
ストンＨ１を基質とし、ペルオキシダーゼ標識を使った
例） 第１工程：０．１ｗ／ｖ％ＮＰ４０（界面活性剤ノニデ
ットＰ−４０）、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．
４， ５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウ
ム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムおよび１００
μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテール（シグマ、
ＳＩＧＭＡ社）を含む溶解緩衝液中で、１ｘ１０７細胞
／５ｍｌの溶解緩衝液という条件下にＨｅＬａ（子宮頚
部癌細胞）細胞を、氷浴中で２３Ｇ針をつけた５ｍｌの
シリンジで１０回吸引排出を繰り返し、細胞溶解液を調
製した。不溶物を１５０００ｒｐｍで５分間４℃で遠心
除去した。上澄み中に含まれる全蛋白質量をＤＣ蛋白質
キット（バイオ−ラッド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用い
て、ウシＩｇＧを標準として測定した。

【００３８】第２工程：１．５ｍｌ用量のエッペンドル
フチューブに、５００μｌの溶解緩衝液中に溶解物の全
蛋白質量が１０μｇとなる量を加え、サンプルを調製し
た。サンプルに、１０μｌのポリクローナル抗ＣＤＫ抗
体（サンタクルツバイオテクノロジー、Ｓａｎｔａ Ｃ
ｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を加えた。そ
のサンプルに、６０μｌのプロテインＡをコートしたセ
ファロースビーズ（最終的には３０μｌの封入されたビ
ーズ）の１：１（セファロースビーズ：溶解緩衝液）ス
ラリーを加えた。サンプルを、１時間４℃で連続的に回
転させてインキュベートした。サンプル中のビーズを１
ｍｌの溶解緩衝液で２回洗浄した。そのビーズを、５０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４，１０ｍＭの塩化マ
グネシウム（ＭｇＣｌ₂）、１ｍＭのＤＴＴを含むキナ
ーゼ緩衝液１ｍｌで１度洗浄した。ビーズを１５μｌの
キナーゼ緩衝液中に再懸濁させた。

【００３９】第３工程：懸濁液に、ヒストンＨ１溶液
（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４中の０．１ｍ
ｇ／ｍｌの溶液）を１０μｌ加えた。その懸濁液にＡＴ
Ｐ−γＳ溶液（１０ｍＭ水溶液）を１０μｌ加えた。懸
濁液を１０分間３７℃で連続的に振とうしながらインキ
ュベートした。１００００ｒｐｍで１０秒間ビーズを遠
心し、沈殿させた。３０μｌの上澄み液を集めた。上澄
み液に、ヨードアセチルビオチンとチオリン酸の結合反
応の至適条件がｐＨ８．５であるため、１５０ｍＭのト
リス−ＨＣｌおよびｐＨ９．２，５ｍＭのＥＤＴＡを含
む結合用緩衝液２５μｌを加えた。上澄み液に、４０ｍ
Ｍ ＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ
社）溶液（２０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０）を２０
μｌ加えた。上澄み液を９０分間暗所室温でインキュベ
ートした。ヨードアセチルビオチンとの反応を、７．５
μｌのβ−ＭＥ（β−メルカプトエタノール）を加えて
停止させた。反応液を、ＴＢＳ（５０ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で希
釈した。

【００４０】第４工程 希釈した反応液の５０μｌをスロットブロッター（Ｓｌ
ｏｔ Ｂｌｏｔｔｅｒ）を用いてＰＶＤＦメンブレン上
に添加し吸引した。メンブレンを５０ｍｌのＴＢＳ−Ｔ
（０．０５ｗ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液）
で１度洗浄した。メンブレンがアビジン−ペルオキシダ
ーゼと反応しないように、予めメンブレンの疎水性部分
をＢＳＡによりブロックする。具体的には、メンブレン
をＴＢＳ−Ｔ中で３ｗ／ｖ％のＢＳＡ（ウシ血清アルブ
ミン、Ｂｏｖｉｎｅ ＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ）で３
０分間室温でブロックした。メンブレンをアビジン−ペ
ルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ社）（ＴＢＳ−Ｔで５０
０００倍希釈）で１０分間室温で反応させた。メンブレ
ンを５０ｍｌのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＥＣＬ−プ
ラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）をメンブレンに５分間反応
させた；溶液の調製は、製造者の指示に従った。メンブ
レンを２００ｍｌの水で洗浄して反応を停止させた。Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）
で蛍光のバンドを視覚化し、定量した。

【００４１】方法例２（活性型ＣＤＫ１の測定の場合；
ヒストンＨ１を基質とし、ＦＩＴＣ標識を使った例） 上記第４工程において、アビジン−ペルオキシダーゼの
代わりにアビジン−ＦＩＴＣを使用し、ＥＣＬ−プラス
を反応させない以外は方法例１と同様に操作した。

【００４２】方法例３（活性型ＣＤＫ２の測定の場合；
ヒストンＨ１を基質とし、ＦＩＴＣ標識を使った例） 第１工程 エッペンドルフチューブ（容量１．５ｍｌ）中に１０ｍ
ｇから５０ｍｇの湿重量を持つ組織を入れ、方法例１の
第１工程中に記載の溶解緩衝液を８００μｌ加え、ペッ
スルで磨り潰した。この際のペッスルは、押し付け力５
ｋｇで９０度の回転を左右に行う基礎運動を合計１０回
繰り返した。ガラスウール（重量約０．１ｇ）を充填
し、先端に０．４５μｍポアサイズを持つディスクフィ
ルター（ミリポア社）を装備した注射筒（容量１ｍｌ）
に、得られた粗可溶化液を通すことより、不溶物及び脂
質を取り除いた細胞可溶化液を調製した。上澄み中に含
まれる全蛋白質量をＤＣ蛋白質キット（バイオ−ラッ
ド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、ウシＩｇＧを標準と
して測定した。

【００４３】第２工程 方法例１の第２工程と同様に操作した。

【００４４】第３工程 懸濁液に、ヒストンＨ１溶液（５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．４中の０．１ｍｇ／ｍｌの溶液）を１０μ
ｌ加えた。その懸濁液にＡＴＰ−γＳ溶液（１０ｍＭ水
溶液）を１０μｌ加えた。懸濁液を９０分間３７℃で連
続的に振盪させながらインキュベートした。１０００ｒ
ｐｍで１０秒間ビーズを遠心し、沈殿させ、３０μｌの
上澄み液を集めた。上澄み液１８μｌに１５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む結合
緩衝液１５μｌを加えた。さらに、５ｍＭ ヨードアセ
チルフルオロセイン（Ｐｉｅｒｃｅ社）溶液（５０ｍＭ
のリン酸緩衝液ｐＨ６．０及び５０％ジメチルスルフォ
オキシド）を１０μｌ加えた後、９０分間暗所室温でイ
ンキュベートした。ヨードアセトアミドフルオロセイン
の反応を４３μｌのβ―ＭＥを加えて停止させた。反応
液を、ＴＢＳ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、
１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で５倍から１０倍に希釈し
た。

【００４５】第４工程 希釈した反応液の５０μｌをスロットブロッターを用い
てＰＶＤＦメンブレン上に添加し吸引した。メンブレン
を５０ｍＭのＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ｗ／ｖ％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＴＢＳ溶液）で振盪しながら１０分間３回
洗浄した。その後、メンブレンを２００ｍｌの水で洗浄
し、乾燥させた。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒ（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社）で蛍光のバンドを視覚化し、イメージ
アナライザーにより数値化した。

【００４６】方法例４（活性型ＣＤＫ２の測定の場合；
ヒストンＨ１を基質とし、ＦＩＴＣ標識を使った例） 第１工程 Ｋ５６２細胞株を用い、方法例１の第１工程を同様に操
作した。 第２工程 ５００μｌの溶解緩衝液中、Ｋ５６２細胞可溶化物の全
蛋白量が、０、２５、５０、１００および２００μｇ／
ｍｌの濃度系列の試料を調製し、５ｍｌ容量のエッペン
ドルフチューブに注入した。それぞれのサンプルに、１
０μｌのポリクロナール抗ＣＤＫ２抗体（２００μｇ／
ｍｌ、サンタクルズバイオテクノロジー、Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を加えた。
そのサンプルに、４０μｌのプロテインＡをコートした
セファロースビーズの１：１（セファロースビーズ：溶
解緩衝液）スラリーを加えた。サンプルを、１時間４℃
で連続的に回転させてインキュベートした。サンプル中
のビーズを１ｍｌの溶解緩衝液で２回洗浄した。そのビ
ーズを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０
０ｍＭ 塩化ナトリウムで１回洗浄し、さらに、１００
ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。

【００４７】第３工程 ビーズに、ヒストンＨ１を含むリン酸化反応溶液（４０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１８ｍＭ塩化マグ
ネシウム、２ｍＭ ＡＴＰ−γＳ、６μｇ／ｔｅｓｔ
ヒストンＨ１）を５０μｌ加えた。懸濁液を９０分間３
７℃で連続的に振盪させながらインキュベートした。１
０００ｒｐｍで１０秒間ビーズを遠心し、沈殿させ、３
６μｌの上澄み液を集めた。上澄み液３６μｌに１５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２、５ｍＭ ＥＤＴＡを
含む結合緩衝液３０μｌを加えた。さらに、３５ｍＭ
ＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社）溶
液（５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０）を２０μｌ加
えた後、９０分間暗所室温でインキュベートした。その
後、等量（８６μｌ）の０．５％ β―ＭＥを加え、反
応を停止した。反応液を、ＴＢＳ（５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで５倍か
ら１０倍に希釈した。

【００４８】第４工程 希釈した反応液の５０μｌをスロットブロッターを用い
てＰＶＤＦメンブレン上に添加し吸引した。得られたメ
ンブレンを１ｗ／ｖ％のＢＳＡで３０分間ブロックし、
ＴＢＳで５分間洗浄した。次にアビジン−ＦＩＴＣ（Ｐ
ｉｅｒｃｅ社）（ＴＢＳで５００倍希釈）溶液中で３７
℃、６０分間反応した。反応後、メンブレンをＴＢＳで
３回、水で１回洗浄し、乾燥させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で蛍光のバンド
を視覚化し、測定した。

【００４９】製造例１（Ｒｂ（網膜芽細胞腫蛋白質）の
システイン残基をアラニン残基で置換した蛋白質をコー
ドする組換えベクターおよびそのベクターを発現したタ
ンパクの製造） （１）発現プラスミドの構築 まず、ヒトＲｂをコードするｃＤＮＡをヒト胎盤のｃＤ
ＮＡライブラリー（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥ
ＮＥ）社）よりクローニングした。Ｃｙｓ８５３をＡｌ
ａに単一変異させた、ヒトのＲｂのＣ−末端部分（Ｌｅ
ｕ７６９からＬｙｓ９２８）を発現するプラスミドを構
築するためには、２工程のＰＣＲを、ヒトＲｂ ｃＤＮ
Ａの全長を含むｐＪ３Ωベクターで、オリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて行った。

【００５０】１．第１のＰＣＲ まず、ヒトＲｂタンパクのＬｅｕ７６９からＡｓｐ９２
１に相当する領域を増幅し、同時に、Ｃｙｓ８５３をＡ
ｌａに変換するために、４種類のプライマーを用いて２
段階ＰＣＲを行った。用いたプライマーは、両端のプラ
イマーＲｂ−１（５’−ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴ
Ｇ ＣＡＧ ＴＡＴ ＧＣＴ ＴＣＣ−３’、ＢａｍＨ
Ｉ部位（下線部）を導入）およびＲｂ−７（５’−ＧＣ
Ｇ ＡＡＴ ＴＣＡ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＴＣ
ＡＴＴ−３’、ＥｃｏＲＩ部位（下線部）を導入）に
加えて、８５３位をＡｌａコドン（ＡＧＣ）に変換した
プライマーＲｂ−２（５’−ＧＣＴ ＧＴＴ ＡＧＣ
ＴＡＣ ＣＡＴ ＣＴＧＡＴＴ ＴＡＴ−３’、点変異
コドンを下線で示した）とその相補的プライマーＲｂ−
３ （５’−ＡＴＧ ＧＴＡ ＧＣＴ ＡＡＣ ＡＧＣ
ＧＡＣ ＣＧＴＧＴＧ−３’）である。ヒトＲｂ全長
ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＲｂ−１／Ｒ
ｂ−２とプライマーセットＲｂ−３／Ｒｂ−７によりそ
れぞれ以下の反応条件下にＰＣＲを行ってＰＣＲフラグ
メント１および２をそれぞれ得た。ＰＣＲフラグメント
１および２は、プライマーＲｂ−２とＲｂ−３に対応す
る領域で相補的である。

【００５１】反応液組成(ヌクレオチド2305-2565に相当するフラグメント１用) pJ3 W-Rb 250 ng Taq DNA ポリメラーゼ (TaKaRa Ex Taq, 宝酒造) 0.03 U TaKaRa Ex Taq 用緩衝液(宝酒造) MgCl₂ (宝酒造) 2 mM dNTPs (宝酒造) 250 mM プライマー Rb-1 1 mM プライマー Rb-2 1 mM 合計 50mL

【００５２】反応液組成(ヌクレオチド2551-2763に相当するフラグメント２用) pJ3 W-Rb 250 ng Taq DNA ポリメラーゼ (TaKaRa Ex Taq, 宝酒造) 0.03 U TaKaRa Ex Taq用緩衝液 (宝酒造) MgCl₂ (宝酒造) 2 mM dNTPs (宝酒造) 250 mM プライマー Rb-3 1 mM プライマー Rb-7 1 mM 合計 50mL

【００５３】反応温度 95℃, 5 分、94℃, 30秒、55℃, 1分、72℃, 1分(15 サ
イクル)、72℃, 2分。

【００５４】２．突出部の処理 ＰＣＲ産物のＡ−３’突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を以
下の反応条件を用いてクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理
した。反応液組成 ＰＣＲフラグメント１および２ クレノウフラグメント(宝酒造) 0.07 U クレノウフラグメント用緩衝液(宝酒造) dNTPs (宝酒造) 250 mM反応温度 37℃, 1時間

【００５５】３．第２のＰＣＲ それらのＰＣＲ産物の混合物を鋳型として、両端のプラ
イマーセットＲｂ−１／Ｒｂ−７により以下の反応条件
下にＰＣＲを行い、Ｃｙｓ８５３Ａｌａを持つＬｅｕ７
６９からＡｓｐ９２１に相当する４７０ｂｐのＤＮＡ断
片を増幅した。反応液組成 クレノウ処理されたPCR フラグメント1および2 Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa Ex Taq, 宝酒造) 0.03 U TaKaRa Ex Taq用緩衝液 (宝酒造) MgCl₂ (宝酒造) 2 mM dNTPs (宝酒造) 250 mM プライマーRb-1 1 mM プライマーRb-7 1 mM 合計 50 mL 反応温度 95℃, 5分、94℃, 30秒、55℃, 1分、72℃, 1分(15サイ
クル)、72℃, 2分。

【００５６】４．ｐＭｅｌＢａｃＡへのクローニング Ｎ末端に分泌シグナルを付加したＲｂタンパクを発現す
るために、前工程３．で増幅された４７０ｂｐのＤＮＡ
フラグメントをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化した
後、ｐＭｅｌＢａｃＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＢ
ａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位に挿入した。得られたプ
ラスミドを、ｐＭｅｌＢａｃＡ−Ｒｂとした。

【００５７】５．ＰＣＲ 得られたプラスミドを鋳型として、プライマーＲｂ−９
（５’−ＧＣＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＴＧＡ ＡＡＴ Ｔ
ＣＴ ＴＡＧ ＴＣＡ−３’、ＥｃｏＲＩ部位（下線
部）を導入）とＲｂ−５（５’−ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＡ
Ｇ ＴＣＡ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＴＣ ＡＴＴ
−３’、ＸｈｏＩ部位（下線部）を導入）を用いて以下
の反応条件下にＰＣＲを行い、分泌シグナルを付加した
５４０ｂｐＤＮＡ断片を増幅した。反応液組成 pMelBacA-Rb 250 ng Taq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa Ex Taq, 宝酒造) 0.03 U TaKaRa Ex Taq用緩衝液 (宝酒造) MgCl₂ (宝酒造) 2 mM dNTPs (宝酒造) 250 mM プライマーRb-9 1 mM プライマーRb-5 1 mM 合計 50 mL 反応温度 94℃, 5分、94℃, 30 秒、55℃, 1分、72℃, 1分(25 サ
イクル)、72℃, 2分。

【００５８】６．ｐＦａｓｔＢａｃ１へのクローニング 前工程５．で増幅された、分泌シグナルを含む５４０ｂ
ｐのＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ
消化した後、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）
のＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位に挿入した。

【００５９】（２）Bac-To-Bac Baculovirus 発現シス
テム(Lifetech社)による組み換えウイルスの単離 添付プロトコールに従い、前工程６で得られた発現プラ
スミドを基に、組み換えウイルスを単離した。

【００６０】（３）発現 前工程（２）で調製した組み換えウイルス液を、ＭＯＩ
＝１０の条件で昆虫細胞 （Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録
商標） ｃｅｌｌ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に感染
させ、Ｃｙｓ８５３Ａｌａを含むＬｅｕ７６９からＡｓ
ｐ９２１に相当する領域を発現させた。発現タンパクが
培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ４０５，ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ社）に分泌されることを、抗ヒトＲｂポリクロー
ナル抗体［Ｒｂ（Ｃ−１５），Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ
社］を用いたウエスタン・ブロット法により確認し、感
染５日後に培地を収穫した。

【００６１】（４）発現タンパクの精製 全工程（３）で得たＲｂ組み換えタンパクを含む培地
を、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により
５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に緩衝液交換し
た後、０〜１Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を用いるＣＭ−５
ｐｗカラム（ＴＯＳＯＨ社）によりタンパクを溶出し
た。約０．３Ｍ ＮａＣｌでＲｂ組み換えタンパクが溶
出されることを、抗ヒトＲｂポリクローナル抗体［Ｒｂ
（Ｃ−１５），Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社］を用いたウエ
スタン・ブロット法により確認した。得られた蛋白質
は、ＣＤＫ４またはＣＤＫ６の測定を行う場合に、方法
１において第３工程の基質蛋白質であるヒストンＨ１の
代わりに用いる。

【００６２】方法例5（活性型ＣＤＫ４の測定の場合；
製造例１で製造した組換えヒトＲｂを基質とし、ＦＩＴ
Ｃ標識を使った例） 第１工程 方法例３の第１工程と同様に操作した。 第２工程 １．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに、５００μ
ｌの溶解緩衝液中にＫ５６２細胞可溶化物の全蛋白量が
０、５０、１００、１２５、２５０μｇとなる量を加
え、サンプルを調製した。それぞれのサンプルに、１０
μｌのポリクロナール抗ＣＤＫ４抗体（２００μｇ／ｍ
ｌ、サンタクルズバイオテクノロジー、Ｓａｎｔａ Ｃ
ｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を加えた。そ
のサンプルに、４０μｌのプロテインＡをコートしたセ
ファロースビーズの１：１（セファロースビーズ：溶解
緩衝液）スラリーを加えた。サンプルを、１時間４℃で
連続的に回転させてインキュベートした。サンプル中の
ビーズを１ｍｌの溶解緩衝液で２回洗浄した。そのビー
ズを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００
ｍＭ 塩化ナトリウムで１回洗浄し、さらに、１００ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。

【００６３】第３工程 ビーズに、製造例１で製造した組換えヒトＲｂ蛋白質を
含むリン酸化反応溶液（４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．４、２００ｍＭ塩化マグネシウム、３．３ｍＭ
ＡＴＰ−γＳ、２０μｌ組換えヒトＲｂ蛋白質溶液：５
０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０）を５０μｌ加え
た。懸濁液を９０分間３７℃で連続的に振盪させながら
インキュベートした。１０００ｒｐｍで１０秒間ビーズ
を遠心し、沈殿させ、３６μｌの上澄み液を集めた。上
澄み液３６μｌに１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．
２、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む結合緩衝液３０μｌを加え
た。さらに、５０ｍＭ ＰＥＯ−ヨードアセチルビオチ
ン（Ｐｉｅｒｃｅ社）溶液（５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐ
Ｈ６．０）を２０μｌ加えた後、９０分間暗所室温でイ
ンキュベートした。その後、等量（８６μｌ）のＳＤＳ
−サンプルローディング緩衝液（０．１２５Ｍトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ，１０％β―ＭＥ，２
５％グリセリン、ブロモフェノールブルー）を加え、５
分間１００℃で処理した。

【００６４】第４工程 第３工程で準備したサンプルを２０μｌ／レーンの条件
でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（第一化学薬品、プレキャ
ストゲル、４−２０％グラジエント、１０ｍｍ×１０ｍ
ｍ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件は、第一化学薬品の指示
に従った（６０ｍＡ、４０分）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、
ゲル内に展開された蛋白質は電気的にＰＶＤＦメンブレ
ンに転写された（１０Ｖ、３０分、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂ
ｌｏｔ法）。得られたメンブレンを４ｗ／ｖ％のＢＳＡ
で３０分間ブロックし、ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。
次にアビジンＦＩＴＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社）（ＴＢＳ−Ｔ
で１０００倍希釈）溶液中で３７℃、３０分間反応し
た。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで２回、水で１回
洗浄し、乾燥させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅ
ｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で蛍光のバンドを視覚化し、測
定した。

【００６５】活性型ＣＤＫ１活性の測定 １．ビオチン化アクチン（ＢＡ）を標準物質とした検量
線作成 ＢＡ濃度０〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度系列の試料を調
製し、各５０μｌをスロットに注入する。スロット中の
試料は方法例１の第４工程の処理を行う。ＢＡはペルオ
キシダーゼで標識されているので第４工程においてＥＣ
Ｌ−プラス（蛍光基質）から蛍光物質を生成する。各Ｂ
Ａ濃度の試料の蛍光物質の蛍光量を測定し、その蛍光量
をカウント（ＣＮＴ）値で表示する。ＢＡ濃度を横軸
に、ＣＮＴ値を縦軸にとり、データをプロットし、方法
例１の反応条件下での検量線を作成する。得られた検量
線は図１に示す。

【００６６】同様に、方法例２についても、スロット中
の試料に方法例１の第４工程の処理を行い、上述のよう
にして方法例２の反応条件下での検量線を作成する。得
られた検量線は図２に示す。

【００６７】２．活性型ＣＤＫ１の活性値の算出 方法例１および２のそれぞれについて、抗ＣＤＫ抗体を
添加しない以外は方法例１に従って処理した試料をブラ
ンク試料として調製する。そのブランク試料の蛍光量を
測定し、得られたＣＮＴ値をそれぞれの方法例に対応す
る上記で作成した検量線を用いてＢＡ濃度に換算する。
得られたＢＡ濃度を以下の式に代入して活性型ＣＤＫ１
の活性値を算出する。 式１：｛（試料のＢＡ換算濃度）−（ブランク試料のＢ
Ａ換算濃度）｝×（試料の希釈倍率）＝（活性型ＣＤＫ
１の活性値）

【００６８】なお、作成した検量線がシグモイド曲線で
はない、直線であるとき（例えば、方法例２）は、（試
料のＣＮＴ値）−（ブランク試料のＣＮＴ値）を算出
し、その差を検量線を用いてＢＡ濃度に換算し、得られ
たＢＡ濃度を以下の式に代入して活性型ＣＤＫの活性値
を算出してもよい。 式２：（試料とブランク試料のＣＮＴ値の差のＢＡ換算
濃度）×（試料の希釈倍率）＝（活性型ＣＤＫ１の活性
値）

【００６９】実施例１（方法例１に従い処理した試料の
活性型ＣＤＫ１の活性値の測定） 方法例１に従い抗ＣＤＫ１抗体を用い希釈倍率４５０倍
で調製した試料の蛍光量を、前述のようにして測定し
た。試料１は増殖期にあるＨｅＬａ細胞を、試料２は増
殖停止期にあるＨｅＬａ細胞を用いて調製した。検量線
が図１に示されたようにシグモイド曲線であったので式
１を用いて、すなわちブランク試料を上述のように作成
し、その蛍光量を測定して、先に測定した試料の蛍光量
から活性型ＣＤＫ１の活性値を算出した。その結果を表
２に示す。

【００７０】

【表２】

【００７１】実施例２（方法例２に従い処理した試料の
活性型ＣＤＫ１の活性値測定） 方法例２に従い抗ＣＤＫ１抗体を用い希釈倍率１００倍
で調製した試料の蛍光量を、前述のようにして測定し
た。検量線は図２に示されたように直線であったので、
式１または式２のいずれを用いても、活性型ＣＤＫ１の
量は算出可能であることが判明した。

【００７２】活性型ＣＤＫ２活性の測定 実施例３（方法例３に従い処理した試料の活性型ＣＤＫ
２の活性測定） 試料３は、方法例３に従い抗ＣＤＫ２抗体を用いて調製
した。対照として、試料４を抗ＣＤＫ２抗体を用いずに
方法例３に従い調製し、試料５を第２工程中の抗ＣＤＫ
２抗体の代わりに非特異的ＩｇＧ抗体を添加する以外は
方法３に従い調製した。試料３〜５の蛍光バンドを図３
に示す。また、それらのバンドの蛍光量は、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で数値化
した。得られた蛍光量は、表３に示す。

【００７３】

【表３】

【００７４】上記の結果から、非特異的ＩｇＧ抗体を抗
ＣＤＫ２抗体の代わりに添加した場合（試料５）に非特
異的反応が見られず、従って活性型ＣＤＫ２の活性値が
本発明の方法により測定可能であることが示された。

【００７５】実施例４（方法例４に従い処理した試料の
活性型ＣＤＫ２の活性値測定） １．Ｋ５６２細胞株（前骨髄性白血病）を標準物質とし
た検量線作成 方法例４に従い作成した０〜２００μｇ／ｍｌの濃度系
列の試料から得られた蛍光量を測定し、その蛍光量をＣ
ＮＴ値で表示した。Ｋ５６２細胞株の濃度を横軸に、Ｃ
ＮＴ値を縦軸にとり、データをプロットし、検量線を作
成した。得られた検量線は、図４に示す。

【００７６】２．活性型ＣＤＫ２の活性値の算出 Ｋ５６２細胞可溶化物の試料の代わりに未知試料を用い
る以外は方法例４に従って、検体として調製する。その
検体の蛍光量を測定し、得られたＣＮＴ値を上記で作成
した検量線を用いて、Ｋ５６２細胞可溶化物のＣＤＫ２
活性値に換算して活性値を算出する。

【００７７】活性型ＣＤＫ４活性の測定 実施例５（方法例５に従い処理した試料の活性型ＣＤＫ
４の活性測定） 試料６は、方法例５に従い抗ＣＤＫ４抗体を用いて調製
した。対照として、試料７を抗ＣＤＫ４抗体を用いない
以外は方法例５に従い調製した。試料６および７の蛍光
バンドを図５に示す。

【００７８】ＣＤＫ特異的阻害剤を用いて活性型ＣＤＫ
２測定値がＣＤＫ２の活性に特異的であることを証明す
る例 実施例６（活性型ＣＤＫ２測定の場合） 第１工程：Ｋ５６２細胞株（前骨髄性白血病）を用い、
方法例１の第１工程を同様に操作した。 第２工程：１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブ
に、５００μｌの溶解緩衝液中にＫ５６２細胞可溶化物
の全蛋白量が２５０μｇとなる量を加え、サンプルを調
整した。サンプルに、１０μｌのポリクロナール抗ＣＤ
Ｋ２抗体（２００μｇ／ｍｌ、サンタクルズバイオテク
ノロジー、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ社）を加えた。そのサンプルに、４０μｌのプ
ロテインＡをコートしたセファロースビーズの１：１
（セファロースビーズ：溶解緩衝液）スラリーを加え
た。サンプルを、１時間４℃で連続的に回転させてイン
キュベートした。サンプル中のビーズを１ｍｌの溶解緩
衝液で２回洗浄した。そのビーズを、１００ｍＭトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ 塩化ナトリウムで
１回洗浄し、さらに、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．４で１回洗浄した。

【００７９】第３工程 ＣＤＫ阻害剤として、ＣＤＫ１および２活性の阻害剤で
あるブチロラクトン（Ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ
Ｉ、カールバイオキム、Calbiochem社）ならびにＣＤＫ
２の阻害を含む広い阻害スペクトラムを持つスタウロス
ポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、カールバイオキ
ム、Calbiochem社）を用いた。ビーズに、ヒストンＨ１
及びＣＤＫ阻害剤（終濃度０，１、１０、３０，１００
μＭのブチロラクトン又は終濃度０，０．３、１、１
０，３０μＭのスタウロスポリン）を含むリン酸化反応
溶液（４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１８ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、２ｍＭ ＡＴＰ−γＳ、６μｇ／
テストのヒストンＨ１）を５０μｌ加えた。懸濁液を９
０分間３７℃で連続的に振盪させながらインキュベート
した。１０００ｒｐｍで１０秒間ビーズを遠心し、沈殿
させ、３６μｌの上澄み液を集めた。上澄み液３６μｌ
に１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む結合緩衝液３０μｌを加えた。さらに、５
０ｍＭ ＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン（Ｐｉｅｒｃ
ｅ社）溶液（５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０）を２
０μｌ加えた後、９０分間暗所室温でインキュベートし
た。その後、等量（８６μｌ）のＳＤＳ−サンプルロー
ディング緩衝液（０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
６．８、４％ ＳＤＳ， １０％ β―ＭＥ， ２５％
グリセリン、ブロモフェノールブルー）を加え、５分間
１００℃で処理した。

【００８０】第４工程 第３工程で準備したサンプルを２０μｌ／レーンの条件
でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（第一化学薬品、プレキャ
ストゲル、４−２０％グラジエント、１０ｍｍｘ １０
ｍｍ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件は、第一化学薬品の指
示に従った（６０ｍＡ、４０分）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
後、ゲル内に展開された蛋白質は電気的にＰＶＤＦメン
ブレンに転写された（１０Ｖ， ３０分、Ｗｅｓｔｅｒ
ｎ Ｂｌｏｔ法）。得られたメンブレンを４ｗ／ｖ％の
ＢＳＡで３０分間ブロックし、ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄
した。次にアビジンＦＩＴＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社）（ＴＢ
Ｓ−Ｔで１０００倍希釈）溶液中で３７℃、３０分間反
応した。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで２回、Ｈ２
Ｏで１回洗浄し、乾燥させた。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍ
ａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で蛍光のバンドを視覚化
し、測定した。

【００８１】得られた視覚化された蛍光バンドをイメー
ジアナライザーにより数値化し、グラフ化したものを図
６に示す。ｎｏｎｅはＣＤＫ阻害剤を添加しないで上記
工程を実施したもの、ＤＭＳＯはＣＤＫ阻害剤の溶剤
（ジメチルスルホキシド）のみを添加して上記工程を実
施したもの、ＩＰ（−）はＣＤＫ２抗体を入れずに上記
工程を実施したものである。図６に示すように、ＣＤＫ
２の活性は、両阻害剤の分量依存的に阻害された。この
結果より、測定された活性値はＣＤＫ２に特異的な値で
あることが証明された。

【００８２】

【発明の効果】上記から示されたように、本発明の方法
は、放射性物質を用いずに、細胞周期調節因子の活性を
鋭敏に高感度に測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において得られるビオチン化アクチン
の量（ｎｇ／スロット）と、蛍光量（カウント）との関
係を示す検量線である。

【図２】実施例２において得られるビオチン化アクチン
の量（ｎｇ／スロット）と、蛍光量（カウント）との関
係を示す検量線である。

【図３】実施例３において得られる蛍光バンドを示す図
である。

【図４】活性型ＣＤＫ２の測定のための検量線である。

【図５】実施例５において得られる蛍光バンドを示す図
である。

【図６】実施例６において得られるグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山崎 正稔 神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号 シスメックス株式会社内 (72)発明者 多田 幸代 神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号 シスメックス株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA12 BA10 CA04 DA02 EA04 HA08 4B063 QA01 QA07 QA19 QQ02 QQ27 QR02 QR77 QR79 QS05 QS25 QS33 QX02

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生体細胞からサイクリン依存性キナーゼ
   ／サイクリン複合体を測定するための試料を調製し、 該試料の存在下、サイクリン依存性キナーゼの基質とな
   る基質蛋白質とアデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホ
   スフェート）（ＡＴＰ−γＳ）を反応させて、該基質蛋
   白質のセリンまたはスレオニン残基にモノチオリン酸基
   を導入し、 導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質
   または標識酵素を結合させることによって該基質蛋白質
   を標識し、 該基質蛋白質を標識した標識蛍光物質からの蛍光量を測
   定するか、または該基質蛋白質を標識した標識酵素に、
   該標識酵素との反応によって光学的に検出可能な物質が
   生じるような基質を作用させて、生じた生成物の量を光
   学的に測定し、 予め作製した検量線をもとにサイクリン依存性キナーゼ
   の活性値を蛍光量または生じた生成物の量から算出する
   ことからなる細胞周期調節因子の活性の測定法。
2. 【請求項２】 該複合体のサイクリン依存性キナーゼ
   が、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６から
   選択される請求項１に記載の測定法。
3. 【請求項３】 該標識蛍光物質が、蛍光色素である請求
   項１に記載の測定法。
4. 【請求項４】 該蛍光色素が、ＦＩＴＣである請求項３
   に記載の測定法。
5. 【請求項５】 該標識酵素が、ペルオキシダーゼである
   請求項１に記載の測定法。
6. 【請求項６】 該複合体のサイクリン依存性キナーゼが
   ＣＤＫ１またはＣＤＫ２であり、該基質蛋白質がヒスト
   ンＨ１である請求項１〜５のいずれか一つに記載の測定
   法。
7. 【請求項７】 該複合体のサイクリン依存性キナーゼが
   ＣＤＫ４またはＣＤＫ６であり、該基質蛋白質が、シス
   テイン残基をアラニンに置換したＲｂである請求項１〜
   ５のいずれか一つに記載の測定法。
8. 【請求項８】 請求項１に記載の測定方法を行い、得ら
   れた結果に基づいて癌を診断する方法。
9. 【請求項９】 癌が、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、食道
   癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮
   癌、脳腫瘍、骨肉種または骨髄腫瘍である請求項８の方
   法。