JP2003516760A - プロテインキナーゼ調節 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、全長マウスプロテインキナーゼ A (PKA) の Lys76, Leu116, Val80及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法を提供する。疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼと相互作用ポリペプチドとの相互作用を阻害、促進又は模倣する化合物の能力が測定され、相互作用を阻害、促進又は模倣する化合物が選択される。そして、相互作用ポリペプチドは、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有するか、又は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有する。また、プロテインキナーゼは、PDK1、PKB、SKG又はp70 S6キナーゼであっても良い。
Description
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼ調節に関する。
【０００２】
細胞がインスリン又は成長因子により刺激されると、プロテインキナーゼB(PK
B) (Shepherd et al (1998) Biochem J 333: 471-479; Alessi & Downes (1998)
Biochem Biophys Acta 1436, 151-164), p70 S6キナーゼ(S6K) (Proud C G (19
95) Trends in Biochem Sci 21, 181-185; Pullen & Thomas (1998) FEBS LETT
410, 78-82)、血清及びグルココルチコイド誘導キナーゼ(SGK) (Kobayashi & Co
hen (1999) Biochem J 339, 319-328; Park et al (1999) EMBO J 18, 3024-303
3)、及びプロテインキナーゼC(PKC)イソ型(Mellor & Parker (1998) Biochem J,
332, 281-292)を含むプロテインキナーゼのAGCサブファミリーの特定のメンバ
ーの活性を誘導する第２のメッセンジャーであるPtdIns(3, 4, 5,) P3、及びPtd
Ins (3, 4) P2 (Leevers et al (1999) Curr Opin Biol 11, 219-225)が生成さ
れる。その際に、これらのキナーゼは、キーとなる(Shepherd et al (1998) Bio
chem J 333, 471-479; Alessi & Downes (1998) Biochem Biophys Acta 1436, 1
51-164 and Alessi & Cohen (1998) Curr Opin Genet Dev 8, 55-62に論じられ
ている)調節タンパク質をリン酸化することによりインスリン又は成長因子によ
る多くの作用を媒介する。
B) (Shepherd et al (1998) Biochem J 333: 471-479; Alessi & Downes (1998)
Biochem Biophys Acta 1436, 151-164), p70 S6キナーゼ(S6K) (Proud C G (19
95) Trends in Biochem Sci 21, 181-185; Pullen & Thomas (1998) FEBS LETT
410, 78-82)、血清及びグルココルチコイド誘導キナーゼ(SGK) (Kobayashi & Co
hen (1999) Biochem J 339, 319-328; Park et al (1999) EMBO J 18, 3024-303
3)、及びプロテインキナーゼC(PKC)イソ型(Mellor & Parker (1998) Biochem J,
332, 281-292)を含むプロテインキナーゼのAGCサブファミリーの特定のメンバ
ーの活性を誘導する第２のメッセンジャーであるPtdIns(3, 4, 5,) P3、及びPtd
Ins (3, 4) P2 (Leevers et al (1999) Curr Opin Biol 11, 219-225)が生成さ
れる。その際に、これらのキナーゼは、キーとなる(Shepherd et al (1998) Bio
chem J 333, 471-479; Alessi & Downes (1998) Biochem Biophys Acta 1436, 1
51-164 and Alessi & Cohen (1998) Curr Opin Genet Dev 8, 55-62に論じられ
ている)調節タンパク質をリン酸化することによりインスリン又は成長因子によ
る多くの作用を媒介する。
【０００３】
PtdIns (3, 4, 5) P3とPKBのPHドメインとの相互作用は、二つの残基、すなわ
ちThr308とSer473のリン酸化により活性化される細胞膜へのPKBの転移を引き起
こす。これらの両残基は、最大限の活性化のためにリン酸化される必要があり、
それらのインビボでのリン酸化は、阻害剤であるフォスファチジルイノシトール
(PI) 3-キナーゼ(Shepherd et al (1998); Alessi & Downes (1998))によって防
げられる。Thr308はキナーゼドメインの活性化ループに存在し、一方Ser473は、
触媒ドメインに対してＣ末端、すなわち、異なるAGCファミリーメンバー間で高
い相同性を表す一領域に位置されている。重要なことには、p70 S6K(Pearson et
al (1995) EMBO J 14, 5278-5287)、PKCイソ型(Mellor & Parker (1998))及びS
GK (Kobayashi & Cohen (1999); Park et al (1999))もまたPKBのThr308及びSer
473に等価な配列中に存在する残基を保持しており、これらのリン酸化は、イン
ビボでの上記キナーゼの活性化のために必要となっている。PKBのSer473、これ
に等価なp70 S6キナーゼ、PKC及びSGKの残基は、疎水性モチーフ、すなわちThr3
08を囲む配列とは異なるPhe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyr中に存在している。
ちThr308とSer473のリン酸化により活性化される細胞膜へのPKBの転移を引き起
こす。これらの両残基は、最大限の活性化のためにリン酸化される必要があり、
それらのインビボでのリン酸化は、阻害剤であるフォスファチジルイノシトール
(PI) 3-キナーゼ(Shepherd et al (1998); Alessi & Downes (1998))によって防
げられる。Thr308はキナーゼドメインの活性化ループに存在し、一方Ser473は、
触媒ドメインに対してＣ末端、すなわち、異なるAGCファミリーメンバー間で高
い相同性を表す一領域に位置されている。重要なことには、p70 S6K(Pearson et
al (1995) EMBO J 14, 5278-5287)、PKCイソ型(Mellor & Parker (1998))及びS
GK (Kobayashi & Cohen (1999); Park et al (1999))もまたPKBのThr308及びSer
473に等価な配列中に存在する残基を保持しており、これらのリン酸化は、イン
ビボでの上記キナーゼの活性化のために必要となっている。PKBのSer473、これ
に等価なp70 S6キナーゼ、PKC及びSGKの残基は、疎水性モチーフ、すなわちThr3
08を囲む配列とは異なるPhe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyr中に存在している。
【０００４】
3-ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ-1 (PDK1)と名付けられたプロ
テインキナーゼは、AGCサブファミリーメンバーの活性化において中心的な役割
を果たしている(Belham et al (1999) Current Biol 9, R93-R96; Peterson &
Schreiber (1999) Current Biol 9, R521-524)に論じられている)。PDK1は、PKB
をThr308においてリン酸化するとともに(Alessi et al (1997) Curr Biol 7, 2
61-269; Alessi et al (1997) Curr Biol 7, 776-789; Stokoe et al (1997
) Science 277, 567-570; Stephens et al (1998) Science 279, 710-714)、PKC
イソ型(LeGood et al (1998) Science, 281, 2042-2045; Chou et al (1998) Cu
rr Biol 8, 1069-1077; Dutil et al (1998) Curr Biol 8, 1366-1375)、p70
S6キナーゼ(Alessi et al (1998) Curr Biol 8, 69-81; Pullen et al (1998
) Science, 279, 707-710)及び SGK (Kobayashi & Cohen (1999); Park et al (
1999))に係る対等な残基をリン酸化する。環状のAMP依存性プロテインキナーゼ(
PKA)も、対等な残基(Thr197)において、PDK1によってリン酸化され、そして、こ
れはPKA活性にとって必要とされている(Chen et al (1998) Proc Natl Acad Sci
, USA 95, 9849-9854)。しかしながら、上記に論じられたプロテインキナーゼの
AGCサブファミリーの他のメンバーとは異なり、PKAはPKBのSer473に等価な残基
を保持していない。その代わりに、そのアミノ酸配列はSer473("PDK2"リン酸化
モチーフ)を囲む疎水性モチーフPhe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyrの第１の部分
に対応する配列Phe-Xaa-Xaa-PheCOOHで終了している。それにもかかわらず、こ
のPKAのC末端領域は、その突然変異又は欠失が活性を非常に弱めるように重要な
役割を果たしている(Etchebehere et al (1997) Eur J Biochem, 248, 820-826)
。
テインキナーゼは、AGCサブファミリーメンバーの活性化において中心的な役割
を果たしている(Belham et al (1999) Current Biol 9, R93-R96; Peterson &
Schreiber (1999) Current Biol 9, R521-524)に論じられている)。PDK1は、PKB
をThr308においてリン酸化するとともに(Alessi et al (1997) Curr Biol 7, 2
61-269; Alessi et al (1997) Curr Biol 7, 776-789; Stokoe et al (1997
) Science 277, 567-570; Stephens et al (1998) Science 279, 710-714)、PKC
イソ型(LeGood et al (1998) Science, 281, 2042-2045; Chou et al (1998) Cu
rr Biol 8, 1069-1077; Dutil et al (1998) Curr Biol 8, 1366-1375)、p70
S6キナーゼ(Alessi et al (1998) Curr Biol 8, 69-81; Pullen et al (1998
) Science, 279, 707-710)及び SGK (Kobayashi & Cohen (1999); Park et al (
1999))に係る対等な残基をリン酸化する。環状のAMP依存性プロテインキナーゼ(
PKA)も、対等な残基(Thr197)において、PDK1によってリン酸化され、そして、こ
れはPKA活性にとって必要とされている(Chen et al (1998) Proc Natl Acad Sci
, USA 95, 9849-9854)。しかしながら、上記に論じられたプロテインキナーゼの
AGCサブファミリーの他のメンバーとは異なり、PKAはPKBのSer473に等価な残基
を保持していない。その代わりに、そのアミノ酸配列はSer473("PDK2"リン酸化
モチーフ)を囲む疎水性モチーフPhe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyrの第１の部分
に対応する配列Phe-Xaa-Xaa-PheCOOHで終了している。それにもかかわらず、こ
のPKAのC末端領域は、その突然変異又は欠失が活性を非常に弱めるように重要な
役割を果たしている(Etchebehere et al (1997) Eur J Biochem, 248, 820-826)
。
【０００５】
近年、我々は、PDK1のキナーゼドメインがPDK1相互作用断片（Intracting Fra
gment）(PIF)と名付けられるプロテインキナーゼ C関連キナーゼ-2 (PRK2)の一
領域と相互作用することを発見した。これは、PKBをThr308においてリン酸化す
る形態から、PKBをThr308及びSer473の両方にてリン酸化する形態へ、PDK1を変
換する(Balendran et al (1999) Current Biology 9, 393-404)。PIFは、Ser473
に等価な残基がAspである以外は、PKBの中で発見されたものと似ている疎水性モ
チーフ(Phe-Xaa-Xaa-Phe-Asp-Tyr)を含んでいる。このモチーフの中に保存され
ている芳香族残基のいずれかの突然変異、又はAsp残基のAla若しくはSerのいず
れかへの突然変異は、それらの残基を介在してPIFがPDK1と結合することを示す
、PIFとPDK1との相互作用を非常に弱めることになる(Balendran et al (1999)。
gment）(PIF)と名付けられるプロテインキナーゼ C関連キナーゼ-2 (PRK2)の一
領域と相互作用することを発見した。これは、PKBをThr308においてリン酸化す
る形態から、PKBをThr308及びSer473の両方にてリン酸化する形態へ、PDK1を変
換する(Balendran et al (1999) Current Biology 9, 393-404)。PIFは、Ser473
に等価な残基がAspである以外は、PKBの中で発見されたものと似ている疎水性モ
チーフ(Phe-Xaa-Xaa-Phe-Asp-Tyr)を含んでいる。このモチーフの中に保存され
ている芳香族残基のいずれかの突然変異、又はAsp残基のAla若しくはSerのいず
れかへの突然変異は、それらの残基を介在してPIFがPDK1と結合することを示す
、PIFとPDK1との相互作用を非常に弱めることになる(Balendran et al (1999)。
【０００６】
p70 S6キナーゼ(p70 S6K又はS6K)は、インスリン又は成長因子によって活性化
され、40Sリボソームタンパク質S6(Proud (1995). Trends in Bioch. Sci 21, 1
81-185)のリン酸化を媒介している。これは、5'転写開始部位(Lane et al (1993
) Nature 363,170-172)にポリピリミヂン区域（polypyrimidine tract）を含ん
でいるmRNA分子の効率的な翻訳を可能としている。p70 S6Kは、さらに分裂周期
のG1期を経ての進行（progression）を可能とする未知のタンパク質をリン酸化
する(Jefferies et al (1997) EMBO J. 16, 3693-3704)。
され、40Sリボソームタンパク質S6(Proud (1995). Trends in Bioch. Sci 21, 1
81-185)のリン酸化を媒介している。これは、5'転写開始部位(Lane et al (1993
) Nature 363,170-172)にポリピリミヂン区域（polypyrimidine tract）を含ん
でいるmRNA分子の効率的な翻訳を可能としている。p70 S6Kは、さらに分裂周期
のG1期を経ての進行（progression）を可能とする未知のタンパク質をリン酸化
する(Jefferies et al (1997) EMBO J. 16, 3693-3704)。
【０００７】
p70 S6Kは、インスリン及び成長因子によって活性化され、PI3-キナーゼ依存
性経路を通り、そしてこれらのアゴニスト（agonists）に反応して少なくとも７
つのSer/Thr残基の位置においてリン酸化される。これらの残基のうちの２つの
リン酸化、すなわち、α-イソ型のより長スプライス突然変異体（the longer sp
lice variant）におけるThr252及びThr412(短スプライスの突然変異体(the shor
ter splice variant)におけるThr229及びThr389)のリン酸化は、p70 S6Kの活性
化に最も重要な貢献をしていると思われる(Pearson et al (1995) EMBO J. 14,
5278-5287; Pullen & Thomas (1998) FEBS LETT.410, 78-82; Weng et al (1998
) J. Biol. Chem.273, 16621-16629)。Thr252単独のリン酸化、又はThr412のリ
ン酸化を模倣するThr412からグルタミン酸への突然変異は、p70 S6Kの小さな活
性化に帰着している。対照的に、両方の残基のリン酸化、又はp70 S6KのT412E突
然変異突然変異体の中におけるThr252のリン酸化は、発現されたp70 S6Kの大き
な活性化に帰着しており、すなわちThr252及びThr412のリン酸化は、p70 S6Kの
相乗作用を有する（synergistic）活性化を導くことを示している(Weng et al (
1998) J. Biol. Chem.273, 16621-16629; Alessi et al (1998) Curr. Biol. 8,
69-81)。
性経路を通り、そしてこれらのアゴニスト（agonists）に反応して少なくとも７
つのSer/Thr残基の位置においてリン酸化される。これらの残基のうちの２つの
リン酸化、すなわち、α-イソ型のより長スプライス突然変異体（the longer sp
lice variant）におけるThr252及びThr412(短スプライスの突然変異体(the shor
ter splice variant)におけるThr229及びThr389)のリン酸化は、p70 S6Kの活性
化に最も重要な貢献をしていると思われる(Pearson et al (1995) EMBO J. 14,
5278-5287; Pullen & Thomas (1998) FEBS LETT.410, 78-82; Weng et al (1998
) J. Biol. Chem.273, 16621-16629)。Thr252単独のリン酸化、又はThr412のリ
ン酸化を模倣するThr412からグルタミン酸への突然変異は、p70 S6Kの小さな活
性化に帰着している。対照的に、両方の残基のリン酸化、又はp70 S6KのT412E突
然変異突然変異体の中におけるThr252のリン酸化は、発現されたp70 S6Kの大き
な活性化に帰着しており、すなわちThr252及びThr412のリン酸化は、p70 S6Kの
相乗作用を有する（synergistic）活性化を導くことを示している(Weng et al (
1998) J. Biol. Chem.273, 16621-16629; Alessi et al (1998) Curr. Biol. 8,
69-81)。
【０００８】
p70 S6KのThr252及びThr412を囲んでいる残基は、全てのAGCファミリーメンバ
ーの中で高度に保存されており、そして上記で論じられたように、p70 S6KのThr
252及びThr412に等価な残基のリン酸化は、インビボでのこれらのキナーゼの活
性化、及び／又はその安定性にとって必要とされている(Belham et al (1999) C
urrent Biol. 9, R93-R96)。Thr412は、触媒ドメインに対してＣ末端に位置され
ており、そしてThr412を囲む残基は、Phe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyr共通モ
チーフに存在している。
ーの中で高度に保存されており、そして上記で論じられたように、p70 S6KのThr
252及びThr412に等価な残基のリン酸化は、インビボでのこれらのキナーゼの活
性化、及び／又はその安定性にとって必要とされている(Belham et al (1999) C
urrent Biol. 9, R93-R96)。Thr412は、触媒ドメインに対してＣ末端に位置され
ており、そしてThr412を囲む残基は、Phe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyr共通モ
チーフに存在している。
【０００９】
上記で論じられたように、3-ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ-1 (
PDK1)は、インビボやトランスフェクション実験にて、Thr252の位置においてp70
S6Kをリン酸化することができる。インビボでのPDK1によるp70 S6Kのリン酸化
は、PtdIns(3,4,5) P3の存在に依存せず、そして活性化は、p70 S6Kの触媒作用
を有さないカルボキシ末端の尾部（non catalytic carboxy terminal tail）が
欠失された場合に、そしてThr412が酸性の残基に突然変異される場合に、非常に
増加させられる。
PDK1)は、インビボやトランスフェクション実験にて、Thr252の位置においてp70
S6Kをリン酸化することができる。インビボでのPDK1によるp70 S6Kのリン酸化
は、PtdIns(3,4,5) P3の存在に依存せず、そして活性化は、p70 S6Kの触媒作用
を有さないカルボキシ末端の尾部（non catalytic carboxy terminal tail）が
欠失された場合に、そしてThr412が酸性の残基に突然変異される場合に、非常に
増加させられる。
【００１０】
近年、我々は、PDK1 は、単独でPKBのThr308(p70 S6KにおけるThr252に等価な
残基)をリン酸化する形態から、プロテインキナーゼＣ関連キナーゼ-2(PRK2)の
一領域との相互作用を経て、Thr308及びSer 473 (p70 S6KにおけるThr412に等価
な残基)の両方をリン酸化する形態へと変換させられるという驚くべき観察をな
し、そして、PDK1相互作用断片(PIF) (Balendran et al (1999) Curr Biol 9(8)
, 393-404; GB 9906245.7, filed 19 March 1999)と名付けた。
残基)をリン酸化する形態から、プロテインキナーゼＣ関連キナーゼ-2(PRK2)の
一領域との相互作用を経て、Thr308及びSer 473 (p70 S6KにおけるThr412に等価
な残基)の両方をリン酸化する形態へと変換させられるという驚くべき観察をな
し、そして、PDK1相互作用断片(PIF) (Balendran et al (1999) Curr Biol 9(8)
, 393-404; GB 9906245.7, filed 19 March 1999)と名付けた。
【００１１】
我々は、PKA以外のプロテインキナーゼ、例えばPDK1のキナーゼドメインの小
ローブ（small lobe）に係るプロテインキナーゼA (PKA)の小ローブに係る疎水
性ポケットに等価な位置の疎水性ポケットを同定し特徴付けて、さらに、疎水性
ポケットと相互作用するポリペプチドを同定する。我々は、プロテインキナーゼ
活性におけるそのようなポリペプチドの有効性、及びそのようなプロテインキナ
ーゼの安定性を同定する。我々は、疎水性ポケットとの相互作用によるプロテイ
ンキナーゼの活性を活性化又は阻害するドラッグ（drugs）を同定するのに適用
できる検定（assays）及びプロテインキナーゼの基質を同定する。
ローブ（small lobe）に係るプロテインキナーゼA (PKA)の小ローブに係る疎水
性ポケットに等価な位置の疎水性ポケットを同定し特徴付けて、さらに、疎水性
ポケットと相互作用するポリペプチドを同定する。我々は、プロテインキナーゼ
活性におけるそのようなポリペプチドの有効性、及びそのようなプロテインキナ
ーゼの安定性を同定する。我々は、疎水性ポケットとの相互作用によるプロテイ
ンキナーゼの活性を活性化又は阻害するドラッグ（drugs）を同定するのに適用
できる検定（assays）及びプロテインキナーゼの基質を同定する。
【００１２】
本発明の第１の側面は、完全長マウスプロテインキナーゼ A (PKA) の Lys76,
Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロ
テインキナーゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において、前記疎水性ポケッ
トを有するプロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同
定する方法である。ここで、前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼと相
互作用ポリペプチドとの相互作用を阻害、促進又は模倣する化合物の能力が測定
され、そして、前記相互作用を阻害、促進又は模倣する化合物が選択される。さ
らに、相互作用ポリペプチドが、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作
用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロテイ
ンキナーゼの疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-X
aa-Xaa-Phe/Tyrを有する。
Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロ
テインキナーゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において、前記疎水性ポケッ
トを有するプロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同
定する方法である。ここで、前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼと相
互作用ポリペプチドとの相互作用を阻害、促進又は模倣する化合物の能力が測定
され、そして、前記相互作用を阻害、促進又は模倣する化合物が選択される。さ
らに、相互作用ポリペプチドが、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作
用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロテイ
ンキナーゼの疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-X
aa-Xaa-Phe/Tyrを有する。
【００１３】
Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr配列のＣ末端側の直後の残基は、如何なる残基であ
っても良い。好ましくは、相互作用ポリペプチドはアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xa
a-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyrを有しており、ここで、Zaaは負に荷電したアミノ酸残基
を表している。さらに好ましくは、相互作用ポリペプチドは、C末端配列Phe/Tyr
-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-COOH、好ましくは、Phe-Xaa-Xaa-Phe-COOH、又はPhe/Tyr-Xaa
-Xaa-Phe/Tyr-(X)n- COOH、好ましくは、Phe-Xaa-Xaa-Phe-(X)n-COOHを有してい
ても良く、ここで、nは、1と20, 15, 10, 5, 4, 3又は2の間であり、好ましくは
1と4の間であり、最も好ましくは4である。各アミノ酸Xは、如何なるアミノ酸残
基であっても良く、好ましくはグリシンである。従って、相互作用ポリペプチド
は、C末端配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-(Gly)4-COOHを有することが好ましい。相互作用
ポリペプチドは、アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrを有
していないことが好ましい。例えばアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有
する相互作用ポリペプチドが、プロテインキナーゼと同じポリペプチド鎖の一部
ではない場合、相互作用ポリペプチドは、約400, 380, 350, 300, 250, 200, 15
0, 100, 80, 50, 40又は30個よりも少ないアミノ酸を有していることが好ましい
。疎水性ポケットを含むポリペプチドがPDK1である場合、相互作用ポリペプチド
は、PKB又はSGK (リン酸化された形態、又はリン酸化されていない形態)又は他
の既知であり天然に発生するPDK1の基質、例えばPKCζの完完全長（full length
）でないものであることが好ましい。
っても良い。好ましくは、相互作用ポリペプチドはアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xa
a-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyrを有しており、ここで、Zaaは負に荷電したアミノ酸残基
を表している。さらに好ましくは、相互作用ポリペプチドは、C末端配列Phe/Tyr
-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-COOH、好ましくは、Phe-Xaa-Xaa-Phe-COOH、又はPhe/Tyr-Xaa
-Xaa-Phe/Tyr-(X)n- COOH、好ましくは、Phe-Xaa-Xaa-Phe-(X)n-COOHを有してい
ても良く、ここで、nは、1と20, 15, 10, 5, 4, 3又は2の間であり、好ましくは
1と4の間であり、最も好ましくは4である。各アミノ酸Xは、如何なるアミノ酸残
基であっても良く、好ましくはグリシンである。従って、相互作用ポリペプチド
は、C末端配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-(Gly)4-COOHを有することが好ましい。相互作用
ポリペプチドは、アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrを有
していないことが好ましい。例えばアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有
する相互作用ポリペプチドが、プロテインキナーゼと同じポリペプチド鎖の一部
ではない場合、相互作用ポリペプチドは、約400, 380, 350, 300, 250, 200, 15
0, 100, 80, 50, 40又は30個よりも少ないアミノ酸を有していることが好ましい
。疎水性ポケットを含むポリペプチドがPDK1である場合、相互作用ポリペプチド
は、PKB又はSGK (リン酸化された形態、又はリン酸化されていない形態)又は他
の既知であり天然に発生するPDK1の基質、例えばPKCζの完完全長（full length
）でないものであることが好ましい。
【００１４】
負に荷電したアミノ酸残基Zaaは、例えば、アスパラギン酸、 グルタミン酸、
リン酸化されたセリン(ホスホセリン)、リン酸化されたトレオニン(ホスホトレ
オニン)、又はリン酸化されたチロシン(ホスホチロシン)残基、或いは負に荷電
した天然に発生しない残基であっても良い。Zaaは、アスパラギン酸塩、グルタ
ミン酸塩、ホスホセリン、又はホスホトレオニン残基であることが好ましく、さ
らに好ましくは、 アスパラギン酸塩又はグルタミン酸残基である。上記共通配
列の何れにも対応する配列において第１の残基は、フェニルアラニン残基である
ことが好ましい。フェニルアラニンは、前記共通配列が同定された天然に発生す
るポリペプチドにおいて、この位置で発見されている。上記共通配列の何れにも
対応する配列の第４の残基がフェニルアラニン残基であることがさらに好ましい
。フェニルアラニン及びチロシンは、前記共通配列が同定された天然に発生する
ポリペプチドにおいて、この位置で両方とも(別々に)見つけられている。
リン酸化されたセリン(ホスホセリン)、リン酸化されたトレオニン(ホスホトレ
オニン)、又はリン酸化されたチロシン(ホスホチロシン)残基、或いは負に荷電
した天然に発生しない残基であっても良い。Zaaは、アスパラギン酸塩、グルタ
ミン酸塩、ホスホセリン、又はホスホトレオニン残基であることが好ましく、さ
らに好ましくは、 アスパラギン酸塩又はグルタミン酸残基である。上記共通配
列の何れにも対応する配列において第１の残基は、フェニルアラニン残基である
ことが好ましい。フェニルアラニンは、前記共通配列が同定された天然に発生す
るポリペプチドにおいて、この位置で発見されている。上記共通配列の何れにも
対応する配列の第４の残基がフェニルアラニン残基であることがさらに好ましい
。フェニルアラニン及びチロシンは、前記共通配列が同定された天然に発生する
ポリペプチドにおいて、この位置で両方とも(別々に)見つけられている。
【００１５】
Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrアミノ酸配列のC末端側の直後の残基が負に荷電した
アミノ酸残基ではない、好ましい相互作用ポリペプチドは、アミノ酸配列FEGFA
又はFAGFSを有していても良い。.
アミノ酸残基ではない、好ましい相互作用ポリペプチドは、アミノ酸配列FEGFA
又はFAGFSを有していても良い。.
【００１６】
疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼは、3-ホスホイノシチド依存性プロ
テインキナーゼ-1 (PDK1)と名付けられるプロテインキナーゼであっても良い。 代わりに、それが血清及びグルココルチコイドにより刺激されたプロテインキ
ナーゼ(SGK)、プロテインキナーゼB(PKB)、プロテインキナーゼA(PKA)、p70 S6
キナーゼ、p90 RSK、PKCイソ型(例えば、PKCα、PKCδ、PKCζ)、PRK1、 PRK2、 MSK1又はMSK2であっても良い。疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼ及び
それらのEMBLデータベースアクセッション（accession）番号 が、表１に記載さ
れ、図15及び16に示されている。上記定義されたように、全てのAGCファミリー
のプロテインキナーゼは、疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼであっても
良い。図１５及び１６に示されたプロテインキナーゼに加えて、例えば、ロドプ
シン及びG-タンパク質に結合されたプロテインキナーゼ受容体も、上記定義され
た疎水性ポケットを有している。そして、マウスPKAのLys76に等価な残基はリジ
ン残基である。
テインキナーゼ-1 (PDK1)と名付けられるプロテインキナーゼであっても良い。 代わりに、それが血清及びグルココルチコイドにより刺激されたプロテインキ
ナーゼ(SGK)、プロテインキナーゼB(PKB)、プロテインキナーゼA(PKA)、p70 S6
キナーゼ、p90 RSK、PKCイソ型(例えば、PKCα、PKCδ、PKCζ)、PRK1、 PRK2、 MSK1又はMSK2であっても良い。疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼ及び
それらのEMBLデータベースアクセッション（accession）番号 が、表１に記載さ
れ、図15及び16に示されている。上記定義されたように、全てのAGCファミリー
のプロテインキナーゼは、疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼであっても
良い。図１５及び１６に示されたプロテインキナーゼに加えて、例えば、ロドプ
シン及びG-タンパク質に結合されたプロテインキナーゼ受容体も、上記定義され
た疎水性ポケットを有している。そして、マウスPKAのLys76に等価な残基はリジ
ン残基である。
【００１７】
ここで使用される用語PDK1は、例えば、WO98/41638 に記載され本明細書の引
用文献に組み込まれたAlessi D.R et al (1997) Curr. Biol. 7: 261-269, Ales
si D.R et al (1997) Curr. Biol. 7: 776-789, Stokoe D et al (1997) Scien
ce 277: 567-570 or Stephens L et al (1998) Science 279: 710-714において
、PDK1として同定されたアミノ酸配列を有するポリペプチド(PDK1ポリペプチド)
、又は、その突然変異体（variant）、断片（fragment）、融合体（fusion）若
しくは誘導体（derivative）、又は、前記突然変異体若しくは断片若しくは誘導
体の融合体を含む。前記PDK1ポリペプチドはプロテインキナーゼであることが好
ましい。前記PDK1ポリペプチドは、Thr-Phe-Cys-Gly-Thr-Xaa-Glu-Leu共通モチ
ーフに存在するトレオニン残基をリン酸化することができ (ここで、下線が引か
れたThrはPDK1によってリン酸化されるトレオニンに対応し、Xaaは突然変異体の
残基である)、そして、好ましくはThr308残基においてPKB、例えば、PKBαをリ
ン酸化することができるプロテインキナーゼであることが好ましい。上記に論じ
られているようなPDK1ポリペプチドがトレオニン残基をリン酸化できる速度は、
PtdIns(3,4,5)P3又はPtdIns(3,4)P2 の存在により増加させられるが、当然のこ
とながら、これは不可欠ではない。前記ポリペプチドは、PKCイソ型(LeGood et
al (1998) Science 281: 2042-2045; et al (1998) Curr. Biol. 8: 1069-1077;
Dutil et al (1998) Curr. Biol. 8:1366-1375)、p70 S6キナーゼ(Alessi et a
l (1998) Curr. Biol. 8: 69-81; Pullen et al (1998) Science 279, 707-710)
、SGK(sequence given in Webster et al (1993) Mol. Cell. Biol. 13, 1031-2
040; equivalent residues identified in US application no 112217 filed on
14 December 1998; GB 9919676.8, filed on 19 August 1999, and Kobayashi
& Cohen (1999))、及びPKA (Cheng et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95: 9849-9854) におけるPKBαのThr308に等価な残基をリン酸化可能であっても
良い。さらに、基質特異性、及び／又は前記PDK1ポリペプチドのインビボでの他
の特徴は、Alessi D.R et al (1997) Curr. Biol. 7: 261-269, Alessi D.R et
al (1997) Curr. Biol. 7: 776-789, Stokoe D et al (1997) Science 277: 56
7-570 or Stephens L et al (1998) Science 279: 710-714において報告された
ように、実質的なものであっても良いということが好ましい。
用文献に組み込まれたAlessi D.R et al (1997) Curr. Biol. 7: 261-269, Ales
si D.R et al (1997) Curr. Biol. 7: 776-789, Stokoe D et al (1997) Scien
ce 277: 567-570 or Stephens L et al (1998) Science 279: 710-714において
、PDK1として同定されたアミノ酸配列を有するポリペプチド(PDK1ポリペプチド)
、又は、その突然変異体（variant）、断片（fragment）、融合体（fusion）若
しくは誘導体（derivative）、又は、前記突然変異体若しくは断片若しくは誘導
体の融合体を含む。前記PDK1ポリペプチドはプロテインキナーゼであることが好
ましい。前記PDK1ポリペプチドは、Thr-Phe-Cys-Gly-Thr-Xaa-Glu-Leu共通モチ
ーフに存在するトレオニン残基をリン酸化することができ (ここで、下線が引か
れたThrはPDK1によってリン酸化されるトレオニンに対応し、Xaaは突然変異体の
残基である)、そして、好ましくはThr308残基においてPKB、例えば、PKBαをリ
ン酸化することができるプロテインキナーゼであることが好ましい。上記に論じ
られているようなPDK1ポリペプチドがトレオニン残基をリン酸化できる速度は、
PtdIns(3,4,5)P3又はPtdIns(3,4)P2 の存在により増加させられるが、当然のこ
とながら、これは不可欠ではない。前記ポリペプチドは、PKCイソ型(LeGood et
al (1998) Science 281: 2042-2045; et al (1998) Curr. Biol. 8: 1069-1077;
Dutil et al (1998) Curr. Biol. 8:1366-1375)、p70 S6キナーゼ(Alessi et a
l (1998) Curr. Biol. 8: 69-81; Pullen et al (1998) Science 279, 707-710)
、SGK(sequence given in Webster et al (1993) Mol. Cell. Biol. 13, 1031-2
040; equivalent residues identified in US application no 112217 filed on
14 December 1998; GB 9919676.8, filed on 19 August 1999, and Kobayashi
& Cohen (1999))、及びPKA (Cheng et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95: 9849-9854) におけるPKBαのThr308に等価な残基をリン酸化可能であっても
良い。さらに、基質特異性、及び／又は前記PDK1ポリペプチドのインビボでの他
の特徴は、Alessi D.R et al (1997) Curr. Biol. 7: 261-269, Alessi D.R et
al (1997) Curr. Biol. 7: 776-789, Stokoe D et al (1997) Science 277: 56
7-570 or Stephens L et al (1998) Science 279: 710-714において報告された
ように、実質的なものであっても良いということが好ましい。
【００１８】
ここで使用されているような用語、例えばSGK、 PKB、PKA、p70 S6キナーゼ、
p90 RSK、PKCα、PKCδ、PKCζ又はPRK2は、表１に示されたEMBLデータベースに
該当する記録において、SGK、 PKB、 PKA、 p70 S6キナーゼ、p90 RSK、PKCα、
PKCδ、PKCζ又はPRK2として同定されたアミノ酸配列を有するポリペプチド(SGK
、PKB、PKA、p70S6キナーゼ、p90 RSK、PKCα、PKCδ、PKCζ又はPRK2ポリペプ
チド)をそれぞれ含んでいる。
p90 RSK、PKCα、PKCδ、PKCζ又はPRK2は、表１に示されたEMBLデータベースに
該当する記録において、SGK、 PKB、 PKA、 p70 S6キナーゼ、p90 RSK、PKCα、
PKCδ、PKCζ又はPRK2として同定されたアミノ酸配列を有するポリペプチド(SGK
、PKB、PKA、p70S6キナーゼ、p90 RSK、PKCα、PKCδ、PKCζ又はPRK2ポリペプ
チド)をそれぞれ含んでいる。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
AGCキナーゼのＴループ（T-loop）周辺アミノ酸配列及び疎水性モチーフの整列
。全ての配列及びアクセッション（accession）番号はヒト由来プロテインのも
のである。下線が引かれた残基は、リン酸化される残基に対応している。脚注：
(1) この位置で、PKAプロテインは終了している。(2) PDK1は疎水性モチーフを
保持しない。
。全ての配列及びアクセッション（accession）番号はヒト由来プロテインのも
のである。下線が引かれた残基は、リン酸化される残基に対応している。脚注：
(1) この位置で、PKAプロテインは終了している。(2) PDK1は疎水性モチーフを
保持しない。
【００２１】
必須ではないが、特に、PDK1の突然変異体若しくは断片若しくは誘導体若しく
は融合体、又は、この突然変異体若しくは断片若しくは誘導体の融合体は、PtdI
ns(3,4,5)P3又はPtdIns(3,4)P2の存在に関わらず、残基Thr308における完全長ヒ
トPKBα又はSGK1のリン酸化について、完全長ヒトPDK1の少なくとも３０％の酵
素活性を有することが好ましい。前記プロテインキナーゼの突然変異体若しくは
断片若しくは誘導体若しくは融合体、又は、この突然変異体若しくは断片若しく
は誘導体の融合体は、PKBα又はSGK1のリン酸化について、少なくとも50%、好ま
しくは少なくとも70%、そして、より好ましくは少なくとも90%の PDK1 酵素活性
を有することがより好ましい。しかしながら、酵素活性が欠如されている突然変
異体又は融合体又は誘導体又は断片は、やはり、例えば、別のポリペプチドと相
互作用することによって有用であるということは当然のことである。従って、酵
素活性が欠如されている突然変異体又は融合体又は誘導体又は断片は、結合検定
（binding assay）において有用となるはずである。この結合検定は、例えば、
相互作用ポリペプチド、例えばアミノ酸配列モチーフPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr
、例えばPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr、例えばPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr-Asp/Glu-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-PhosphoSer/PhosphoThr-Phe/
Tyrを有する相互作用ポリペプチドとの PDK1 の相互作用の調整を測定する本発
明の方法において、適用されてもよい。
は融合体、又は、この突然変異体若しくは断片若しくは誘導体の融合体は、PtdI
ns(3,4,5)P3又はPtdIns(3,4)P2の存在に関わらず、残基Thr308における完全長ヒ
トPKBα又はSGK1のリン酸化について、完全長ヒトPDK1の少なくとも３０％の酵
素活性を有することが好ましい。前記プロテインキナーゼの突然変異体若しくは
断片若しくは誘導体若しくは融合体、又は、この突然変異体若しくは断片若しく
は誘導体の融合体は、PKBα又はSGK1のリン酸化について、少なくとも50%、好ま
しくは少なくとも70%、そして、より好ましくは少なくとも90%の PDK1 酵素活性
を有することがより好ましい。しかしながら、酵素活性が欠如されている突然変
異体又は融合体又は誘導体又は断片は、やはり、例えば、別のポリペプチドと相
互作用することによって有用であるということは当然のことである。従って、酵
素活性が欠如されている突然変異体又は融合体又は誘導体又は断片は、結合検定
（binding assay）において有用となるはずである。この結合検定は、例えば、
相互作用ポリペプチド、例えばアミノ酸配列モチーフPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr
、例えばPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr、例えばPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr-Asp/Glu-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-PhosphoSer/PhosphoThr-Phe/
Tyrを有する相互作用ポリペプチドとの PDK1 の相互作用の調整を測定する本発
明の方法において、適用されてもよい。
【００２２】
以下に、さらに論じられるように、前記疎水性ポケットを含むプロテインキナ
ーゼの突然変異体若しくは断片若しくは誘導体若しくは融合体、又は、この突然
変異体若しくは断片若しくは誘導体の融合体は、完全長マウスPKAのLys76、Leu1
16、Val80 及び／又はLys111を含む残基によって規定される(マウス) PKAの疎水
性ポケットに等価な位置において、疎水性ポケットを有することが好ましい。
ーゼの突然変異体若しくは断片若しくは誘導体若しくは融合体、又は、この突然
変異体若しくは断片若しくは誘導体の融合体は、完全長マウスPKAのLys76、Leu1
16、Val80 及び／又はLys111を含む残基によって規定される(マウス) PKAの疎水
性ポケットに等価な位置において、疎水性ポケットを有することが好ましい。
【００２３】
等価の好適例は、SGK, PKB, PKA, p70 S6 キナーゼ, p90 RSK, PKCα, PKCδ,
PKCζ又はPRK2(例えば)の突然変異体、断片、誘導体若しくは融合体、又は、こ
の突然変異体、断片若しくは誘導体の融合体であって、ペプチド基質 Crosstide
(GRPRTSSFAEG) のSGK、PKB及びp70S6キナーゼに関連する置換、又は、PKB及びS
GKの場合はペプチド基質RPRAATF；ペプチド基質Kemptide (LRRASLG)のPKAに関連
する置換；ヒストンH1の PKCイソ型及びPRK1/2に関連する置換；CREBtide (EILS
RRPSYRK) のMSK1/2又はp90-RSK1/2/3に関連する置換を含む。
PKCζ又はPRK2(例えば)の突然変異体、断片、誘導体若しくは融合体、又は、こ
の突然変異体、断片若しくは誘導体の融合体であって、ペプチド基質 Crosstide
(GRPRTSSFAEG) のSGK、PKB及びp70S6キナーゼに関連する置換、又は、PKB及びS
GKの場合はペプチド基質RPRAATF；ペプチド基質Kemptide (LRRASLG)のPKAに関連
する置換；ヒストンH1の PKCイソ型及びPRK1/2に関連する置換；CREBtide (EILS
RRPSYRK) のMSK1/2又はp90-RSK1/2/3に関連する置換を含む。
【００２４】
ポリペプチドの「突然変異体」には、挿入、欠失、及び同類であるかないかに
関わらない置換が含まれている。特に、上記したように、ポリペプチドの突然変
異体には、例えば、PDK1のプロテインキナーゼ活性等の前記ポリペプチドの活性
を実質的に変更しないような変形が含まれている。
関わらない置換が含まれている。特に、上記したように、ポリペプチドの突然変
異体には、例えば、PDK1のプロテインキナーゼ活性等の前記ポリペプチドの活性
を実質的に変更しないような変形が含まれている。
【００２５】
「同類置換（conservative substitutions）」には、Gly, Ala； Val, Ile, L
eu； Asp, Glu； Asn, Gln； Ser, Thr； Lys, Arg；及び Phe, Tyrのような組
合せが意図されている。.
eu； Asp, Glu； Asn, Gln； Ser, Thr； Lys, Arg；及び Phe, Tyrのような組
合せが意図されている。.
【００２６】
特に、PDK1 (或いはSGK, PKB, PKA、又はp70 S6キナーゼ、又は上記定義され
た他の疎水性ポケットを含むキナーゼ)の突然変異体は、前記PDK1のアミノ酸配
列(或いは、必要に応じて、前記SGK (SGK1, 2及び3を含む)、PKB, PKA、又はp70
S6キナーゼのための配列)と少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%, 71
%, 72%, 73%又は74%、さらにより好ましくは少なくとも75%、さらにもっと好ま
しくは少なくとも80%、さらに優先的であるのは少なくとも85%、もっと優先的で
あるのは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有している場合が好ましく、
そして、上記定義されたアミノ酸配列と少なくとも95%又は97%同一である場合が
最も好ましい。
た他の疎水性ポケットを含むキナーゼ)の突然変異体は、前記PDK1のアミノ酸配
列(或いは、必要に応じて、前記SGK (SGK1, 2及び3を含む)、PKB, PKA、又はp70
S6キナーゼのための配列)と少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%, 71
%, 72%, 73%又は74%、さらにより好ましくは少なくとも75%、さらにもっと好ま
しくは少なくとも80%、さらに優先的であるのは少なくとも85%、もっと優先的で
あるのは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有している場合が好ましく、
そして、上記定義されたアミノ酸配列と少なくとも95%又は97%同一である場合が
最も好ましい。
【００２７】
PDK1(或いは、上記定義されたように、SGK、PKB, PKA又はp70 S6キナーゼ、若
しくは他の疎水性ポケットを含むキナーゼ)の突然変異体は、前記該当する配列
の中におけるPDK1 (或いは、例えば、SGK, PKB, PKA又はp70 S6キナーゼ)の触媒
ドメイン、特に疎水性ポケットを形成する残基のアミノ酸配列と少なくとも65%
、より好ましくは少なくとも70%, 71%, 72%, 73%又は74%、さらにより好ましく
は少なくとも75%、さらにもっと好ましくは少なくとも80%、さらに優先的である
のは少なくとも85%、もっと優先的であるのは少なくとも90%同一であるアミノ酸
配列を有している場合が好ましく、そして、上記定義されたアミノ酸配列と少な
くとも95%又は97%同一である場合が最も好ましい。当然のことながら、プロテイ
ンキナーゼ関連ポリペプチド（a protein kinase-related polypeptide）の触媒
ドメインは、例えば、以下に示すような配列比較（sequence comparisons）を用
いると、当業者により容易に同定されるはずである。
しくは他の疎水性ポケットを含むキナーゼ)の突然変異体は、前記該当する配列
の中におけるPDK1 (或いは、例えば、SGK, PKB, PKA又はp70 S6キナーゼ)の触媒
ドメイン、特に疎水性ポケットを形成する残基のアミノ酸配列と少なくとも65%
、より好ましくは少なくとも70%, 71%, 72%, 73%又は74%、さらにより好ましく
は少なくとも75%、さらにもっと好ましくは少なくとも80%、さらに優先的である
のは少なくとも85%、もっと優先的であるのは少なくとも90%同一であるアミノ酸
配列を有している場合が好ましく、そして、上記定義されたアミノ酸配列と少な
くとも95%又は97%同一である場合が最も好ましい。当然のことながら、プロテイ
ンキナーゼ関連ポリペプチド（a protein kinase-related polypeptide）の触媒
ドメインは、例えば、以下に示すような配列比較（sequence comparisons）を用
いると、当業者により容易に同定されるはずである。
【００２８】
二つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、適するコンピュータプログ
ラム、例えば、ウィスコンシン大学遺伝子コンピューティンググループ（the Un
iversity of Wisconsin Genetic Computing Group）のＧＡＰプログラムを用い
て決定され、当然のことながら、パーセント同一性は、配列が最適に整列されて
いるポリペプチドについて計算される。
ラム、例えば、ウィスコンシン大学遺伝子コンピューティンググループ（the Un
iversity of Wisconsin Genetic Computing Group）のＧＡＰプログラムを用い
て決定され、当然のことながら、パーセント同一性は、配列が最適に整列されて
いるポリペプチドについて計算される。
【００２９】
代わりになるべきものとして、クラスタルＷプログラム（the Clustal W prog
ram）を用いて、その整列が行われる（Thompson等 (1994) Nucl Acid Res 22, 4
673-4680）。用いられたパラメータは、以下の通りである： Fast pairwise alignment parameters：K-tuple(word) size；1，window size；
5，gap penalty；3，number of top diagonals；5．Scoring method：x percent
． Multiple alignment parameters：gap open penalty；10，gap extension penal
ty；0.05． Scoring matrix：BLOSUM．
ram）を用いて、その整列が行われる（Thompson等 (1994) Nucl Acid Res 22, 4
673-4680）。用いられたパラメータは、以下の通りである： Fast pairwise alignment parameters：K-tuple(word) size；1，window size；
5，gap penalty；3，number of top diagonals；5．Scoring method：x percent
． Multiple alignment parameters：gap open penalty；10，gap extension penal
ty；0.05． Scoring matrix：BLOSUM．
【００３０】
PDK1 (或いは、例えば、SGK, PKB, PKA又はp70 S6キナーゼ) は、前記プロテ
インキナーゼPDK1 (或いは、場合に応じて、例えばSGK, PKB, PKA又はp70 S6キ
ナーゼ)の配列、或いはその天然発生アレリック突然変異体（naturally occurri
ng allelic vatiants）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ま
しい。天然発生アレリック突然変異体は、ほ乳類であることが好ましく、より好
ましくはヒトであるが、代わりに、寄生生物、或いは病原性を有する生物、或い
は病原性を潜在的に有する生物からの同族体（homologues）であっても良い。そ
のような生物及び同族体の実例、そのような同族体の調製剤（modulator）の用
途（use）例は、1998年12月14日に申請された米国特許出願No 60/112,114、及び
そこから優先権を主張する出願、又はCasamayorら(1999) Curr Biol 9, 186-197
により、与えられている。
インキナーゼPDK1 (或いは、場合に応じて、例えばSGK, PKB, PKA又はp70 S6キ
ナーゼ)の配列、或いはその天然発生アレリック突然変異体（naturally occurri
ng allelic vatiants）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ま
しい。天然発生アレリック突然変異体は、ほ乳類であることが好ましく、より好
ましくはヒトであるが、代わりに、寄生生物、或いは病原性を有する生物、或い
は病原性を潜在的に有する生物からの同族体（homologues）であっても良い。そ
のような生物及び同族体の実例、そのような同族体の調製剤（modulator）の用
途（use）例は、1998年12月14日に申請された米国特許出願No 60/112,114、及び
そこから優先権を主張する出願、又はCasamayorら(1999) Curr Biol 9, 186-197
により、与えられている。
【００３１】
実施例２に記載されているように、PDK1は、さらに完全長ヒトPDK1の残基51か
ら404のアミノ酸配列を含むポリペプチドであっても良い。；これは、PDK1のプ
ロテインキナーゼドメインを有していても良い。実施例１に記載されているよう
に、PDK1 (又は、SGK PKB, PKA若しくはp70 S6キナーゼ) は、さらに、Myc抗原
標識（Myc epitope-tagged）又はHis標識（His-tagged）されていても良い。例
えば、p70 S6キナーゼは、N末端がHis標識（His-tagged）されていても良いし、
及び／又はカルボキシ末端の104個の残基を欠いていても良い(p70 S6K-T2; 実施
例１参照)。Casamayorら (1999) Curr Biol 9, 186-197に記載されているように
、PDK1又はSGKは、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)同族
体、例えば、Pkh1又はPkh2 (PDK1同族体)又はYpk1又は Yrk2 (SGK同族体)であっ
ても良い。
ら404のアミノ酸配列を含むポリペプチドであっても良い。；これは、PDK1のプ
ロテインキナーゼドメインを有していても良い。実施例１に記載されているよう
に、PDK1 (又は、SGK PKB, PKA若しくはp70 S6キナーゼ) は、さらに、Myc抗原
標識（Myc epitope-tagged）又はHis標識（His-tagged）されていても良い。例
えば、p70 S6キナーゼは、N末端がHis標識（His-tagged）されていても良いし、
及び／又はカルボキシ末端の104個の残基を欠いていても良い(p70 S6K-T2; 実施
例１参照)。Casamayorら (1999) Curr Biol 9, 186-197に記載されているように
、PDK1又はSGKは、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)同族
体、例えば、Pkh1又はPkh2 (PDK1同族体)又はYpk1又は Yrk2 (SGK同族体)であっ
ても良い。
【００３２】
以下に示されるように、PDK1 (又は、例えばSGK, PKB, PKA若しくはp70 S6キ
ナーゼ)は、アミノ酸配列モチーフPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr、好ましくはPhe-Xa
a-Xaa-Phe/Tyr、より好ましくはPhe-Xaa-Xaa-Phe、さらにもっと好ましくはPhe/
Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-COOHを有する
ポリペプチドが、例えばポリペプチドPIF又はPIFtideと相互作用できるポリペプ
チドであることが好ましい。前記ポリペプチドにとってさらに好ましいものは、
相互作用するポリペプチドに関連して上記のように与えられるようなものである
。
ナーゼ)は、アミノ酸配列モチーフPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr、好ましくはPhe-Xa
a-Xaa-Phe/Tyr、より好ましくはPhe-Xaa-Xaa-Phe、さらにもっと好ましくはPhe/
Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-COOHを有する
ポリペプチドが、例えばポリペプチドPIF又はPIFtideと相互作用できるポリペプ
チドであることが好ましい。前記ポリペプチドにとってさらに好ましいものは、
相互作用するポリペプチドに関連して上記のように与えられるようなものである
。
【００３３】
以下に、さらに示されるように、例えば、アミノ酸配列モチーフPhe/Tyr-Xaa-
Xaa-Phe/Tyr、例えばPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-Xaa-Xa
a-Phe/Tyr-COOHを有するポリペプチド等のポリペプチドへの相互作用、或いは結
合に関する前記PDK1 (或いは、例えばSGK, PKB, PKA又はp70 S6キナーゼ) ポリ
ペプチドの能力は、タンパク質／タンパク質相互作用を検出／測定する（detect
ing/measuring）何れかの方法により、測定される。適する方法には、上記しか
つ実施例１又は実施例２に記載された方法に類似した方法、例えば、酵母ツーハ
イブリッド相互作用（yeast two-hybrid interactions）法，共精製（co-purifi
cation）法，エリザ（ELISA）法、共免疫沈降（co-immunoprecipitation）法、
表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）法が含まれる。従って、例
えば実施例１又は実施例２に記載されたように、エリザ法，共免疫沈降法、表面
プラズモン共鳴法、又は、酵母ツーハイブリッド相互作用法，共精製法により、
前記PDK1ポリペプチドと前記相互作用ポリペプチドとの間で相互作用が検出され
る場合には、前記PDK1 (或いは、SGK, PKB, PKA又は p70 S6キナーゼ)は、例え
ば、アミノ酸配列モチーフPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr、例えばPhe/Tyr-Xaa-Xaa-P
he/Tyr-Zaa-Phe/Tyr、Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Asp/Glu-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-X
aa-Xaa-Phe/Tyr-PhosphoSer/PhosphoThr-Phe/Tyrを有するポリペプチド等のポリ
ペプチドと結合或いは相互作用できると考えられても良い。
Xaa-Phe/Tyr、例えばPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-Xaa-Xa
a-Phe/Tyr-COOHを有するポリペプチド等のポリペプチドへの相互作用、或いは結
合に関する前記PDK1 (或いは、例えばSGK, PKB, PKA又はp70 S6キナーゼ) ポリ
ペプチドの能力は、タンパク質／タンパク質相互作用を検出／測定する（detect
ing/measuring）何れかの方法により、測定される。適する方法には、上記しか
つ実施例１又は実施例２に記載された方法に類似した方法、例えば、酵母ツーハ
イブリッド相互作用（yeast two-hybrid interactions）法，共精製（co-purifi
cation）法，エリザ（ELISA）法、共免疫沈降（co-immunoprecipitation）法、
表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）法が含まれる。従って、例
えば実施例１又は実施例２に記載されたように、エリザ法，共免疫沈降法、表面
プラズモン共鳴法、又は、酵母ツーハイブリッド相互作用法，共精製法により、
前記PDK1ポリペプチドと前記相互作用ポリペプチドとの間で相互作用が検出され
る場合には、前記PDK1 (或いは、SGK, PKB, PKA又は p70 S6キナーゼ)は、例え
ば、アミノ酸配列モチーフPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr、例えばPhe/Tyr-Xaa-Xaa-P
he/Tyr-Zaa-Phe/Tyr、Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Asp/Glu-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-X
aa-Xaa-Phe/Tyr-PhosphoSer/PhosphoThr-Phe/Tyrを有するポリペプチド等のポリ
ペプチドと結合或いは相互作用できると考えられても良い。
【００３４】
実施例１又は実施例２、及びBalendranら (1999), supra 及びGB9906245.7, s
upraに記載されているように、相互作用は表面プラズモン共鳴法を使用して検出
されることが好ましい。例えば製造業者の使用説明書に従い、 相互作用ポリペ
プチドは、アミノ基を介してセンサーチップ（SensorChip） CM5（商標）に結合
され、又は、ビオチニル化された（biotinylated）ポリペプチドがセンサーチッ
プSAを被覆したアビヂンに結合されるようにして、測定表面（test surface）上
で固定される。そして、プロテインキナーゼ (濃度が、例えば、0と、10μM〜1.
0μM、例えば2μMとの間) がその表面に亘って注入されて、定常状態の結合（st
eady state binding）がその都度決定された。これらの測定から、Kdが決定され
る。相互作用は、8μMより少ないKdであることが好ましく、より好ましくは5μM
, 2μM, 1μM, 500nM, 300nM, 200nM又は100nM、例えば、約150nMより少ないこ
とである。GST-PDK1とPIFとの間で決定された相互作用のKd は約150nMであって
も良い。代わりに、Kd は、固定されたポリペプチドと競合するポリペプチドの
ために決定されても良い。プロテインキナーゼ(例えば、0.5μM)は、フリー（fr
ee）ポリペプチド(例えば、0〜3μM)に混合され、その混合物が固定されている
ポリペプチドに亘って注入された。定常状態の結合は、チェングプレスコット関
係（Cheng-Prescott relationship）に従って決定される相互作用のKd からその
都度決定された。代わりに、実施例２に記載されているように、相互作用は、観
察された応答（response）に置き換えて、又は関連する（relative）観察された
応答、すなわち、表面に結合されたタンパク質の量に置き換えて表されても良い
。例えば、ポリペプチドは、アミノ基を有して結合されたセンサーチップCM5 に
固定され、そして固定されたポリペプチドに亘って、例えば濃度が1.0μMである
各プロテインキナーゼ (以下に論じられているように、例えば異なるように突然
変異させられたプロテインキナーゼ)が注入されても良い。代わりに、ポリペプ
チドはSAセンサーチップに固定され、そして、固定されたポリペプチドに亘って
、例えば濃度が40nMである各プロテインキナーゼが注入されても良い。各プロテ
インキナーゼに対する定常状態での応答（steady state response）は、例えば
、応答単位(RU)で表現されることで決定されている。1000RUは、表面に結合され
たタンパク質の1 ng/mm2 に対応するものである。10RUよりも少ない応答は、相
互作用が生じていないと示唆することができる。少なくとも10RUの応答は、固定
された分子と注入された分子とが互いに相互作用していると示唆することができ
る。
upraに記載されているように、相互作用は表面プラズモン共鳴法を使用して検出
されることが好ましい。例えば製造業者の使用説明書に従い、 相互作用ポリペ
プチドは、アミノ基を介してセンサーチップ（SensorChip） CM5（商標）に結合
され、又は、ビオチニル化された（biotinylated）ポリペプチドがセンサーチッ
プSAを被覆したアビヂンに結合されるようにして、測定表面（test surface）上
で固定される。そして、プロテインキナーゼ (濃度が、例えば、0と、10μM〜1.
0μM、例えば2μMとの間) がその表面に亘って注入されて、定常状態の結合（st
eady state binding）がその都度決定された。これらの測定から、Kdが決定され
る。相互作用は、8μMより少ないKdであることが好ましく、より好ましくは5μM
, 2μM, 1μM, 500nM, 300nM, 200nM又は100nM、例えば、約150nMより少ないこ
とである。GST-PDK1とPIFとの間で決定された相互作用のKd は約150nMであって
も良い。代わりに、Kd は、固定されたポリペプチドと競合するポリペプチドの
ために決定されても良い。プロテインキナーゼ(例えば、0.5μM)は、フリー（fr
ee）ポリペプチド(例えば、0〜3μM)に混合され、その混合物が固定されている
ポリペプチドに亘って注入された。定常状態の結合は、チェングプレスコット関
係（Cheng-Prescott relationship）に従って決定される相互作用のKd からその
都度決定された。代わりに、実施例２に記載されているように、相互作用は、観
察された応答（response）に置き換えて、又は関連する（relative）観察された
応答、すなわち、表面に結合されたタンパク質の量に置き換えて表されても良い
。例えば、ポリペプチドは、アミノ基を有して結合されたセンサーチップCM5 に
固定され、そして固定されたポリペプチドに亘って、例えば濃度が1.0μMである
各プロテインキナーゼ (以下に論じられているように、例えば異なるように突然
変異させられたプロテインキナーゼ)が注入されても良い。代わりに、ポリペプ
チドはSAセンサーチップに固定され、そして、固定されたポリペプチドに亘って
、例えば濃度が40nMである各プロテインキナーゼが注入されても良い。各プロテ
インキナーゼに対する定常状態での応答（steady state response）は、例えば
、応答単位(RU)で表現されることで決定されている。1000RUは、表面に結合され
たタンパク質の1 ng/mm2 に対応するものである。10RUよりも少ない応答は、相
互作用が生じていないと示唆することができる。少なくとも10RUの応答は、固定
された分子と注入された分子とが互いに相互作用していると示唆することができ
る。
【００３５】
当然のことながら、上記方法は、例えば天然に発生する疎水性ポケットを含む
プロテインキナーゼである、完全長マウスプロテインキナーゼ A (PKA) の Lys7
6, Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプ
ロテインキナーゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において、前記疎水性ポケ
ットを有するプロテインキナーゼに関する相互作用ポリペプチドである特定のポ
リペプチドかどうかを決定するために使用されても良い。
プロテインキナーゼである、完全長マウスプロテインキナーゼ A (PKA) の Lys7
6, Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプ
ロテインキナーゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において、前記疎水性ポケ
ットを有するプロテインキナーゼに関する相互作用ポリペプチドである特定のポ
リペプチドかどうかを決定するために使用されても良い。
【００３６】
ここで、「完全長マウスプロテインキナーゼ A (PKA) の Lys76, Leu116, Val
80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロテインキナー
ゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において、前記疎水性ポケットを有するプ
ロテインキナーゼ」とは、プロテインキナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列と
同定されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるということを意味し、さら
に、実施例２に論じられているように、完全長PKAのC末端のアミノ酸、例えば、
Phe348 及び／又は Phe351に相互作用するPKAに対して、Knightonら (1991) Sci
ence 253, 407-414に示唆された領域に対応する疎水性ポケットを含む、予測さ
れる又は決定された三次元構造をさらに有するポリペプチドであるということを
意味している。PKAにおける疎水性ポケットは、触媒ドメインの小ローブの中に
あり、ATP、又はPKA上のペプチド基質結合部位（peptide substrate binding si
tes）と重複していません。
80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロテインキナー
ゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において、前記疎水性ポケットを有するプ
ロテインキナーゼ」とは、プロテインキナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列と
同定されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるということを意味し、さら
に、実施例２に論じられているように、完全長PKAのC末端のアミノ酸、例えば、
Phe348 及び／又は Phe351に相互作用するPKAに対して、Knightonら (1991) Sci
ence 253, 407-414に示唆された領域に対応する疎水性ポケットを含む、予測さ
れる又は決定された三次元構造をさらに有するポリペプチドであるということを
意味している。PKAにおける疎水性ポケットは、触媒ドメインの小ローブの中に
あり、ATP、又はPKA上のペプチド基質結合部位（peptide substrate binding si
tes）と重複していません。
【００３７】
PKAの疎水性ポケットの中における残基Lys76, Val80, Lys111及び／又はLeu11
6 は、完全長マウスPKA (Uhler et al (1996) PNAS USA 83, 1300-1304)のC末端
においての残基Phe347及びPhe350と相互作用するものとしても良い。プロテイン
キナーゼは、マウスPKAのLys76, Val80, Lys111及び／又は Leu116、より好まし
くはマウスPKAの少なくともLys76 及びLeu116、最も好ましくはLys76に等価な同
一の残基と等価であり、同一の又は保存（conserved）残基を有するものが好ま
しい。従って、例えば、プロテインキナーゼは、PKAのLys76に等価な位置におい
てLys残基を、及び／又はPKAのLeu116の等価な位置においてLeu残基を有するも
のとしても良い。例えば、PDK1のLys115 及びLeu155は、PKAのLys76及びLeu116
とそれぞれ等価となっている。プロテインキナーゼは、PKAのLys76に等価な位置
においてAlaを、及び／又は、PKAのLeu116に等価な位置においてSer, Asp又はGl
u を有さないものとすることが好ましい。プロテインキナーゼは、PRK1及び2 (
図15及び16参照)におけるように、PKAのLeu116に等価な位置においてVal残基、
又はIle残基を有するものとしても良い。プロテインキナーゼは、Lys111に等価
な位置及び／又はVal80に等価な位置に非保存(non-conserved)残基、例えば、グ
ルタミン残基を有していても良い。
6 は、完全長マウスPKA (Uhler et al (1996) PNAS USA 83, 1300-1304)のC末端
においての残基Phe347及びPhe350と相互作用するものとしても良い。プロテイン
キナーゼは、マウスPKAのLys76, Val80, Lys111及び／又は Leu116、より好まし
くはマウスPKAの少なくともLys76 及びLeu116、最も好ましくはLys76に等価な同
一の残基と等価であり、同一の又は保存（conserved）残基を有するものが好ま
しい。従って、例えば、プロテインキナーゼは、PKAのLys76に等価な位置におい
てLys残基を、及び／又はPKAのLeu116の等価な位置においてLeu残基を有するも
のとしても良い。例えば、PDK1のLys115 及びLeu155は、PKAのLys76及びLeu116
とそれぞれ等価となっている。プロテインキナーゼは、PKAのLys76に等価な位置
においてAlaを、及び／又は、PKAのLeu116に等価な位置においてSer, Asp又はGl
u を有さないものとすることが好ましい。プロテインキナーゼは、PRK1及び2 (
図15及び16参照)におけるように、PKAのLeu116に等価な位置においてVal残基、
又はIle残基を有するものとしても良い。プロテインキナーゼは、Lys111に等価
な位置及び／又はVal80に等価な位置に非保存(non-conserved)残基、例えば、グ
ルタミン残基を有していても良い。
【００３８】
図15及び16は、PKAの疎水性ポケットに等価な位置における前記疎水性ポケッ
トを有するプロテインキナーゼの実施例の調整を示している。完全長マウスPKA
のLys76, Val80, Lys111及びLeu116に等価な残基が示されている。Lys残基は、
調整された全ての配列の中でマウスPKAのLys76に等価な位置にて存在している。
トを有するプロテインキナーゼの実施例の調整を示している。完全長マウスPKA
のLys76, Val80, Lys111及びLeu116に等価な残基が示されている。Lys残基は、
調整された全ての配列の中でマウスPKAのLys76に等価な位置にて存在している。
【００３９】
当業者において周知のように、アミノ酸配列は、既知のプロテインキナーゼド
メインとの配列の同一性、又は三次元構造の類似性に対して、参考文献によるプ
ロテインキナーゼ触媒ドメインのそれとして同定可能とされても良い。
メインとの配列の同一性、又は三次元構造の類似性に対して、参考文献によるプ
ロテインキナーゼ触媒ドメインのそれとして同定可能とされても良い。
【００４０】
プロテインキナーゼは、Johnson ら (1996) Cell, 85, 149-158 and Taylor &
Radzio-Andzelm (1994) Structure 2, 345-355に調査されたように、保存され
た触媒作用を有する核（catalytic core）を明らかにしている。この核は、平行
でない（anti-parallel）β-シート（sheet）を主に有する小さなN末端のローブ
と、大部分がα-へリカル（helical）をなす大きなC末端のローブとに折り畳ま
れている。これらのローブの間のインターフェースにおける深い裂け目は、裂け
目の開始部の近くのリン酸基とともに、ATP結合部位となっている。
Radzio-Andzelm (1994) Structure 2, 345-355に調査されたように、保存され
た触媒作用を有する核（catalytic core）を明らかにしている。この核は、平行
でない（anti-parallel）β-シート（sheet）を主に有する小さなN末端のローブ
と、大部分がα-へリカル（helical）をなす大きなC末端のローブとに折り畳ま
れている。これらのローブの間のインターフェースにおける深い裂け目は、裂け
目の開始部の近くのリン酸基とともに、ATP結合部位となっている。
【００４１】
さらに、プロテインキナーゼは、この触媒作用を有する核の内側の保存配列も
明らかにしている。そして、例えば、PKAの残基に与えられる等価な残基は、配
列間のマッチ（match）を最大にするような方法において、既知のキナーゼの配
列とキナーゼの配列との調整によって同定されても良い。調整は、目視による検
査（visual inspection）、及び／又は適するコンピュータプログラム、例えば
、ポリペプチドのパーセント同一性の計算も可能とするウィスコンシン大学遺伝
子コンピューティンググループのＧＡＰプログラムの使用によって行われても良
い。調整（Align）プログラム (Pearson (1994) in: Methods in Molecular Bio
logy, Computer Analysis of Sequence Data, Part II (Griffin, AM and Griff
in, HG eds) pp 365-389, Humana Press, Clifton).
明らかにしている。そして、例えば、PKAの残基に与えられる等価な残基は、配
列間のマッチ（match）を最大にするような方法において、既知のキナーゼの配
列とキナーゼの配列との調整によって同定されても良い。調整は、目視による検
査（visual inspection）、及び／又は適するコンピュータプログラム、例えば
、ポリペプチドのパーセント同一性の計算も可能とするウィスコンシン大学遺伝
子コンピューティンググループのＧＡＰプログラムの使用によって行われても良
い。調整（Align）プログラム (Pearson (1994) in: Methods in Molecular Bio
logy, Computer Analysis of Sequence Data, Part II (Griffin, AM and Griff
in, HG eds) pp 365-389, Humana Press, Clifton).
【００４２】
以下に、記述されかつ実施例２に記載されているように、アミノ酸配列 又は
三次元構造 (例えば、結晶学、或いは既知の構造に基づいたコンピュータによる
モデリング（modelling）)の比較は、当業者に周知の方法を用いて行われても良
い。
三次元構造 (例えば、結晶学、或いは既知の構造に基づいたコンピュータによる
モデリング（modelling）)の比較は、当業者に周知の方法を用いて行われても良
い。
【００４３】
MAPキナーゼ, MEK1, Cdk2及びErk2(例えば)は、完全長マウスPKAのLys76, Leu
116, Val80 及び／又はLys111を含む残基によって規定されるプロテインキナー
ゼA (PKA)の疎水性ポケットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプ
ロテインキナーゼではない。MEK1, Cdk2及びERK2は、完全長マウスPKAのLys76、
すなわちリジン又は同類置換でないものに等価な残基にヒスチジン、グルタミン
及びプロリンをそれぞれ有しており、Phe-Xaa-Xaa-Pheアミノ酸配列と相互作用
しない。MEK1, Cdk2及びERK2は、Phe-Xaa-Xaa-Pheでない(Phe-Xaa-Phe-Proであ
っても良い)アミノ酸配列モチーフと相互作用するより大きな疎水性ポケットを
有していても良い。従って、これらプロテインキナーゼは、プロテインキナーゼ
Aの疎水性ポケットに等価な位置において、前記疎水性ポケットを有していない
。
116, Val80 及び／又はLys111を含む残基によって規定されるプロテインキナー
ゼA (PKA)の疎水性ポケットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプ
ロテインキナーゼではない。MEK1, Cdk2及びERK2は、完全長マウスPKAのLys76、
すなわちリジン又は同類置換でないものに等価な残基にヒスチジン、グルタミン
及びプロリンをそれぞれ有しており、Phe-Xaa-Xaa-Pheアミノ酸配列と相互作用
しない。MEK1, Cdk2及びERK2は、Phe-Xaa-Xaa-Pheでない(Phe-Xaa-Phe-Proであ
っても良い)アミノ酸配列モチーフと相互作用するより大きな疎水性ポケットを
有していても良い。従って、これらプロテインキナーゼは、プロテインキナーゼ
Aの疎水性ポケットに等価な位置において、前記疎水性ポケットを有していない
。
【００４４】
相互作用ポリペプチドは、プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作
用しても良い。従って、相互作用ポリペプチドは、プロテインキナーゼと相互作
用するが、前記疎水性ポケットを形成する一つ以上の残基が突然変異、好ましく
は非保存アミノ酸に突然変異されたプロテインキナーゼとはほとんど相互作用し
ないものであることが好ましい。最も好ましくは、突然変異された残基は、完全
長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111を含む残基によって規
定されたPKAの疎水性ポケットにおいて、 Lys76, Val80, Lys111 及び／又はLeu
116に等価な残基である。特に、PKAのLys76残基に等価な位置における残基がAla
に突然変異されたもの、及び／又はPKAのLeu116に等価な位置における残基がSer
, Asp又はGluに突然変異されたものが好ましい。
用しても良い。従って、相互作用ポリペプチドは、プロテインキナーゼと相互作
用するが、前記疎水性ポケットを形成する一つ以上の残基が突然変異、好ましく
は非保存アミノ酸に突然変異されたプロテインキナーゼとはほとんど相互作用し
ないものであることが好ましい。最も好ましくは、突然変異された残基は、完全
長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111を含む残基によって規
定されたPKAの疎水性ポケットにおいて、 Lys76, Val80, Lys111 及び／又はLeu
116に等価な残基である。特に、PKAのLys76残基に等価な位置における残基がAla
に突然変異されたもの、及び／又はPKAのLeu116に等価な位置における残基がSer
, Asp又はGluに突然変異されたものが好ましい。
【００４５】
当然のことながら、相互作用ポリペプチドは、プロテインキナーゼの付加（ad
ditional）領域と相互作用しても良い。例えば、PKAのC末端がPKAの疎水性ポケ
ットと相互作用する際に、Phe350のC末端のカルボキシル基で水素結合を形成す
るように、(PKAのN末端の触媒作用を有さない領域において)PKAのGln35に等価な
残基と (例えば、上記示唆された好ましいアミノ酸配列における酸性の残基又は
基を介して) 相互作用しても良い。
ditional）領域と相互作用しても良い。例えば、PKAのC末端がPKAの疎水性ポケ
ットと相互作用する際に、Phe350のC末端のカルボキシル基で水素結合を形成す
るように、(PKAのN末端の触媒作用を有さない領域において)PKAのGln35に等価な
残基と (例えば、上記示唆された好ましいアミノ酸配列における酸性の残基又は
基を介して) 相互作用しても良い。
【００４６】
相互作用は、上記に論じられている何れかの方法によって測定されるものとし
ても良い。特に、上記に且つ実施例１及び２に論じられているように、表面プラ
ズモン共鳴法を用いて測定されるものとしても良い。特に、上記に記載されてい
るように、プロテインキナーゼ及び突然変異されたプロテインキナーゼの相対的
な相互作用の強度が、相対的な定常状態での応答を測定することによって決定さ
れるものが好ましい。突然変異されていないプロテインキナーゼに対する(Rusで
表現される)応答は、突然変異されたプロテインキナーゼに対する応答の少なく
とも2, 5, 10, 30, 50, 80, 100, 200又は500倍であることが好ましい。
ても良い。特に、上記に且つ実施例１及び２に論じられているように、表面プラ
ズモン共鳴法を用いて測定されるものとしても良い。特に、上記に記載されてい
るように、プロテインキナーゼ及び突然変異されたプロテインキナーゼの相対的
な相互作用の強度が、相対的な定常状態での応答を測定することによって決定さ
れるものが好ましい。突然変異されていないプロテインキナーゼに対する(Rusで
表現される)応答は、突然変異されたプロテインキナーゼに対する応答の少なく
とも2, 5, 10, 30, 50, 80, 100, 200又は500倍であることが好ましい。
【００４７】
例えば、アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有する相互作用ポリペプチ
ドは、プロテインキナーゼと同じポリペプチド鎖の一部とされても良い。例えば
、PKAはアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有し、そしてSGK, PKB 及びp70
S6キナーゼはアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyrを有しており
、ここで、Zaaは、ホスホセリン又はホスホトレオニンである。従って、相互作
用は、例えば、(ポリペプチドのプロテインキナーゼドメインの)疎水性ポケット
とポリペプチドの相互作用部分とにおいての、例えば、一本鎖（single）のポリ
ペプチドにおけるPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr配列を有するポリペプチドの部分が
相互作用する、分子内の相互作用であっても良い。代わりに、そのような２つ以
上のポリペプチド鎖は、例えば、一つのポリペプチド鎖の疎水性ポケットと別の
ポリペプチドの相互作用部分との間で、分子間の相互作用を介して二量体、又は
多量体を形成するものであっても良い。分子内の相互作用は、当業者にとって周
知である、架橋研究（cross-linking studies）、構造研究（structural studie
s）、例えば、分子の異なる部分に付けられた蛍光団（fluorophores）の分離の
変化が測定される蛍光共鳴エネルギー転移（fluorescence resonance energy tr
ansfer）(FRET)法を含む技術によって測定可能とされる。
ドは、プロテインキナーゼと同じポリペプチド鎖の一部とされても良い。例えば
、PKAはアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有し、そしてSGK, PKB 及びp70
S6キナーゼはアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyrを有しており
、ここで、Zaaは、ホスホセリン又はホスホトレオニンである。従って、相互作
用は、例えば、(ポリペプチドのプロテインキナーゼドメインの)疎水性ポケット
とポリペプチドの相互作用部分とにおいての、例えば、一本鎖（single）のポリ
ペプチドにおけるPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr配列を有するポリペプチドの部分が
相互作用する、分子内の相互作用であっても良い。代わりに、そのような２つ以
上のポリペプチド鎖は、例えば、一つのポリペプチド鎖の疎水性ポケットと別の
ポリペプチドの相互作用部分との間で、分子間の相互作用を介して二量体、又は
多量体を形成するものであっても良い。分子内の相互作用は、当業者にとって周
知である、架橋研究（cross-linking studies）、構造研究（structural studie
s）、例えば、分子の異なる部分に付けられた蛍光団（fluorophores）の分離の
変化が測定される蛍光共鳴エネルギー転移（fluorescence resonance energy tr
ansfer）(FRET)法を含む技術によって測定可能とされる。
【００４８】
アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrを有するポリペプチ
ドは、Ser/Thr残基のリン酸化状態（state）に依存した異なるアフィニティー（
affinity）でプロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しても良い。
従って、ポリペプチドは、Ser/Thr残基上でリン酸化される場合のほうがそんな
にリン酸化されてない場合よりも強く疎水性ポケットと相互作用しても良い。リ
ン酸化されてない場合、相互作用は、上記記載されている一つ以上の方法を用い
ても実質的には検出不可能であるか、又はリン酸化された場合よりも約2, 5又は
10倍弱くなるとされても良い。従って、例えば、SGK, PKB、又はp70 S6キナーゼ
のプロテインキナーゼドメインと配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Ty
rを有する部分との間における分子内・分子間相互作用は、実質的には前記配列
がSer/Thr残基上でリン酸化される場合のみに生じるとしても良い。相互作用は
、プロテインキナーゼドメイン(又は、完全なポリペプチド)の活性及び／又は安
定性を調整、例えば増加させることとしても良い。
ドは、Ser/Thr残基のリン酸化状態（state）に依存した異なるアフィニティー（
affinity）でプロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しても良い。
従って、ポリペプチドは、Ser/Thr残基上でリン酸化される場合のほうがそんな
にリン酸化されてない場合よりも強く疎水性ポケットと相互作用しても良い。リ
ン酸化されてない場合、相互作用は、上記記載されている一つ以上の方法を用い
ても実質的には検出不可能であるか、又はリン酸化された場合よりも約2, 5又は
10倍弱くなるとされても良い。従って、例えば、SGK, PKB、又はp70 S6キナーゼ
のプロテインキナーゼドメインと配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Ty
rを有する部分との間における分子内・分子間相互作用は、実質的には前記配列
がSer/Thr残基上でリン酸化される場合のみに生じるとしても良い。相互作用は
、プロテインキナーゼドメイン(又は、完全なポリペプチド)の活性及び／又は安
定性を調整、例えば増加させることとしても良い。
【００４９】
例えば、アミノ酸配列モチーフPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有する相互作用ポ
リペプチドは、実施例１に記載されているようなアミノ酸配列(PIFと名付けられ
た)EDVKKHPFFRLIDWSALMDKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFTSEAPILTPPREPRILSEEEQEMFRD
FDYIADWC、又は (GST-PIFと名付けられた) (GST)- EDVKKHPFFRLIDWSALMDKKVKPPF
IPTIRGREDVSNFDDEFTSEAPILTPPREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC、又は(PIFtideと名付
けられた)REPRILSEEEQEMFRDFDYIADWCを有するポリペプチドと実質的には同じ方
法で、PDK1と結合、及びp70 S6キナーゼに対する活性を阻害することができるポ
リペプチドであることが好ましい。ここで、当業者において周知のように、GST
はグルタチオンS-トランスフェラーゼの部分を表し、そしてアミノ酸配列モチー
フに対応する配列は下線が引かれている。
リペプチドは、実施例１に記載されているようなアミノ酸配列(PIFと名付けられ
た)EDVKKHPFFRLIDWSALMDKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFTSEAPILTPPREPRILSEEEQEMFRD
FDYIADWC、又は (GST-PIFと名付けられた) (GST)- EDVKKHPFFRLIDWSALMDKKVKPPF
IPTIRGREDVSNFDDEFTSEAPILTPPREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC、又は(PIFtideと名付
けられた)REPRILSEEEQEMFRDFDYIADWCを有するポリペプチドと実質的には同じ方
法で、PDK1と結合、及びp70 S6キナーゼに対する活性を阻害することができるポ
リペプチドであることが好ましい。ここで、当業者において周知のように、GST
はグルタチオンS-トランスフェラーゼの部分を表し、そしてアミノ酸配列モチー
フに対応する配列は下線が引かれている。
【００５０】
代えて若しくは加えて、 例えば、アミノ酸配列モチーフPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe
/Tyrを有する相互作用ポリペプチドは、実施例２に記載されているようなアミノ
酸配列(PIFと名付けられた) EDVKKHPFFRLIDWSALMDKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFTSE
APILTPPREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC 、又は(GST-PIFと名付けられた) (GST)- ED
VKKHPFFRLIDWSALMDKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFTSEAPILTPPREPRILSEEEQEMFRDFDYIA
DWC、又は(PIFtideと名付けられた)REPRILSEEEQEMFRDFDYIADWCを有するポリペプ
チドと実質的には同じ方法で、PDK1と結合、及び (T308tideと名付けられた)KTF
CGTPEYLAPEVRR(すなわち、下線が引かれた残基のリン酸化)に対する活性を増加
させることができるポリペプチドであることが好ましい。
/Tyrを有する相互作用ポリペプチドは、実施例２に記載されているようなアミノ
酸配列(PIFと名付けられた) EDVKKHPFFRLIDWSALMDKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFTSE
APILTPPREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC 、又は(GST-PIFと名付けられた) (GST)- ED
VKKHPFFRLIDWSALMDKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFTSEAPILTPPREPRILSEEEQEMFRDFDYIA
DWC、又は(PIFtideと名付けられた)REPRILSEEEQEMFRDFDYIADWCを有するポリペプ
チドと実質的には同じ方法で、PDK1と結合、及び (T308tideと名付けられた)KTF
CGTPEYLAPEVRR(すなわち、下線が引かれた残基のリン酸化)に対する活性を増加
させることができるポリペプチドであることが好ましい。
【００５１】
上記に定義されたように、本明細書においては、記号Zaaを除き、IUPAC-IUB生
化学命名委員会（the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）の３
文字アミノ酸コードが用いられている。特に、Xaaは如何なるアミノ酸であって
も良いことを表している。Xaa及びZaaは天然に発生するアミノ酸を表しているこ
とが好ましい。少なくとも上記で定義された共通配列に対応するアミノ酸は、Ｌ
アミノ酸であることが好ましい。
化学命名委員会（the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）の３
文字アミノ酸コードが用いられている。特に、Xaaは如何なるアミノ酸であって
も良いことを表している。Xaa及びZaaは天然に発生するアミノ酸を表しているこ
とが好ましい。少なくとも上記で定義された共通配列に対応するアミノ酸は、Ｌ
アミノ酸であることが好ましい。
【００５２】
プロテインキナーゼ活性の調整には、プロテインキナーゼ活性の阻害又は増加
が含まれている。
が含まれている。
【００５３】
調整されたPDK1のプロテインキナーゼ活性は、アミノ酸配列Thr/Ser-Phe-Cys-
Gly-Thr-Xaa-Glu-Leu ("PDK1" 活性)を有するポリペプチドにおける下線が引か
れた残基のリン酸化であるとしても良い。代えて若しくは加えて、調整された（
modulated）活性は、アミノ酸配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyr (「PDK2」
活性)を有するポリペプチドにおける下線が引かれた残基のリン酸化であるとし
ても良い。ポリペプチドは、例えば、PKB, SGK, p70 S6キナーゼ, PKC又は (ア
ミノ酸配列Thr/Ser-Phe-Cys-Gly-Thr-Xaa-Glu-Leuを有するポリペプチドにおけ
る下線が引かれた残基のリン酸化にのみ関連する) PKA ポリペプチドであっても
良い。
Gly-Thr-Xaa-Glu-Leu ("PDK1" 活性)を有するポリペプチドにおける下線が引か
れた残基のリン酸化であるとしても良い。代えて若しくは加えて、調整された（
modulated）活性は、アミノ酸配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyr (「PDK2」
活性)を有するポリペプチドにおける下線が引かれた残基のリン酸化であるとし
ても良い。ポリペプチドは、例えば、PKB, SGK, p70 S6キナーゼ, PKC又は (ア
ミノ酸配列Thr/Ser-Phe-Cys-Gly-Thr-Xaa-Glu-Leuを有するポリペプチドにおけ
る下線が引かれた残基のリン酸化にのみ関連する) PKA ポリペプチドであっても
良い。
【００５４】
調整されたPKAのプロテインキナーゼ活性は、アミノ酸配列Arg-Arg-X-Ser-Yを
有するポリペプチドにおける下線が引かれた残基のリン酸化であるとしても良い
。ここで、Xは如何なる小さな残基であっても良く、そしてYは大きな疎水性基で
ある。PKAの基質は、 Ser133においてリン酸化される転写因子CREBと、Ser112及
びSer155においてリン酸化されるポリペプチドBADを含んでいる。
有するポリペプチドにおける下線が引かれた残基のリン酸化であるとしても良い
。ここで、Xは如何なる小さな残基であっても良く、そしてYは大きな疎水性基で
ある。PKAの基質は、 Ser133においてリン酸化される転写因子CREBと、Ser112及
びSer155においてリン酸化されるポリペプチドBADを含んでいる。
【００５５】
調整されたPKB, SGK、又はp70 S6キナーゼのプロテインキナーゼ活性は、アミ
ノ酸配列Arg-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thrを有するポリペプチドにおける下線が引
かれた残基のリン酸化であるとしても良い。ポリペプチドは、グリコーゲン合成
酵素キナーゼ3 (GSK3), 40 Sリボソームサブユニット（ subunit） S6, BAD, 6-
ホスホフルクト（phosphofructo）-2-キナーゼ, ホスホダイエステラーゼ（phos
phodiesterase）3b, ヒトカスパーゼ（caspase）9, 内皮の一酸化窒素合成酵素
、又はBRACA1であっても良い。
ノ酸配列Arg-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thrを有するポリペプチドにおける下線が引
かれた残基のリン酸化であるとしても良い。ポリペプチドは、グリコーゲン合成
酵素キナーゼ3 (GSK3), 40 Sリボソームサブユニット（ subunit） S6, BAD, 6-
ホスホフルクト（phosphofructo）-2-キナーゼ, ホスホダイエステラーゼ（phos
phodiesterase）3b, ヒトカスパーゼ（caspase）9, 内皮の一酸化窒素合成酵素
、又はBRACA1であっても良い。
【００５６】
本発明の一方法によって同定された化合物は、例えば、天然に発生する異なる
ポリペプチド等の異なる基質をリン酸化するプロテインキナーゼの能力を異なる
程度まで調整しても良い。例えば、実施例２に論じられているように、化合物は
、一つの基質に関連するプロテインキナーゼ活性を阻害しても良いが、第２の基
質に関連するプロテインキナーゼ活性を増加しても良い。例えば、プロテインキ
ナーゼ活性は、SGK, p70 S6キナーゼ及び／又はPKCに比較して、PKBに対しては
異なる程度まで調整されても良い。
ポリペプチド等の異なる基質をリン酸化するプロテインキナーゼの能力を異なる
程度まで調整しても良い。例えば、実施例２に論じられているように、化合物は
、一つの基質に関連するプロテインキナーゼ活性を阻害しても良いが、第２の基
質に関連するプロテインキナーゼ活性を増加しても良い。例えば、プロテインキ
ナーゼ活性は、SGK, p70 S6キナーゼ及び／又はPKCに比較して、PKBに対しては
異なる程度まで調整されても良い。
【００５７】
当然のことながら、例えば、プロテインキナーゼに結合するための発見された
化合物の調整的な阻害作用（inhibitory action）(或いは、ポリペプチド又は化
合物の結合の阻害)は、化合物の存在下において、酵素活性(例えば、PDK1及び／
又はPDK2プロテインキナーゼ活性)の検定（assay）の実行により確認されても良
い。
化合物の調整的な阻害作用（inhibitory action）(或いは、ポリペプチド又は化
合物の結合の阻害)は、化合物の存在下において、酵素活性(例えば、PDK1及び／
又はPDK2プロテインキナーゼ活性)の検定（assay）の実行により確認されても良
い。
【００５８】
前記相互作用ポリペプチドは、PRK1, PRK2, 例えばPKCζ, PKCα又はPKCδ等
のPKCイソ型, PKA, SGK, p70 S6キナーゼ又はPKB、好ましくはPKA, PRK1, PRK2,
PKCα, PKCδ又はPKCζのC末端部分から誘導されても良い。Balendran et al (
1999), supraに記載されているように、前記相互作用ポリペプチドは、例えばカ
スパーゼ（Caspase） 3により、タンパク質分解的裂け目（proteolytic cleavag
e）によってPRK2から誘導されても良い。
のPKCイソ型, PKA, SGK, p70 S6キナーゼ又はPKB、好ましくはPKA, PRK1, PRK2,
PKCα, PKCδ又はPKCζのC末端部分から誘導されても良い。Balendran et al (
1999), supraに記載されているように、前記相互作用ポリペプチドは、例えばカ
スパーゼ（Caspase） 3により、タンパク質分解的裂け目（proteolytic cleavag
e）によってPRK2から誘導されても良い。
【００５９】
従って、相互作用ポリペプチドは、残基701 からPRK2のC末端までのアミノ酸
配列を有しても良いし、又は実質的に構成されていても良い。これは、PDK1-相
互作用断片 (PIF;Balendran et al (1999), supra参照)と名付けられたPRK2のC
末端の77個のアミノ酸に対応しても良い。PRK2のPIF領域は、PRK2のキナーゼ触
媒ドメインに対して直後の（immediately）のC末端に存在している。ポリペプチ
ドは、PRK2 の(領域Bと名付けられた)残基960から984のアミノ酸配列、又は、図
7Eに示されるように、PRK1, PRK1, PKBα, p70S6キナーゼ, PKB, SGK, 例えばPK
Cζ又はPKCα等のPKCイソ型、又はKAβの対応する領域のアミノ酸配列を有して
も良いし、又は実質的に構成されていても良い。実施例２に記載されかつ図7に
示されるように、ポリペプチドは、PKAのC末端の223又は62個のアミノ酸を有し
ても良いし、構成されていても良い。PKCイソ型は、例えば、Mellor & Parker (
1998) Biochem J 332, 281-292に記載されている。共通配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Ph
e/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、(1)
ポリペプチドは共通配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-PhosphoSer/PhosphoThr-Phe/
Tyrに対応するアミノ酸配列を有するため、セリン又はトレオニン残基がリン酸
化されたとき、又は (2) セリン又はトレオニン残基がアスパラギン酸又はグル
タミン酸残基に置き換えられた場合、PDK1と相互作用可能である。PKCδは、共
通配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrに対応するアミノ酸配列(図15
参照)を有し、リン酸化されない場合にPDK1と相互作用可能である。
配列を有しても良いし、又は実質的に構成されていても良い。これは、PDK1-相
互作用断片 (PIF;Balendran et al (1999), supra参照)と名付けられたPRK2のC
末端の77個のアミノ酸に対応しても良い。PRK2のPIF領域は、PRK2のキナーゼ触
媒ドメインに対して直後の（immediately）のC末端に存在している。ポリペプチ
ドは、PRK2 の(領域Bと名付けられた)残基960から984のアミノ酸配列、又は、図
7Eに示されるように、PRK1, PRK1, PKBα, p70S6キナーゼ, PKB, SGK, 例えばPK
Cζ又はPKCα等のPKCイソ型、又はKAβの対応する領域のアミノ酸配列を有して
も良いし、又は実質的に構成されていても良い。実施例２に記載されかつ図7に
示されるように、ポリペプチドは、PKAのC末端の223又は62個のアミノ酸を有し
ても良いし、構成されていても良い。PKCイソ型は、例えば、Mellor & Parker (
1998) Biochem J 332, 281-292に記載されている。共通配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Ph
e/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、(1)
ポリペプチドは共通配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-PhosphoSer/PhosphoThr-Phe/
Tyrに対応するアミノ酸配列を有するため、セリン又はトレオニン残基がリン酸
化されたとき、又は (2) セリン又はトレオニン残基がアスパラギン酸又はグル
タミン酸残基に置き換えられた場合、PDK1と相互作用可能である。PKCδは、共
通配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrに対応するアミノ酸配列(図15
参照)を有し、リン酸化されない場合にPDK1と相互作用可能である。
【００６０】
前記相互作用ポリペプチドは、配列REPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC又はREPRILSEEE
QEMARDFDYIADWC又はREPRILSEEEQEMFGDFDYIADWCを有しても良いし、実質的に構成
されていても良い。さらに、前記相互作用ポリペプチドは、配列EDVKKHPFFRLIDW
SALMDKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFTSEAPILTPPを有していても良い(Balendran et a
l (1999), supra and GB 9906245.7参照)。
QEMARDFDYIADWC又はREPRILSEEEQEMFGDFDYIADWCを有しても良いし、実質的に構成
されていても良い。さらに、前記相互作用ポリペプチドは、配列EDVKKHPFFRLIDW
SALMDKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFTSEAPILTPPを有していても良い(Balendran et a
l (1999), supra and GB 9906245.7参照)。
【００６１】
前記相互作用ポリペプチドは、上記示唆された配列の突然変異体を有していて
も良いし、前記配列の突然変異体から実質的に構成されていても良い。好ましく
は、そのような突然変異体の中で、上記示唆された配列においてアミノ酸配列Ph
e/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrに対応する残基が変化しなくても、又は変化しても、配
列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを未だに有しているものである。前記配列のC又はN
末端の約2, 5、又は10個以下のアミノ酸を有する残基は、不変であるものが好ま
しい。相互作用ポリペプチドは、約400, 380, 350, 300, 250, 200, 150, 100,
80, 50, 40、又は30個よりも少ないアミノ酸を有するものが好ましい。
も良いし、前記配列の突然変異体から実質的に構成されていても良い。好ましく
は、そのような突然変異体の中で、上記示唆された配列においてアミノ酸配列Ph
e/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrに対応する残基が変化しなくても、又は変化しても、配
列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを未だに有しているものである。前記配列のC又はN
末端の約2, 5、又は10個以下のアミノ酸を有する残基は、不変であるものが好ま
しい。相互作用ポリペプチドは、約400, 380, 350, 300, 250, 200, 150, 100,
80, 50, 40、又は30個よりも少ないアミノ酸を有するものが好ましい。
【００６２】
実施例１及び２において記載されているように、前記相互作用ポリペプチドは
GST部分を有していても良い。これは、前記相互作用ポリペプチドの精製、及び
／又は検出に有用となるであろう。前記相互作用ポリペプチドは、当業者に周知
のように、ビオチニル化（biotinylated）されても良いし 又は、さもなければ
、例えば6His, HA, myc又は他の抗原標識（epitope tag）によって標識されても
良い。
GST部分を有していても良い。これは、前記相互作用ポリペプチドの精製、及び
／又は検出に有用となるであろう。前記相互作用ポリペプチドは、当業者に周知
のように、ビオチニル化（biotinylated）されても良いし 又は、さもなければ
、例えば6His, HA, myc又は他の抗原標識（epitope tag）によって標識されても
良い。
【００６３】
本発明の更なる側面は、表面プラズモン共鳴法において測定表面としての使用
に適した粒子の表面上に固定される前記相互作用ポリペプチドを提供することで
ある。 表面は、例えば、センサーチップCM5（商標）又はSAセンサーチップ（商
標）等の表面であるセンサーチップ（商標）の表面であっても良い。相互作用ポ
リペプチドは、PIF又はPIFtideでないものが好ましい。相互作用ポリペプチドは
、アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有し、アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa
-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrを有さな
いものであることがさらに好ましい。相互作用ポリペプチドは、約400, 380, 35
0, 300, 250, 200, 150, 100, 80, 50, 40又は 30個よりも少ないアミノ酸を有
するものが好ましい。
に適した粒子の表面上に固定される前記相互作用ポリペプチドを提供することで
ある。 表面は、例えば、センサーチップCM5（商標）又はSAセンサーチップ（商
標）等の表面であるセンサーチップ（商標）の表面であっても良い。相互作用ポ
リペプチドは、PIF又はPIFtideでないものが好ましい。相互作用ポリペプチドは
、アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有し、アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa
-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrを有さな
いものであることがさらに好ましい。相互作用ポリペプチドは、約400, 380, 35
0, 300, 250, 200, 150, 100, 80, 50, 40又は 30個よりも少ないアミノ酸を有
するものが好ましい。
【００６４】
前記プロテインキナーゼと相互作用ポリペプチドとの相互作用を阻害、又は促
進させる化合物の能力は、適する如何なる方法を用いて相互作用を検出／測定す
ることによって測定されても良いし、例えば、約100μM, 30μM, 10μM, 3μM,
1μM, 0.1μM, 0.01μM、及び／又は0.001μM等の異なる濃度の化合物の存在下
にて検出／測定された相互作用を、例えば、化合物の不在及び存在下において比
較することによって測定されても良い。適する方法には、上記論じられかつ実施
例１、又は実施例２に記載された方法に類似した方法、例えば、酵母ツーハイブ
リッド相互作用法，共精製法，エリザ法、共免疫沈降法、表面プラズモン共鳴法
が含まれる。
進させる化合物の能力は、適する如何なる方法を用いて相互作用を検出／測定す
ることによって測定されても良いし、例えば、約100μM, 30μM, 10μM, 3μM,
1μM, 0.1μM, 0.01μM、及び／又は0.001μM等の異なる濃度の化合物の存在下
にて検出／測定された相互作用を、例えば、化合物の不在及び存在下において比
較することによって測定されても良い。適する方法には、上記論じられかつ実施
例１、又は実施例２に記載された方法に類似した方法、例えば、酵母ツーハイブ
リッド相互作用法，共精製法，エリザ法、共免疫沈降法、表面プラズモン共鳴法
が含まれる。
【００６５】
本発明の更なる側面は、プロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポケットに等価
な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼのプロテインキナ
ーゼ活性を調整する化合物を同定する方法を提供することである。ここで、前記
疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリン酸化速度又
はリン酸化度に係る前記化合物の有効性が、相互作用ポリペプチドの存在下で前
記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼにより測定される。そして、前記リ
ン酸化速度又はリン酸化度を調整する化合物が選択される。さらに、前記相互作
用ポリペプチドが、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミ
ノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロテインキナーゼの
疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr を有し、かつ、疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのセパレートポリ
ペプチド鎖に含まれている。さらに、基質ポリペプチドが 400 個、より好まし
くは380, 350, 300, 250, 200, 150, 120, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25又
は20個よりも少ないアミノ酸を有している。
な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼのプロテインキナ
ーゼ活性を調整する化合物を同定する方法を提供することである。ここで、前記
疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリン酸化速度又
はリン酸化度に係る前記化合物の有効性が、相互作用ポリペプチドの存在下で前
記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼにより測定される。そして、前記リ
ン酸化速度又はリン酸化度を調整する化合物が選択される。さらに、前記相互作
用ポリペプチドが、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミ
ノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロテインキナーゼの
疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr を有し、かつ、疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのセパレートポリ
ペプチド鎖に含まれている。さらに、基質ポリペプチドが 400 個、より好まし
くは380, 350, 300, 250, 200, 150, 120, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25又
は20個よりも少ないアミノ酸を有している。
【００６６】
化合物の有効性は、例えば、約100μM, 30μM, 10μM, 3μM, 1μM, 0.1μM,
0.01μM、及び／又は0.001μM等の異なる濃度の化合物の存在下にて前記疎水性
ポケットを含むプロテインキナーゼによる前記基質ポリペプチドのリン酸化速度
又はリン酸化度を、例えば、化合物の不在及び存在下において比較することによ
って測定されても良い。
0.01μM、及び／又は0.001μM等の異なる濃度の化合物の存在下にて前記疎水性
ポケットを含むプロテインキナーゼによる前記基質ポリペプチドのリン酸化速度
又はリン酸化度を、例えば、化合物の不在及び存在下において比較することによ
って測定されても良い。
【００６７】
基質ポリペプチドは、例えば、アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有す
る相互作用ポリペプチドである一部分を含んでいても良い。従って、基質ポリペ
プチドは、非重複相互作用部分及び基質部分を有していても良い。基質ポリペプ
チドは、(1) 例えば、 アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを含む一つの相互
作用部分、そして (2) 例えば、PDK1, PKB, SGK, p70 S6キナーゼ又はPKA等のプ
ロテインキナーゼA (PKA)の前記疎水性ポケットに等価な位置において疎水性ポ
ケットを有するプロテインキナーゼによるリン酸化のための共通配列を含む基質
部分（例えば、配列Thr/Ser-Phe-Cys-Gly-Thr-Xaa-Glu-Leu, Phe-Xaa-Xaa-Phe-S
er/Thr-Phe/Tyr, Arg-Arg-X-Ser-Val or Arg-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thr）を含ん
でいても良い。前記基質部分及び相互作用部分に関連して示唆されたアミノ酸配
列は、約1個と100 〜150個の間、好ましくは約5個と50個の間、さらに好ましく
は約10個と30個の間、例えば、約26個のアミノ酸で分けられるものが好ましい。
る相互作用ポリペプチドである一部分を含んでいても良い。従って、基質ポリペ
プチドは、非重複相互作用部分及び基質部分を有していても良い。基質ポリペプ
チドは、(1) 例えば、 アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを含む一つの相互
作用部分、そして (2) 例えば、PDK1, PKB, SGK, p70 S6キナーゼ又はPKA等のプ
ロテインキナーゼA (PKA)の前記疎水性ポケットに等価な位置において疎水性ポ
ケットを有するプロテインキナーゼによるリン酸化のための共通配列を含む基質
部分（例えば、配列Thr/Ser-Phe-Cys-Gly-Thr-Xaa-Glu-Leu, Phe-Xaa-Xaa-Phe-S
er/Thr-Phe/Tyr, Arg-Arg-X-Ser-Val or Arg-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thr）を含ん
でいても良い。前記基質部分及び相互作用部分に関連して示唆されたアミノ酸配
列は、約1個と100 〜150個の間、好ましくは約5個と50個の間、さらに好ましく
は約10個と30個の間、例えば、約26個のアミノ酸で分けられるものが好ましい。
【００６８】
本発明の更なる側面は、前記基質部分及び相互作用部分に関連して示唆された
アミノ酸配列は、約1個と100 〜150個の間、好ましくは約5個と50個の間、さら
に好ましくは約10個と30個の間、例えば、約26個のアミノ酸で分けられる、上記
定義された基質ポリペプチドを提供することである。
アミノ酸配列は、約1個と100 〜150個の間、好ましくは約5個と50個の間、さら
に好ましくは約10個と30個の間、例えば、約26個のアミノ酸で分けられる、上記
定義された基質ポリペプチドを提供することである。
【００６９】
従って、疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼがPDK1である場合に、基質
ポリペプチドは、例えば、配列KTFCGTPEYLAPEV (基質部分) 及び,配列EPRILSEEE
QEMFRDFDYIADWC (相互作用ポリペプチド部分、例えば、疎水性ポケット結合部分
)を含んでいても良い。例えば、基質ポリペプチドは、配列 KTFCGTPEYLAPEVRREP
RILSEEEQEMFRDFDYIADWCを有していても良いし、配列KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEE
QEMFRDFDYIADWCから構成されても良い。
ポリペプチドは、例えば、配列KTFCGTPEYLAPEV (基質部分) 及び,配列EPRILSEEE
QEMFRDFDYIADWC (相互作用ポリペプチド部分、例えば、疎水性ポケット結合部分
)を含んでいても良い。例えば、基質ポリペプチドは、配列 KTFCGTPEYLAPEVRREP
RILSEEEQEMFRDFDYIADWCを有していても良いし、配列KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEE
QEMFRDFDYIADWCから構成されても良い。
【００７０】
代わりに、基質部分及び相互作用部分は、セパレートポリペプチド鎖上、すな
わち、セパレート基質ポリペプチド及び相互作用ポリペプチドとして存在しても
良い。従って、疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼがPDK1である場合に、
基質ポリペプチドは、配列KTFCGTPEYLAPEVを有していても良いし、配列KTFCGTPE
YLAPEVから構成されていても良く、そして、相互作用ポリペプチドは、配列EPRI
LSEEEQEMFRDFDYIADWCを有していても良いし、配列EPRILSEEEQEMFRDFDYIADWCから
構成されていても良い。
わち、セパレート基質ポリペプチド及び相互作用ポリペプチドとして存在しても
良い。従って、疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼがPDK1である場合に、
基質ポリペプチドは、配列KTFCGTPEYLAPEVを有していても良いし、配列KTFCGTPE
YLAPEVから構成されていても良く、そして、相互作用ポリペプチドは、配列EPRI
LSEEEQEMFRDFDYIADWCを有していても良いし、配列EPRILSEEEQEMFRDFDYIADWCから
構成されていても良い。
【００７１】
当然のことながら、化合物は、PDK1、又は前記相互作用ポリペプチド、又はそ
の両方と相互作用しても良い。
の両方と相互作用しても良い。
【００７２】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKAの Lys76, Leu116, Val80 及び／又
はLys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポ
ケットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼのプ
ロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法を提供することである。
ここで、前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリ
ン酸化速度又はリン酸化度に係る前記化合物の有効性が、前記疎水性ポケットを
含むプロテインキナーゼにより測定され、そして、前記リン酸化速度又はリン酸
化度を調整する化合物が選択される。さらに、化合物の有効性が相互作用ポリペ
プチドが(実質的に存在しない状態を含んで)存在しない状態で測定される。そし
て、前記相互作用ポリペプチドが、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互
作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロテ
インキナーゼの疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr
-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有している。さらに、基質ポリペプチドが 400 個、より好
ましくは380, 350, 300, 250, 200, 150, 120, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30,
25又は20個よりも少ないアミノ酸を有している。
はLys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポ
ケットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼのプ
ロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法を提供することである。
ここで、前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリ
ン酸化速度又はリン酸化度に係る前記化合物の有効性が、前記疎水性ポケットを
含むプロテインキナーゼにより測定され、そして、前記リン酸化速度又はリン酸
化度を調整する化合物が選択される。さらに、化合物の有効性が相互作用ポリペ
プチドが(実質的に存在しない状態を含んで)存在しない状態で測定される。そし
て、前記相互作用ポリペプチドが、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互
作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロテ
インキナーゼの疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr
-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有している。さらに、基質ポリペプチドが 400 個、より好
ましくは380, 350, 300, 250, 200, 150, 120, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30,
25又は20個よりも少ないアミノ酸を有している。
【００７３】
従って、基質ポリペプチド及び疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼは、
プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-X
aa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相
互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有する相互作
用ポリペプチドを含まない。
プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-X
aa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相
互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有する相互作
用ポリペプチドを含まない。
【００７４】
化合物は、相互作用ポリペプチド (プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相
互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロ
テインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/T
yr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有する)とプロテインキナーゼとの相互作用の有効性を模
倣しても良い。
互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロ
テインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/T
yr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有する)とプロテインキナーゼとの相互作用の有効性を模
倣しても良い。
【００７５】
化合物の有効性は、例えば、約100μM, 30μM, 10μM, 3μM, 1μM, 0.1μM,
0.01μM、及び／又は0.001μM等の異なる濃度の化合物の存在下にて前記疎水性
ポケットを含むプロテインキナーゼによる前記基質ポリペプチドのリン酸化速度
又はリン酸化度を、例えば、化合物の不在及び存在下において比較することによ
って測定されても良い。
0.01μM、及び／又は0.001μM等の異なる濃度の化合物の存在下にて前記疎水性
ポケットを含むプロテインキナーゼによる前記基質ポリペプチドのリン酸化速度
又はリン酸化度を、例えば、化合物の不在及び存在下において比較することによ
って測定されても良い。
【００７６】
最も好ましくは、プロテインキナーゼはPDK1であり、そして基質ポリペプチド
は、アミノ酸配列KTFCGTPEYLAPEV又はKTFCGTPEYLAPEVRRからなるか、又はアミノ
酸配列KTFCGTPEYLAPEV又はKTFCGTPEYLAPEVRRを含んでいる。化合物は、PDK1上に
おける相互作用ポリペプチドの有効性を模倣する化合物は、PDK1によるそのよう
な基質ポリペプチドのリン酸化速度又はリン酸化度を増加させても良い。
は、アミノ酸配列KTFCGTPEYLAPEV又はKTFCGTPEYLAPEVRRからなるか、又はアミノ
酸配列KTFCGTPEYLAPEV又はKTFCGTPEYLAPEVRRを含んでいる。化合物は、PDK1上に
おける相互作用ポリペプチドの有効性を模倣する化合物は、PDK1によるそのよう
な基質ポリペプチドのリン酸化速度又はリン酸化度を増加させても良い。
【００７７】
「前記相互作用ポリペプチドとプロテインキナーゼとの相互作用の有効性を模
倣する」とは、実施例１及び２において論じられているように、化合物が、プロ
テインキナーゼにおける相互作用ポリペプチドの例えば、プロテインキナーゼ活
性又は安定性の有効性と同じである、疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼ
にかかる例えば、プロテインキナーゼ活性又は安定性の量的又は質的な有効性を
有しているということ意味している。例えば、相互作用ポリペプチドPIFは、PDK
1がポリペプチドKTFCGTPEYLAPEVRRをリン酸化する速度を増加させる。； PIFの
模倣物は、(PIFが存在しない状態で) PDK1が前記ポリペプチドをリン酸化する速
度を増加させても良い。
倣する」とは、実施例１及び２において論じられているように、化合物が、プロ
テインキナーゼにおける相互作用ポリペプチドの例えば、プロテインキナーゼ活
性又は安定性の有効性と同じである、疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼ
にかかる例えば、プロテインキナーゼ活性又は安定性の量的又は質的な有効性を
有しているということ意味している。例えば、相互作用ポリペプチドPIFは、PDK
1がポリペプチドKTFCGTPEYLAPEVRRをリン酸化する速度を増加させる。； PIFの
模倣物は、(PIFが存在しない状態で) PDK1が前記ポリペプチドをリン酸化する速
度を増加させても良い。
【００７８】
実施例１及び２に示されるように、プロテインキナーゼ及び相互作用ポリペプ
チドは、例えば、BiaCore測定等の細胞フリー（cell-free）システムにおいて検
出される複合物（complex）を形成しても良い。複合物の形成や安定性を阻害又
は促進させる化合物の能力は、プロテインキナーゼを曝露すること、及び／又は
ポリペプチドの相互作用、及び／又はプロテインキナーゼの複合物、及び化合物
へのポリペプチドの相互作用、アフィニティーにおける何れかの変化の決定、化
合物の存在下における相互作用の程度又は安定性によって決定されても良い。GS
T-PIFとHis-tagged PDK1との間に関する概算の平行解離定数は、600nMとしても
良い。表面プラズモン共鳴測定を用いて検出される上記領域Ｂ(PIF)に対応する
固定化され（immobilised）かつビオチニル化された（biotinylated）２４残基
の合成ペプチドと、His-PDK1との間の概算の解離定数Ｋdは800 nM、又は1.5μM
であった。
チドは、例えば、BiaCore測定等の細胞フリー（cell-free）システムにおいて検
出される複合物（complex）を形成しても良い。複合物の形成や安定性を阻害又
は促進させる化合物の能力は、プロテインキナーゼを曝露すること、及び／又は
ポリペプチドの相互作用、及び／又はプロテインキナーゼの複合物、及び化合物
へのポリペプチドの相互作用、アフィニティーにおける何れかの変化の決定、化
合物の存在下における相互作用の程度又は安定性によって決定されても良い。GS
T-PIFとHis-tagged PDK1との間に関する概算の平行解離定数は、600nMとしても
良い。表面プラズモン共鳴測定を用いて検出される上記領域Ｂ(PIF)に対応する
固定化され（immobilised）かつビオチニル化された（biotinylated）２４残基
の合成ペプチドと、His-PDK1との間の概算の解離定数Ｋdは800 nM、又は1.5μM
であった。
【００７９】
前記プロテインキナーゼ、相互作用ポリペプチド、及び／又は、適切な場合に
は基質ポリペプチドは、組み換えられた又は合成されたポリペプチドであること
が好ましい。前記プロテインキナーゼ、相互作用ポリペプチド、及び／又は、適
切な場合には基質ポリペプチドは、本発明の方法に導入された場合実質的に純粋
であることがさらに好ましい。
は基質ポリペプチドは、組み換えられた又は合成されたポリペプチドであること
が好ましい。前記プロテインキナーゼ、相互作用ポリペプチド、及び／又は、適
切な場合には基質ポリペプチドは、本発明の方法に導入された場合実質的に純粋
であることがさらに好ましい。
【００８０】
「実質的に純粋な」とは、プロテインキナーゼ又は相互作用ポリペプチド又は
基質ポリペプチドには他のプロテインが実質的にないということを意味している
。従って、前記プロテインキナーゼ又は相互作用ポリペプチド又は基質ポリペプ
チドとして、重量にしてそのプロテイン含有量の少なくとも30％、好ましくは少
なくとも50％、もっと好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも
90％を有する組成物（composition）が含まれる。さらに、最も好ましくはプロ
テイン含有量の少なくとも95％を有する組成物が前記PDK1又は相互作用ポリペプ
チドである。
基質ポリペプチドには他のプロテインが実質的にないということを意味している
。従って、前記プロテインキナーゼ又は相互作用ポリペプチド又は基質ポリペプ
チドとして、重量にしてそのプロテイン含有量の少なくとも30％、好ましくは少
なくとも50％、もっと好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも
90％を有する組成物（composition）が含まれる。さらに、最も好ましくはプロ
テイン含有量の少なくとも95％を有する組成物が前記PDK1又は相互作用ポリペプ
チドである。
【００８１】
従って、この実質的に純粋なプロテインキナーゼまたは相互作用ポリペプチド
又は基質ポリペプチドには、重量にしてその組成物の70％、好ましくは50％、も
っと好ましくは30％、さらに好ましくは10％、さらに、最も好ましくは5％より
少ない混入物（a contaminant）が含まれるとしても良い。
又は基質ポリペプチドには、重量にしてその組成物の70％、好ましくは50％、も
っと好ましくは30％、さらに好ましくは10％、さらに、最も好ましくは5％より
少ない混入物（a contaminant）が含まれるとしても良い。
【００８２】
この実質的に純粋な前記プロテインキナーゼ又は相互作用ポリペプチドまたは
基質ポリペプチドは、エクスビボ（ex vivo）における他の成分（components）
、すなわち、前記プロテインキナーゼ又は相互作用ポリペプチド又は基質ポリペ
プチドが天然で発見された細胞内で発見される成分の全てではない前記他の成分
に結合されていても良い。
基質ポリペプチドは、エクスビボ（ex vivo）における他の成分（components）
、すなわち、前記プロテインキナーゼ又は相互作用ポリペプチド又は基質ポリペ
プチドが天然で発見された細胞内で発見される成分の全てではない前記他の成分
に結合されていても良い。
【００８３】
実施例１及び２に記載されているように、例えば、PDK1 (或いは、SGK, PKB,
p70 S6キナーゼ又はPKA)等の前記プロテインキナーゼ及び前記相互作用ポリペプ
チドは、互いに、及び前記プロテインキナーゼと前記相互作用ポリペプチドの両
方が発現される細胞の中で検定された化合物に曝されていても良い。プロテイン
キナーゼは内因性のプロテインキナーゼであっても良いし、又はそれが組換え構
築物（recombinant construct）から発現されたプロテインキナーゼであっても
良い。実施例１に記載されているように、同様に、前記相互作用ポリペプチドは
、内因性のものであっても良いし、又は組換え構築物から発現されたものであっ
ても良い。前記プロテインキナーゼ及び前記相互作用ポリペプチドは、前記プロ
テインキナーゼと前記相互作用ポリペプチドの両方が天然に発現された細胞の中
で互いに曝されていない。前記プロテインキナーゼ及び前記相互作用ポリペプチ
ドの両方が、前記プロテインキナーゼと前記相互作用ポリペプチドの両方が互い
に曝されていない細胞に対して内因性のポリペプチドではない。
p70 S6キナーゼ又はPKA)等の前記プロテインキナーゼ及び前記相互作用ポリペプ
チドは、互いに、及び前記プロテインキナーゼと前記相互作用ポリペプチドの両
方が発現される細胞の中で検定された化合物に曝されていても良い。プロテイン
キナーゼは内因性のプロテインキナーゼであっても良いし、又はそれが組換え構
築物（recombinant construct）から発現されたプロテインキナーゼであっても
良い。実施例１に記載されているように、同様に、前記相互作用ポリペプチドは
、内因性のものであっても良いし、又は組換え構築物から発現されたものであっ
ても良い。前記プロテインキナーゼ及び前記相互作用ポリペプチドは、前記プロ
テインキナーゼと前記相互作用ポリペプチドの両方が天然に発現された細胞の中
で互いに曝されていない。前記プロテインキナーゼ及び前記相互作用ポリペプチ
ドの両方が、前記プロテインキナーゼと前記相互作用ポリペプチドの両方が互い
に曝されていない細胞に対して内因性のポリペプチドではない。
【００８４】
実施例１及び２に記載されているように、複合物は、例えば、(上記定義され
た)プロテインキナーゼ及び前記相互作用ポリペプチドの両方が発現された細胞
からの材料（material）において、共免疫沈降又は共精製法によって、又は蛍光
共鳴エネルギー転移(FRET)技術(例えば、緑、青、黄の蛍光プロテイン(GFPs; 当
業者に周知のYFPs, BFPs)等の蛍光プロテインを有する融合プロテイン（fusion
proteins）を用いて)を用いて検出されても良い。
た)プロテインキナーゼ及び前記相互作用ポリペプチドの両方が発現された細胞
からの材料（material）において、共免疫沈降又は共精製法によって、又は蛍光
共鳴エネルギー転移(FRET)技術(例えば、緑、青、黄の蛍光プロテイン(GFPs; 当
業者に周知のYFPs, BFPs)等の蛍光プロテインを有する融合プロテイン（fusion
proteins）を用いて)を用いて検出されても良い。
【００８５】
本発明の更なる側面は、前記プロテインキナーゼと相互作用ポリペプチドとの
相互作用を阻害する化合物であって、上記定義されたような疎水性ポケットを含
むプロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整可能な（相互作用化合物
と名付けられた）化合物を提供することである。ここで、相互作用ポリペプチド
が、前記プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 P
he/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、又は、前記プロテインキナーゼの疎水性ポケ
ットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し
ている。さらに、前記化合物が、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-P
he/Tyr を有するポリペプチドを有さず、更に、PKA 又はPKCδでもない。
相互作用を阻害する化合物であって、上記定義されたような疎水性ポケットを含
むプロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整可能な（相互作用化合物
と名付けられた）化合物を提供することである。ここで、相互作用ポリペプチド
が、前記プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 P
he/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、又は、前記プロテインキナーゼの疎水性ポケ
ットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し
ている。さらに、前記化合物が、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-P
he/Tyr を有するポリペプチドを有さず、更に、PKA 又はPKCδでもない。
【００８６】
本発明の更なる側面は、上記定義されたような疎水性ポケットを含むプロテイ
ンキナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整可能な（相互作用化合物と名付けら
れた）化合物を提供することである。ここで、化合物が、前記疎水性ポケットを
含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリン酸化速度又はリン酸化度を、
相互作用ポリペプチドの（実質的に不存在を含み）不存在下で前記疎水性ポケッ
トを含むプロテインキナーゼによって調整する。そして、相互作用ポリペプチド
が、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列Phe/Ty
r-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、又は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互
作用するか若しくはアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有している。さら
に、基質ポリペプチドが、400 個、さらにより好ましくは、380, 350, 300, 250
, 200, 150, 120, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25又は20個より少ないアミノ
酸を有している。
ンキナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整可能な（相互作用化合物と名付けら
れた）化合物を提供することである。ここで、化合物が、前記疎水性ポケットを
含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリン酸化速度又はリン酸化度を、
相互作用ポリペプチドの（実質的に不存在を含み）不存在下で前記疎水性ポケッ
トを含むプロテインキナーゼによって調整する。そして、相互作用ポリペプチド
が、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列Phe/Ty
r-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、又は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互
作用するか若しくはアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有している。さら
に、基質ポリペプチドが、400 個、さらにより好ましくは、380, 350, 300, 250
, 200, 150, 120, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25又は20個より少ないアミノ
酸を有している。
【００８７】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポケ
ットを等価な位置において疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼのプロテ
インキナーゼ活性を調整する化合物を提供することである。ここで、化合物が、
前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリン酸化速
度又はリン酸化度を、相互作用ポリペプチドの存在下で前記疎水性ポケットを含
むプロテインキナーゼによって調整する。そして、相互作用ポリペプチドが、プ
ロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa
-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互
作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、かつ、疎
水性ポケットを含むプロテインキナーゼのセパレートポリペプチド鎖に含まれて
いる。さらに、基質ポリペプチドが、400 個、さらにより好ましくは、380, 350
, 300, 250, 200, 150, 120, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25又は20個より少
ないアミノ酸を有している。
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポケ
ットを等価な位置において疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼのプロテ
インキナーゼ活性を調整する化合物を提供することである。ここで、化合物が、
前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリン酸化速
度又はリン酸化度を、相互作用ポリペプチドの存在下で前記疎水性ポケットを含
むプロテインキナーゼによって調整する。そして、相互作用ポリペプチドが、プ
ロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa
-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互
作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、かつ、疎
水性ポケットを含むプロテインキナーゼのセパレートポリペプチド鎖に含まれて
いる。さらに、基質ポリペプチドが、400 個、さらにより好ましくは、380, 350
, 300, 250, 200, 150, 120, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25又は20個より少
ないアミノ酸を有している。
【００８８】
化合物は、配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-COOH、又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-(X)n-C
OOH、好ましくはPhe-Xaa-Xaa-Phe-(X)n-COOHのC末端を有するポリペプチドであ
っても良いし、前記C末端を有するポリペプチドから構成されていても良い。こ
こで、nは、1と150, 100, 60, 50, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3又は2との間、好ま
しくは1と4との間、最も好ましくは 4である。各アミノ酸Xは、何れのアミノ酸
残基であっても良く、好ましくはグリシンである。従って、そのポリペプチドは
、配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-COOH又はPhe-Xaa-Xaa-Phe-(Gly)4-COOHのC末端を有する
ことが好ましい。そのポリペプチドは、PKAから誘導される一連の（contiguous
）残基から構成されていても良いし、前記一連の残基を有していても良い。例え
ば、それは、PKAのC末端の約223, 220, 200, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 70
, 65, 63, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 又は5個のアミノ酸、或い
は配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-COOH又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-(X)n-COOHのC末端を
有するこの突然変異体又は融合体を有していても良い。
OOH、好ましくはPhe-Xaa-Xaa-Phe-(X)n-COOHのC末端を有するポリペプチドであ
っても良いし、前記C末端を有するポリペプチドから構成されていても良い。こ
こで、nは、1と150, 100, 60, 50, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3又は2との間、好ま
しくは1と4との間、最も好ましくは 4である。各アミノ酸Xは、何れのアミノ酸
残基であっても良く、好ましくはグリシンである。従って、そのポリペプチドは
、配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-COOH又はPhe-Xaa-Xaa-Phe-(Gly)4-COOHのC末端を有する
ことが好ましい。そのポリペプチドは、PKAから誘導される一連の（contiguous
）残基から構成されていても良いし、前記一連の残基を有していても良い。例え
ば、それは、PKAのC末端の約223, 220, 200, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 70
, 65, 63, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 又は5個のアミノ酸、或い
は配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-COOH又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-(X)n-COOHのC末端を
有するこの突然変異体又は融合体を有していても良い。
【００８９】
当然のことながら、ポリペプチドは、共有結合修飾（covalent modification
）を有していても良い、例えば、ビオチニル化（biotinylation）、すなわちビ
オチン基を有するように調整されても良い。
）を有していても良い、例えば、ビオチニル化（biotinylation）、すなわちビ
オチン基を有するように調整されても良い。
【００９０】
本発明の更なる側面は、本発明の方法によって同定可能な化合物(相互作用化
合物と名付けた)を提供することである。この化合物は、アミノ酸配列Phe/Tyr-X
aa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyrを有するポリペプチドではなく、更に、完全長PKA
でもない。
合物と名付けた)を提供することである。この化合物は、アミノ酸配列Phe/Tyr-X
aa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyrを有するポリペプチドではなく、更に、完全長PKA
でもない。
【００９１】
上記に論じられているように、例えば、化合物は、当業者に周知のように、例
えば、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr（例えば、Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/
Tyr-COOH）を有する相互作用ポリペプチドの三次元構造に似ているであろう三次
元構造に基づいて選択された化合物であっても良いし、又は三次元構造を有して
設計された化合物であっても良い。
えば、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr（例えば、Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/
Tyr-COOH）を有する相互作用ポリペプチドの三次元構造に似ているであろう三次
元構造に基づいて選択された化合物であっても良いし、又は三次元構造を有して
設計された化合物であっても良い。
【００９２】
本発明の更なる側面は、突然変異されたプロテインキナーゼを提供することで
ある。ここで、突然変異前のプロテインキナーゼは、完全長マウスPKAのLys76,
Leu116, Val80 及び／又はLys111を含む残基によって規定されるプロテインキナ
ーゼA (PKA)の疎水性ポケットと等価位置において疎水性ポケットを有している
。そして、プロテインキナーゼの疎水性ポケットを形成する一つ以上の残基が突
然変異される。前記プロテインキナーゼは、PKAではないのが好ましい。前記プ
ロテインキナーゼは、例えば、SGK, PKB, p70 S6キナーゼ又はPDK1であっても良
く、好ましくはPDK1である。突然変異された残基（複数の残基）は PKAの疎水
性ポケットにおける残基Lys76, Val80, Lys111及び／又はLeu116に等価な残基で
あるのが好ましい。特に、PKAの残基Lys76に等価な位置における残基はAlaに突
然変異されるのが好ましく、及び／又はPKAのLeu116に等価な位置における残基
はSer, Asp又はGluに突然変異されるのが好ましい。図15にいくつかのプロテイ
ンキナーゼに対して、等価な残基が示唆されている。上記論じられ且つ実施例１
及び２に記載されているように、突然変異されたプロテインキナーゼは、ポリペ
プチドか突然変異されたプロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用する化
合物かどうかを決定するのに有用であるとされても良い。例えば、突然変異され
たプロテインキナーゼ及び突然変異されていないプロテインキナーゼに結合する
(ポリペプチドを含む)化合物の能力、或いはプロテインキナーゼの一つ以上の基
質に対するプロテインキナーゼの活性の調整が、測定され比較されても良い。
ある。ここで、突然変異前のプロテインキナーゼは、完全長マウスPKAのLys76,
Leu116, Val80 及び／又はLys111を含む残基によって規定されるプロテインキナ
ーゼA (PKA)の疎水性ポケットと等価位置において疎水性ポケットを有している
。そして、プロテインキナーゼの疎水性ポケットを形成する一つ以上の残基が突
然変異される。前記プロテインキナーゼは、PKAではないのが好ましい。前記プ
ロテインキナーゼは、例えば、SGK, PKB, p70 S6キナーゼ又はPDK1であっても良
く、好ましくはPDK1である。突然変異された残基（複数の残基）は PKAの疎水
性ポケットにおける残基Lys76, Val80, Lys111及び／又はLeu116に等価な残基で
あるのが好ましい。特に、PKAの残基Lys76に等価な位置における残基はAlaに突
然変異されるのが好ましく、及び／又はPKAのLeu116に等価な位置における残基
はSer, Asp又はGluに突然変異されるのが好ましい。図15にいくつかのプロテイ
ンキナーゼに対して、等価な残基が示唆されている。上記論じられ且つ実施例１
及び２に記載されているように、突然変異されたプロテインキナーゼは、ポリペ
プチドか突然変異されたプロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用する化
合物かどうかを決定するのに有用であるとされても良い。例えば、突然変異され
たプロテインキナーゼ及び突然変異されていないプロテインキナーゼに結合する
(ポリペプチドを含む)化合物の能力、或いはプロテインキナーゼの一つ以上の基
質に対するプロテインキナーゼの活性の調整が、測定され比較されても良い。
【００９３】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80及び／又は
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポケ
ットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼ、及び
第２の(相互作用ポリペプチドを含む（encompassing）)相互作用化合物を有する
調製を提供することである。ここで、相互作用化合物は、プロテインキナーゼの
疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有
するか、又は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用するか若しくは
アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有している。さらに、前記調製は、
更に、上記定義されたような基質ポリペプチドを有し、かつ、前記プロテインキ
ナーゼ又は化合物が天然に発見された細胞において発見される全ての成分は有さ
ない。
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポケ
ットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼ、及び
第２の(相互作用ポリペプチドを含む（encompassing）)相互作用化合物を有する
調製を提供することである。ここで、相互作用化合物は、プロテインキナーゼの
疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有
するか、又は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用するか若しくは
アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有している。さらに、前記調製は、
更に、上記定義されたような基質ポリペプチドを有し、かつ、前記プロテインキ
ナーゼ又は化合物が天然に発見された細胞において発見される全ての成分は有さ
ない。
【００９４】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80及び／又は
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポケ
ットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼ、及び
第２の相互作用化合物を有する調製を提供することである。ここで、相互作用化
合物はプロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用する。そして、前記調製
が、前記プロテインキナーゼ又は化合物が天然に発見された細胞において発見さ
れる全ての成分は有さず、プロテインキナーゼが PDK1 である場合、相互作用化
合物はアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr を有するポリペプ
チドではない。相互作用化合物は、上記定義されているような相互作用ポリペプ
チドであっても良い。相互作用ポリペプチド及びプロテインキナーゼとして好ま
しいものは、上記で与えられている。相互作用ポリペプチドは、配列Phe/Tyr-Xa
a-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrを有さないのが好ましい。従って、調製は、前
記相互作用ポリペプチド以外の細胞に存在するか、或いは関連しているプロテイ
ンキナーゼ又は化合物を備えるポリペプチドが実質的にない状態とされる。化合
物は、プロテインキナーゼにおける相互作用ポリペプチドの有効性を模倣する本
発明の化合物であるとしても良い。
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポケ
ットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼ、及び
第２の相互作用化合物を有する調製を提供することである。ここで、相互作用化
合物はプロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用する。そして、前記調製
が、前記プロテインキナーゼ又は化合物が天然に発見された細胞において発見さ
れる全ての成分は有さず、プロテインキナーゼが PDK1 である場合、相互作用化
合物はアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr を有するポリペプ
チドではない。相互作用化合物は、上記定義されているような相互作用ポリペプ
チドであっても良い。相互作用ポリペプチド及びプロテインキナーゼとして好ま
しいものは、上記で与えられている。相互作用ポリペプチドは、配列Phe/Tyr-Xa
a-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyrを有さないのが好ましい。従って、調製は、前
記相互作用ポリペプチド以外の細胞に存在するか、或いは関連しているプロテイ
ンキナーゼ又は化合物を備えるポリペプチドが実質的にない状態とされる。化合
物は、プロテインキナーゼにおける相互作用ポリペプチドの有効性を模倣する本
発明の化合物であるとしても良い。
【００９５】
従って、（すなわち、組合せにおける）前記プロテインキナーゼ又は相互作用
ポリペプチド又は（適切な場合には）基質ポリペプチドとして、重量にしてその
プロテイン含有量の少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは
少なくとも70%、さらにもっと好ましくは少なくとも90%を有する組成物を含んで
おり、そして、最も好ましくはプロテイン含有量の少なくとも95%を有する組成
物が前記プロテインキナーゼ又は相互作用ポリペプチド又は (適切な場合には)
基質ポリペプチドである。
ポリペプチド又は（適切な場合には）基質ポリペプチドとして、重量にしてその
プロテイン含有量の少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは
少なくとも70%、さらにもっと好ましくは少なくとも90%を有する組成物を含んで
おり、そして、最も好ましくはプロテイン含有量の少なくとも95%を有する組成
物が前記プロテインキナーゼ又は相互作用ポリペプチド又は (適切な場合には)
基質ポリペプチドである。
【００９６】
従って、本発明には、さらに、前記プロテインキナーゼ、例えばポリペプチド
等の相互作用化合物、及び（適切な場合には）前記基質ポリペプチド、重量にし
て70%、好ましくは50%、より好ましくは30%、さらにもっと好ましくは10%、最も
好ましくは5%より少ない組成物を有する混入物を有する調製が含まれている。本
発明には、前記プロテインキナーゼと、例えばポリペプチド等の前記相互作用化
合物と、（適切な場合には）エクスビボにおいて他の成分と混合される場合の前
記基質ポリペプチドとを有する調製が含まれている。なお、前記他の成分は、前
記プロテインキナーゼ、及び／又は、例えば、ポリペプチド等の相互作用化合物
、及び／又は基質ポリペプチドが天然に発見された細胞において発見される全て
の成分というわけではない。
等の相互作用化合物、及び（適切な場合には）前記基質ポリペプチド、重量にし
て70%、好ましくは50%、より好ましくは30%、さらにもっと好ましくは10%、最も
好ましくは5%より少ない組成物を有する混入物を有する調製が含まれている。本
発明には、前記プロテインキナーゼと、例えばポリペプチド等の前記相互作用化
合物と、（適切な場合には）エクスビボにおいて他の成分と混合される場合の前
記基質ポリペプチドとを有する調製が含まれている。なお、前記他の成分は、前
記プロテインキナーゼ、及び／又は、例えば、ポリペプチド等の相互作用化合物
、及び／又は基質ポリペプチドが天然に発見された細胞において発見される全て
の成分というわけではない。
【００９７】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポケ
ットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼのため
の基質ポリペプチドをリン酸化する方法を提供することである。ここで、本発明
の前記された側面による調製が用いられている。基質ポリペプチドは、完全長マ
ウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又はLys111残基によって規定されるプロ
テインキナーゼA(PKA)の疎水性ポケットに等価な位置において、疎水性ポケット
を有するプロテインキナーゼ、例えば、PDK1, PKB, SGK, p70 S6キナーゼ又はPK
Aによるリン酸化のための適切な共通配列、例えば、配列Thr/Ser-Phe-Cys-Gly-T
hr-Xaa-Glu-Leu、Phe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyr, Arg-Arg-X-Ser-Val又はAr
g-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thrを有している。
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA (PKA)の疎水性ポケ
ットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼのため
の基質ポリペプチドをリン酸化する方法を提供することである。ここで、本発明
の前記された側面による調製が用いられている。基質ポリペプチドは、完全長マ
ウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又はLys111残基によって規定されるプロ
テインキナーゼA(PKA)の疎水性ポケットに等価な位置において、疎水性ポケット
を有するプロテインキナーゼ、例えば、PDK1, PKB, SGK, p70 S6キナーゼ又はPK
Aによるリン酸化のための適切な共通配列、例えば、配列Thr/Ser-Phe-Cys-Gly-T
hr-Xaa-Glu-Leu、Phe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyr, Arg-Arg-X-Ser-Val又はAr
g-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thrを有している。
【００９８】
プロテインキナーゼがPDK1である場合には、基質ポリペプチドは、例えば、PK
Bα等のPKB、 SGK, p70S6キナーゼ, PKA、又はPKCイソ型であるとしても良い。
プロテインキナーゼがp70 S6キナーゼである場合には、基質はリボソーム40Sサ
ブユニットS6であるとしても良い。プロテインキナーゼがPKB, SGK、又はp70S6
キナーゼである場合には、基質はグリコーゲン合成酵素キナーゼ3 (GSK3), BAD,
6-ホスホフルクト -2-キナーゼ, ホスホダイエステラーゼ（phosphodiesterase
）3b, ヒトカスパーゼ9, 内皮の一酸化窒素合成酵素又は、例えばBRCA2等のBRCA
であるとしても良い。
Bα等のPKB、 SGK, p70S6キナーゼ, PKA、又はPKCイソ型であるとしても良い。
プロテインキナーゼがp70 S6キナーゼである場合には、基質はリボソーム40Sサ
ブユニットS6であるとしても良い。プロテインキナーゼがPKB, SGK、又はp70S6
キナーゼである場合には、基質はグリコーゲン合成酵素キナーゼ3 (GSK3), BAD,
6-ホスホフルクト -2-キナーゼ, ホスホダイエステラーゼ（phosphodiesterase
）3b, ヒトカスパーゼ9, 内皮の一酸化窒素合成酵素又は、例えばBRCA2等のBRCA
であるとしても良い。
【００９９】
当然のことながら、方法は、ホスホイノシチド、例えばPIP2又はPtdIns(3,4,5
)P3 (PIP3)の存在下において行われても良い。前記PIP2 又はPIP3 は、例えばP
DK1による、共通配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyrに対応するアミノ酸配列
を有する基質ポリペプチドにおける下線が引かれた残基、及び／又は共通配列Th
r/Ser-Phe-Cys-Gly-Thr-Xaa-Glu-Leuにおける下線が引かれた残基に対応する残
基のリン酸化速度又はリン酸化度を増加させるであろう。基質は、PKB、例えば
機能的な（すなわち、ホスホイノシチド結合（phosphoinositide-binding））PH
ドメインを有するPKBであっても良い。
)P3 (PIP3)の存在下において行われても良い。前記PIP2 又はPIP3 は、例えばP
DK1による、共通配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-Ser/Thr-Phe/Tyrに対応するアミノ酸配列
を有する基質ポリペプチドにおける下線が引かれた残基、及び／又は共通配列Th
r/Ser-Phe-Cys-Gly-Thr-Xaa-Glu-Leuにおける下線が引かれた残基に対応する残
基のリン酸化速度又はリン酸化度を増加させるであろう。基質は、PKB、例えば
機能的な（すなわち、ホスホイノシチド結合（phosphoinositide-binding））PH
ドメインを有するPKBであっても良い。
【０１００】
本発明の更なる側面は、完全長ヒト p70 S6 キナーゼの Thr412 に等価な残基
について p70 S6 キナーゼをリン酸化する方法を提供する。ここで、前記 p70 S
6 キナーゼは、組換え PDK1 に暴露される。本発明の更なる側面は、完全長ヒト
p70 S6キナーゼのThr412と等価な残基についてp70 S6キナーゼをリン酸化する方
法におけるPDK1の用途を提供する。P70 S6キナーゼは、完全長ヒトp70 S6キナー
ゼのThr412と等価な位置にセリン又はスレオニン残基を有する。P70 S6キナーゼ
は、例えば完全長ヒトp70 S6キナーゼ、又は例えば実施例１に示されるようなそ
のフラグメントや融合物、或いはそのフラグメントの融合物等、天然に生じるp7
0 S6キナーゼであることが好ましい。P70 S6キナーゼ及び／又はPDK1は、組換え
p70 S6キナーゼ又はPDK1であることが好ましく、細菌、酵母菌又は哺乳類の細胞
中で発現されたp70 S6キナーゼ又はPDK1であることが更に好ましい。
について p70 S6 キナーゼをリン酸化する方法を提供する。ここで、前記 p70 S
6 キナーゼは、組換え PDK1 に暴露される。本発明の更なる側面は、完全長ヒト
p70 S6キナーゼのThr412と等価な残基についてp70 S6キナーゼをリン酸化する方
法におけるPDK1の用途を提供する。P70 S6キナーゼは、完全長ヒトp70 S6キナー
ゼのThr412と等価な位置にセリン又はスレオニン残基を有する。P70 S6キナーゼ
は、例えば完全長ヒトp70 S6キナーゼ、又は例えば実施例１に示されるようなそ
のフラグメントや融合物、或いはそのフラグメントの融合物等、天然に生じるp7
0 S6キナーゼであることが好ましい。P70 S6キナーゼ及び／又はPDK1は、組換え
p70 S6キナーゼ又はPDK1であることが好ましく、細菌、酵母菌又は哺乳類の細胞
中で発現されたp70 S6キナーゼ又はPDK1であることが更に好ましい。
【０１０１】
本発明の更なる側面は、完全長ヒト p70 S6 キナーゼのThr412 に等価な残基
について p70 S6 キナーゼの活性化及び／又はリン酸化を PDK1 によって調整す
る化合物を同定する方法を提供する。ここで、完全長ヒト p70 S6 キナーゼのTh
r412 に等価なp70 S6 キナーゼの残基についてのPDK1 による前記活性化及び／
又はリン酸化は、前記化合物が一濃度よりも大きい濃度で（例えば、存在下又は
不存在下で）存在する状態において測定される。本発明の更なる側面は、上記の
方法により同定した又は同定可能な化合物である。
について p70 S6 キナーゼの活性化及び／又はリン酸化を PDK1 によって調整す
る化合物を同定する方法を提供する。ここで、完全長ヒト p70 S6 キナーゼのTh
r412 に等価なp70 S6 キナーゼの残基についてのPDK1 による前記活性化及び／
又はリン酸化は、前記化合物が一濃度よりも大きい濃度で（例えば、存在下又は
不存在下で）存在する状態において測定される。本発明の更なる側面は、上記の
方法により同定した又は同定可能な化合物である。
【０１０２】
本発明の更なる側面は、例えばアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを備え
たもの等の上記のように規定した相互作用ポリペプチドの用途、又は完全長マウ
スPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を有する残基によって規定さ
れるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポケットと等価な位置に疎水性ポケッ
トを有するプロテインキナーゼを安定化させる方法における本発明の相互作用化
合物の用途を提供する。ここで、プロテインキナーゼは、前記化合物又はポリペ
プチドに露出される。安定化度（stabilisation)は、TM50値を測定することによ
り測定されることとしても良い。TM50値とは、実施例2に示されるように、２分
間の加熱をすることで、プロテインキナーゼ活性（何らかの適当な基質を用いて
測定したもの）に、この加熱前のプロテインキナーゼ活性と比べて５０％の減少
が引き起こされる温度である。TM50値における増加、例えば少なくとも約１，２
，３，４，５，５，６，７，８，９，１０又は１５℃の増加は安定化を示す。
たもの等の上記のように規定した相互作用ポリペプチドの用途、又は完全長マウ
スPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を有する残基によって規定さ
れるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポケットと等価な位置に疎水性ポケッ
トを有するプロテインキナーゼを安定化させる方法における本発明の相互作用化
合物の用途を提供する。ここで、プロテインキナーゼは、前記化合物又はポリペ
プチドに露出される。安定化度（stabilisation)は、TM50値を測定することによ
り測定されることとしても良い。TM50値とは、実施例2に示されるように、２分
間の加熱をすることで、プロテインキナーゼ活性（何らかの適当な基質を用いて
測定したもの）に、この加熱前のプロテインキナーゼ活性と比べて５０％の減少
が引き起こされる温度である。TM50値における増加、例えば少なくとも約１，２
，３，４，５，５，６，７，８，９，１０又は１５℃の増加は安定化を示す。
【０１０３】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 and/or Lys
111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポケッ
トと等価な位置に疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのプロテインキナー
ゼ活性を細胞中で調製する方法を提供する。ここで、組換え相互作用ポリペプチ
ドは細胞中で発現する。また、この相互作用ポリペプチドはプロテインキナーゼ
の疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を
有するか、又は、プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用するか若
しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有する。プロテインキナーゼ
及び相互作用ポリペプチドの好適例は上述したとおりである。例えば、実施例１
及び２に示すようにGST-PIFを細胞中で発現されても良い。GST-PIFは、PDK1によ
るp70 S6キナーゼのリン酸化を抑制しても良い。
111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポケッ
トと等価な位置に疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのプロテインキナー
ゼ活性を細胞中で調製する方法を提供する。ここで、組換え相互作用ポリペプチ
ドは細胞中で発現する。また、この相互作用ポリペプチドはプロテインキナーゼ
の疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を
有するか、又は、プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用するか若
しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有する。プロテインキナーゼ
及び相互作用ポリペプチドの好適例は上述したとおりである。例えば、実施例１
及び２に示すようにGST-PIFを細胞中で発現されても良い。GST-PIFは、PDK1によ
るp70 S6キナーゼのリン酸化を抑制しても良い。
【０１０４】
都合がよいことに、前記方法は、細胞中で相互作用ポリペプチドを発現するの
に適した組換えポリヌクレオチドを提供し、細胞中に組換えポリヌクレオチドを
提供し、この細胞を、細胞がこの組換えポリヌクレオチドから相互作用ポリペプ
チドを発現する条件下に露出する工程を有している。
に適した組換えポリヌクレオチドを提供し、細胞中に組換えポリヌクレオチドを
提供し、この細胞を、細胞がこの組換えポリヌクレオチドから相互作用ポリペプ
チドを発現する条件下に露出する工程を有している。
【０１０５】
本発明の更なる側面は、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するポ
リペプチドを提供する。ここで、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列 Phe/Tyr-X
aa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr 又は Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyr
を有さず、更に、完全長 PKA ではない。ポリペプチドはC-末端配列Phe-Xaa-Xaa
-Phe-COOH、又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-(X)n-COOHを有していても良く、Phe-
Xaa-Xaa-Phe-(X)n-COOHを有していることが好ましい。ここで、nは1 と200, 150
, 100, 50, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 又は 2との間であり、１と４との間であ
ることが好ましく、４であることが最も好ましい。各アミノ酸Xは如何なるアミ
ノ残基でも良く、グリシンであることが好ましい。従って、ポリペプチドはC-末
端配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-COOH又はPhe-Xaa-Xaa-Phe-(Gly)4-COOHを有しているこ
とが好ましい。ポリペプチドは、PKAから得られる連続した残基からなるか、ま
たはPKAから得られる連続した残基を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、P
KAの223, 220, 200, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 70, 65, 63, 55, 50, 45,
40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 又は 5 個のアミノ酸又はC-末端配列Phe-Xaa-Xaa-
Phe-COOH若しくはPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-(X)n-COOHを有するこれらの変異体
や融合物でもよい。PKA配列は、図１５及び図１６、並びに図１に図示されたデ
ータベースレコードに示されている。例えばPKAαの配列はまた、Maldonado et
al (1988) Nucl Acids Res 16(16), 8189-8190 (Accession no 4506055)にも示
されている。従って、例えば、ポリペプチドは、例えばヒトやマウスのPKA等のP
KAのC-末端223個又は63個のアミノ酸を有するか、本質的にPKAのC-末端223個又
は63個のアミノ酸からなることとしてもよい。ポリペプチドは、上記規定された
ように相互作用ポリペプチドとして有用であっても良い。
リペプチドを提供する。ここで、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列 Phe/Tyr-X
aa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr 又は Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyr
を有さず、更に、完全長 PKA ではない。ポリペプチドはC-末端配列Phe-Xaa-Xaa
-Phe-COOH、又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-(X)n-COOHを有していても良く、Phe-
Xaa-Xaa-Phe-(X)n-COOHを有していることが好ましい。ここで、nは1 と200, 150
, 100, 50, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 又は 2との間であり、１と４との間であ
ることが好ましく、４であることが最も好ましい。各アミノ酸Xは如何なるアミ
ノ残基でも良く、グリシンであることが好ましい。従って、ポリペプチドはC-末
端配列Phe-Xaa-Xaa-Phe-COOH又はPhe-Xaa-Xaa-Phe-(Gly)4-COOHを有しているこ
とが好ましい。ポリペプチドは、PKAから得られる連続した残基からなるか、ま
たはPKAから得られる連続した残基を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、P
KAの223, 220, 200, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 70, 65, 63, 55, 50, 45,
40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 又は 5 個のアミノ酸又はC-末端配列Phe-Xaa-Xaa-
Phe-COOH若しくはPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-(X)n-COOHを有するこれらの変異体
や融合物でもよい。PKA配列は、図１５及び図１６、並びに図１に図示されたデ
ータベースレコードに示されている。例えばPKAαの配列はまた、Maldonado et
al (1988) Nucl Acids Res 16(16), 8189-8190 (Accession no 4506055)にも示
されている。従って、例えば、ポリペプチドは、例えばヒトやマウスのPKA等のP
KAのC-末端223個又は63個のアミノ酸を有するか、本質的にPKAのC-末端223個又
は63個のアミノ酸からなることとしてもよい。ポリペプチドは、上記規定された
ように相互作用ポリペプチドとして有用であっても良い。
【０１０６】
本発明のポリペプチドは、実施例１及び２に示されるように、GST部分を含ん
でも良い。このことは前記ポリペプチドを精製及び／又は検出するのに役立つか
もしれない。
でも良い。このことは前記ポリペプチドを精製及び／又は検出するのに役立つか
もしれない。
【０１０７】
本発明の更なる側面は、本発明のポリペプチド又は突然変異したプロテインキ
ナーゼをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のまた更なる側面
は、本発明のポリペプチド又は突然変異したプロテインキナーゼを発現するのに
適した組換えポリヌクレオチドを提供する。本発明のなおまた更なる側面は、本
発明のポリヌクレオチドを有する宿主細胞を提供する。
ナーゼをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のまた更なる側面
は、本発明のポリペプチド又は突然変異したプロテインキナーゼを発現するのに
適した組換えポリヌクレオチドを提供する。本発明のなおまた更なる側面は、本
発明のポリヌクレオチドを有する宿主細胞を提供する。
【０１０８】
本発明の更なる側面は、本発明のポリペプチド又は突然変異したプロテインキ
ナーゼを作製する方法を提供する。この方法は、前記ポリペプチド又は突然変異
したプロテインキナーゼを発現する本発明の宿主細胞の培養と、前記ポリペプチ
ド又は突然変異したプロテインキナーゼの単離とを有する。アミノ酸配列Phe/Ty
r-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有する本発明の前記ポリペプチドが、完全長マウスPKAのLy
s76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111を含む残基によって規定されるプロテイ
ンキナーゼA（PKA)の疎水性ポケットと等価な位置に疎水性ポケットを有する内
因性プロテインキナーゼ、例えば、細胞中で発現したPDK1や、組換えプロテイン
キナーゼとともに細胞中で発現したPDK1等との複合体として、単離されうるとい
うことは高く評価されるであろう。
ナーゼを作製する方法を提供する。この方法は、前記ポリペプチド又は突然変異
したプロテインキナーゼを発現する本発明の宿主細胞の培養と、前記ポリペプチ
ド又は突然変異したプロテインキナーゼの単離とを有する。アミノ酸配列Phe/Ty
r-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有する本発明の前記ポリペプチドが、完全長マウスPKAのLy
s76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111を含む残基によって規定されるプロテイ
ンキナーゼA（PKA)の疎水性ポケットと等価な位置に疎水性ポケットを有する内
因性プロテインキナーゼ、例えば、細胞中で発現したPDK1や、組換えプロテイン
キナーゼとともに細胞中で発現したPDK1等との複合体として、単離されうるとい
うことは高く評価されるであろう。
【０１０９】
本発明の更なる側面は、上記方法により入手可能なポリペプチド又は突然変異
プロテインキナーゼを提供する。
プロテインキナーゼを提供する。
【０１１０】
上記規定されたような相互作用ポリペプチドは、約950, 900, 800, 700, 600,
500, 400, 300, 200, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 18, 16, 15, 14, 12
, 10, 8 又は 7個までのアミノ酸残基を有していても良い。ポリペプチドが共有
結合修飾（covalent modification）を有しても良いこと、例えば、ビオチニル
化によって修飾されても良い、即ちビオチン基を有しても良いことは高く評価さ
れるだろう。そのようなペプチドは本発明の方法、例えばインビトロ又はインビ
ボでのPDK1等のプロテインキナーゼの酵素活性を変化させる方法において有用で
あろう。
, 10, 8 又は 7個までのアミノ酸残基を有していても良い。ポリペプチドが共有
結合修飾（covalent modification）を有しても良いこと、例えば、ビオチニル
化によって修飾されても良い、即ちビオチン基を有しても良いことは高く評価さ
れるだろう。そのようなペプチドは本発明の方法、例えばインビトロ又はインビ
ボでのPDK1等のプロテインキナーゼの酵素活性を変化させる方法において有用で
あろう。
【０１１１】
上記ポリペプチドは、例えば分子生物学的手法や自動化された化学的ペプチド
合成法（automated chemical peptide synthesis methods)等、当該技術分野に
おける周知の方法によって合成されることとしても良いし、下記及び実施例１又
は２に記載のように合成されることとしてもよい。
合成法（automated chemical peptide synthesis methods)等、当該技術分野に
おける周知の方法によって合成されることとしても良いし、下記及び実施例１又
は２に記載のように合成されることとしてもよい。
【０１１２】
ペプチド擬態化合物（peptidomimetic compounds)もまた有用であるだろうと
いうことは高く評価されるであろう。従って、「ポリペプチド」又は「ペプチド
」には、ペプチド鎖(-CO-NH-)によりアミノ酸残基が結合された分子だけではな
く、このペプチド結合が逆にされた（reversed)分子も含まれる。このようなレ
トロインバーソ（retro-inverso)ペプチド擬態物は、例えば引用文献として本明
細書に組み込まれたin Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記
載されているような方法など、当該技術において周知の方法を用いて合成されて
もよい。この研究方法は、バックボーンに伴い、側鎖の配向は伴わない変化を含
む偽ペプチド（pseudopeptides)作製と関係する。Meziere et al (1997)は、少
なくともMHCクラスII及びTヘルパー細胞反応に関しては、これらの擬似ペプチド
は有用であることを示している。レトロ反転ペプチドはNH-CO結合をCO-NHペプチ
ド結合の変わりに有するものであるが、タンパク質分解に対してより耐性がある
。
いうことは高く評価されるであろう。従って、「ポリペプチド」又は「ペプチド
」には、ペプチド鎖(-CO-NH-)によりアミノ酸残基が結合された分子だけではな
く、このペプチド結合が逆にされた（reversed)分子も含まれる。このようなレ
トロインバーソ（retro-inverso)ペプチド擬態物は、例えば引用文献として本明
細書に組み込まれたin Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記
載されているような方法など、当該技術において周知の方法を用いて合成されて
もよい。この研究方法は、バックボーンに伴い、側鎖の配向は伴わない変化を含
む偽ペプチド（pseudopeptides)作製と関係する。Meziere et al (1997)は、少
なくともMHCクラスII及びTヘルパー細胞反応に関しては、これらの擬似ペプチド
は有用であることを示している。レトロ反転ペプチドはNH-CO結合をCO-NHペプチ
ド結合の変わりに有するものであるが、タンパク質分解に対してより耐性がある
。
【０１１３】
同様に、もしアミノ酸残基のCα原子間のスペーシング（spacing)を保持する
適当な結合部分が用いられるならば、全体的にみてこのペプチド結合は分散され
てもよい；このことは、この結合部分が、ペプチド結合と実質的に同一の電荷分
布（charge distribution）を有し、かつ、実質的に同一の平面（planarity）を
有するなら特に好ましい。
適当な結合部分が用いられるならば、全体的にみてこのペプチド結合は分散され
てもよい；このことは、この結合部分が、ペプチド結合と実質的に同一の電荷分
布（charge distribution）を有し、かつ、実質的に同一の平面（planarity）を
有するなら特に好ましい。
【０１１４】
外タンパク質加水分解（exoproteolytic digestion）に対する感受性を減少さ
せるために、このペプチドが便宜的にそのＮ又はＣ末端でブロックされてもよい
ことは、高く評価されるだろう。
せるために、このペプチドが便宜的にそのＮ又はＣ末端でブロックされてもよい
ことは、高く評価されるだろう。
【０１１５】
従って、上述のように、例えば完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び
／又は Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA)の疎水
性ポケットと等価な位置に疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼが露出さ
れるかもしれないアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを含む相互作用ポリペ
プチド等の相互作用ポリペプチドがペプチド擬態化合物であっても良いことは高
く評価されるであろう。
／又は Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA)の疎水
性ポケットと等価な位置に疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼが露出さ
れるかもしれないアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを含む相互作用ポリペ
プチド等の相互作用ポリペプチドがペプチド擬態化合物であっても良いことは高
く評価されるであろう。
【０１１６】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポケ
ットと等価な位置に疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼを発現するのに
適した組換え核酸と、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有する第二の
ポリペプチドを発現するのに適した組換え核酸とを含む細胞である。ここで、前
記プロテインキナーゼがPDK1の場合には、前記第二のポリペプチドは、上記規定
されたようにPIFではなく、またアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr
-Phe/Tyrを含まない。与えられたポリペプチドを発現するのに適した組換えポリ
ヌクレオチドは当業者にとって周知であり、その例は実施例１及び２に示されて
いる。アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを含むプロテインキナーゼ及び第
二ポリペプチドを発現するのに組換え核酸分子が適しても良いということは、高
く評価されるだろう。細胞は、哺乳類の細胞又は昆虫の細胞であることが好まし
い。
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポケ
ットと等価な位置に疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼを発現するのに
適した組換え核酸と、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有する第二の
ポリペプチドを発現するのに適した組換え核酸とを含む細胞である。ここで、前
記プロテインキナーゼがPDK1の場合には、前記第二のポリペプチドは、上記規定
されたようにPIFではなく、またアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr
-Phe/Tyrを含まない。与えられたポリペプチドを発現するのに適した組換えポリ
ヌクレオチドは当業者にとって周知であり、その例は実施例１及び２に示されて
いる。アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを含むプロテインキナーゼ及び第
二ポリペプチドを発現するのに組換え核酸分子が適しても良いということは、高
く評価されるだろう。細胞は、哺乳類の細胞又は昆虫の細胞であることが好まし
い。
【０１１７】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポケ
ットと等価な位置に疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼ、及び、第二の、
相互作用ポリペプチドを有する調製を行う方法である。ここで、相互作用化合物
は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用する。また、調製は、前記
プロテインキナーゼ又は化合物が天然に発見された細胞において発見される全て
の成分を有さない。また、プロテインキナーゼがPDK1の場合には、相互作用化合
物はアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyrを有するポリペプチド
ではない。また、プロテインキナーゼ及び相互作用ポリペプチドは本発明の上記
側面において規定される細胞中で共発現される。プロテインキナーゼ及び相互作
用ポリペプチドは、例えば上述された方法や、実施例１及び２で議論された方法
を用い、他の細胞の化合物と分離されることとしても良い。本発明の更なる側面
は、本発明の上記方法により得ることができる調製である。
Lys111を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポケ
ットと等価な位置に疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼ、及び、第二の、
相互作用ポリペプチドを有する調製を行う方法である。ここで、相互作用化合物
は、プロテインキナーゼの疎水性ポケットと相互作用する。また、調製は、前記
プロテインキナーゼ又は化合物が天然に発見された細胞において発見される全て
の成分を有さない。また、プロテインキナーゼがPDK1の場合には、相互作用化合
物はアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyrを有するポリペプチド
ではない。また、プロテインキナーゼ及び相互作用ポリペプチドは本発明の上記
側面において規定される細胞中で共発現される。プロテインキナーゼ及び相互作
用ポリペプチドは、例えば上述された方法や、実施例１及び２で議論された方法
を用い、他の細胞の化合物と分離されることとしても良い。本発明の更なる側面
は、本発明の上記方法により得ることができる調製である。
【０１１８】
ヒトα−イソ型p70 S6キナーゼの長スプライス突然変異体（longer splice va
riant)のThr412と等価な残基についてリン酸化され、かつ、Thr412と等価な前記
残基についてリン酸化されていないp70 S6キナーゼ又はそのキナーゼのフラグメ
ント若しくは融合物とは反応性を有しないp70 S6キナーゼ又はそのフラグメント
若しくは融合物に対する抗体反応については、実施例１に記載されておりUpstat
e Biotechnology Inc., 199 Saranac Avenue, Lake Placed, NY, USAから手に入
れることができる。同様な抗体は、New England Biolabs (UK) Ltd, Knowl Piec
e, Wilbury Way, Hitchin, Herts, SG4 0TYから手に入れることができる。抗体
は、以下の下線部の残基がホスホスレオニン（phosphorothreonine)であるペプ
チドSESANQVFLGFTYVAPSV（前記長スプライス突然変異体の410‐418残基に対応す
る）と反応しても良い。このような抗体を調製する方法は実施例1から得ること
ができる。
riant)のThr412と等価な残基についてリン酸化され、かつ、Thr412と等価な前記
残基についてリン酸化されていないp70 S6キナーゼ又はそのキナーゼのフラグメ
ント若しくは融合物とは反応性を有しないp70 S6キナーゼ又はそのフラグメント
若しくは融合物に対する抗体反応については、実施例１に記載されておりUpstat
e Biotechnology Inc., 199 Saranac Avenue, Lake Placed, NY, USAから手に入
れることができる。同様な抗体は、New England Biolabs (UK) Ltd, Knowl Piec
e, Wilbury Way, Hitchin, Herts, SG4 0TYから手に入れることができる。抗体
は、以下の下線部の残基がホスホスレオニン（phosphorothreonine)であるペプ
チドSESANQVFLGFTYVAPSV（前記長スプライス突然変異体の410‐418残基に対応す
る）と反応しても良い。このような抗体を調製する方法は実施例1から得ること
ができる。
【０１１９】
前記ポリペプチドに対して反応性を有する抗体は、当該技術分野において周知
の方法によって形成されても良い。特に、抗体はポリクローナル（polyclonal)
又はモノクローナル（monoclonal)でも良い。
の方法によって形成されても良い。特に、抗体はポリクローナル（polyclonal)
又はモノクローナル（monoclonal)でも良い。
【０１２０】
前記ポリペプチドに対して反応性を有する適当なモノクローナル抗体は、例え
ば"Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 19
88) 及び "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications",
SGR Hurrell (CRC Press, 1982)において開示される技術によって調製されても
良い。
ば"Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 19
88) 及び "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications",
SGR Hurrell (CRC Press, 1982)において開示される技術によって調製されても
良い。
【０１２１】
抗体を調製する技術は、例えばHarlow, ED & Lane, D "Antibodies: a labora
tory manual" (1988) Newにおいて記載されるように、当業者にとって周知であ
る。
tory manual" (1988) Newにおいて記載されるように、当業者にとって周知であ
る。
【０１２２】
完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を含む残基によ
って規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポケットと等価な位置に疎
水性ポケットを有する例えばPDK1, SGK, PKB, PKA 又は p70 S6キナーゼ等のプ
ロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性（例えば、特異基質に対するプロテ
インキナーゼ活性）、例えばPDK1のPDK1 又はPDK2活性（上述のとおり）等の調
整、例えば促進又は抑制等に有用であるかもしれない薬剤の検定スクリーニング
を本発明が提供することは、高く評価されるだろう。前記方法において同定され
る化合物は、それ自体薬剤として有用であってもよいし、又はより有効な化合物
の設計及び合成に対するリード化合物（lead compounds)を発現し(represent)て
もよい。
って規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポケットと等価な位置に疎
水性ポケットを有する例えばPDK1, SGK, PKB, PKA 又は p70 S6キナーゼ等のプ
ロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性（例えば、特異基質に対するプロテ
インキナーゼ活性）、例えばPDK1のPDK1 又はPDK2活性（上述のとおり）等の調
整、例えば促進又は抑制等に有用であるかもしれない薬剤の検定スクリーニング
を本発明が提供することは、高く評価されるだろう。前記方法において同定され
る化合物は、それ自体薬剤として有用であってもよいし、又はより有効な化合物
の設計及び合成に対するリード化合物（lead compounds)を発現し(represent)て
もよい。
【０１２３】
化合物は、ドラッグ様（drug-like)化合物や、化合物の前記同定方法のそれぞ
れに用いられるドラッグ様化合物の開発に対するリード化合物でもあっても良い
。当業者にとって周知のように、前記方法が薬剤化合物や薬剤の発現におけるス
クリーニング検定として有用であってもよいということは高く評価されるだろう
。
れに用いられるドラッグ様化合物の開発に対するリード化合物でもあっても良い
。当業者にとって周知のように、前記方法が薬剤化合物や薬剤の発現におけるス
クリーニング検定として有用であってもよいということは高く評価されるだろう
。
【０１２４】
「ドラッグ様化合物」という用語は当業者にとって周知であり、この用語には
、例えば薬剤における活性成分として医療用に適する特性を有する化合物という
意味が含まれても良い。従って、例えば、ドラッグ様化合物は、有機化学の技術
によって合成される分子であっても良い。また、やや劣るが、ドラッグ様化合物
は、分子生物学や生化学の技術により合成される分子であることが好ましい。ま
た、ドラッグ様化合物は、小さい分子であることが好ましく、5000ドルトン（do
ltons)より小さい分子であっても良い。ドラッグ様化合物は、更に、特異的な1
つのプロテイン又は複数のプロテインと選択的に相互作用する特徴を示しても良
く、生物学的に有用であっても良いし、かつ／又は細胞膜を透過することができ
るものであっても良い。しかし、これらの特徴が必要不可欠ではないことは高く
評価されるだろう。
、例えば薬剤における活性成分として医療用に適する特性を有する化合物という
意味が含まれても良い。従って、例えば、ドラッグ様化合物は、有機化学の技術
によって合成される分子であっても良い。また、やや劣るが、ドラッグ様化合物
は、分子生物学や生化学の技術により合成される分子であることが好ましい。ま
た、ドラッグ様化合物は、小さい分子であることが好ましく、5000ドルトン（do
ltons)より小さい分子であっても良い。ドラッグ様化合物は、更に、特異的な1
つのプロテイン又は複数のプロテインと選択的に相互作用する特徴を示しても良
く、生物学的に有用であっても良いし、かつ／又は細胞膜を透過することができ
るものであっても良い。しかし、これらの特徴が必要不可欠ではないことは高く
評価されるだろう。
【０１２５】
「リード化合物」という用語は、当業者にとって同様に周知であり、それ自体
は（例えば、意図された標的に対しては少しだけ効力がある，作用は非選択的で
ある，不安定である，合成が困難である又は生物的利用可能性に乏しいという理
由から）薬剤としての使用に適していないが、より望ましい特性を有するであろ
う他の化合物を設計するための出発点を提供しうる化合物、という意味を含んで
も良い。
は（例えば、意図された標的に対しては少しだけ効力がある，作用は非選択的で
ある，不安定である，合成が困難である又は生物的利用可能性に乏しいという理
由から）薬剤としての使用に適していないが、より望ましい特性を有するであろ
う他の化合物を設計するための出発点を提供しうる化合物、という意味を含んで
も良い。
【０１２６】
本発明の更なる側面は、本発明の方法、例えばスクリーニング方法、を実施す
るのに有用なパーツキットである。このようなキットは、完全長マウスPKAのLys
76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるプロテイ
ンキナーゼA（PKA）の疎水性ポケットと等価な位置に疎水性ポケットを有する例
えばPDK1, SGK, PKB, PKA 又は p70 S6キナーゼ等のプロテインキナーゼ、及び
、例えばアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を含み、かつアミノ酸配列Phe/
Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/T
yrを含まない相互作用ポリペプチドを有しても良い。このキットは更に、上記規
定されたように基質ポリペプチドを有しても良い。プロテインキナーゼ、基質ポ
リペプチド及び相互作用ポリペプチドのプレファレンスは上述したとおりである
。このキットは本発明の突然変異したプロテインキナーゼを含んでも良い。
るのに有用なパーツキットである。このようなキットは、完全長マウスPKAのLys
76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるプロテイ
ンキナーゼA（PKA）の疎水性ポケットと等価な位置に疎水性ポケットを有する例
えばPDK1, SGK, PKB, PKA 又は p70 S6キナーゼ等のプロテインキナーゼ、及び
、例えばアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を含み、かつアミノ酸配列Phe/
Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr又はPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/T
yrを含まない相互作用ポリペプチドを有しても良い。このキットは更に、上記規
定されたように基質ポリペプチドを有しても良い。プロテインキナーゼ、基質ポ
リペプチド及び相互作用ポリペプチドのプレファレンスは上述したとおりである
。このキットは本発明の突然変異したプロテインキナーゼを含んでも良い。
【０１２７】
プロテインキナーゼのインビボでの活性を調整するかもしれない化合物を同定
することが望ましい、ということは理解されるだろう。従って、例えば前記プロ
テインキナーゼと相互作用ポリペプチドとの間の相互作用が、ヒトプロテインキ
ナーゼと前記アミノ酸配列を含んで自然に生じる相互作用ポリペプチドとの間の
相互作用と実質的に等しくなるように、この方法において用いられる試薬及び条
件が選択されても良い、ということは理解されるだろう。化合物がプロテインキ
ナーゼと結合しても良い、又は相互作用ポリペプチドと結合しても良いというこ
とは高く評価されるだろう。
することが望ましい、ということは理解されるだろう。従って、例えば前記プロ
テインキナーゼと相互作用ポリペプチドとの間の相互作用が、ヒトプロテインキ
ナーゼと前記アミノ酸配列を含んで自然に生じる相互作用ポリペプチドとの間の
相互作用と実質的に等しくなるように、この方法において用いられる試薬及び条
件が選択されても良い、ということは理解されるだろう。化合物がプロテインキ
ナーゼと結合しても良い、又は相互作用ポリペプチドと結合しても良いというこ
とは高く評価されるだろう。
【０１２８】
前記検定のスクリーニング方法において試験される化合物、又は、例えば上記
規定されたように疎水性ポケットを含んだプロテインキナーゼ等のプロテインキ
ナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物の調整能力が測定されうる他
の検定のスクリーニング方法において試験される化合物は、例えばコンピュータ
技術などの分子モデリング技術を用いて選択され、かつ／又は設計（修飾を含む
）された化合物であっても良い。
規定されたように疎水性ポケットを含んだプロテインキナーゼ等のプロテインキ
ナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物の調整能力が測定されうる他
の検定のスクリーニング方法において試験される化合物は、例えばコンピュータ
技術などの分子モデリング技術を用いて選択され、かつ／又は設計（修飾を含む
）された化合物であっても良い。
【０１２９】
本発明の更なる側面は、上記規定されたように疎水性ポケットを含むプロテイ
ンキナーゼの活性を調整する化合物を選択又は設計する方法を提供する。この方
法は、前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼと相互作用すると予測され
る化合物を選択又は設計する分子モデリング手段を用いる工程を有する。ここで
、化合物の三次元構造は、前記疎水性ポケットの三次元構造、及び／又は、上記
規定されたように相互作用ポリペプチドの三次元構造と比較される。そして、前
記疎水性ポケットと相互作用すると予測される化合物が選択される。
ンキナーゼの活性を調整する化合物を選択又は設計する方法を提供する。この方
法は、前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼと相互作用すると予測され
る化合物を選択又は設計する分子モデリング手段を用いる工程を有する。ここで
、化合物の三次元構造は、前記疎水性ポケットの三次元構造、及び／又は、上記
規定されたように相互作用ポリペプチドの三次元構造と比較される。そして、前
記疎水性ポケットと相互作用すると予測される化合物が選択される。
【０１３０】
従って、化合物の三次元構造は、アミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyrを有
する相互作用ポリペプチドの三次元構造と比較されることとしても良い。特に、
化合物の構造は、上記及び実施例２で議論されるように、疎水性ポケットと相互
作用する相互作用ポリペプチドの部分（相互作用部分）、例えば相互作用ポリペ
プチドのPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr部分等の構造と比較されることとしても良い
。相互作用ポリペプチドの構造を模倣する化合物、好ましくはポリペプチドの相
互作用部分を模倣する化合物、更に好ましくは疎水性ポケット、つまり完全長マ
ウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111と等価な残基を規定するプ
ロテインキナーゼの残基と相互作用する相互作用部分の特徴を模倣する化合物が
選択されることとしても良い。
する相互作用ポリペプチドの三次元構造と比較されることとしても良い。特に、
化合物の構造は、上記及び実施例２で議論されるように、疎水性ポケットと相互
作用する相互作用ポリペプチドの部分（相互作用部分）、例えば相互作用ポリペ
プチドのPhe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr部分等の構造と比較されることとしても良い
。相互作用ポリペプチドの構造を模倣する化合物、好ましくはポリペプチドの相
互作用部分を模倣する化合物、更に好ましくは疎水性ポケット、つまり完全長マ
ウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111と等価な残基を規定するプ
ロテインキナーゼの残基と相互作用する相互作用部分の特徴を模倣する化合物が
選択されることとしても良い。
【０１３１】
化合物の三次元構造は疎水性ポケットの三次元構造と比較されることとしても
良い。相互作用ポリペプチドと同様の態様（例えば相互作用の分離及び／又はタ
イプ、即ち疎水性又はイオン性が同様、及び／又は、相互作用の集積エネルギー
（cumulative energy)が同様)で疎水性ポケットと相互作用することができる化
合物、特に完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111に対し
て等価な残基と相互作用することができる化合物が選択されることとしても良い
。相互作用の評価方法は、当業者にとって周知である。
良い。相互作用ポリペプチドと同様の態様（例えば相互作用の分離及び／又はタ
イプ、即ち疎水性又はイオン性が同様、及び／又は、相互作用の集積エネルギー
（cumulative energy)が同様)で疎水性ポケットと相互作用することができる化
合物、特に完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111に対し
て等価な残基と相互作用することができる化合物が選択されることとしても良い
。相互作用の評価方法は、当業者にとって周知である。
【０１３２】
比較される三次元構造は、例えば、当業者に周知のようなX線結晶学（X-ray c
rystallography)のような技術によって予測された三次元構造でも良いし、決定
された三次元構造でも良い。三次元構造は、例えばコンピュータスクリーン上な
ど、コンピュータによって二次元形態で表示されることとしても良い。比較は、
このような二次元表示を用いて実施されることとしても良い。
rystallography)のような技術によって予測された三次元構造でも良いし、決定
された三次元構造でも良い。三次元構造は、例えばコンピュータスクリーン上な
ど、コンピュータによって二次元形態で表示されることとしても良い。比較は、
このような二次元表示を用いて実施されることとしても良い。
【０１３３】
以下の文献は、分子モデリング技術に関連している：Blundell et al (1996)
Stucture-based drug design Nature 384, 23-26; Bohm (1996) Computational
tools for structure-based ligand design Prog Biophys Mol Biol 66(3), 197-210; Cohen et al (1990) J Med Chem 33,
883-894; Navia et al (1992) Curr Opin Struct Biol 2, 202-210。
Stucture-based drug design Nature 384, 23-26; Bohm (1996) Computational
tools for structure-based ligand design Prog Biophys Mol Biol 66(3), 197-210; Cohen et al (1990) J Med Chem 33,
883-894; Navia et al (1992) Curr Opin Struct Biol 2, 202-210。
【０１３４】
以下のコンピュータープログラムは、例えば本発明のこの側面の方法を実施す
るのに有用であるかもしれない：GRID (Goodford (1985) J Med Chem 28, 849-8
57; オックスフォード大学から得られる, オックスフォード, UK); MCSS (Miran
ker et al (1991) Proteins: Structure, Function and Genetics 11, 29-34; M
olecular Simulationsから得られる, Burlington, MA); AUTODOCK (Goodsell et
al (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8, 195-202; Scripp
s Research Instituteから得られる, La Jolla, CA); DOCK (Kuntz et al (1982
) J Mol Biol 161, 269-288; カリフォルニア大学から得られる, サンフランシ
スコ, CA); LUDI (Bohm (1992) J Comp Aid Molec Design 6, 61-78; Biosym Te
chnologiesから得られる, サンディエゴ, CA); LEGEND (Nishibata et al (1991
) Tetrahedron 47, 8985; Molecular Simulationsから得られる, Burlington, M
A); LeapFrog (Tripos Associatesから得られる, St Louis, MO); Gaussian 92,
例えば revision C (MJ Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA c1992); AM
BER, バージョン 4.0 (PA Kollman, サンフランシスコのカリフォルニア大学, c
1994); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA c1994)
; 及び Insight II/Discover (Biosym Technologies Inc., サンディエゴ, CA c
1994)。プログラムは、例えばSilicon Graphics（商標） workstation, Indigo2 （商標） or IBM RISC/6000（商標） workstation model 550上で作動するかも
しれない。
るのに有用であるかもしれない：GRID (Goodford (1985) J Med Chem 28, 849-8
57; オックスフォード大学から得られる, オックスフォード, UK); MCSS (Miran
ker et al (1991) Proteins: Structure, Function and Genetics 11, 29-34; M
olecular Simulationsから得られる, Burlington, MA); AUTODOCK (Goodsell et
al (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8, 195-202; Scripp
s Research Instituteから得られる, La Jolla, CA); DOCK (Kuntz et al (1982
) J Mol Biol 161, 269-288; カリフォルニア大学から得られる, サンフランシ
スコ, CA); LUDI (Bohm (1992) J Comp Aid Molec Design 6, 61-78; Biosym Te
chnologiesから得られる, サンディエゴ, CA); LEGEND (Nishibata et al (1991
) Tetrahedron 47, 8985; Molecular Simulationsから得られる, Burlington, M
A); LeapFrog (Tripos Associatesから得られる, St Louis, MO); Gaussian 92,
例えば revision C (MJ Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA c1992); AM
BER, バージョン 4.0 (PA Kollman, サンフランシスコのカリフォルニア大学, c
1994); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA c1994)
; 及び Insight II/Discover (Biosym Technologies Inc., サンディエゴ, CA c
1994)。プログラムは、例えばSilicon Graphics（商標） workstation, Indigo2 （商標） or IBM RISC/6000（商標） workstation model 550上で作動するかも
しれない。
【０１３５】
選択又は設計された化合物は、合成され（まだ合成されていない場合）、関連
する疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼについてのその化合物の有効性
、例えばプロテインキナーゼ活性についてのその化合物の有効性を試験されるこ
ととしても良い。化合物は、本発明のスクリーニング方法において試験されるこ
ととしても良い。
する疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼについてのその化合物の有効性
、例えばプロテインキナーゼ活性についてのその化合物の有効性を試験されるこ
ととしても良い。化合物は、本発明のスクリーニング方法において試験されるこ
ととしても良い。
【０１３６】
本発明の更なる側面は、本発明の上記選択／設計方法により同定される化合物
、又は同定可能な化合物である。
、又は同定可能な化合物である。
【０１３７】
本発明の更なる側面は、本発明の医薬用の化合物（又はポリペプチド又はポリ
ヌクレオチド）である。
ヌクレオチド）である。
【０１３８】
この化合物（若しくはポリペプチド若しくはポリヌクレオチド）は何らかの適す
る方法で、通常は非経口的に、例えば静脈内に，腹腔内に又は嚢内に、標準の無
菌，非発熱性の希釈剤及び担体からなる製剤形態で投与されてもよい。この化合
物（若しくはポリペプチド若しくはポリヌクレオチド）はさらに、局所的に投与
されてもよい。この化合物は外傷（surface wounds）の治療に特に有効であろう
。化合物（又はポリペプチド又はポリヌクレオチド）はまた、例えば注射などに
より局在的（localised)態様で投与されても良い。化合物はまた、抗菌の（又は
他の寄生性の有機体（organism)、病原性の有機体、又は潜在的寄生性の有機体
若しくは潜在的病原性の有機体)の薬として有用であっても良い。
る方法で、通常は非経口的に、例えば静脈内に，腹腔内に又は嚢内に、標準の無
菌，非発熱性の希釈剤及び担体からなる製剤形態で投与されてもよい。この化合
物（若しくはポリペプチド若しくはポリヌクレオチド）はさらに、局所的に投与
されてもよい。この化合物は外傷（surface wounds）の治療に特に有効であろう
。化合物（又はポリペプチド又はポリヌクレオチド）はまた、例えば注射などに
より局在的（localised)態様で投与されても良い。化合物はまた、抗菌の（又は
他の寄生性の有機体（organism)、病原性の有機体、又は潜在的寄生性の有機体
若しくは潜在的病原性の有機体)の薬として有用であっても良い。
【０１３９】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は
Lys111 を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポ
ケットと等価な位置に疎水性ポケットを含む例えばPDK1, SGK, PKB, PKA 又は p
70 S6キナーゼ等のプロテインキナーゼによるシグナリング、例えばインスリン
シグナリング経路（insulin signaling pathway)及び／又はPDK1/PDK2/SGK/PKB/
p70 S6 kinase/PRK2/PKC/PKAシグナリング等の調整を必要とする患者の治療用薬
剤の製造における、上記定義されたような化合物（又はポリペプチド又はポリヌ
クレオチド）の用途である。患者は、感染性有機体（infecting organism)中に
おける前記疎水性ポケットを有するキナーゼの抑制を必要としても良く、例えば
、患者は治療を必要とする真菌感染症を有しても良い。化合物は、疎水性ポケッ
トを有する感染性の有機体の（例えば、菌類の）プロテインキナーゼを抑制して
も良いが、疎水性ポケットを有する患者の等価なプロテインキナーゼを抑制しな
くても良い。
Lys111 を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポ
ケットと等価な位置に疎水性ポケットを含む例えばPDK1, SGK, PKB, PKA 又は p
70 S6キナーゼ等のプロテインキナーゼによるシグナリング、例えばインスリン
シグナリング経路（insulin signaling pathway)及び／又はPDK1/PDK2/SGK/PKB/
p70 S6 kinase/PRK2/PKC/PKAシグナリング等の調整を必要とする患者の治療用薬
剤の製造における、上記定義されたような化合物（又はポリペプチド又はポリヌ
クレオチド）の用途である。患者は、感染性有機体（infecting organism)中に
おける前記疎水性ポケットを有するキナーゼの抑制を必要としても良く、例えば
、患者は治療を必要とする真菌感染症を有しても良い。化合物は、疎水性ポケッ
トを有する感染性の有機体の（例えば、菌類の）プロテインキナーゼを抑制して
も良いが、疎水性ポケットを有する患者の等価なプロテインキナーゼを抑制しな
くても良い。
【０１４０】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKAのLys76, Leu116, Val80 及び／又は
Lys111 を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポ
ケットと等価な位置に疎水性ポケットを含む例えばPDK1, SGK, PKB, PKA 又は p
70 S6キナーゼ等のプロテインキナーゼによってシグナリング、例えばインスリ
ンシグナリング経路（insulin signaling pathway)及び／又はPDK1/PDK2/SGK/PK
B/p70 S6 kinase/PRK2/PKC/PKAシグナリング等を調整する必要がある患者を治療
する方法である。ここで、患者は、上記規定されたように化合物（またはポリペ
プチド又はポリヌクレオチド）の有効量を投与される。
Lys111 を含む残基によって規定されるプロテインキナーゼA（PKA）の疎水性ポ
ケットと等価な位置に疎水性ポケットを含む例えばPDK1, SGK, PKB, PKA 又は p
70 S6キナーゼ等のプロテインキナーゼによってシグナリング、例えばインスリ
ンシグナリング経路（insulin signaling pathway)及び／又はPDK1/PDK2/SGK/PK
B/p70 S6 kinase/PRK2/PKC/PKAシグナリング等を調整する必要がある患者を治療
する方法である。ここで、患者は、上記規定されたように化合物（またはポリペ
プチド又はポリヌクレオチド）の有効量を投与される。
【０１４１】
例えばPKCβ, PRK1 又は PRK2, PKA, PDK1 (即ちPDK1及び／又はPDK2活性）,
PKB, SGK or p70 S6 kinase等、PKCの活性を減少する能力がある化合物は、ガン
の治療に有効であるかもしれない。PDK1は、例えばPKB及び／又はSGKを介して、
多様な態様で誘発されるアポトーシス(Cross et al (1995) Nature 378, 785-78
9 and Alessi & Cohen (1998) Curr. Opin. Genetics. Develop. 8, 55-62にお
いて調査されている)から細胞を守る生存シグナル（survival signal)を発する
能力をもつかもしれない。従って、このような化合物はアポトーシスを促進（ai
d)するかもしれない。PDK1, PKB, SGK 及び／又はp70 S6 キナーゼの活性は、ア
ポトーシスを促進するかもしれず、従ってガンの治療に有効かもしれない。アポ
トーシスの促進に有効かもしれない条件にはまた、炎症を消散すること（resolu
tion of inflammation)も含まれるだろう。
PKB, SGK or p70 S6 kinase等、PKCの活性を減少する能力がある化合物は、ガン
の治療に有効であるかもしれない。PDK1は、例えばPKB及び／又はSGKを介して、
多様な態様で誘発されるアポトーシス(Cross et al (1995) Nature 378, 785-78
9 and Alessi & Cohen (1998) Curr. Opin. Genetics. Develop. 8, 55-62にお
いて調査されている)から細胞を守る生存シグナル（survival signal)を発する
能力をもつかもしれない。従って、このような化合物はアポトーシスを促進（ai
d)するかもしれない。PDK1, PKB, SGK 及び／又はp70 S6 キナーゼの活性は、ア
ポトーシスを促進するかもしれず、従ってガンの治療に有効かもしれない。アポ
トーシスの促進に有効かもしれない条件にはまた、炎症を消散すること（resolu
tion of inflammation)も含まれるだろう。
【０１４２】
PDK1, PKB, SGK or p70 S6キナーゼ活性を高める能力がある化合物は、糖尿病
若しくは肥満症の治療、又はアポトーシスの抑制に有用だろう。PDK1, PKB, SGK
or p70 S6キナーゼの高められた活性は、上述のように体重を減少させるレプチ
ンのレベルを高めるだろう。従ってこのような化合物は体重を減少させるだろう
。例えば、細胞損傷過程（cell damaging process)の間じゅう又はこれに引き続
いて細胞の生存を助けるかもしれないこのような化合物は、アポトーシスを抑制
するかもしれない。このような化合物は、アポトーシスが関与した病気の治療に
有用であると考えられている。このような病気の例としては、これに限定される
ものではないが、例えば脳梗塞及び心筋梗塞、神経損傷及び心筋梗塞等の機械的
（熱的を含む）組織損傷若しくは虚血性疾患(ischaemic desease)を含む。従っ
て、PDK1, PKB, SGK or p70 S6キナーゼの活性の調整を必要とする患者は、ガン
や糖尿病の患者であるかもしれないし、例えば脳梗塞を含んだ虚血性損傷（isch
aemic injury)や組織損傷に苦しむ患者など、アポトーシスの抑制を必要とする
患者かもしれない。
若しくは肥満症の治療、又はアポトーシスの抑制に有用だろう。PDK1, PKB, SGK
or p70 S6キナーゼの高められた活性は、上述のように体重を減少させるレプチ
ンのレベルを高めるだろう。従ってこのような化合物は体重を減少させるだろう
。例えば、細胞損傷過程（cell damaging process)の間じゅう又はこれに引き続
いて細胞の生存を助けるかもしれないこのような化合物は、アポトーシスを抑制
するかもしれない。このような化合物は、アポトーシスが関与した病気の治療に
有用であると考えられている。このような病気の例としては、これに限定される
ものではないが、例えば脳梗塞及び心筋梗塞、神経損傷及び心筋梗塞等の機械的
（熱的を含む）組織損傷若しくは虚血性疾患(ischaemic desease)を含む。従っ
て、PDK1, PKB, SGK or p70 S6キナーゼの活性の調整を必要とする患者は、ガン
や糖尿病の患者であるかもしれないし、例えば脳梗塞を含んだ虚血性損傷（isch
aemic injury)や組織損傷に苦しむ患者など、アポトーシスの抑制を必要とする
患者かもしれない。
【０１４３】
従って、本発明の更なる側面は、虚血性疾患を持つ患者の治療方法を提供する
。この方法は、本発明のスクリーニング方法により同定されるか、または同定可
能な化合物の有効量を患者に投与することを含む。
。この方法は、本発明のスクリーニング方法により同定されるか、または同定可
能な化合物の有効量を患者に投与することを含む。
【０１４４】
本発明の更なる側面は、患者の虚血性疾患の治療用薬剤の製造における本発明
のスクリーニング方法によって同定可能な化合物の用途を提供する。
のスクリーニング方法によって同定可能な化合物の用途を提供する。
【０１４５】
従って、本発明の更なる側面は、虚血性疾患を持つ患者の治療方法を提供する
。この方法は、本発明のスクリーニング方法によって同定可能な化合物の有効量
を患者に投与することを含む。
。この方法は、本発明のスクリーニング方法によって同定可能な化合物の有効量
を患者に投与することを含む。
【０１４６】
もし患者が例えばガンの患者である場合など、アポトーシスの促進を必要とす
る患者である場合には、薬剤の調製に用いられる本発明の化合物は、PDK1, PKB,
SGK or p70 S6キナーゼの活性を減少させられることが好ましい。もし患者が糖
尿病の患者又は例えば虚血性疾患を持つ患者である場合など、アポトーシスの抑
制が必要な患者であった場合には、薬剤の調製に用いられる本発明の化合物は、
PDK1, PKB, SGK or p70 S6キナーゼの活性を増加させられることが好ましい。
る患者である場合には、薬剤の調製に用いられる本発明の化合物は、PDK1, PKB,
SGK or p70 S6キナーゼの活性を減少させられることが好ましい。もし患者が糖
尿病の患者又は例えば虚血性疾患を持つ患者である場合など、アポトーシスの抑
制が必要な患者であった場合には、薬剤の調製に用いられる本発明の化合物は、
PDK1, PKB, SGK or p70 S6キナーゼの活性を増加させられることが好ましい。
【０１４７】
本発明は更に、完全長マウスPKA、例えばPDK1、の Lys76, Leu116, Val80 及
び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロテインキナーゼ A
の疎水性ポケットに等価な位置において前記疎水性ポケットを有するプロテイン
キナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法を提供する
。この方法は、（１）前記プロテインキナーゼ及び／又はその突然変異体のプロ
テインキナーゼ活性についての試験化合物の有効性を決定する工程、（２）(i)
前記プロテインキナーゼ（疎水性ポケット依存性基質）の前記疎水性ポケットと
結合する基質と、(ii)前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットに結合しな
いか、又は前記第一の基質（疎水性ポケット依存性基質）より低い程度で結合す
る基質（例えばPKB等）とに対する前記プロテインキナーゼのプロテインキナー
ゼ活性を異なる程度に調整することができる化合物を選択する工程を含む。
び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロテインキナーゼ A
の疎水性ポケットに等価な位置において前記疎水性ポケットを有するプロテイン
キナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法を提供する
。この方法は、（１）前記プロテインキナーゼ及び／又はその突然変異体のプロ
テインキナーゼ活性についての試験化合物の有効性を決定する工程、（２）(i)
前記プロテインキナーゼ（疎水性ポケット依存性基質）の前記疎水性ポケットと
結合する基質と、(ii)前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットに結合しな
いか、又は前記第一の基質（疎水性ポケット依存性基質）より低い程度で結合す
る基質（例えばPKB等）とに対する前記プロテインキナーゼのプロテインキナー
ゼ活性を異なる程度に調整することができる化合物を選択する工程を含む。
【０１４８】
プロテインキナーゼはPDK1であることが好ましい。上記示されたプレファレン
スは、これと、以下の本発明の側面とに必要に応じて適用される。
スは、これと、以下の本発明の側面とに必要に応じて適用される。
【０１４９】
疎水性ポケット非依存性基質に対する前記プロテインキナーゼ（例えばPDK1）
のプロテインキナーゼ活性より、疎水性ポケット依存性基質に対する前記プロテ
インキナーゼのプロテインキナーゼ活性をより大きな程度で抑制する化合物が選
択されても良い。
のプロテインキナーゼ活性より、疎水性ポケット依存性基質に対する前記プロテ
インキナーゼのプロテインキナーゼ活性をより大きな程度で抑制する化合物が選
択されても良い。
【０１５０】
プロテインキナーゼがPDK１である場合には、疎水性ポケット依存性基質はSGK
、PRK2、S6K1又はPKCζでも良い。疎水性ポケット非依存性基質はPKBでも良い。
、PRK2、S6K1又はPKCζでも良い。疎水性ポケット非依存性基質はPKBでも良い。
【０１５１】
本発明の更なる側面は、完全長マウスPKA（例えばPDK1）の Lys76, Leu116, V
al80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロテインキナ
ーゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において前記疎水性ポケットを有するプ
ロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法を
提供する。この方法は、例えば完全長マウスPKAのリシン７６と等価な残基等、
プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットの少なくとも一部を規定する残基にお
いて突然変異した( 1 )前記プロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性に係
る前記化合物の有効性を決定する工程、又は、 ( 1 )前記プロテインキナーゼに
対する前記化合物の結合能力を決定する工程を有する。
al80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロテインキナ
ーゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において前記疎水性ポケットを有するプ
ロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法を
提供する。この方法は、例えば完全長マウスPKAのリシン７６と等価な残基等、
プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットの少なくとも一部を規定する残基にお
いて突然変異した( 1 )前記プロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性に係
る前記化合物の有効性を決定する工程、又は、 ( 1 )前記プロテインキナーゼに
対する前記化合物の結合能力を決定する工程を有する。
【０１５２】
この方法は更に、プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットの少なくとも一部
を規定する前記残基において突然変異していないプロテインキナーゼ（例えばPD
K1）のプロテインキナーゼ活性に係る化合物の有効性を決定する工程、又は、プ
ロテインキナーゼの前記疎水性ポケットの少なくとも一部を規定する前記残基に
おいて突然変異していないプロテインキナーゼ（例えばPDK1）に対する前記化合
物の結合能力を決定する工程を含んでも良い。プロテインキナーゼがPDK1である
場合には、このプロテインキナーゼは機能的PHドメイン（functional PH domain
)を欠如していても良い（即ち、ホスホイノチシドを結合する（binding)するこ
とができるPHドメインを欠如しても良い）。
を規定する前記残基において突然変異していないプロテインキナーゼ（例えばPD
K1）のプロテインキナーゼ活性に係る化合物の有効性を決定する工程、又は、プ
ロテインキナーゼの前記疎水性ポケットの少なくとも一部を規定する前記残基に
おいて突然変異していないプロテインキナーゼ（例えばPDK1）に対する前記化合
物の結合能力を決定する工程を含んでも良い。プロテインキナーゼがPDK1である
場合には、このプロテインキナーゼは機能的PHドメイン（functional PH domain
)を欠如していても良い（即ち、ホスホイノチシドを結合する（binding)するこ
とができるPHドメインを欠如しても良い）。
【０１５３】
疎水性ポケット依存性基質のリン酸化の度合い又は割合についての化合物の有
用性が決定されても良い。疎水性ポケット依存性基質に対する、例えばPDK1等の
プロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を減少させるとともに、疎水性ポ
ケット依存性基質、例えばキナーゼがPDK1である場合におけるPKB、に対するプ
ロテインキナーゼ活性に影響を及ぼさないか、或いは疎水性ポケット依存性基質
に対するプロテインキナーゼ活性を増加させない化合物が選択されても良い。PD
K1のアクチベータはインスリンを模倣するかもしなないし、糖尿病や肥満症を治
療するのに有用であるかもしれないし、細胞をアポトーシスから守るかもしれな
い。
用性が決定されても良い。疎水性ポケット依存性基質に対する、例えばPDK1等の
プロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を減少させるとともに、疎水性ポ
ケット依存性基質、例えばキナーゼがPDK1である場合におけるPKB、に対するプ
ロテインキナーゼ活性に影響を及ぼさないか、或いは疎水性ポケット依存性基質
に対するプロテインキナーゼ活性を増加させない化合物が選択されても良い。PD
K1のアクチベータはインスリンを模倣するかもしなないし、糖尿病や肥満症を治
療するのに有用であるかもしれないし、細胞をアポトーシスから守るかもしれな
い。
【０１５４】
本発明の上述の側面に基づく方法を実施するのに有用なパーツキットを提供する
。このパーツキットは、( 1 ) 上記規定したような突然変異させたプロテインキ
ナーゼ、及び／又は、上記規定したような前記プロテインキナーゼの突然変異さ
れていないプロテインキナーゼと、( 2 ) 前記プロテインキナーゼの疎水性ポケ
ット依存性基質、及び前記プロテインキナーゼの疎水性ポケット非依存性基質を
有する。
。このパーツキットは、( 1 ) 上記規定したような突然変異させたプロテインキ
ナーゼ、及び／又は、上記規定したような前記プロテインキナーゼの突然変異さ
れていないプロテインキナーゼと、( 2 ) 前記プロテインキナーゼの疎水性ポケ
ット依存性基質、及び前記プロテインキナーゼの疎水性ポケット非依存性基質を
有する。
【０１５５】
本発明の更なる側面は、( 1 ) プロテインキナーゼの疎水性ポケット依存性基
質を含む基質のリン酸化及び ( 2 ) プロテインキナーゼの疎水性ポケット依存
性基質を含む基質のリン酸化の阻害を異なる程度まで必要とする患者の医療用薬
剤の製造において、プロテインキナーゼの疎水性ポケット非依存性基質よりも疎
水性ポケット依存性基質のうちの、完全長マウスプロテインキナーゼ A (PKA)
の Lys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマ
ウスプロテインキナーゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において疎水性ポケ
ットを有するプロテインキナーゼ ( 例えば PDK1 ) によるリン酸化速度又はリ
ン酸化度を異なる程度まで阻害可能な化合物の用途を提供する。好ましくは、こ
のプロテインキナーゼは PDK1 である。
質を含む基質のリン酸化及び ( 2 ) プロテインキナーゼの疎水性ポケット依存
性基質を含む基質のリン酸化の阻害を異なる程度まで必要とする患者の医療用薬
剤の製造において、プロテインキナーゼの疎水性ポケット非依存性基質よりも疎
水性ポケット依存性基質のうちの、完全長マウスプロテインキナーゼ A (PKA)
の Lys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマ
ウスプロテインキナーゼ A の疎水性ポケットに等価な位置において疎水性ポケ
ットを有するプロテインキナーゼ ( 例えば PDK1 ) によるリン酸化速度又はリ
ン酸化度を異なる程度まで阻害可能な化合物の用途を提供する。好ましくは、こ
のプロテインキナーゼは PDK1 である。
【０１５６】
化合物は、相互作用ポリペプチド又は上述したような化合物であっても良い。
例えば、プロテインキナーゼがPDK1である場合には、化合物はPIFであっても良
い。
例えば、プロテインキナーゼがPDK1である場合には、化合物はPIFであっても良
い。
【０１５７】
化合物はプロテインキナーゼ（例えばPDK1）による（１）プロテインキナーゼ
の疎水性ポケット依存性基質のリン酸化速度又はリン酸化度を、（２）プロテイ
ンキナーゼの疎水性ポケット非依存性基質のリン酸化速度又はリン酸化度より大
きな度合いで抑制することが好ましい。
の疎水性ポケット依存性基質のリン酸化速度又はリン酸化度を、（２）プロテイ
ンキナーゼの疎水性ポケット非依存性基質のリン酸化速度又はリン酸化度より大
きな度合いで抑制することが好ましい。
【０１５８】
プロテインキナーゼがPDK1の場合、化合物は糖尿病やガンを治療するのに用い
られても良い。
られても良い。
【０１５９】
以下の実施例及び図面を参照して本発明を説明する。
【０１６０】
実施例１：PDK1 は、インビボにおいて p70 S6 キナーゼの Ser252 のみなら
ず Thr412 をもリン酸化するという証拠。
ず Thr412 をもリン酸化するという証拠。
【０１６１】
略語: PKB, プロテインキナーゼ B(Protein kinase B) ; PtdIns, ホスホイノ
シトール(Phosphatidylinositol) ; PI3 キナーゼ (PI3-kinase) , ホスホイノ
シチド3キナーゼ (Phosphoinositide 3-kinase) ; PH, プレクストリンホモロジ
ー (pleckstrin homology) ; RSK, リボソーム S6 キナーゼ (Ribosomal S6 kin
ase) ; MSK, マイトジェン及びストレス刺激キナーゼ (Mitogen and Stress Sti
mulated kinase) ; 1,2-SAD-PtdIns(3,4,5)P3, sn-1- ステアロイル -2- アラキ
ドノイル -D-PtdIns(3,4,5)P3 (sn-1-stearoy1-2-arachidonoy1-D-PtdIns(3,4,5
)P3) ; C16-PtdIns(3,4,5)P3, sn-1,2 ジパルミトイル -D-PtdIns(3,4,5)P3 (sn
-1,2 di-palmitoy1-D-PtdIns(3,4,5)P3) ; C16-PtdIns(3,4)P2, sn-1,2 ジパル
ミトイル (di-palmitoy1) -D-PtdIns(3,4)P2 (sn-1,2 di-palmitoy1-D-PtdIns(3
,4)P2)
シトール(Phosphatidylinositol) ; PI3 キナーゼ (PI3-kinase) , ホスホイノ
シチド3キナーゼ (Phosphoinositide 3-kinase) ; PH, プレクストリンホモロジ
ー (pleckstrin homology) ; RSK, リボソーム S6 キナーゼ (Ribosomal S6 kin
ase) ; MSK, マイトジェン及びストレス刺激キナーゼ (Mitogen and Stress Sti
mulated kinase) ; 1,2-SAD-PtdIns(3,4,5)P3, sn-1- ステアロイル -2- アラキ
ドノイル -D-PtdIns(3,4,5)P3 (sn-1-stearoy1-2-arachidonoy1-D-PtdIns(3,4,5
)P3) ; C16-PtdIns(3,4,5)P3, sn-1,2 ジパルミトイル -D-PtdIns(3,4,5)P3 (sn
-1,2 di-palmitoy1-D-PtdIns(3,4,5)P3) ; C16-PtdIns(3,4)P2, sn-1,2 ジパル
ミトイル (di-palmitoy1) -D-PtdIns(3,4)P2 (sn-1,2 di-palmitoy1-D-PtdIns(3
,4)P2)
【０１６２】
本実施例では、細胞、例えば293細胞又は細菌で発現したPDK1が、インビトロ
において p70 S6 キナーゼの Thr412 をリン酸化できることを説明する。PIF に
結合した PDK1 は、インビトロにおいてはもはや p70 S6 と相互作用できない、
又は、p70 S6 キナーゼの Thr252 若しくは Thr412 のどちらかをリン酸化でき
ないということを、我々は発見した。細胞でのPIFの発現は、IGF1 がp70 S6キナ
ーゼの活性化及び p70 S6 キナーゼの Thr412 のリン酸化を誘導するのを妨げる
。細胞での PDK1 の過剰発現は、刺激されていない細胞 (unstimulated cells)
において p70 S6 の Thr412 のリン酸化を誘導し、更に PDK1 の触媒機能が不活
性な突然変異体は、IGF1 刺激細胞 (IGF1-stimulated cells) において p70 S6K
の Thr412 のリン酸化を妨げる。これらの観測から、PDK1 が p70 S6 キナーゼ
の活性化を調節するキナーゼの一つであるという更なる証拠を提供し、更にPDK1
が細胞において p70 S6 キナーゼの Thr-412 のリン酸化を仲介するという第一
の証拠を提供する。
において p70 S6 キナーゼの Thr412 をリン酸化できることを説明する。PIF に
結合した PDK1 は、インビトロにおいてはもはや p70 S6 と相互作用できない、
又は、p70 S6 キナーゼの Thr252 若しくは Thr412 のどちらかをリン酸化でき
ないということを、我々は発見した。細胞でのPIFの発現は、IGF1 がp70 S6キナ
ーゼの活性化及び p70 S6 キナーゼの Thr412 のリン酸化を誘導するのを妨げる
。細胞での PDK1 の過剰発現は、刺激されていない細胞 (unstimulated cells)
において p70 S6 の Thr412 のリン酸化を誘導し、更に PDK1 の触媒機能が不活
性な突然変異体は、IGF1 刺激細胞 (IGF1-stimulated cells) において p70 S6K
の Thr412 のリン酸化を妨げる。これらの観測から、PDK1 が p70 S6 キナーゼ
の活性化を調節するキナーゼの一つであるという更なる証拠を提供し、更にPDK1
が細胞において p70 S6 キナーゼの Thr-412 のリン酸化を仲介するという第一
の証拠を提供する。
【０１６３】
実験工程
材料 PKBα, (RPRAATF) [23] p70 S6K (GRPRTSSFAEG) [24] を検定するのに
適用したペプチド、及び、T412-P 抗体を養い (raise) かつ精製するのに適用し
たペプチドは、Dr G. Blomberg (University of Bristol, U.K) によって合成さ
れた。プロテイン G セファロース、グルタチオンセファロース及び CHXセファ
ロースをPharmaciaから購入した。プロテアーゼカクテルタブレット (Protease-
cocktail tablets) を Roche から、組織培養試薬、IGFI 及びミクロシスチン L
R (microcystin-LR) を Life Technologies から、センサーチップ CM5 及び SA
(sensorChips CM5 and SA) を BiaCore AB から、ビオチニル化された (biotin
ylated) 試薬及びワサビペルオキシダーゼ (horse radish peroxidase) を共役
した二次抗体をPierceから購入した。 抗体 ペプチド SESANQVFLGFTYVAPSV (p70 S6Kのヒトαイソ型のうち長スプラ
イス突然変異体 (the longer splice variant) の残基 401-418 に対応する) に
対して、Thr412 がリン酸化された p70 S6K を認識するホスホ特異性 (phospho-
specific) 抗体をヒツジで養った。下線を引いた残基は、ホスホトレオニン (ph
osphothreonine) である。リン酸化されたペプチドに共有結合する CH セファロ
ースで抗体をアフィニティー精製した (affinity purified)。その後、リン酸化
されていないペプチドに結合するカラムに抗体を通して、このカラムに結合しな
かった抗体を選択した。HA 又は Myc エピトープを認識するモノクローナル抗体
を Boehringer Mannheim から購入した。GST を認識するモノクローナル抗体を
、Sigma から購入して、細胞での GST-PIF の発現レベルを確認するのに用いた
。PRK2/PIF の 18 個のC 末端残基を認識する白ウサギポリクローナル抗体を Sa
ntaCruz Biotechnology から購入した。 昆虫細胞 His-p70 S6K の調製。 カルボキシル末端の 104 個の残基を欠く N
末端に His エピトープ標識 (His-epitope tag) を有する p70 S6K を p70 S6K
-T2 と称する。野生型及び突然変異体 412E-p70 S6K-T2 を調製するために、以
下のオリゴヌクレオチド 5'-AGG ATC CAC CAT GCA CCA TCA CCA TCA CCA TAT GA
G GCG AGC AAG GAG GCG G-3' and 5'-GCG GCC GCT CAA CTT TCA AGT ACA GAT GG
A GCC-3' を用いて、p70 S6K のこれらの型をエンコードする pMT2 ベクターか
らこれら構築物のための cDNA を PCR により増幅した [6]。PCR 産物をその後
pFASTBAC 1 ベクターの BamH1/Not1 部位にサブクローニングし、更に Bac-to-B
ac システム (Life Technologies Inc) を用いて、組換えバキュロウイルスを産
生するのにこのベクターを用いた。産生したウイルスは、N 末端にヘキサヒスチ
ジン (hexahistidine) 配列を有する p70 S6K-T2 又は 412E-p70 S6K-T2 をエン
コードしており、この産生したウイルスを、感染多重度 5 で Sf21 細胞 (1.5 x
106/m) を感染させるのに用いた。感染した細胞を 72 時間の感染後に収集し、
His-p70 S6K プロテインを、PKBβについて以前記載したように [25] Ni2+/NTA
(ニトリロ三酢酸 (nitrilotriacetic acid) ) アガロースクロマトグラフィーに
より精製した。その後それらを50 mM Tris/HCl pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 0.27 M
スクロース(sucrose), 0.03 ％ (体積当たり) Brij-35, 0.15 (体積当たり) 2-
メルカプトエタノール(mercaptoethanol), 1 mM ベンズアミジン (benzamidine)
及び 0.2 mM フェニルメチルスホニルフッ化物 (phenylmethylsuphonyl fluori
de) に対して透析し、分割して (in aliquots) 素早く凍結させ、−80 ℃で保存
した。p70 S6K-T2 又は 412E p70 S6K-T2 の両方を、収率 60 mg/litre の感染
した Sf21 細胞で回収したが、ポリアクリルアミドゲル電気泳動とその後のクー
マシーブルー染色により判断すると >90％ 均質であった。 PDK1 による GST-p70 S6K のリン酸化。 GST-PIF 及び GST-D978A-PIF をヒ
ト胚腎臓 (embryonic kidney) 293 細胞において発現させ、グルタチオンセファ
ロースで精製し、更に GST-PIF に係る微量の内因性 (endogenous) PDK1 を PDK
1 抗体による免疫沈降により除去した [22]。Mg[γ32PATP] による検定開始前に
図示した濃度の GST-PIF 又は PIF ペプチドで 10 分間インキュベートした以外
は、PDK1によるGST-p70 S6K-T2のリン酸化を以前記載したように[7]行った。野
生型 GST-p70 S6K-T2, 及び 突然変異体 T252A-GST-p70 S6K-T2, T412A GST-p70
S6K-T2 プロテインを 293 細胞で発現させ、以前記載したように [7] 精製した
。野生型及び触媒機能が不活性な GST-PDK1 を 293 細胞 [26] 又は大腸菌 (E.c
oli ) [27] で発現させた。 一時的なトランスフェクション実験。 この研究に用いた pMT2 ベクターにお
いて HA-p70 S6K の野生型及び突然変異体型を発現するDNA構築物は、以前から
記載されている [6]。野生型 HA-PKBα [25]; 野生型 Myc-PDK [26] 及び 触媒
機能が不活性な Myc-PDK1 の突然変異体, ( Lys 111 及び Asp223 の両方をAla
に突然変異させている) キナーゼ死滅 (kinase-dead) と称した PDK1 [26]は、
全て pCMV5 ベクターに存した。GST-PIF 及び突然変異体 GST-F977A-PIF [22]
を発現するのに用いた構築物は、pEBG2T ベクターに存する。コントロール実験
において GST プロテインを発現するのにエンプティー (empty) pEBG2T ベクタ
ーを用いた。製作者のプロトコルに従い Qiagen plasmid Mega kit を用いて、
この研究で用いた DNA 構築物を細菌から精製した。
適用したペプチド、及び、T412-P 抗体を養い (raise) かつ精製するのに適用し
たペプチドは、Dr G. Blomberg (University of Bristol, U.K) によって合成さ
れた。プロテイン G セファロース、グルタチオンセファロース及び CHXセファ
ロースをPharmaciaから購入した。プロテアーゼカクテルタブレット (Protease-
cocktail tablets) を Roche から、組織培養試薬、IGFI 及びミクロシスチン L
R (microcystin-LR) を Life Technologies から、センサーチップ CM5 及び SA
(sensorChips CM5 and SA) を BiaCore AB から、ビオチニル化された (biotin
ylated) 試薬及びワサビペルオキシダーゼ (horse radish peroxidase) を共役
した二次抗体をPierceから購入した。 抗体 ペプチド SESANQVFLGFTYVAPSV (p70 S6Kのヒトαイソ型のうち長スプラ
イス突然変異体 (the longer splice variant) の残基 401-418 に対応する) に
対して、Thr412 がリン酸化された p70 S6K を認識するホスホ特異性 (phospho-
specific) 抗体をヒツジで養った。下線を引いた残基は、ホスホトレオニン (ph
osphothreonine) である。リン酸化されたペプチドに共有結合する CH セファロ
ースで抗体をアフィニティー精製した (affinity purified)。その後、リン酸化
されていないペプチドに結合するカラムに抗体を通して、このカラムに結合しな
かった抗体を選択した。HA 又は Myc エピトープを認識するモノクローナル抗体
を Boehringer Mannheim から購入した。GST を認識するモノクローナル抗体を
、Sigma から購入して、細胞での GST-PIF の発現レベルを確認するのに用いた
。PRK2/PIF の 18 個のC 末端残基を認識する白ウサギポリクローナル抗体を Sa
ntaCruz Biotechnology から購入した。 昆虫細胞 His-p70 S6K の調製。 カルボキシル末端の 104 個の残基を欠く N
末端に His エピトープ標識 (His-epitope tag) を有する p70 S6K を p70 S6K
-T2 と称する。野生型及び突然変異体 412E-p70 S6K-T2 を調製するために、以
下のオリゴヌクレオチド 5'-AGG ATC CAC CAT GCA CCA TCA CCA TCA CCA TAT GA
G GCG AGC AAG GAG GCG G-3' and 5'-GCG GCC GCT CAA CTT TCA AGT ACA GAT GG
A GCC-3' を用いて、p70 S6K のこれらの型をエンコードする pMT2 ベクターか
らこれら構築物のための cDNA を PCR により増幅した [6]。PCR 産物をその後
pFASTBAC 1 ベクターの BamH1/Not1 部位にサブクローニングし、更に Bac-to-B
ac システム (Life Technologies Inc) を用いて、組換えバキュロウイルスを産
生するのにこのベクターを用いた。産生したウイルスは、N 末端にヘキサヒスチ
ジン (hexahistidine) 配列を有する p70 S6K-T2 又は 412E-p70 S6K-T2 をエン
コードしており、この産生したウイルスを、感染多重度 5 で Sf21 細胞 (1.5 x
106/m) を感染させるのに用いた。感染した細胞を 72 時間の感染後に収集し、
His-p70 S6K プロテインを、PKBβについて以前記載したように [25] Ni2+/NTA
(ニトリロ三酢酸 (nitrilotriacetic acid) ) アガロースクロマトグラフィーに
より精製した。その後それらを50 mM Tris/HCl pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 0.27 M
スクロース(sucrose), 0.03 ％ (体積当たり) Brij-35, 0.15 (体積当たり) 2-
メルカプトエタノール(mercaptoethanol), 1 mM ベンズアミジン (benzamidine)
及び 0.2 mM フェニルメチルスホニルフッ化物 (phenylmethylsuphonyl fluori
de) に対して透析し、分割して (in aliquots) 素早く凍結させ、−80 ℃で保存
した。p70 S6K-T2 又は 412E p70 S6K-T2 の両方を、収率 60 mg/litre の感染
した Sf21 細胞で回収したが、ポリアクリルアミドゲル電気泳動とその後のクー
マシーブルー染色により判断すると >90％ 均質であった。 PDK1 による GST-p70 S6K のリン酸化。 GST-PIF 及び GST-D978A-PIF をヒ
ト胚腎臓 (embryonic kidney) 293 細胞において発現させ、グルタチオンセファ
ロースで精製し、更に GST-PIF に係る微量の内因性 (endogenous) PDK1 を PDK
1 抗体による免疫沈降により除去した [22]。Mg[γ32PATP] による検定開始前に
図示した濃度の GST-PIF 又は PIF ペプチドで 10 分間インキュベートした以外
は、PDK1によるGST-p70 S6K-T2のリン酸化を以前記載したように[7]行った。野
生型 GST-p70 S6K-T2, 及び 突然変異体 T252A-GST-p70 S6K-T2, T412A GST-p70
S6K-T2 プロテインを 293 細胞で発現させ、以前記載したように [7] 精製した
。野生型及び触媒機能が不活性な GST-PDK1 を 293 細胞 [26] 又は大腸菌 (E.c
oli ) [27] で発現させた。 一時的なトランスフェクション実験。 この研究に用いた pMT2 ベクターにお
いて HA-p70 S6K の野生型及び突然変異体型を発現するDNA構築物は、以前から
記載されている [6]。野生型 HA-PKBα [25]; 野生型 Myc-PDK [26] 及び 触媒
機能が不活性な Myc-PDK1 の突然変異体, ( Lys 111 及び Asp223 の両方をAla
に突然変異させている) キナーゼ死滅 (kinase-dead) と称した PDK1 [26]は、
全て pCMV5 ベクターに存した。GST-PIF 及び突然変異体 GST-F977A-PIF [22]
を発現するのに用いた構築物は、pEBG2T ベクターに存する。コントロール実験
において GST プロテインを発現するのにエンプティー (empty) pEBG2T ベクタ
ーを用いた。製作者のプロトコルに従い Qiagen plasmid Mega kit を用いて、
この研究で用いた DNA 構築物を細菌から精製した。
【０１６４】
修飾リン酸カルシウム法 (a modified calcium phosphate method) [28] を用い
て、野生型若しくは突然変異体 HA-p70 S6K 又は HA-PKBαのどちらかをエンコ
ードする 2μg の DNA 構築物、及び、GST-PIF, GST-F977A-PIF, GST, Myc-PDK1
, キナーゼ死滅 Myc-PDK1, 又は エンプティー pCMV5のどちらかをエンコードす
る 10 μg の DNA により、10 ％ (体積当たり) ウシ胎児血清を含むダルベッコ
改変イーグル培地 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) で直径 10 cm 皿を
用いて培養した 293 細胞をトランスフェクトした。24 時間のトランスフェクシ
ョン後に、16 時間の間細胞から血清を奪い、細胞を図示した時間の間 IGF1 (10
0 nM) に暴露した。細胞を1 mlの溶菌緩衝液 (50 mM Tris/HC1 pH 7.5, 1mM EDT
A, 1mM EGTA, 1% (体積当たり) Triton X-100, 1mMオルトバナジウム酸ナトリウ
ム(sodium orthovanadate), 10 mM βグリセロリン酸ナトリウム(sodium β-gly
cerophosphate), 50 mM NaF, 5 mM ピロリン酸ナトリウム(sodium pyrophosphat
e), 1μM ミクロシスチンLR(microcystin-LR), 0.27 M スクロース(sucrose) 及
び プロテアーゼカクテルタブレット(protease cocktail tablets)) に溶菌し、
遠心分離により清澄化し (cleared)、50 μg のプロテインをアンチ (anti) HA
モノクローナル抗体を用いて免疫沈降に被検した (subjected)。溶菌液のプロテ
イン濃度をブラッドフォード法 (Bradford method) により決定した。 キナーゼ検定。HA-p70 S6K 又は HA-PKBα免疫沈降物を洗浄し、更に PKBαにつ
いて以前記載した [28] ようにペプチド Crosstide (GRPRTSSFAEG) を用いてキ
ナーゼ活性を検定した。活性の一単位，U，を、1 分間における 1 nmol の基質
のリン酸化を触媒した量とした。 脱リン酸化 (dephosphorylated) p70 S6 キナーゼ及び Thr412- リン酸化 (phos
phorylated) p70 S6 キナーゼの免疫ブロッティング。細菌溶菌液を1 ％ SDSに
して、図示した量のプロテインをSDS / ポリアクリルアミドゲル電気泳動に被検
し、その後ニトロセルロースに移し、更に50 mM Tris/HC1 pH7.5, 0.15M NaCl,
0.5% (体積当たり) Tween 及び 10% (質量当たり) スキンミルク (skimmed milk
) において、図示したモノクローナル抗体又は T412-P ホスホ特異性 (phospho-
specific) 抗体 (0.4 μg/ml) を用い免疫ブロットした。増強化学発光試薬 (en
hanced chemiluminescence reagent) (Amersham Pharmacia Biotech) を用いて
検定を行った。 p70 S6 キナーゼに結合する PDK1 の表面プラズモン共鳴測定。製作者の機器に
従って、p70 S6K-T2 及び T412Ep70S6K-T2 突然変異体を CM5 センサーチップ (
BIAcore AB) にアミン結合させた (amine coupled) 。図示した濃度の His-PDK1
を流速 30 μl / 分でチップを覆って注入し、PIF ペプチドが存在するか又は
存在しない状態において定常状態結合 (steady-state binding) を決定した。Si
gmaPlot 4 (SPSS Inc)を用いて、増加したPDK1濃度に基づく定常状態結合の増加
を直角な双曲線に合わせることにより、p70 S6 に対する His-PDK1 の結合に係
る見かけ上の平衡解離定数 (Kd) を決定した。本実験における応答の測定単位を
RUと称した；1000 RU＝1 ng/mm2 のプロテインが表面に結合
て、野生型若しくは突然変異体 HA-p70 S6K 又は HA-PKBαのどちらかをエンコ
ードする 2μg の DNA 構築物、及び、GST-PIF, GST-F977A-PIF, GST, Myc-PDK1
, キナーゼ死滅 Myc-PDK1, 又は エンプティー pCMV5のどちらかをエンコードす
る 10 μg の DNA により、10 ％ (体積当たり) ウシ胎児血清を含むダルベッコ
改変イーグル培地 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) で直径 10 cm 皿を
用いて培養した 293 細胞をトランスフェクトした。24 時間のトランスフェクシ
ョン後に、16 時間の間細胞から血清を奪い、細胞を図示した時間の間 IGF1 (10
0 nM) に暴露した。細胞を1 mlの溶菌緩衝液 (50 mM Tris/HC1 pH 7.5, 1mM EDT
A, 1mM EGTA, 1% (体積当たり) Triton X-100, 1mMオルトバナジウム酸ナトリウ
ム(sodium orthovanadate), 10 mM βグリセロリン酸ナトリウム(sodium β-gly
cerophosphate), 50 mM NaF, 5 mM ピロリン酸ナトリウム(sodium pyrophosphat
e), 1μM ミクロシスチンLR(microcystin-LR), 0.27 M スクロース(sucrose) 及
び プロテアーゼカクテルタブレット(protease cocktail tablets)) に溶菌し、
遠心分離により清澄化し (cleared)、50 μg のプロテインをアンチ (anti) HA
モノクローナル抗体を用いて免疫沈降に被検した (subjected)。溶菌液のプロテ
イン濃度をブラッドフォード法 (Bradford method) により決定した。 キナーゼ検定。HA-p70 S6K 又は HA-PKBα免疫沈降物を洗浄し、更に PKBαにつ
いて以前記載した [28] ようにペプチド Crosstide (GRPRTSSFAEG) を用いてキ
ナーゼ活性を検定した。活性の一単位，U，を、1 分間における 1 nmol の基質
のリン酸化を触媒した量とした。 脱リン酸化 (dephosphorylated) p70 S6 キナーゼ及び Thr412- リン酸化 (phos
phorylated) p70 S6 キナーゼの免疫ブロッティング。細菌溶菌液を1 ％ SDSに
して、図示した量のプロテインをSDS / ポリアクリルアミドゲル電気泳動に被検
し、その後ニトロセルロースに移し、更に50 mM Tris/HC1 pH7.5, 0.15M NaCl,
0.5% (体積当たり) Tween 及び 10% (質量当たり) スキンミルク (skimmed milk
) において、図示したモノクローナル抗体又は T412-P ホスホ特異性 (phospho-
specific) 抗体 (0.4 μg/ml) を用い免疫ブロットした。増強化学発光試薬 (en
hanced chemiluminescence reagent) (Amersham Pharmacia Biotech) を用いて
検定を行った。 p70 S6 キナーゼに結合する PDK1 の表面プラズモン共鳴測定。製作者の機器に
従って、p70 S6K-T2 及び T412Ep70S6K-T2 突然変異体を CM5 センサーチップ (
BIAcore AB) にアミン結合させた (amine coupled) 。図示した濃度の His-PDK1
を流速 30 μl / 分でチップを覆って注入し、PIF ペプチドが存在するか又は
存在しない状態において定常状態結合 (steady-state binding) を決定した。Si
gmaPlot 4 (SPSS Inc)を用いて、増加したPDK1濃度に基づく定常状態結合の増加
を直角な双曲線に合わせることにより、p70 S6 に対する His-PDK1 の結合に係
る見かけ上の平衡解離定数 (Kd) を決定した。本実験における応答の測定単位を
RUと称した；1000 RU＝1 ng/mm2 のプロテインが表面に結合
【０１６５】
結果
PDK1によるp70 S6Kのリン酸化はPIFにより阻害される。
サブマイクロモル濃度のアフィニティーを有した状態で (with submicromolar a
ffinity)、PDK1 は、PDK1 相互作用断片 (PDK1-Interacting Fragment) (PIF)
と称したプロテインキナーゼC関連キナーゼ 2 (Protein Kinase C-Related Kina
se-2) (PRK2) の領域に結合する [22] 。PIF は PRK2 のキナーゼドメインに至
る C 末端に位置しており、PRK2 のこの領域の PDK1 への結合は、p70 S6K の T
hr412 を取り囲む共通モチーフと同様の共通モチーフによって仲介される。この
位置の残基が Thr 又は Ser ではなく Asp (Asp978) であることを除く。図１に
おいて、GST-PIF 又は配列が PIF に係る PDK1 結合部位 (PIFtide) を取り囲む
24 個の残基からなる合成ペプチドのどちらかと PDK1 が複合化した (complexe
d) 場合、PDK1は、インビトロにおいて GST-p70 S6K-T2 (C 末端の 104 個の残
基を欠く p70 S6K の欠失突然変異体) に結合できなかった。以前報告した [22]
ように、平行実験において、GST-PIF 又は PIF ペプチドに複合化した PDK1 は
、科学量論的レベル近傍に至るまで PKB の Thr308 及び Ser473 の両方をリン
酸化できない (データは示さない) ことを確認した。インビトロで PDK1 により
ほとんどリン酸化されない [7,8] 完全長 p70 S6K ではなく GST-p70 S6K-T2 を
、PDK1 の基質 (図１) として適用した。p70 S6KのうちC末端の104個のトランケ
ーションは良性であって (be benign)、ラパマイシン (rapamycin) 及び フォル
トマニンセンシティブマナー (wortmannin sensitive manner) においてインス
リン及び成長因子により活性化されるように [5+6] 、細胞で発現させた場合の
p70S6K-T2 は、完全長プロテインとは区別できない特性を有する。
ffinity)、PDK1 は、PDK1 相互作用断片 (PDK1-Interacting Fragment) (PIF)
と称したプロテインキナーゼC関連キナーゼ 2 (Protein Kinase C-Related Kina
se-2) (PRK2) の領域に結合する [22] 。PIF は PRK2 のキナーゼドメインに至
る C 末端に位置しており、PRK2 のこの領域の PDK1 への結合は、p70 S6K の T
hr412 を取り囲む共通モチーフと同様の共通モチーフによって仲介される。この
位置の残基が Thr 又は Ser ではなく Asp (Asp978) であることを除く。図１に
おいて、GST-PIF 又は配列が PIF に係る PDK1 結合部位 (PIFtide) を取り囲む
24 個の残基からなる合成ペプチドのどちらかと PDK1 が複合化した (complexe
d) 場合、PDK1は、インビトロにおいて GST-p70 S6K-T2 (C 末端の 104 個の残
基を欠く p70 S6K の欠失突然変異体) に結合できなかった。以前報告した [22]
ように、平行実験において、GST-PIF 又は PIF ペプチドに複合化した PDK1 は
、科学量論的レベル近傍に至るまで PKB の Thr308 及び Ser473 の両方をリン
酸化できない (データは示さない) ことを確認した。インビトロで PDK1 により
ほとんどリン酸化されない [7,8] 完全長 p70 S6K ではなく GST-p70 S6K-T2 を
、PDK1 の基質 (図１) として適用した。p70 S6KのうちC末端の104個のトランケ
ーションは良性であって (be benign)、ラパマイシン (rapamycin) 及び フォル
トマニンセンシティブマナー (wortmannin sensitive manner) においてインス
リン及び成長因子により活性化されるように [5+6] 、細胞で発現させた場合の
p70S6K-T2 は、完全長プロテインとは区別できない特性を有する。
【０１６６】
GST-PIF の突然変異体型、又は、PRK2 において Asp978 に等価なアミノ酸残
基を Ala に突然変異させた 24 個の残基からなる PIF ペプチド (GST-D978A-PI
F) は、PDK1 とのアフィニティーが著しく減少する [22] 。これに一致して、GS
T-D978A-PIF 又は突然変異体 D978A-PIF ペプチドは、PDK1 による GST-p70 S6K
-T2 のリン酸化をほとんど阻害しなかった (図１) 。PIF ペプチドにおいて Asp
978 を Ala の代わりにホスホセリン (phosphoserine) 残基に突然変異させ負の
荷電を回復させると、その結果生じたペプチドは、野生型 PIF ペプチドと同様
のアフィニティーを有した状態で PDK1 と相互作用し[22]、更に PDK1 が GST-p
70 S6K-T2 をリン酸化するのを妨げた(図１)。
基を Ala に突然変異させた 24 個の残基からなる PIF ペプチド (GST-D978A-PI
F) は、PDK1 とのアフィニティーが著しく減少する [22] 。これに一致して、GS
T-D978A-PIF 又は突然変異体 D978A-PIF ペプチドは、PDK1 による GST-p70 S6K
-T2 のリン酸化をほとんど阻害しなかった (図１) 。PIF ペプチドにおいて Asp
978 を Ala の代わりにホスホセリン (phosphoserine) 残基に突然変異させ負の
荷電を回復させると、その結果生じたペプチドは、野生型 PIF ペプチドと同様
のアフィニティーを有した状態で PDK1 と相互作用し[22]、更に PDK1 が GST-p
70 S6K-T2 をリン酸化するのを妨げた(図１)。
【０１６７】
インビトロにおいてPDK1はp70 S6 キナーゼの Thr412をリン酸化する。
PDK1 が p70 S6K の Thr412 をリン酸化できるかどうかを決定するために、Thr4
12 がリン酸化された p70 S6K だけを認識するホスホ特異性 (phospho-specific
) 抗体 (T412-P抗体と称した) を作製した (raised) 。この抗体は、PDK1 が存
在しない状態において MgATP とともにインキュベートした GST-p70 S6K-T2 を
認識しなかった。しかしながら、293 細胞又は細菌のどちらかで発現させた PDK
1 を添加すると、GST-p70 S6K-T2 は T412-P により認識された (図２) 。抗体
を作製するのに用いたリン酸化された Thr412 ペプチド抗原 (脱リン酸化ペプチ
ドではない) と T412-P 抗体をインキュベーションすると、T412-P 抗体は GST-
p70 S6K-T2 を認識しなかった(図３)。PDK1 が GST-p-70 S6K-T2 の (Thr252 だ
けでなく) T412 をリン酸化する速度は、ホスファチジルイノシトール - 3,4,5
- トリスリン酸 (phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate) を含む脂質小胞
が存在する状態において、増加しなかった (データは示さない) 。PDK1は、野生
型 GST-p70 S6K-T2 と同程度に GST-p-70 S6K-T2 の T252A 突然変異体の Thr41
2 をリン酸化した。PDK1/MgATP とのインキュベーション後は、GST-p70 S6K-T2
の T412A 突然変異体は T412-P 抗体によって認識されなかった。24 個の残基か
らなる PIF ペプチドは、PDK1がp70 S6K の Thr412をリン酸化するのを妨げた。
PDK1 のキナーゼ死滅 (kinase-dead) 突然変異体は、GST-p-70 S6K-T2 の Thr41
2 をリン酸化しなかった (図２) 。
12 がリン酸化された p70 S6K だけを認識するホスホ特異性 (phospho-specific
) 抗体 (T412-P抗体と称した) を作製した (raised) 。この抗体は、PDK1 が存
在しない状態において MgATP とともにインキュベートした GST-p70 S6K-T2 を
認識しなかった。しかしながら、293 細胞又は細菌のどちらかで発現させた PDK
1 を添加すると、GST-p70 S6K-T2 は T412-P により認識された (図２) 。抗体
を作製するのに用いたリン酸化された Thr412 ペプチド抗原 (脱リン酸化ペプチ
ドではない) と T412-P 抗体をインキュベーションすると、T412-P 抗体は GST-
p70 S6K-T2 を認識しなかった(図３)。PDK1 が GST-p-70 S6K-T2 の (Thr252 だ
けでなく) T412 をリン酸化する速度は、ホスファチジルイノシトール - 3,4,5
- トリスリン酸 (phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate) を含む脂質小胞
が存在する状態において、増加しなかった (データは示さない) 。PDK1は、野生
型 GST-p70 S6K-T2 と同程度に GST-p-70 S6K-T2 の T252A 突然変異体の Thr41
2 をリン酸化した。PDK1/MgATP とのインキュベーション後は、GST-p70 S6K-T2
の T412A 突然変異体は T412-P 抗体によって認識されなかった。24 個の残基か
らなる PIF ペプチドは、PDK1がp70 S6K の Thr412をリン酸化するのを妨げた。
PDK1 のキナーゼ死滅 (kinase-dead) 突然変異体は、GST-p-70 S6K-T2 の Thr41
2 をリン酸化しなかった (図２) 。
【０１６８】
PDK1 が Thr412 をリン酸化する速度は、Thr252 をリン酸化する速度よりも著
しく遅いだろう。PDK1 によりリン酸化された 32P- 標識 GST-p70 S6K-T2 を、
トリプシン (trypsin) 又は V8 プロテアーゼで消化し、その後以前記載した [7
] ようにHPLC を用いたペプチドマップ分析 (peptide map analysis) に被検し
た。この分析から、ペプチドに対応する HPLC カラムに適用した全放射能の20-3
0 ％を含むメジャー 32P 標識ペプチドは Thr252 でリン酸化されることが明ら
かになった。この分析においていくつかのマイナーペプチドが存在し、各マイナ
ーペプチドは全てのリン酸のうちの <5 ％を有していたけれども、それらのうち
のどれかを、Thr412 をリン酸化したペプチドには帰属できなかった。この分析
から、Thr-412でリン酸化された32P標識ペプチドの回復はほとんど無いという可
能性は除外されないが、この分析は、PDK1がp70 S6K の Thr412をリン酸化した
化学量論はThr252をリン酸化する化学量論よりとても小さいことを示唆する。
しく遅いだろう。PDK1 によりリン酸化された 32P- 標識 GST-p70 S6K-T2 を、
トリプシン (trypsin) 又は V8 プロテアーゼで消化し、その後以前記載した [7
] ようにHPLC を用いたペプチドマップ分析 (peptide map analysis) に被検し
た。この分析から、ペプチドに対応する HPLC カラムに適用した全放射能の20-3
0 ％を含むメジャー 32P 標識ペプチドは Thr252 でリン酸化されることが明ら
かになった。この分析においていくつかのマイナーペプチドが存在し、各マイナ
ーペプチドは全てのリン酸のうちの <5 ％を有していたけれども、それらのうち
のどれかを、Thr412 をリン酸化したペプチドには帰属できなかった。この分析
から、Thr-412でリン酸化された32P標識ペプチドの回復はほとんど無いという可
能性は除外されないが、この分析は、PDK1がp70 S6K の Thr412をリン酸化した
化学量論はThr252をリン酸化する化学量論よりとても小さいことを示唆する。
【０１６９】
PIF は、p70 S6K の IGF1- 誘導活性化 (induced activation) を阻害する。
細胞での PIF の発現により、内因性 PDK1 が p70 S6K をリン酸化し活性化する
のを妨げるかどうかを決定するために、HA-標識完全長 p70 S6K (HA-p70 S6K)
を、GST-PIF，PDK1 と弱く相互作用する GST-PIF の突然変異体型 (GST-F977A-P
IF)、又は、GST 自体のどちらかをエンコードする構築物とともに 293 細胞にト
ランスフェクトした。野生型又は突然変異体 GST-PIF 及び GST 自体は全て同じ
レベルで発現したが、内因性 PDK1 又は PRK2 よりも大きい濃度で存在した (デ
ータは示さない) 。細胞を 40 分間 (HA-p70 S6K が最も活性化される時間、デ
ータは示さない) IGF1 で刺激し、細胞を溶菌し、更に HA-p70 S6K を免疫沈降
して検定した。HA-p70 S6K 及び GST を発現する細胞は、刺激されてない細胞に
おいて容易に測定可能な基礎 p70 S6K 活性を示し、p70 S6K 活性は、IGF1 に対
する応答において 10 倍増加した (図３Ａ) 。対称的に、HA-p70 S6K 及び GST-
PIF を発現する細胞は、実質的に検出不能な基礎 HA-p70 S6K 活性を有し、IGF
刺激しても HA p70 S6K 活性の増加はわずかだった (図３) 。HA-p70 S6K 及び
GST を発現する細胞と同程度ではないが、HA-p70 S6K 及び GST-F977A-PIF, HA-
p70 S6K を発現する細胞は、IGF1 により実質的に活性化された (図３Ａ) 。こ
れはおそらく PDK1 との GST-F977A-PIF の弱い相互作用によるものと説明され
る。
細胞での PIF の発現により、内因性 PDK1 が p70 S6K をリン酸化し活性化する
のを妨げるかどうかを決定するために、HA-標識完全長 p70 S6K (HA-p70 S6K)
を、GST-PIF，PDK1 と弱く相互作用する GST-PIF の突然変異体型 (GST-F977A-P
IF)、又は、GST 自体のどちらかをエンコードする構築物とともに 293 細胞にト
ランスフェクトした。野生型又は突然変異体 GST-PIF 及び GST 自体は全て同じ
レベルで発現したが、内因性 PDK1 又は PRK2 よりも大きい濃度で存在した (デ
ータは示さない) 。細胞を 40 分間 (HA-p70 S6K が最も活性化される時間、デ
ータは示さない) IGF1 で刺激し、細胞を溶菌し、更に HA-p70 S6K を免疫沈降
して検定した。HA-p70 S6K 及び GST を発現する細胞は、刺激されてない細胞に
おいて容易に測定可能な基礎 p70 S6K 活性を示し、p70 S6K 活性は、IGF1 に対
する応答において 10 倍増加した (図３Ａ) 。対称的に、HA-p70 S6K 及び GST-
PIF を発現する細胞は、実質的に検出不能な基礎 HA-p70 S6K 活性を有し、IGF
刺激しても HA p70 S6K 活性の増加はわずかだった (図３) 。HA-p70 S6K 及び
GST を発現する細胞と同程度ではないが、HA-p70 S6K 及び GST-F977A-PIF, HA-
p70 S6K を発現する細胞は、IGF1 により実質的に活性化された (図３Ａ) 。こ
れはおそらく PDK1 との GST-F977A-PIF の弱い相互作用によるものと説明され
る。
【０１７０】
PIFは、IGF1がp70 S6K の Thr412のリン酸化を誘導するのを阻害する。
細胞において PIF が P70 S6K 活性化を阻害したように、p70 S6K の Thr412 及
び Thr252 のリン酸化に係る PIF 発現の有効性を、我々は決定しようとした。
我々は、p70 S6K の Thr412 のリン酸化を測定するため T412-P 抗体を使用した
。これら実験では、IGF1 が Thr412 のリン酸化を誘発した (図３Ａ) 。これを
、抗体を作製するのに用いたリン酸化された Thr412 ペプチド抗原 (脱リン酸化
ペプチドではない) (図３Ａ) 又は Thr252 周辺の配列に対応するホスホペプチ
ド (データは示さない) との T412-P 抗体のインキュベーションにより止めた (
abolished) 。更に、Thr412 を Ala に変えた HA-p70 S6K の突然変異体型は、T
412-P 抗体、次の IGF1 刺激によっては認識されなかった (図５Ｃ) 。
び Thr252 のリン酸化に係る PIF 発現の有効性を、我々は決定しようとした。
我々は、p70 S6K の Thr412 のリン酸化を測定するため T412-P 抗体を使用した
。これら実験では、IGF1 が Thr412 のリン酸化を誘発した (図３Ａ) 。これを
、抗体を作製するのに用いたリン酸化された Thr412 ペプチド抗原 (脱リン酸化
ペプチドではない) (図３Ａ) 又は Thr252 周辺の配列に対応するホスホペプチ
ド (データは示さない) との T412-P 抗体のインキュベーションにより止めた (
abolished) 。更に、Thr412 を Ala に変えた HA-p70 S6K の突然変異体型は、T
412-P 抗体、次の IGF1 刺激によっては認識されなかった (図５Ｃ) 。
【０１７１】
GST-PIF とともに HA-p70 S6K を細胞で共発現した場合、IGF1 は HA-p70 S6K
の Thr412 のリン酸化を誘導しなかった (図３Ａ)。対称的に、HA-p70 S6K 及
び 突然変異体 GST-F977A-PIF を発現する細胞においては、HA-p70 S6K のリン
酸化は引き起こされたが、HA-p70 S6K 及び GST を発現する細胞で観測されるも
のより低いレベルだった。GST のみを発現する細胞に比べるとこれら細胞におい
ては、Thr412 リン酸化の減少は、HA-p70 S6K の活性化の減少と一致する (図３
Ａ) 。GST-F977A-PIF 突然変異体との HAp70 S6K の共トランスフェクションは
、T412 のリン酸化レベルを著しく減少させるものの、P70 S6K の最大活性化の
50 ％を誘導したことは注目すべきである (図３Ａ) 。この発見から、Thr412 の
p70 リン酸化と p70 S6K 活性のレベルとの間の関係は比例しないようである。
この観測に係る一つの説明としては、F977A-PIF 突然変異体が、Thr252 よりも
Thr412 での p70 S6K リン酸化をより強く阻害するにちがいないということにな
る。；しかし、これまでのところ、我々は、この可能性を調査するための、Thr2
52 をリン酸化した p70 S6K を認識するホスホ特異性抗体を作製できてない。
の Thr412 のリン酸化を誘導しなかった (図３Ａ)。対称的に、HA-p70 S6K 及
び 突然変異体 GST-F977A-PIF を発現する細胞においては、HA-p70 S6K のリン
酸化は引き起こされたが、HA-p70 S6K 及び GST を発現する細胞で観測されるも
のより低いレベルだった。GST のみを発現する細胞に比べるとこれら細胞におい
ては、Thr412 リン酸化の減少は、HA-p70 S6K の活性化の減少と一致する (図３
Ａ) 。GST-F977A-PIF 突然変異体との HAp70 S6K の共トランスフェクションは
、T412 のリン酸化レベルを著しく減少させるものの、P70 S6K の最大活性化の
50 ％を誘導したことは注目すべきである (図３Ａ) 。この発見から、Thr412 の
p70 リン酸化と p70 S6K 活性のレベルとの間の関係は比例しないようである。
この観測に係る一つの説明としては、F977A-PIF 突然変異体が、Thr252 よりも
Thr412 での p70 S6K リン酸化をより強く阻害するにちがいないということにな
る。；しかし、これまでのところ、我々は、この可能性を調査するための、Thr2
52 をリン酸化した p70 S6K を認識するホスホ特異性抗体を作製できてない。
【０１７２】
細胞での GST-PIF の過剰発現もまた、IGF1 が p70 S6K-T2 突然変異体の活性
化及び p70 S6K-T2 突然変異体の Thr412 のリン酸化を誘導するのを止める (デ
ータは示さない) 。なお、p70 S6K-T2 突然変異体は、C 末端の 104 個の残基を
欠くものである。
化及び p70 S6K-T2 突然変異体の Thr412 のリン酸化を誘導するのを止める (デ
ータは示さない) 。なお、p70 S6K-T2 突然変異体は、C 末端の 104 個の残基を
欠くものである。
【０１７３】
PIFは、IGF1がp70 S6K の Thr252 のリン酸化を誘導するのを阻害する。
Thr412 の位置でリン酸化された残基が存在する状態を模倣するために Thr412
をグルタミン酸に代えた HA-p70 S6K の突然変異体型は、GST 又は突然変異体 G
ST-F977A-PIF とともに共発現した場合に IGF1 により更に活性化された高い基
礎活性を保持した(図３Ｂ)。先の研究で、この突然変異体の基礎活性及び IGF1
刺激活性が、Thr252 のリン酸化を通して仲介されることを確立している [6] 。
図３Ｂにおいて、PIFとのHA-412E p70 S6Kの共発現が、この突然変異体の基礎活
性を著しく減少させ、IGF1によるこの突然変異体の活性化を大きく妨げたことを
例証する。これは、PIF が p70 S6K の Thr252 のリン酸化を阻害することを示
唆する。PIF 細胞の過剰発現もまた、細胞における T412E p70 S6K-T2 突然変異
体の基礎活性及び IGF1 刺激活性を大きく減少させた (データは示さない) 。
をグルタミン酸に代えた HA-p70 S6K の突然変異体型は、GST 又は突然変異体 G
ST-F977A-PIF とともに共発現した場合に IGF1 により更に活性化された高い基
礎活性を保持した(図３Ｂ)。先の研究で、この突然変異体の基礎活性及び IGF1
刺激活性が、Thr252 のリン酸化を通して仲介されることを確立している [6] 。
図３Ｂにおいて、PIFとのHA-412E p70 S6Kの共発現が、この突然変異体の基礎活
性を著しく減少させ、IGF1によるこの突然変異体の活性化を大きく妨げたことを
例証する。これは、PIF が p70 S6K の Thr252 のリン酸化を阻害することを示
唆する。PIF 細胞の過剰発現もまた、細胞における T412E p70 S6K-T2 突然変異
体の基礎活性及び IGF1 刺激活性を大きく減少させた (データは示さない) 。
【０１７４】
PIFは、PKBαの活性化及びPKBαのSer473のリン酸化を阻害しない。先の研究
から、PIF は、3ホスホイノシチド脂質 (3-phosphoinositide lipids) 存在下に
おいて PDK1 が PKB をリン酸化するのを妨げないが、代わりに、PDK1 に PKB
の Thr308 及び Ser473 の両方をリン酸化させることが分かってきている (緒言
を参照) 。ここで、p70 S5K 活性化に係る GST-PIF の有効性とは著しく対称的
に、293 細胞における GST-PIF の発現は、IGF1 が (20 倍の HA-PKBα活性化を
誘導するのを妨げない。この活性化は、HA-PKBαを GST とともに共発現する場
合に観測されるものと同様である (図４) 。GST-PIFの発現は、HA-PKBα の Ser
473 (p70 S6K における Thr412 に等価な残基) の IGF1誘導リン酸化を阻害又は
増強しなかった (図４) 。GST-PIF は、PKB 及び HA-p70 S6K と共トランスフェ
クトした場合と同レベルで発現する (データは示さない) が、これは、PIF が細
胞において PKB の活性化に影響を与えられないのは PIF の発現レベルが低いた
めではないことを示す。
から、PIF は、3ホスホイノシチド脂質 (3-phosphoinositide lipids) 存在下に
おいて PDK1 が PKB をリン酸化するのを妨げないが、代わりに、PDK1 に PKB
の Thr308 及び Ser473 の両方をリン酸化させることが分かってきている (緒言
を参照) 。ここで、p70 S5K 活性化に係る GST-PIF の有効性とは著しく対称的
に、293 細胞における GST-PIF の発現は、IGF1 が (20 倍の HA-PKBα活性化を
誘導するのを妨げない。この活性化は、HA-PKBαを GST とともに共発現する場
合に観測されるものと同様である (図４) 。GST-PIFの発現は、HA-PKBα の Ser
473 (p70 S6K における Thr412 に等価な残基) の IGF1誘導リン酸化を阻害又は
増強しなかった (図４) 。GST-PIF は、PKB 及び HA-p70 S6K と共トランスフェ
クトした場合と同レベルで発現する (データは示さない) が、これは、PIF が細
胞において PKB の活性化に影響を与えられないのは PIF の発現レベルが低いた
めではないことを示す。
【０１７５】
触媒機能が不活性な PDK1 の突然変異体は、p70 S6K の活性化及びリン酸化を
妨げる。先の発見 [7,8] に一致して、野生型 PDK1 との HA-p70 S6K の共発現
は、HA p70 S6K の大きな活性化を誘導したが、この活性化は IGF1 刺激によっ
て更には増加しなかった (図５Ａ) 。PDK1 を過剰発現し次に IGF 刺激を行う細
胞において HA-p70 S6K 活性がわずかに減少するのを我々は絶えず観測した。HA
-p70 S6K 又は T252A-p70 S6K との野生型 PDK1 の共発現もまた、刺激されてい
ない細胞において Thr412 のリン酸化を大きく増加させる結果をもたらした (図
５Ａ及び５Ｂ) 。対称的に、野生型 PDK1 及び HA-T412A p70 S6K 突然変異体を
共発現した場合、T412P 抗体を用いた免疫ブロッティング後に免疫感受性の無い
(no immunoreative) バンドを検出した (図５Ｃ) 。HA-p70 S6K とともに PDK1
のキナーゼ死滅突然変異体を共発現した場合、後者の HA-p70 S6K はもはや細
胞の IGF1 刺激に引き続いて活性化されず、さらに Thr412 もリン酸化されなか
った (図５Ａ) 。図５Ｄにおいて、触媒機能が不活性な PDK1 との HA-412E p70
S6K の共発現は、HA412E p70 S6K の基礎レベルを減少させ、更に IGF1 による
HA412E p70 S6K の活性化を大きく妨げた。このことは、細胞におけるキナーゼ
死滅 PDK1 の過剰発現もまた p70 S6K の Thr252 のリン酸化を阻害するという
証拠を提供する。
妨げる。先の発見 [7,8] に一致して、野生型 PDK1 との HA-p70 S6K の共発現
は、HA p70 S6K の大きな活性化を誘導したが、この活性化は IGF1 刺激によっ
て更には増加しなかった (図５Ａ) 。PDK1 を過剰発現し次に IGF 刺激を行う細
胞において HA-p70 S6K 活性がわずかに減少するのを我々は絶えず観測した。HA
-p70 S6K 又は T252A-p70 S6K との野生型 PDK1 の共発現もまた、刺激されてい
ない細胞において Thr412 のリン酸化を大きく増加させる結果をもたらした (図
５Ａ及び５Ｂ) 。対称的に、野生型 PDK1 及び HA-T412A p70 S6K 突然変異体を
共発現した場合、T412P 抗体を用いた免疫ブロッティング後に免疫感受性の無い
(no immunoreative) バンドを検出した (図５Ｃ) 。HA-p70 S6K とともに PDK1
のキナーゼ死滅突然変異体を共発現した場合、後者の HA-p70 S6K はもはや細
胞の IGF1 刺激に引き続いて活性化されず、さらに Thr412 もリン酸化されなか
った (図５Ａ) 。図５Ｄにおいて、触媒機能が不活性な PDK1 との HA-412E p70
S6K の共発現は、HA412E p70 S6K の基礎レベルを減少させ、更に IGF1 による
HA412E p70 S6K の活性化を大きく妨げた。このことは、細胞におけるキナーゼ
死滅 PDK1 の過剰発現もまた p70 S6K の Thr252 のリン酸化を阻害するという
証拠を提供する。
【０１７６】
PIFは、p70 S6キナーゼとのPDK1の相互作用を妨げる。
Blenis 及びその同僚による最近の研究 [29] の報告によると、PDK1 及び p70 S
6K を細胞に共トランスフェクトした場合、少量の PDK1 が p70 S6K とともに共
免疫沈降され、これは、これらプロテインが直接相互作用する可能性があること
を示唆する。表面プラズモン共鳴測定を用いて、我々は、PDK1 と p412E-p70 S6
K-T2 との間の重要な相互作用 (見かけ上 Kd 8 μM) を検出することができた (
図６) 。PIF ペプチドの Asp978Ala 突然変異体ではなく 24 個の残基からなる
野生型 PIF ペプチドが存在する状態においてこの相互作用は廃されたが、これ
は、PIF 及び 412E-p70 S6K-T2 突然変異体が PDK1 の同じ結合部位に競合する
ことを示唆する。平行実験において、PDK1 と野生型 p70 S6K-T2 キナーゼとの
間の重要な弱い相互作用を検出した (図６) 。
6K を細胞に共トランスフェクトした場合、少量の PDK1 が p70 S6K とともに共
免疫沈降され、これは、これらプロテインが直接相互作用する可能性があること
を示唆する。表面プラズモン共鳴測定を用いて、我々は、PDK1 と p412E-p70 S6
K-T2 との間の重要な相互作用 (見かけ上 Kd 8 μM) を検出することができた (
図６) 。PIF ペプチドの Asp978Ala 突然変異体ではなく 24 個の残基からなる
野生型 PIF ペプチドが存在する状態においてこの相互作用は廃されたが、これ
は、PIF 及び 412E-p70 S6K-T2 突然変異体が PDK1 の同じ結合部位に競合する
ことを示唆する。平行実験において、PDK1 と野生型 p70 S6K-T2 キナーゼとの
間の重要な弱い相互作用を検出した (図６) 。
【０１７７】
考察
最近の研究から、PIF と PDK1 のキナーゼドメインとの間には高いアフィニティ
ー相互作用が存在し、このアフィニティー相互作用は、PDK1 が PKBαをリン酸
化する速度を増強し、更に Thr308 だけでなく Ser473 のリン酸化をも許容する
ことが分かってきている。我々は、この研究において、PIF は、PDK1 が p70 S6
K をリン酸化するのを妨げ (図１及び２) 、更に 293 細胞における PIF の発現
は、PKBαの活性化に影響を与えずに (図４) p70 S6K の IGF1 誘導活性化を妨
げるという驚くべき観測を目の当たりにした (図３) 。PDK1 と弱く相互作用す
る PIF の突然変異体型は、インビトロにおいてPDK1 による p70 S6K のリン酸
化を阻害する又は p70 S6K の IGF1 誘導活性化を阻害するのにほとんど有効で
はなかった。これらの観測から、p70 S6K が PDK1 によりリン酸化される前に、
PKBαではなく p70 S6K は、PIF 結合部位に重複する部位で PDK1 と相互作用す
る必要があるかどうかを説明できるだろう。この結論は、p70 S6K が PDK1 との
相互作用するという図６の発見から支持され、更に、この相互作用は、PIF ペプ
チドが存在する状態において廃される。p70 S6K の T412E 突然変異体型が野生
型酵素よりも高いアフィニティーを有した状態で PDK1 と相互作用するという発
見もまた、何故、先の研究で観測された p70 S6K の T412E が、p70 S6K の野生
型又は T412A 突然変異体よりも PDK1 に適する優れた基質になる [7,8] かを説
明するだろう。PDK1 による PKBαのリン酸化は、PIF の存在により阻害されな
いが、我々は、表面プラズモン共鳴によってはインビトロでの PKBαと PDK1 と
の間の重要な相互作用をも検出できなかった (データは示さない) 。PKBα 及び
PDK1 の両方は 3 ホスホイノシチドと PH ドメインを介して相互作用するが、
このことが、これら分子を細胞膜に局在させて PDK1 による PKBαのリン酸化を
許容する一次決定要素となる可能性がある。対称的に、3 ホスホイノシチドとは
相互作用しないp70 S6KのようなPDK1の基質は、リン酸化された状態になる前に
、実際には比較的高いアフィニティーを有した状態でPDK1と相互作用する必要が
あるにちがいない。PDK1 は p70 S6K の活性化因子になるという証拠は、インビ
トロでの共トランスフェクション実験においてPDK1がp70 S6Kをリン酸化しかつ
活性化するという証明に大きく依存した。PIF が発現すると、おそらく PIFの P
DK1 への結合によって、インビトロでの p70 S6K の活性化を妨げることができ
るという本実験の発見から、PDK1 は細胞において p70 S6K の活性化に必要であ
るという更なる証拠が提供される。
ー相互作用が存在し、このアフィニティー相互作用は、PDK1 が PKBαをリン酸
化する速度を増強し、更に Thr308 だけでなく Ser473 のリン酸化をも許容する
ことが分かってきている。我々は、この研究において、PIF は、PDK1 が p70 S6
K をリン酸化するのを妨げ (図１及び２) 、更に 293 細胞における PIF の発現
は、PKBαの活性化に影響を与えずに (図４) p70 S6K の IGF1 誘導活性化を妨
げるという驚くべき観測を目の当たりにした (図３) 。PDK1 と弱く相互作用す
る PIF の突然変異体型は、インビトロにおいてPDK1 による p70 S6K のリン酸
化を阻害する又は p70 S6K の IGF1 誘導活性化を阻害するのにほとんど有効で
はなかった。これらの観測から、p70 S6K が PDK1 によりリン酸化される前に、
PKBαではなく p70 S6K は、PIF 結合部位に重複する部位で PDK1 と相互作用す
る必要があるかどうかを説明できるだろう。この結論は、p70 S6K が PDK1 との
相互作用するという図６の発見から支持され、更に、この相互作用は、PIF ペプ
チドが存在する状態において廃される。p70 S6K の T412E 突然変異体型が野生
型酵素よりも高いアフィニティーを有した状態で PDK1 と相互作用するという発
見もまた、何故、先の研究で観測された p70 S6K の T412E が、p70 S6K の野生
型又は T412A 突然変異体よりも PDK1 に適する優れた基質になる [7,8] かを説
明するだろう。PDK1 による PKBαのリン酸化は、PIF の存在により阻害されな
いが、我々は、表面プラズモン共鳴によってはインビトロでの PKBαと PDK1 と
の間の重要な相互作用をも検出できなかった (データは示さない) 。PKBα 及び
PDK1 の両方は 3 ホスホイノシチドと PH ドメインを介して相互作用するが、
このことが、これら分子を細胞膜に局在させて PDK1 による PKBαのリン酸化を
許容する一次決定要素となる可能性がある。対称的に、3 ホスホイノシチドとは
相互作用しないp70 S6KのようなPDK1の基質は、リン酸化された状態になる前に
、実際には比較的高いアフィニティーを有した状態でPDK1と相互作用する必要が
あるにちがいない。PDK1 は p70 S6K の活性化因子になるという証拠は、インビ
トロでの共トランスフェクション実験においてPDK1がp70 S6Kをリン酸化しかつ
活性化するという証明に大きく依存した。PIF が発現すると、おそらく PIFの P
DK1 への結合によって、インビトロでの p70 S6K の活性化を妨げることができ
るという本実験の発見から、PDK1 は細胞において p70 S6K の活性化に必要であ
るという更なる証拠が提供される。
【０１７８】
PIFとの相互作用は、PDK1 を、PKB の Thr308 及び Ser473 の両方の部位をリ
ン酸化できるキナーゼに変える。これは、PDK1が最少で一つのAGCキナーゼファ
ミリーメンバーの PDK2 モチーフだけでなく T ループ (T-loop) の残基をもリ
ン酸化する固有能力を有することを例証する。p70 S6K の Thr412 周辺残基が P
KB の Ser473 周辺残基に高く相同するので、おそらく他のプロテインとの複合
において、PDK1 は、更に、p70 S6K の Thr252 及び Thr412 をもリン酸化する
固有能力を有するだろう。本研究はこの仮説を支持する。何故なら、第一に、野
生型 PDK1 の過剰発現が p70 S6K の Thr412 のリン酸化を引き起こすからであ
る (図５Ａ) 。第二に、PDK1 が触媒するインビボでの p70 S6K の Thr412 のリ
ン酸化は、PIF により妨げられた (図２) 。第三に、PIF との発現は、細胞にお
ける p70 S6K の Thr412 の IGF 刺激リン酸化を妨げる (図３Ａ) 。最後に、細
胞における PDK1 のキナーゼ死滅突然変異体の過剰発現は、他者により報告され
た [8] ように、p70 S6 の活性化を妨げるだけでなく、p70 S6K の Thr412 のリ
ン酸化をも妨げた (図５) 。同時に、このデータは、PDK1 がインビボで p70 S6
K の Thr412 をリン酸化できたことを示唆する。インビトロにおける p70 S6K
の Thr412 の PDK1 リン酸化は、3 ホスホイノシチド脂質に依存しないので、細
胞においてのこれら脂質に対する PDK1 の感受性を、他のプロテインとの PDK1
の相互作用により比較できる。この点において、PIF と PDK1 とが相互作用する
と、PDK1が3 ホスホイノシチドにより直接活性化されることを思い出すべきであ
る [22] 。また、PDK1 相互作用プロテイン (PDK1-interacting protein (s))
は、PDK1 が p70 S6K のThr252 及び Thr412 の両方をリン酸化する速度を大き
くできる可能性がある。
ン酸化できるキナーゼに変える。これは、PDK1が最少で一つのAGCキナーゼファ
ミリーメンバーの PDK2 モチーフだけでなく T ループ (T-loop) の残基をもリ
ン酸化する固有能力を有することを例証する。p70 S6K の Thr412 周辺残基が P
KB の Ser473 周辺残基に高く相同するので、おそらく他のプロテインとの複合
において、PDK1 は、更に、p70 S6K の Thr252 及び Thr412 をもリン酸化する
固有能力を有するだろう。本研究はこの仮説を支持する。何故なら、第一に、野
生型 PDK1 の過剰発現が p70 S6K の Thr412 のリン酸化を引き起こすからであ
る (図５Ａ) 。第二に、PDK1 が触媒するインビボでの p70 S6K の Thr412 のリ
ン酸化は、PIF により妨げられた (図２) 。第三に、PIF との発現は、細胞にお
ける p70 S6K の Thr412 の IGF 刺激リン酸化を妨げる (図３Ａ) 。最後に、細
胞における PDK1 のキナーゼ死滅突然変異体の過剰発現は、他者により報告され
た [8] ように、p70 S6 の活性化を妨げるだけでなく、p70 S6K の Thr412 のリ
ン酸化をも妨げた (図５) 。同時に、このデータは、PDK1 がインビボで p70 S6
K の Thr412 をリン酸化できたことを示唆する。インビトロにおける p70 S6K
の Thr412 の PDK1 リン酸化は、3 ホスホイノシチド脂質に依存しないので、細
胞においてのこれら脂質に対する PDK1 の感受性を、他のプロテインとの PDK1
の相互作用により比較できる。この点において、PIF と PDK1 とが相互作用する
と、PDK1が3 ホスホイノシチドにより直接活性化されることを思い出すべきであ
る [22] 。また、PDK1 相互作用プロテイン (PDK1-interacting protein (s))
は、PDK1 が p70 S6K のThr252 及び Thr412 の両方をリン酸化する速度を大き
くできる可能性がある。
【０１７９】
触媒機能が不活性な PKCλの突然変異体 [30] 及び触媒機能が不活性な PKCξ
の突然変異体 [29] は、細胞において p70 S6K を活性化するアゴニスト (agoni
sts) の能力を中和する (antagonise) ことが最近報告されている。これらの観
測は、PKCλ/PKCξが細胞において p70 S6K を活性化する役割を担う可能性があ
ることを示すものとして解釈された。しかしながら、PKCλ and PKCζは両方と
も、インビボで PDK1 によりおそらく活性化される AGC キナーゼファミリーメ
ンバーであって、それらの PKD2 共通モチーフにおいて Ser/Thr よりもむしろ
酸性残基を有する。更に、PIF に似た PKCζが PDK1 のキナーゼドメインと直接
相互作用するということが明らかにされてきている [16,18] 。それ故、PKC( 及
び PKCζの両方は、PIF と同様に PDK1 に相互作用し、その結果 PDK1 が p70 S
6K の活性化を誘導するのを妨げるという可能性がある。最近の研究は、また、P
KCζが、p70 S6K の Thr412 に等価な残基での新規な PKC イソ型 (PKCδ)ラパ
マイシン感受性 (rapamycin-sensitive) リン酸化を仲介するのに関与すること
を示した [31] 。しかしながら、この研究は、PKCζに複合化したPDK1が、PKCδ
の等価残基を直接リン酸化するPKCζそれ自体よりもむしろPKCδの等価残基をリ
ン酸化する能力を必要とするという可能性を決定付けるものではなかった。事態
を更に複雑にすることには、従来の PKCαは、p70 S6K の Thr412 に等価な自己
の残基を自己リン酸化できるということが最近明らかになってきている [32, 33
論評] 。Sabatini 及び同僚から、mTOR が p70 S6K の Thr412 を直接リン酸化
するということが報告されてきている [34] 。しかしながら、ごく最近の証拠で
は、mTor キナーゼの阻害剤となるラパマイシン (rapamycin) における p70 S6K
の活性を抑制する能力は、最初に p70 S6K を脱リン酸化する mTor- 調節 (mTo
r-regulated) プロテインホスファターゼのラパマイシン誘導 (rapamycin-induc
ed) 活性化を介して仲介されることが示唆されている [35-37] 。p70 S6K の Th
r412 をリン酸化できる mTor 又は他のインスリン刺激 (insulin-stimulated)
キナーゼが PIF により阻害されるかどうかを確かめることは、非常に重要だろ
う。
の突然変異体 [29] は、細胞において p70 S6K を活性化するアゴニスト (agoni
sts) の能力を中和する (antagonise) ことが最近報告されている。これらの観
測は、PKCλ/PKCξが細胞において p70 S6K を活性化する役割を担う可能性があ
ることを示すものとして解釈された。しかしながら、PKCλ and PKCζは両方と
も、インビボで PDK1 によりおそらく活性化される AGC キナーゼファミリーメ
ンバーであって、それらの PKD2 共通モチーフにおいて Ser/Thr よりもむしろ
酸性残基を有する。更に、PIF に似た PKCζが PDK1 のキナーゼドメインと直接
相互作用するということが明らかにされてきている [16,18] 。それ故、PKC( 及
び PKCζの両方は、PIF と同様に PDK1 に相互作用し、その結果 PDK1 が p70 S
6K の活性化を誘導するのを妨げるという可能性がある。最近の研究は、また、P
KCζが、p70 S6K の Thr412 に等価な残基での新規な PKC イソ型 (PKCδ)ラパ
マイシン感受性 (rapamycin-sensitive) リン酸化を仲介するのに関与すること
を示した [31] 。しかしながら、この研究は、PKCζに複合化したPDK1が、PKCδ
の等価残基を直接リン酸化するPKCζそれ自体よりもむしろPKCδの等価残基をリ
ン酸化する能力を必要とするという可能性を決定付けるものではなかった。事態
を更に複雑にすることには、従来の PKCαは、p70 S6K の Thr412 に等価な自己
の残基を自己リン酸化できるということが最近明らかになってきている [32, 33
論評] 。Sabatini 及び同僚から、mTOR が p70 S6K の Thr412 を直接リン酸化
するということが報告されてきている [34] 。しかしながら、ごく最近の証拠で
は、mTor キナーゼの阻害剤となるラパマイシン (rapamycin) における p70 S6K
の活性を抑制する能力は、最初に p70 S6K を脱リン酸化する mTor- 調節 (mTo
r-regulated) プロテインホスファターゼのラパマイシン誘導 (rapamycin-induc
ed) 活性化を介して仲介されることが示唆されている [35-37] 。p70 S6K の Th
r412 をリン酸化できる mTor 又は他のインスリン刺激 (insulin-stimulated)
キナーゼが PIF により阻害されるかどうかを確かめることは、非常に重要だろ
う。
【０１８０】
引用文献
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22.Alessi et al (1996). FEBS Lett 399, 333-338.
23.Leighton et al (1995). FEBS Lett. 375, 289-293.
24.Walker et al (1998). Biochem. J. 331, 299-308.
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30.Ziegler et al (1999). Curr. Biol. 9, 522-529.
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37.Sabatini et al (1999). Science 284, 1161-1164.
【０１８１】
実施例２：PIF及びPKAのC-末端残基と相互作用するPDK１キナーゼドメインの
小さいローブ中における疎水性ポケットの同定。 使用された略記号（第１の実施の形態で定義された略記号以外のもの）：PKA
、 cAMP依存性プロテインキナーゼ；PKACT、１２９−３５０個の残基から構成さ
れたPKAのC―末端フラグメント；PH、プレクストリン相同；PIF；PDK１相互作用
性フラグメント。
小さいローブ中における疎水性ポケットの同定。 使用された略記号（第１の実施の形態で定義された略記号以外のもの）：PKA
、 cAMP依存性プロテインキナーゼ；PKACT、１２９−３５０個の残基から構成さ
れたPKAのC―末端フラグメント；PH、プレクストリン相同；PIF；PDK１相互作用
性フラグメント。
【０１８２】
材料と方法
材料
完全なプロテアーゼ抑制因子反応混液錠剤（complete protease inhibitor co
cktail tablets)及びアンチマイク（anti-Myc)モノクローナル抗体は、Rocheか
ら得たものであり；組織培養試薬はライフテクノロジー（Life Technologies)か
ら得たものであり；SAセンサーチップ(SensorChip SA)はBiocore ABから得たも
のであり；わさび（horse radish)ペルオキシダーゼに結合されたビオチン化試
薬（biotinylated reagent)及び第２のアンチ―マウスIgG抗体はPierseから得た
ものである。グルタチオン―セファローズ及びECL試薬は、Amersham Pharmacia
biotechから得たものである。ペプチド：PIFtide（REPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC)
、突然変異体D978A−PIFtide（ヒトのPRK２配列であるREPRILSEEEQEMFRDFAYLADW
Cに基づいて番号付けている）、非関連ペプチド（図６の対照実験において使用
されるKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFT及びYRRAAVPPSPSLSRHSSPHQAEDEEE）、PKBの特
定のペプチド基質（RPRAATF）、PDK１ペプチド基質T308tide（KTFCGTPEYLAPEVRR
）、及びPDKtide（KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYLADWC）と呼ばれるPDK
１結合部位を包含する配列を有する２４個の残基の合成ペプチドは、Dr G Blomb
erg（イギリス、Bristol大学)によって合成されたものである。
cktail tablets)及びアンチマイク（anti-Myc)モノクローナル抗体は、Rocheか
ら得たものであり；組織培養試薬はライフテクノロジー（Life Technologies)か
ら得たものであり；SAセンサーチップ(SensorChip SA)はBiocore ABから得たも
のであり；わさび（horse radish)ペルオキシダーゼに結合されたビオチン化試
薬（biotinylated reagent)及び第２のアンチ―マウスIgG抗体はPierseから得た
ものである。グルタチオン―セファローズ及びECL試薬は、Amersham Pharmacia
biotechから得たものである。ペプチド：PIFtide（REPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC)
、突然変異体D978A−PIFtide（ヒトのPRK２配列であるREPRILSEEEQEMFRDFAYLADW
Cに基づいて番号付けている）、非関連ペプチド（図６の対照実験において使用
されるKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFT及びYRRAAVPPSPSLSRHSSPHQAEDEEE）、PKBの特
定のペプチド基質（RPRAATF）、PDK１ペプチド基質T308tide（KTFCGTPEYLAPEVRR
）、及びPDKtide（KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYLADWC）と呼ばれるPDK
１結合部位を包含する配列を有する２４個の残基の合成ペプチドは、Dr G Blomb
erg（イギリス、Bristol大学)によって合成されたものである。
【０１８３】
一般的な方法
分子生物学技術については標準のプロトコルを用いて行った。部位特異的突然
変異については、クイックチェンジキット（QuikChange kit)(Stratagene)を用
い、製造メーカーから与えられた取扱説明書に従って行った。トランスフェクシ
ョン（transfection)に用いられたDNA構築物を、キアゲンプラスミドメガキット
（Qiagen plasmid Mega kit)を用い製造メーカーのプロトコルに従ってバクテリ
アから精製した。これらDNA構築物の配列を、自動DNAシーケンサー（モデル373
、Applied Biosystems)を用いて確認した。ヒト胚の腎臓の２９３細胞を、１０
ｃｍの皿(dishes)上で、牛の胎児の血清を１０％含んだDulbecco's Modified Ea
gle溶媒中で培養した。ホスファチジルコリン(phosphatidylicholine)、ホスフ
ァチジルセリン（phosphatidylserine)及びsn-1-stearoyl-2-arachidonoyl-D-Pt
dIns(3、4、5)P3[26]を含んだ疎水性小胞（vesicles)を上述のように調整した［
13］。
変異については、クイックチェンジキット（QuikChange kit)(Stratagene)を用
い、製造メーカーから与えられた取扱説明書に従って行った。トランスフェクシ
ョン（transfection)に用いられたDNA構築物を、キアゲンプラスミドメガキット
（Qiagen plasmid Mega kit)を用い製造メーカーのプロトコルに従ってバクテリ
アから精製した。これらDNA構築物の配列を、自動DNAシーケンサー（モデル373
、Applied Biosystems)を用いて確認した。ヒト胚の腎臓の２９３細胞を、１０
ｃｍの皿(dishes)上で、牛の胎児の血清を１０％含んだDulbecco's Modified Ea
gle溶媒中で培養した。ホスファチジルコリン(phosphatidylicholine)、ホスフ
ァチジルセリン（phosphatidylserine)及びsn-1-stearoyl-2-arachidonoyl-D-Pt
dIns(3、4、5)P3[26]を含んだ疎水性小胞（vesicles)を上述のように調整した［
13］。
【０１８４】
PDK1構築物
完全長PDK１（１−５５６個の残基）、PDK１（５２−５５６個の残基）、PDK
１（５２−４０４個の残基）、PDK１（１−３６０個の残基）及びPDK１（１−４
２６個の残基）の構築物を、pEBG2Tベクター［２７］からのN末端グルタチオンS
トランスフェラーゼ(GST)ラベルとともに２９３細胞中で発現し、グルタチオン
セファロースでアフィニティー精製した[14]。本実験において用いられる図示さ
れた（indicated)PDK１のLys115、Ile119、Gin150及びLeu155突然変異体を同様
の形式（fashion)において発現し精製した。0.5と1.0ｍｇとの間の各GST融合プ
ロテインを、直径１０ｃｍの皿２０枚の２９３細胞をトランスフェクション（tr
ansfection)することにより得た。それぞれのプロテインは、SDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定したところ、９０％より高く同質（homogeneous)で
あった（データは図示しない）。PDK１（５２−５５６個の残基）もまた、N末端
のSf9細胞中でヘキサヒスチヂン（His)ラベルとともに発現し、上述したように
精製した［24］。
１（５２−４０４個の残基）、PDK１（１−３６０個の残基）及びPDK１（１−４
２６個の残基）の構築物を、pEBG2Tベクター［２７］からのN末端グルタチオンS
トランスフェラーゼ(GST)ラベルとともに２９３細胞中で発現し、グルタチオン
セファロースでアフィニティー精製した[14]。本実験において用いられる図示さ
れた（indicated)PDK１のLys115、Ile119、Gin150及びLeu155突然変異体を同様
の形式（fashion)において発現し精製した。0.5と1.0ｍｇとの間の各GST融合プ
ロテインを、直径１０ｃｍの皿２０枚の２９３細胞をトランスフェクション（tr
ansfection)することにより得た。それぞれのプロテインは、SDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定したところ、９０％より高く同質（homogeneous)で
あった（データは図示しない）。PDK１（５２−５５６個の残基）もまた、N末端
のSf9細胞中でヘキサヒスチヂン（His)ラベルとともに発現し、上述したように
精製した［24］。
【０１８５】
酵母菌ツーハイブリッドスクリーン（screen)
MyeでラベルされたヒトPDK１を、Gal4 DNA結合ドメイン融合としてのpAS2-1(C
lonetech)のEcoRI/SalI部位にサブクローニングした。酵母菌ツーハイブリッド
スクリーンを、pAS2-1 PDK1及びpACT2ヒト脳cDNAライブラリ（clontech)を酵母
菌株Y190に共形質転換させることにより実施した。ヒスチジン、ロイシン及びト
リプトファンを欠如したＳＤ培地に２５ｍｍ ３−アミノトリアゾールを加え、
形質転換された酵母菌細胞をこの培地上、３０℃で１０日間培養した。およそ5
×１０6のコロニーをスクリーンした。
lonetech)のEcoRI/SalI部位にサブクローニングした。酵母菌ツーハイブリッド
スクリーンを、pAS2-1 PDK1及びpACT2ヒト脳cDNAライブラリ（clontech)を酵母
菌株Y190に共形質転換させることにより実施した。ヒスチジン、ロイシン及びト
リプトファンを欠如したＳＤ培地に２５ｍｍ ３−アミノトリアゾールを加え、
形質転換された酵母菌細胞をこの培地上、３０℃で１０日間培養した。およそ5
×１０6のコロニーをスクリーンした。
【０１８６】
酵母菌２−ハイブリッド分析
pAS2-1 PDK1(L155D)、(L155E)及び(L155S)の部位特異的突然変異体を形成した
。Y190株酵母菌を、図示されたベクターの混合物とともに共形質転換し、ヒスチ
ジン、ウラシル、トリプトファン及びロイシンが不足したＳＤ培地上、３０℃で
、コロニーが発現するまで成長させた。酵母菌のコロニーを新たな培地上に移し
替え（patch)、３０℃で１晩培養し、フィルターリフトを行った（filter lifts
taken)。Ｘ−ガラクトース（X-Gal)中、３０℃で、４時間フィルターを培養す
ることにより、β―ガラクトシダーゼ（glactosidase)活性を測定した。
。Y190株酵母菌を、図示されたベクターの混合物とともに共形質転換し、ヒスチ
ジン、ウラシル、トリプトファン及びロイシンが不足したＳＤ培地上、３０℃で
、コロニーが発現するまで成長させた。酵母菌のコロニーを新たな培地上に移し
替え（patch)、３０℃で１晩培養し、フィルターリフトを行った（filter lifts
taken)。Ｘ−ガラクトース（X-Gal)中、３０℃で、４時間フィルターを培養す
ることにより、β―ガラクトシダーゼ（glactosidase)活性を測定した。
【０１８７】
構造のモデル
PDK１（９２−３４１個の残基）のキナーゼドメインの構造を、Swiss Model A
utomated Protein Modelling Serverに接続してSwiss-Pdb Viewerプログラム（[
http://www.expasy.ch/spdbv/main page.htm。 [28]）を用いることによりモデ
ル化した。データベース（Protein Data Bank Identification: 1YDR, 1CTP, 1S
TC, 1ATP and 1CDK）中で手に入れられる幾つかのPKA触媒サブユニットの構造に
基づいてモデル化を行った。触媒領域（マウスPKAの５５−２９７個の残基）内
においてPDK１に対する配列の同一性は４０％であり、この時の類似性は６８％
であった。
utomated Protein Modelling Serverに接続してSwiss-Pdb Viewerプログラム（[
http://www.expasy.ch/spdbv/main page.htm。 [28]）を用いることによりモデ
ル化した。データベース（Protein Data Bank Identification: 1YDR, 1CTP, 1S
TC, 1ATP and 1CDK）中で手に入れられる幾つかのPKA触媒サブユニットの構造に
基づいてモデル化を行った。触媒領域（マウスPKAの５５−２９７個の残基）内
においてPDK１に対する配列の同一性は４０％であり、この時の類似性は６８％
であった。
【０１８８】
PIFのMyc-PDK1に対する結合
野生型Myc-PDK1又は図示されたPDK1の突然変異体（10μｇ）を発現するGST-PI
F（10μｇ）[24]及びpCMV5プラスミドと呼ばれるPRK２の末端の７７個の残基に
融合されたGSTをコードするpEBG2Tプラスミドを、改良されたカルシウムリン酸
塩法(modified calcium phosphate method)［29］を用いることにより、２９３
細胞の10ｃｍの直径の皿中に共トランスフェクトする。４８時間のポストトラン
スフェクション（post-transfection)後に、細胞を、遠心分離によりクリアにさ
れた0.6ｍｌの溶解緩衝液（50mM tris-HCl PH 7.5, 1mM EGTA, 1mM EDTA, (質量
当たり（by mass))1% Triton-X100, 1mM ナトリウムオルトバナジン酸塩、50mM
ナトリウムフッ化物、5mMナトリウムピロリン酸塩、0.27Mサッカロース、1mMマ
イクロシスチン-LR（microcystin-LR)、(体積当たり）0.1% β―メルカプトエタ
ノール、及び緩衝液の50ｍｌ当たり１つのプロテアーゼ抑制因子錠剤）に溶解し
た。上澄み液の0.5mlを、30μｌのグルタチオンセファロースとともに２時間４
℃で培養した。ビーズを、0.5MのNaClを含んだ溶解緩衝液中で２度洗浄し、続い
て更に２度、溶解緩衝液で洗浄した。100mM Tris/HCl、pH6.8、（質量当たり）
４％ SDS、（体積当たり）２０％ グリセロル及び200mM DTTを含んだ緩衝液の１
体積中（vol)でビーズを懸濁し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にさらし
た。ゲルをクーマシーブルー（Coomassie blue)により染色するか、或いは抗Myc
抗体で免疫ブロットすることにより解析した。
F（10μｇ）[24]及びpCMV5プラスミドと呼ばれるPRK２の末端の７７個の残基に
融合されたGSTをコードするpEBG2Tプラスミドを、改良されたカルシウムリン酸
塩法(modified calcium phosphate method)［29］を用いることにより、２９３
細胞の10ｃｍの直径の皿中に共トランスフェクトする。４８時間のポストトラン
スフェクション（post-transfection)後に、細胞を、遠心分離によりクリアにさ
れた0.6ｍｌの溶解緩衝液（50mM tris-HCl PH 7.5, 1mM EGTA, 1mM EDTA, (質量
当たり（by mass))1% Triton-X100, 1mM ナトリウムオルトバナジン酸塩、50mM
ナトリウムフッ化物、5mMナトリウムピロリン酸塩、0.27Mサッカロース、1mMマ
イクロシスチン-LR（microcystin-LR)、(体積当たり）0.1% β―メルカプトエタ
ノール、及び緩衝液の50ｍｌ当たり１つのプロテアーゼ抑制因子錠剤）に溶解し
た。上澄み液の0.5mlを、30μｌのグルタチオンセファロースとともに２時間４
℃で培養した。ビーズを、0.5MのNaClを含んだ溶解緩衝液中で２度洗浄し、続い
て更に２度、溶解緩衝液で洗浄した。100mM Tris/HCl、pH6.8、（質量当たり）
４％ SDS、（体積当たり）２０％ グリセロル及び200mM DTTを含んだ緩衝液の１
体積中（vol)でビーズを懸濁し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にさらし
た。ゲルをクーマシーブルー（Coomassie blue)により染色するか、或いは抗Myc
抗体で免疫ブロットすることにより解析した。
【０１８９】
Myc‐PDK1に対するPIF結合の解析
改良型Bia-LiteTMシステムにおける表面プラスモン共鳴により結合を直接的に
解析した。PIFtide（PRK2の最後の２４個の残基を構成しているもの）を、上述
のように［24］、そのC−末端Cysを介して（though)ビオチン化し、ストレプト
アビジンでコートされたセンサーチップSA(Sensor/ Ship SA)に結合した。上述
したように（James et as (1996) Biochem J 315, 709-713)、GST-PDK1 (10-400
nM)の野生型又は突然変異体の調整物を、細胞内タイプ緩衝液中に、固定されビ
オチン化された(immobilized biotinylated)PIFtide上で、1分当たり３０μlの
流速で注入した。或いは、GST-PDK1（1μM）の野生型又は突然変異体の調整物を
PIFtide又はD978A-PIFtide(0.10μl)とともに培養し、固定されたペプチド上に
混合物を注入した。野生型と突然変異体のGST-PDK1とペプチドとの間の定常状態
結合の減少を用い、PDK1とペプチドとの間の相互作用のKdを決定した。異なるペ
プチド濃度での最大反応における減少を、PDK1への両ペプチドの相対アフィニテ
ィーを評価するのに用いた。センサーチップ表面を10mM NaOHのパルスによって
再生した。
解析した。PIFtide（PRK2の最後の２４個の残基を構成しているもの）を、上述
のように［24］、そのC−末端Cysを介して（though)ビオチン化し、ストレプト
アビジンでコートされたセンサーチップSA(Sensor/ Ship SA)に結合した。上述
したように（James et as (1996) Biochem J 315, 709-713)、GST-PDK1 (10-400
nM)の野生型又は突然変異体の調整物を、細胞内タイプ緩衝液中に、固定されビ
オチン化された(immobilized biotinylated)PIFtide上で、1分当たり３０μlの
流速で注入した。或いは、GST-PDK1（1μM）の野生型又は突然変異体の調整物を
PIFtide又はD978A-PIFtide(0.10μl)とともに培養し、固定されたペプチド上に
混合物を注入した。野生型と突然変異体のGST-PDK1とペプチドとの間の定常状態
結合の減少を用い、PDK1とペプチドとの間の相互作用のKdを決定した。異なるペ
プチド濃度での最大反応における減少を、PDK1への両ペプチドの相対アフィニテ
ィーを評価するのに用いた。センサーチップ表面を10mM NaOHのパルスによって
再生した。
【０１９０】
PDK1の触媒活性の測定
sn-1-stearoyl-2-arachidonoyl-D-PtdIns (3, 4, 5)P3を含んだリン脂質小胞
の存在下でSer473がAsp（GST-473D PKBα)に突然変異したGST‐PKBα突然変異体
を用い、PKBαのThr308をリン酸化するPDK１の能力を測定した[13]。合成ペプチ
ドT308tide又はPDKtideをリン酸化する野生型及び突然変異体のPDK1の能力の実
験を、50mM Tris/HCl pH 7.5, 0.1% 2-メルカプトエタノール 10mM MgCl2、100
μM[γ32P]ATP (~500 cpm/pmol) 0.5μM マイクロシスチン-LR (microcystin-LR
) 含んだ20μl検定において実施した。PDK1及びペプチドの濃度を結果に示した
。３０℃での１０分間の培養の後、１５０ｍMのリン酸２０μlを加えることによ
り反応を止めた。キナーゼマップ（MAP kinase)の測定法[30]で先に述べたよう
に、３５μlの反応混合物をP81リン酸セルロースペーパー（P81 phosphocellulo
se paper)（２×２ｃｍ）にスポットし、紙を洗浄して分析した。野生型のPIFti
de又は突然変異体のD978A PIFtideペプチドを、図示されるように反応に含めた
。PDK1又はペプチド基質が除かれた対照検定を並行して行った；これらの値は、
これらの試薬の存在下で測定される活性の５％より常に低かった。PDK１活性の1
つのユニットを、1分間で1nmolのT308tideのリン酸化を触媒するのに必要な量と
して定義した。検定は、最終的なPDK1濃度が５U/mlとなるまで線形であった。
の存在下でSer473がAsp（GST-473D PKBα)に突然変異したGST‐PKBα突然変異体
を用い、PKBαのThr308をリン酸化するPDK１の能力を測定した[13]。合成ペプチ
ドT308tide又はPDKtideをリン酸化する野生型及び突然変異体のPDK1の能力の実
験を、50mM Tris/HCl pH 7.5, 0.1% 2-メルカプトエタノール 10mM MgCl2、100
μM[γ32P]ATP (~500 cpm/pmol) 0.5μM マイクロシスチン-LR (microcystin-LR
) 含んだ20μl検定において実施した。PDK1及びペプチドの濃度を結果に示した
。３０℃での１０分間の培養の後、１５０ｍMのリン酸２０μlを加えることによ
り反応を止めた。キナーゼマップ（MAP kinase)の測定法[30]で先に述べたよう
に、３５μlの反応混合物をP81リン酸セルロースペーパー（P81 phosphocellulo
se paper)（２×２ｃｍ）にスポットし、紙を洗浄して分析した。野生型のPIFti
de又は突然変異体のD978A PIFtideペプチドを、図示されるように反応に含めた
。PDK1又はペプチド基質が除かれた対照検定を並行して行った；これらの値は、
これらの試薬の存在下で測定される活性の５％より常に低かった。PDK１活性の1
つのユニットを、1分間で1nmolのT308tideのリン酸化を触媒するのに必要な量と
して定義した。検定は、最終的なPDK1濃度が５U/mlとなるまで線形であった。
【０１９１】
熱変性
図示された形態のPDK1 (0.4 mg/ml)を２分間、３０℃から６５℃の温度範囲で
培養することで加熱変性を行った。４μlのアリクウォット（aliquot)を検定し
てT308tideに対する活性を得る前に、加熱処理を１０倍超過の氷の冷却緩衝液（
50ｍM Tris/HCl pH 7.5、1mM DTT 及び0.1mg/ml BSA)を加えることにより終了し
、サンプルを２分間氷水槽中で培養した。
培養することで加熱変性を行った。４μlのアリクウォット（aliquot)を検定し
てT308tideに対する活性を得る前に、加熱処理を１０倍超過の氷の冷却緩衝液（
50ｍM Tris/HCl pH 7.5、1mM DTT 及び0.1mg/ml BSA)を加えることにより終了し
、サンプルを２分間氷水槽中で培養した。
【０１９２】
結果
PDK１はPKAのC-末端フラグメントと相互作用する。PDK1と相互作用するヒト脳
中で発現したプロテインを同定するために酵母菌ツーハイブリッドスクリーンを
実施した。我々は、PDK１（図７A)のPHドメインとではなく完全長PDK1とで積極
的な相互作用をする（yielded) PKA (PKActと呼ばれる）のC-末端の２２３個の
アミノ酸に対応するクローンを同定した（データは図示しない）。PKActは、AGC
サブファミリーキナーゼとの間で高い配列相同性を示すPKAのC-末端非触媒領域
におけるアミノ酸だけでなく、キナーゼドメインの一部を含んでいる（図７B)。
PKAのC-末端の６２個のアミノ酸は、PIFと顕著な相同性を有しており、モチーフ
配列（347-Phe-Xaa-Xaa-PheCOOH）において終結している。この配列は、Asp残基
がPKAのC-末端カルボン酸塩基と置換されていることと、C-末端Tyrが消失してい
ることを除いては、PDK１が相互作用するPIF（ヒトPRK2配列[24]に基づいて番号
付けした974Phe-Xaa-Xaa-Phe-Asp-Tyr979）のモチーフと同様である。このこと
は、PKActのPDK１との相互作用が、C-末端配列347-Phe-Xaa-Xaa-PheCOOHによっ
て媒介されうるということを示唆した。C-末端Phe347及びPhe350の両方または一
方の、PKActのAlaへの突然変異はPDK1（図７A）との相互作用を終了させた。し
かし、PKActのC-末端に４個のGly残基を加え、自由カルボン酸塩基を他の位置へ
移動させても、PKActのPDK1（図７A)との相互作用能力には影響がなかった。こ
れらの発見は、PKActのPDK１との相互作用には前記モチーフ内のカルボン酸塩基
ではなく２個のPhe残基が必要であることを示している。
中で発現したプロテインを同定するために酵母菌ツーハイブリッドスクリーンを
実施した。我々は、PDK１（図７A)のPHドメインとではなく完全長PDK1とで積極
的な相互作用をする（yielded) PKA (PKActと呼ばれる）のC-末端の２２３個の
アミノ酸に対応するクローンを同定した（データは図示しない）。PKActは、AGC
サブファミリーキナーゼとの間で高い配列相同性を示すPKAのC-末端非触媒領域
におけるアミノ酸だけでなく、キナーゼドメインの一部を含んでいる（図７B)。
PKAのC-末端の６２個のアミノ酸は、PIFと顕著な相同性を有しており、モチーフ
配列（347-Phe-Xaa-Xaa-PheCOOH）において終結している。この配列は、Asp残基
がPKAのC-末端カルボン酸塩基と置換されていることと、C-末端Tyrが消失してい
ることを除いては、PDK１が相互作用するPIF（ヒトPRK2配列[24]に基づいて番号
付けした974Phe-Xaa-Xaa-Phe-Asp-Tyr979）のモチーフと同様である。このこと
は、PKActのPDK１との相互作用が、C-末端配列347-Phe-Xaa-Xaa-PheCOOHによっ
て媒介されうるということを示唆した。C-末端Phe347及びPhe350の両方または一
方の、PKActのAlaへの突然変異はPDK1（図７A）との相互作用を終了させた。し
かし、PKActのC-末端に４個のGly残基を加え、自由カルボン酸塩基を他の位置へ
移動させても、PKActのPDK1（図７A)との相互作用能力には影響がなかった。こ
れらの発見は、PKActのPDK１との相互作用には前記モチーフ内のカルボン酸塩基
ではなく２個のPhe残基が必要であることを示している。
【０１９３】
PIFと相互作用するPDK１のキナーゼドメイン中の推定される（putative)疎水性
ポケットの同定 PKAは、その３次元構造が高い溶解度で溶解する[31]とともに、大部分のプロ
テインキナーゼの触媒ドメインの構造骨格をもたらす（established）［32で調
査されている］第１のプロテインであった。PKAの構造解析により、非触媒C-末
端がキナーゼドメインと相互作用するループを形成するということが明らかにな
った（図８A)。最も興味深いことに、上述のように図示されPDK１のキナーゼド
メインに結合しているPKAのC-末端残基は、PKA触媒ドメインの小さいローブ中の
深い疎水性ポケット(deep hydrophobic pocket)と相互作用する（図８B）。この
部位は、PKAの部位に結合しているATPやペプチド基質と重ならない。PKAの末端3
47Phe-Xaa-Xaa-Pheモチーフ中の２個のPhe残基と明らかな疎水性の相互作用を行
う残基は、PKA（図２B)のLys76, Val80, Lys111及びLeu116である。
ポケットの同定 PKAは、その３次元構造が高い溶解度で溶解する[31]とともに、大部分のプロ
テインキナーゼの触媒ドメインの構造骨格をもたらす（established）［32で調
査されている］第１のプロテインであった。PKAの構造解析により、非触媒C-末
端がキナーゼドメインと相互作用するループを形成するということが明らかにな
った（図８A)。最も興味深いことに、上述のように図示されPDK１のキナーゼド
メインに結合しているPKAのC-末端残基は、PKA触媒ドメインの小さいローブ中の
深い疎水性ポケット(deep hydrophobic pocket)と相互作用する（図８B）。この
部位は、PKAの部位に結合しているATPやペプチド基質と重ならない。PKAの末端3
47Phe-Xaa-Xaa-Pheモチーフ中の２個のPhe残基と明らかな疎水性の相互作用を行
う残基は、PKA（図２B)のLys76, Val80, Lys111及びLeu116である。
【０１９４】
PDK1及びPKAのキナーゼドメインの配列の配置（sequence alignment)は、PKA
のLys76 (PDK1上のLys115)及びLeu116 (PDK1上のLeu155)に等価な残基がPDK1中
に保存されている（conserved)ことを示した（図８D)。PKAの構造に基づいたPDK
1のキナーゼドメイン構造の分子モデル化は、PDK1がそのキナーゼドメインの等
価な領域中に疎水性ポケットを有していそうだと言うことと、PDK1中のLys115及
びLeu155がPKAのLys76及びLeu116と等価な位置に存在していそうだと言うことと
を裏付けた。疎水性ポケットの一部を形成するVal180及びLys111に等価なPKA上
の残基は、PDK1キナーゼドメインのIle119及びGln150のそれぞれと同じ位置に存
在する。PDK1キナーゼドメインのモデルは、これらの残基が、Lys115及びLeu155
に加え、疎水性の結合部位の一部を形成しうるということを示している（図８D)
。
のLys76 (PDK1上のLys115)及びLeu116 (PDK1上のLeu155)に等価な残基がPDK1中
に保存されている（conserved)ことを示した（図８D)。PKAの構造に基づいたPDK
1のキナーゼドメイン構造の分子モデル化は、PDK1がそのキナーゼドメインの等
価な領域中に疎水性ポケットを有していそうだと言うことと、PDK1中のLys115及
びLeu155がPKAのLys76及びLeu116と等価な位置に存在していそうだと言うことと
を裏付けた。疎水性ポケットの一部を形成するVal180及びLys111に等価なPKA上
の残基は、PDK1キナーゼドメインのIle119及びGln150のそれぞれと同じ位置に存
在する。PDK1キナーゼドメインのモデルは、これらの残基が、Lys115及びLeu155
に加え、疎水性の結合部位の一部を形成しうるということを示している（図８D)
。
【０１９５】
PIFのPDK１への結合におけるLys115及びLeu155の突然変異の有効性
PDK1の疎水性ポケットのモデルは、PIFのPhe974及びPhe977と等価な残基との
疎水性相互作用にLys115及びLeu155が関与するはずであるということを予測して
いる。従って、我々はLys115をAlaに、Leu155をSer、Asp又はGluに突然変異させ
、これらのPDK1突然変異体及び野生型PDK1の、GST-PIFとの相互作用を比較した
（図９）。上述したように、複合体はGST-PIFと野生型PDK1との間においてよく
観察された。対照的に、これらのPDK1突然変異体は野生型PDK1と同じレベルまで
発現したものの、何れのL155突然変異体もPIFと顕著に相互作用しないのに対し
て、K115Aは非常に乏しくPIFと相互作用した（図９C及び９G)。
疎水性相互作用にLys115及びLeu155が関与するはずであるということを予測して
いる。従って、我々はLys115をAlaに、Leu155をSer、Asp又はGluに突然変異させ
、これらのPDK1突然変異体及び野生型PDK1の、GST-PIFとの相互作用を比較した
（図９）。上述したように、複合体はGST-PIFと野生型PDK1との間においてよく
観察された。対照的に、これらのPDK1突然変異体は野生型PDK1と同じレベルまで
発現したものの、何れのL155突然変異体もPIFと顕著に相互作用しないのに対し
て、K115Aは非常に乏しくPIFと相互作用した（図９C及び９G)。
【０１９６】
上述したように[24]、表面プラスモン共鳴（SPR)測定により、野生型GST-PDK1
と、固定されビオチン化され、かつPDK1の結合部位を包含した配列を有するPIFt
ideと呼ばれる合成ペプチドとの高いアフィニティーの相互作用が裏づけされた
。しかしながら、K115AがPIFtideと弱弱しく相互作用するのに対して（図９D)、
PDK1のL155S、L155D及びL155E突然変異体はPIFtideに対して検知しうるアフィニ
ティーを持たなかった（図９D)。
と、固定されビオチン化され、かつPDK1の結合部位を包含した配列を有するPIFt
ideと呼ばれる合成ペプチドとの高いアフィニティーの相互作用が裏づけされた
。しかしながら、K115AがPIFtideと弱弱しく相互作用するのに対して（図９D)、
PDK1のL155S、L155D及びL155E突然変異体はPIFtideに対して検知しうるアフィニ
ティーを持たなかった（図９D)。
【０１９７】
酵母菌２‐ハイブリッドスクリーンもまた、PDK1のL155S、L155D及びL155E突
然変異体がPIFと相互作用しないということを裏付けた（図１０）。更に、PDK1
のL155S、L155D及びL155E突然変異体とのPKActの相互作用は酵母菌ツーハイブリ
ッドスクリーンにおいて大いに減少し、PKAのカルボキシル末端が、PIFと同じ部
位におけるPDK1触媒ドメインと相互作用することをいっそう強く示唆している（
図１０）。
然変異体がPIFと相互作用しないということを裏付けた（図１０）。更に、PDK1
のL155S、L155D及びL155E突然変異体とのPKActの相互作用は酵母菌ツーハイブリ
ッドスクリーンにおいて大いに減少し、PKAのカルボキシル末端が、PIFと同じ部
位におけるPDK1触媒ドメインと相互作用することをいっそう強く示唆している（
図１０）。
【０１９８】
PDK1のL155S、L155D及びL155E突然変異体は、MgATP及びPtdIns (3, 4, 5)P3の
存在下で、GST-473D-PKBαの活性化において野生型PDK1の５０−６０％有効であ
った（図11）。このことは、PDK1の活性部位のコンフォメーションがこれらの突
然変異によっては顕著に損なわれていないことを示している。
存在下で、GST-473D-PKBαの活性化において野生型PDK1の５０−６０％有効であ
った（図11）。このことは、PDK1の活性部位のコンフォメーションがこれらの突
然変異によっては顕著に損なわれていないことを示している。
【０１９９】
PIFのPDK1への結合におけるIle119及びGln１５０の突然変異の有効性
Ile119及びGlu150もまたPDK１キナーゼドメインの小さいローブ上のPIF結合ポ
ケットの一部を形成することが予測されており、これらをAlaに突然変異させた
。プルダウン（pull down）（図９E及び9F)及び表面プラスモン共鳴実験（図9H)
の両方において、PDK1のI119A及びQ150A突然変異体は、野生型PDK1と比べてとて
も弱弱しくPIFと相互作用した。これらの突然変異体もまた、野生型PDK1の５０
−６０％の割合でGST-473D-PKBαを活性化した（データは図示せず）。
ケットの一部を形成することが予測されており、これらをAlaに突然変異させた
。プルダウン（pull down）（図９E及び9F)及び表面プラスモン共鳴実験（図9H)
の両方において、PDK1のI119A及びQ150A突然変異体は、野生型PDK1と比べてとて
も弱弱しくPIFと相互作用した。これらの突然変異体もまた、野生型PDK1の５０
−６０％の割合でGST-473D-PKBαを活性化した（データは図示せず）。
【０２００】
ペプチド基質に対するPDK1の触媒活性におけるPIFの有効性
Dong and colleaguesによる最近の研究[27]により、C-末端に加えられP81ペー
パー（P81 paper)に対するペプチド結合を形成した２つのArg残基によりPKBαの
307個から320個の残基を包含する配列を有する、本明細書中でT308tideと呼ばれ
る合成ペプチドKT*FCGTPEYLAPEV-RRを、PDK1がリン酸化することが示された。T3
08tideがPDK1のPIF結合ポケットと相互作用しそうにないため、我々は、PDK1の
触媒活性におけるPIF結合の有効性を調査するのにこの基質を用いることを決め
た。我々は、たとえKmが非常に高くても（＞10mM）、PDK1によってT308tideがイ
ンビトロでリン酸化されることを確認した。我々はまた、PDK1によってリン酸化
され32PでラベルされたT308tideを固相配列する（solid phase sequencing)こと
により、T308tideがPKBαのThr308に等価な残機においてリン酸化される（アス
タリスクで示す）ことを明らかにした（データは図示せず）。
パー（P81 paper)に対するペプチド結合を形成した２つのArg残基によりPKBαの
307個から320個の残基を包含する配列を有する、本明細書中でT308tideと呼ばれ
る合成ペプチドKT*FCGTPEYLAPEV-RRを、PDK1がリン酸化することが示された。T3
08tideがPDK1のPIF結合ポケットと相互作用しそうにないため、我々は、PDK1の
触媒活性におけるPIF結合の有効性を調査するのにこの基質を用いることを決め
た。我々は、たとえKmが非常に高くても（＞10mM）、PDK1によってT308tideがイ
ンビトロでリン酸化されることを確認した。我々はまた、PDK1によってリン酸化
され32PでラベルされたT308tideを固相配列する（solid phase sequencing)こと
により、T308tideがPKBαのThr308に等価な残機においてリン酸化される（アス
タリスクで示す）ことを明らかにした（データは図示せず）。
【０２０１】
T308tideに対するPDK1の活性はPIFtideの存在下で４倍まで増加した。最大の
半分の活性に必要とされる濃度は、PIFtide（~0.3μMのKd［24］）に対するPDK1
のアフィニティーと相関する0.14μMであった。PDK1活性におけるこの増加を、
完全長PDK1とともに、或いは非触媒領域N-末端又はC-末端を欠くフォーム（form
)とともに観察した（データは図示せず）。PIFtideのPDK1活性に対する有効性は
、検定を始めるに先立ち、これらの成分を３０分まで氷上でプレ培養（pureincu
bating)することによっては影響を受けなかった。同様に、D978A-PIFtideは、PD
K1に対して１０倍減少したアフィニティーを示すものであるが[24]、PDK1活性の
誘発に対する有効性は８倍より少なくなった（図１２A）。同様のサイズのいく
つかの無関係なペプチドは、PDK1の活性化を全く誘発することができなかった（
データは図示しない）。このことは、PDK1がPIFによって直接活性化されること
を強く示している。更に、PIFは、ATPに対するPDK１のKmを変化させなかった（
データは図示しない）。
半分の活性に必要とされる濃度は、PIFtide（~0.3μMのKd［24］）に対するPDK1
のアフィニティーと相関する0.14μMであった。PDK1活性におけるこの増加を、
完全長PDK1とともに、或いは非触媒領域N-末端又はC-末端を欠くフォーム（form
)とともに観察した（データは図示せず）。PIFtideのPDK1活性に対する有効性は
、検定を始めるに先立ち、これらの成分を３０分まで氷上でプレ培養（pureincu
bating)することによっては影響を受けなかった。同様に、D978A-PIFtideは、PD
K1に対して１０倍減少したアフィニティーを示すものであるが[24]、PDK1活性の
誘発に対する有効性は８倍より少なくなった（図１２A）。同様のサイズのいく
つかの無関係なペプチドは、PDK1の活性化を全く誘発することができなかった（
データは図示しない）。このことは、PDK1がPIFによって直接活性化されること
を強く示している。更に、PIFは、ATPに対するPDK１のKmを変化させなかった（
データは図示しない）。
【０２０２】
GST-PDK1活性は、酵素が５０℃で２分間過熱された際には５０％まで減少した
（TM50値、図１２B)。しかしながら、PDK1は野生型PIFtideの存在下では安定し
、TM50は８−１０℃まで増加された。PIFはまた、PHドメイン、N-末端５１残基
又は両方の非触媒活性の何れかを欠いた全ての被試験GST-PDK1転写突然変異体の
TM50値において６−１０℃の増加を引き起こした。GST-PDK1のL155D突然変異体
はTM50値が４２℃である野生型PDK1より熱変形しやすかった。期待されたように
、PIFはこの突然変異体をあまり安定化しなかった（図１２B)。
（TM50値、図１２B)。しかしながら、PDK1は野生型PIFtideの存在下では安定し
、TM50は８−１０℃まで増加された。PIFはまた、PHドメイン、N-末端５１残基
又は両方の非触媒活性の何れかを欠いた全ての被試験GST-PDK1転写突然変異体の
TM50値において６−１０℃の増加を引き起こした。GST-PDK1のL155D突然変異体
はTM50値が４２℃である野生型PDK1より熱変形しやすかった。期待されたように
、PIFはこの突然変異体をあまり安定化しなかった（図１２B)。
【０２０３】
T308tideに対するPDK1突然変異体の活性
次に、我々は、T308tideに対するPIF結合ポケット突然変異体の比活性を調べ
た。PDK1のL115A、L155S、L155D及びL155Eの突然変異体は野生型PDK1より３‐５
倍速く、つまり、PIFの存在下での野生型PDK１の速度(that)と同様の割合で、T3
08tideをリン酸化した（図７）。PIFtideは、これら突然変異体のPIF結合不能（
inability)に一致して、これらの突然変異体を更には活性しなかった。その一方
、PDK1のL119A及びQ150A突然変異体は、野生型PDK1と同様の比活性を有し、PIF
の存在下で２倍刺激された。しかしながら、これら突然変異体のPIFに対する減
少したアフィニティーと一致して、野生型PDK1と比べて１０倍より多いPIFが、
最大活性のために必要とされた（図９）。
た。PDK1のL115A、L155S、L155D及びL155Eの突然変異体は野生型PDK1より３‐５
倍速く、つまり、PIFの存在下での野生型PDK１の速度(that)と同様の割合で、T3
08tideをリン酸化した（図７）。PIFtideは、これら突然変異体のPIF結合不能（
inability)に一致して、これらの突然変異体を更には活性しなかった。その一方
、PDK1のL119A及びQ150A突然変異体は、野生型PDK1と同様の比活性を有し、PIF
の存在下で２倍刺激された。しかしながら、これら突然変異体のPIFに対する減
少したアフィニティーと一致して、野生型PDK1と比べて１０倍より多いPIFが、
最大活性のために必要とされた（図９）。
【０２０４】
PDK1は、PDK1に対して非常に優れたペプチド基質である
PDK1に対するペプチド基質がPDK1相互作用性のPIFの配列も含んだ場合には、
このペプチド基質はずっと低いKm値でリン酸化されうるということを、上述した
結果は示唆している。従って、我々は、PIFtideに融合されたT308tideからなる
３９個のアミノ酸のポリペプチドを合成し、これをPDKtideと名づけた。このペ
プチドはT308tideよりPDK１に対して非常に優れた基質で；そのKmは−80μM（T3
08tideに対する＞１０ｍMと比較した（compared to > 10 mM for T308tide))で
あり、100μMで検定された際に、PDKtideはT308tideを用いた場合より１００倍
より大きい割合でリン酸化された（図１４A)。PDKtideに対するPDK1の活性は、P
IFtideによって刺激されるT308tideリン酸化と対照的に、検定におけるPIFtide
の含有物(inclusion）によって抑制された（図１４B)。
このペプチド基質はずっと低いKm値でリン酸化されうるということを、上述した
結果は示唆している。従って、我々は、PIFtideに融合されたT308tideからなる
３９個のアミノ酸のポリペプチドを合成し、これをPDKtideと名づけた。このペ
プチドはT308tideよりPDK１に対して非常に優れた基質で；そのKmは−80μM（T3
08tideに対する＞１０ｍMと比較した（compared to > 10 mM for T308tide))で
あり、100μMで検定された際に、PDKtideはT308tideを用いた場合より１００倍
より大きい割合でリン酸化された（図１４A)。PDKtideに対するPDK1の活性は、P
IFtideによって刺激されるT308tideリン酸化と対照的に、検定におけるPIFtide
の含有物(inclusion）によって抑制された（図１４B)。
【０２０５】
考察
PKAのC-末端残基Phe-Xaa-Xaa-PheCOOHは、PIFのPDK1結合モチーフの一部に対
応する。これらの残基は、ATP又はペプチド基質の結合部位とは異なる位置にお
いてPKAのキナーゼドメインの小さいローブと相互作用することが知られている
（図２）。我々はこの明細書中で、PKActがPDK1のキナーゼドメインとも相互作
用することを酵母菌ツーハイブリッドスクリーンにおいて立証した。また、我々
は、Phe347又はPhe350と等価なPKAct中の残基のAlaへの突然変異がPDK１との相
互作用を終了させる（abolishes)か、又は顕著に減少させることを立証した（図
7）。PIFについての等価なPhe残基のAlaへの突然変異もまたPDK１との相互作用
を終了させているため［24］、これらの発見により、PKAct及びPIFがPDK1キナー
ゼドメインの同じ部位において相互作用するかもしれないと言うことが示唆され
ている。
応する。これらの残基は、ATP又はペプチド基質の結合部位とは異なる位置にお
いてPKAのキナーゼドメインの小さいローブと相互作用することが知られている
（図２）。我々はこの明細書中で、PKActがPDK1のキナーゼドメインとも相互作
用することを酵母菌ツーハイブリッドスクリーンにおいて立証した。また、我々
は、Phe347又はPhe350と等価なPKAct中の残基のAlaへの突然変異がPDK１との相
互作用を終了させる（abolishes)か、又は顕著に減少させることを立証した（図
7）。PIFについての等価なPhe残基のAlaへの突然変異もまたPDK１との相互作用
を終了させているため［24］、これらの発見により、PKAct及びPIFがPDK1キナー
ゼドメインの同じ部位において相互作用するかもしれないと言うことが示唆され
ている。
【０２０６】
このプロテインのC-末端と相互作用することが知られているPKAのキナーゼド
メイン中の残基はPDK１中に存在し、これらの突然変異体は、PIF及びPKActの両
方とPDK1との相互作用を終了させたか、又は顕著に減少させた。これらの観察に
より、PDK1はPIF及びPKActと相互作用するキナーゼドメインに等価な疎水性ポケ
ットを有していることが強く示唆されている。PDK1は、それ自体がプロテインキ
ナーゼのサブファミリーのメンバーであるが、PKAと対照的に、等価な位置に疎
水性のPhe-Xaa-Xaa-Pheモチーフを有しない。従って、PDK１は、PKA及び他のAGC
サブファミリーメンバーのC-末端疎水性モチーフとの相互作用に有効なキナーゼ
ドメインに、ふさがっていないPIF結合ポケットを有していそうである。
メイン中の残基はPDK１中に存在し、これらの突然変異体は、PIF及びPKActの両
方とPDK1との相互作用を終了させたか、又は顕著に減少させた。これらの観察に
より、PDK1はPIF及びPKActと相互作用するキナーゼドメインに等価な疎水性ポケ
ットを有していることが強く示唆されている。PDK1は、それ自体がプロテインキ
ナーゼのサブファミリーのメンバーであるが、PKAと対照的に、等価な位置に疎
水性のPhe-Xaa-Xaa-Pheモチーフを有しない。従って、PDK１は、PKA及び他のAGC
サブファミリーメンバーのC-末端疎水性モチーフとの相互作用に有効なキナーゼ
ドメインに、ふさがっていないPIF結合ポケットを有していそうである。
【０２０７】
PIFのPDK1との相互作用は、PDK1を、PKBαをThr308においてリン酸化するのみ
の酵素からPtdInds (3, 4, 5)P3又はPtdIns (3, 4) P2依存の態様でThr308及びS
er 473の両方をリン酸化する形態に転換する。従って、PIF中のPDK1結合モチー
フ(Phe-Xaa-Xaa-Phe-Asp-Tyr)は、PDK1の基質結合部位とPIFが相互作用する可能
性を高める擬似基質配列として必要とされるかもしれない。しかしながら、その
ような場合には、PTは、PKBαをSer473においてPDK1がリン酸化することを促進
するよりもむしろ妨げることになるであろう。基質結合部位とは異なるPDK１の
キナーゼドメイン上の部位とPIFとが相互作用するという発見は、このことが何
故事実ではないかを明らかにし、PDK1の基質を特異的に変化させるPDK1の触媒中
心（catalytic core)の構造変化をPIFが誘発しうるということを示唆している。
の酵素からPtdInds (3, 4, 5)P3又はPtdIns (3, 4) P2依存の態様でThr308及びS
er 473の両方をリン酸化する形態に転換する。従って、PIF中のPDK1結合モチー
フ(Phe-Xaa-Xaa-Phe-Asp-Tyr)は、PDK1の基質結合部位とPIFが相互作用する可能
性を高める擬似基質配列として必要とされるかもしれない。しかしながら、その
ような場合には、PTは、PKBαをSer473においてPDK1がリン酸化することを促進
するよりもむしろ妨げることになるであろう。基質結合部位とは異なるPDK１の
キナーゼドメイン上の部位とPIFとが相互作用するという発見は、このことが何
故事実ではないかを明らかにし、PDK1の基質を特異的に変化させるPDK1の触媒中
心（catalytic core)の構造変化をPIFが誘発しうるということを示唆している。
【０２０８】
PDK1の固有の触媒活性についてのPIFの有効性を評価するために、PIF結合ポケ
ットと重なる部位においてPDK1と相互作用するかもしれない例えばp70 S6キナー
ゼ等のPDK1のプロテイン基質ではなく、ペプチド基質T308tideを用いた（実施例
１参照）。この検定を用いることにより、我々は、PDK1の活性を調整するのにPI
F結合ポケットが重要そうであることを立証した。PIF結合ポケットがふさがって
いない時には、PIF結合ポケットはPDK１の活性を抑制するようである。なぜなら
、PDK1を形成するキー残基Lys115及びLeu155の突然変異は、T308tideに対するPD
K１の活性を、PIF存在下での野生型PDK1の活性と同レベルまで高めたからである
（図6）。従って、PIFの結合は、PDK1の機能的活性構造（functionally active
conformation)を安定化するアロステリック転移を形質導入する（transduces)よ
うである。
ットと重なる部位においてPDK1と相互作用するかもしれない例えばp70 S6キナー
ゼ等のPDK1のプロテイン基質ではなく、ペプチド基質T308tideを用いた（実施例
１参照）。この検定を用いることにより、我々は、PDK1の活性を調整するのにPI
F結合ポケットが重要そうであることを立証した。PIF結合ポケットがふさがって
いない時には、PIF結合ポケットはPDK１の活性を抑制するようである。なぜなら
、PDK1を形成するキー残基Lys115及びLeu155の突然変異は、T308tideに対するPD
K１の活性を、PIF存在下での野生型PDK1の活性と同レベルまで高めたからである
（図6）。従って、PIFの結合は、PDK1の機能的活性構造（functionally active
conformation)を安定化するアロステリック転移を形質導入する（transduces)よ
うである。
【０２０９】
PIFのPDK1との相互作用は、PKBαのSer473と等価な位置にAsp残基（Asp978）
を必要としている。PKActのPhe-Xaa-Xaa-PheCOOHモチーフのC-末端カルボン酸塩
基が、PDK1への結合を可能にするというPIFのAsp978に類似した機能を果たして
いたかもしれないということは興味深い。しかしながら、このことは、PKActのC
-末端に加えた４つのグリシンがPDK１との相互作用に影響を及ぼさなかったため
、事実ではないようである。PKAのPhe350のC-末端カルボン酸塩基は、PKAのキナ
ーゼドメインの疎水性ポケットとどのような相互作用も形成しないが、変わりに
この部位から外側に面し、PKAのN-末端非触媒領域中のGln35と水素結合を形成す
る［33］。この相互作用の重要性は、PKAのGln35を突然変異させることによって
は未だ調査されていない。同様に、PIFのAsp978はPIF結合ポケットとは相互作用
せずにPDK1の別の領域と相互作用しているかもしれない。
を必要としている。PKActのPhe-Xaa-Xaa-PheCOOHモチーフのC-末端カルボン酸塩
基が、PDK1への結合を可能にするというPIFのAsp978に類似した機能を果たして
いたかもしれないということは興味深い。しかしながら、このことは、PKActのC
-末端に加えた４つのグリシンがPDK１との相互作用に影響を及ぼさなかったため
、事実ではないようである。PKAのPhe350のC-末端カルボン酸塩基は、PKAのキナ
ーゼドメインの疎水性ポケットとどのような相互作用も形成しないが、変わりに
この部位から外側に面し、PKAのN-末端非触媒領域中のGln35と水素結合を形成す
る［33］。この相互作用の重要性は、PKAのGln35を突然変異させることによって
は未だ調査されていない。同様に、PIFのAsp978はPIF結合ポケットとは相互作用
せずにPDK1の別の領域と相互作用しているかもしれない。
【０２１０】
PKB、SGK及びp７０ S６キナーゼの配列の配置は、これらのキナーゼのAGCサブ
ファミリーのメンバーもまたキナーゼドメインにPIF結合ポケットを有していそ
うであることを示している。これらのキナーゼは全て、PIFのAsp978と等価な位
置におけるSer/Thr残基のリン酸化によって活性化される。従って、PIFが活性化
してPDK1を安定化する方法と同様に、リン酸化によってこの部位に負荷電を導入
すること(introduction)により、このモチーフの残基がこれらキナーゼの有する
PIF様（PIF-like)の結合ポケットと相互作用し、これにより活性及び安定性を高
めるようになる。同じ部位のリン酸化が従来のPKCイソ型の安定性を高めるとい
う見解(observation)は、この結論と一致している［8］。
ファミリーのメンバーもまたキナーゼドメインにPIF結合ポケットを有していそ
うであることを示している。これらのキナーゼは全て、PIFのAsp978と等価な位
置におけるSer/Thr残基のリン酸化によって活性化される。従って、PIFが活性化
してPDK1を安定化する方法と同様に、リン酸化によってこの部位に負荷電を導入
すること(introduction)により、このモチーフの残基がこれらキナーゼの有する
PIF様（PIF-like)の結合ポケットと相互作用し、これにより活性及び安定性を高
めるようになる。同じ部位のリン酸化が従来のPKCイソ型の安定性を高めるとい
う見解(observation)は、この結論と一致している［8］。
【０２１１】
PIF結合ポケットは、PDK1をその基質と相互作用させうる部位にあるかもしれ
ない。この相互作用はまた、これらの基質がPDK1によってリン酸化される割合を
高める構造変化を誘発するかもしれない。例えば、PKAのC-末端Phe-Xaa-Xaa-Phe
COOHモチーフを介したPKAのPDK1との相互作用は、PKAのThr197におけるリン酸化
を促進するかもしれない。しかしながら、我々は近年の研究により、PIFの存在
下ではPDK1はp70 S6キナーゼと相互作用することができないか、又はp70 S6キナ
ーゼをリン酸化することができないこと[25]、このことがSGK，PRK2及びPKCζに
ついてもあてはまることを示した（データは図示しない）。このことにより、p7
0 S6キナーゼ及びSGKは、リン酸化されるために、PIF結合ポケットと重なる部位
においてPDK1と相互作用することを必要とするかもしれないことが示唆されてい
る［25］。P70 S6キナーゼは、その疎水性モチーフにおいてリン酸化された際に
、非常に高いアフィニティーでPDK1と相互作用した。
ない。この相互作用はまた、これらの基質がPDK1によってリン酸化される割合を
高める構造変化を誘発するかもしれない。例えば、PKAのC-末端Phe-Xaa-Xaa-Phe
COOHモチーフを介したPKAのPDK1との相互作用は、PKAのThr197におけるリン酸化
を促進するかもしれない。しかしながら、我々は近年の研究により、PIFの存在
下ではPDK1はp70 S6キナーゼと相互作用することができないか、又はp70 S6キナ
ーゼをリン酸化することができないこと[25]、このことがSGK，PRK2及びPKCζに
ついてもあてはまることを示した（データは図示しない）。このことにより、p7
0 S6キナーゼ及びSGKは、リン酸化されるために、PIF結合ポケットと重なる部位
においてPDK1と相互作用することを必要とするかもしれないことが示唆されてい
る［25］。P70 S6キナーゼは、その疎水性モチーフにおいてリン酸化された際に
、非常に高いアフィニティーでPDK1と相互作用した。
【０２１２】
PKCζは、PRK１、PRK2及びPKCαのようにC-末端疎水性モチーフ中にSer/Thrで
はなく酸性残基を有するPDK1［17及び18］と相互作用する他のプロテインである
。従って、PKCζのこの領域はPDK1のPIF結合ポケットと相互作用するようであり
、この相互作用はPDK１にPKCζをリン酸化させ、これによりPKCζを活性化させ
るようである。このことは、Balendran et al (2000) J Biol Chem 275(27)、20
806-20813に示され、Biondi et al (2000) EMBO J 19(5), 979-988 (共に、特に
参照によって本明細書中に組み込まれている）において議論されている。従って
、これらのキナーゼのC-末端は、PDK1「ドッキング部位（docking site)」とし
て機能するかもしれない。PDK１に対するドッキング部位であるPIFのPhe-Xaa-Xa
a-Phe-Asp-Tyrモチーフと一致して、このモチーフのT308tideへの付加は、これ
がPDK1（図１４）によってリン酸化される割合を大きく増加させ、PRK1、PRK2、
PKCζ及びPKC1は、PKBのSer473と等価な部位において、PDK1にPKBと他のAGCサブ
ファミリーのメンバーをリン酸化させるという別の役割を果たすかもしれない［
12及び24］。
はなく酸性残基を有するPDK1［17及び18］と相互作用する他のプロテインである
。従って、PKCζのこの領域はPDK1のPIF結合ポケットと相互作用するようであり
、この相互作用はPDK１にPKCζをリン酸化させ、これによりPKCζを活性化させ
るようである。このことは、Balendran et al (2000) J Biol Chem 275(27)、20
806-20813に示され、Biondi et al (2000) EMBO J 19(5), 979-988 (共に、特に
参照によって本明細書中に組み込まれている）において議論されている。従って
、これらのキナーゼのC-末端は、PDK1「ドッキング部位（docking site)」とし
て機能するかもしれない。PDK１に対するドッキング部位であるPIFのPhe-Xaa-Xa
a-Phe-Asp-Tyrモチーフと一致して、このモチーフのT308tideへの付加は、これ
がPDK1（図１４）によってリン酸化される割合を大きく増加させ、PRK1、PRK2、
PKCζ及びPKC1は、PKBのSer473と等価な部位において、PDK1にPKBと他のAGCサブ
ファミリーのメンバーをリン酸化させるという別の役割を果たすかもしれない［
12及び24］。
【０２１３】
要するに、基質との相互作用を調整するだけでなくその活性を調整するキナー
ゼ触媒ドメインの小さいローブ中に、PDK1は疎水性結合部位を有しているようで
ある。これらの発見により、PDK1上のPIF結合ポケットと相互作用する新規な薬
剤の開発の可能性が高められる。このような薬剤は、特異な基質との相互作用を
調整することによりPDK1を活性化させるか、或いは抑制することができ、これに
よりPDK1により調整されるシグナルトランスダクション経路（signal transduct
ion pathways)をスイッチオンまたはスイッチオフすることができるだろう。従
って、PIFとのPDK1の相互作用を中断する化合物を同定するのにPDKtideが優れた
ペプチドであるかもしれないのに対し、T308tideは、PIFの効果を模倣すること
によりPDK1を活性化する化合物を同定する基質として用いられることができるだ
ろう。
ゼ触媒ドメインの小さいローブ中に、PDK1は疎水性結合部位を有しているようで
ある。これらの発見により、PDK1上のPIF結合ポケットと相互作用する新規な薬
剤の開発の可能性が高められる。このような薬剤は、特異な基質との相互作用を
調整することによりPDK1を活性化させるか、或いは抑制することができ、これに
よりPDK1により調整されるシグナルトランスダクション経路（signal transduct
ion pathways)をスイッチオンまたはスイッチオフすることができるだろう。従
って、PIFとのPDK1の相互作用を中断する化合物を同定するのにPDKtideが優れた
ペプチドであるかもしれないのに対し、T308tideは、PIFの効果を模倣すること
によりPDK1を活性化する化合物を同定する基質として用いられることができるだ
ろう。
【０２１４】
引用文献
1. Leevers et al (1999) Curr Opin Biol 11, 219-225
2. Shepherd et al (1998) Biochem J 333: 471-479
3. Alessi D R and Downes C P (1998) Biochem Biophys Acta 1436, 151-1
64 4. Proud C G (1995) Trends in Biochem Sci 21, 181-185 5. Pullen N & Thomas G, (1998) FEBS LETT 410, 78-82 6. Kobayashi T & Cohen P (1999) Biochem J 339, 319-328 7. Park et al (1999) EMBO J18, 3024-3033 8. Mellor H and Parker P J, (1998), Biochem J, 332, 281-292 9. Alessi, D R and Cohen P (1998) Curr Opin Genet Dev 8, 55-62 10. Pearson et al (1995) EMBO J 14, 5278-5287 11. Belham et al (1999) Current Biol 9, R93-R96. 12. Peterson, R T & Schreiber, S L (1999) Current Biol 9, R521-524 13. Alessi et al (1997) Curr Biol 7, 261-269 14. Alessi et al (1997) Curr Biol 7, 776-789 15. Stokoe et al (1997) Science 277, 567-570 16. Stephens et al (1998) Science 279, 710-714 17. LeGood et al (1998) Science, 281, 2042-2045 18. Chou et al (1998) Curr Biol, 8, 1069-1077 19. Dutil et al (1998) Curr Biol, , 8, 1366-1375 20. Alessi et al (1998) Curr Biol 8, 69-81 21. Pullen et al (1998) Science, 279, 707-710 22. Chen et al (1998) Proc Natl Acad, USA 95, 9849-9854 23. Etchebehere et al (1997) Eur J Biochem, 248, 820-826 24. Balendran et al (1999) Current Biology 9, 393-404 26. Gaffney P R J & Reese C B (1997) Bioorg Med Chem Lett, 7, 3171-31
76 27. Sanchez et al (1994) Nature, 372, 794-798 28. Guex N and Peitsch M C (1997) Electrophoresis, 18, 2714-2723 29. Alessi et al (1996) EMBO J 15, 6541-6551 30. Alessi et al (1994), Methods of Enzymology 255, 279-290 31. Knighton et al (1991) Science 253, 407-414 32. Taylor, S S & Radzio-Andzelm E (1994) Structure 2, 345-355 33. Zheng et al (1993) Biochemistry 32, 2154-61 34. Holland P M and Cooper J A (1999) Curr Biol 9, R329-R331 35. Jacobs et al (1999) Genes and Development, 10, 163-175
64 4. Proud C G (1995) Trends in Biochem Sci 21, 181-185 5. Pullen N & Thomas G, (1998) FEBS LETT 410, 78-82 6. Kobayashi T & Cohen P (1999) Biochem J 339, 319-328 7. Park et al (1999) EMBO J18, 3024-3033 8. Mellor H and Parker P J, (1998), Biochem J, 332, 281-292 9. Alessi, D R and Cohen P (1998) Curr Opin Genet Dev 8, 55-62 10. Pearson et al (1995) EMBO J 14, 5278-5287 11. Belham et al (1999) Current Biol 9, R93-R96. 12. Peterson, R T & Schreiber, S L (1999) Current Biol 9, R521-524 13. Alessi et al (1997) Curr Biol 7, 261-269 14. Alessi et al (1997) Curr Biol 7, 776-789 15. Stokoe et al (1997) Science 277, 567-570 16. Stephens et al (1998) Science 279, 710-714 17. LeGood et al (1998) Science, 281, 2042-2045 18. Chou et al (1998) Curr Biol, 8, 1069-1077 19. Dutil et al (1998) Curr Biol, , 8, 1366-1375 20. Alessi et al (1998) Curr Biol 8, 69-81 21. Pullen et al (1998) Science, 279, 707-710 22. Chen et al (1998) Proc Natl Acad, USA 95, 9849-9854 23. Etchebehere et al (1997) Eur J Biochem, 248, 820-826 24. Balendran et al (1999) Current Biology 9, 393-404 26. Gaffney P R J & Reese C B (1997) Bioorg Med Chem Lett, 7, 3171-31
76 27. Sanchez et al (1994) Nature, 372, 794-798 28. Guex N and Peitsch M C (1997) Electrophoresis, 18, 2714-2723 29. Alessi et al (1996) EMBO J 15, 6541-6551 30. Alessi et al (1994), Methods of Enzymology 255, 279-290 31. Knighton et al (1991) Science 253, 407-414 32. Taylor, S S & Radzio-Andzelm E (1994) Structure 2, 345-355 33. Zheng et al (1993) Biochemistry 32, 2154-61 34. Holland P M and Cooper J A (1999) Curr Biol 9, R329-R331 35. Jacobs et al (1999) Genes and Development, 10, 163-175
【０２１５】
実施例３：PDK1 疎水性 PIFポケットは、PKBではなくS6K 及び SGKのリン酸化
及び活性化に必須である。
及び活性化に必須である。
【０２１６】
本実施例において、我々は、PDK1が、p70 リボソーム S6 キナーゼ (S6K) [6,
7] S6K1，血清 (serum) 及びグルココルチコイド誘導キナーゼ -1 (glucocortic
oid induced kinase-1) (SGK) [8-10] SGK1 並びに PH ドメインを欠く PKBαの
突然変異体 (ΔPH-PKBα) をリン酸化しかつ活性化するのに、PDK1のPIF結合ポ
ケットが重要な役割を担うことを証明する。我々は、また、S6K1， SGK1 及び
ΔPH-PKBαがインビトロ及びインビボにおいてPDK1によりリン酸化された状態に
なるのを許容するのに、これらキナーゼの疎水性モチーフが重要な役割を担うこ
とを証明する。対称的に、ホスファチジルイノシトール (3,4,5) P3 (phosphati
dylinositol(3,4,5)P3) 存在下では、PDK1 の PIF 結合ポケット又は PKBαの疎
水性モチーフは、どちらもPDK1 による PKBαのリン酸化を必要としない。我々
は、また、PDK1に代わる劣等 (poor) 基質となる非リン酸化 (non-phosphorylat
ed) 型 S6K1 及び SGK1 が PDK1 と相互作用しないという証拠を提供する。S6K1
の C 末端自己 (autoinhibitory) 阻害ドメインを除去すると、PDK1 は S6K1
に相互作用し S6K1 をリン酸化できる。自己の疎水性モチーフでリン酸化を模倣
する SGK1 の突然変異体においても、PDK1 は SGK1 の突然変異体に相互作用し
この突然変異体をリン酸化できる。PKB を除いてこれまでのところ同定されてき
ている PDK1 基質のリン酸化は、それら基質の疎水性モチーフにおける PDK1 の
PIF 結合ポケットとの直接的な相互作用により調節されるというモデルを、我
々は示唆する。
7] S6K1，血清 (serum) 及びグルココルチコイド誘導キナーゼ -1 (glucocortic
oid induced kinase-1) (SGK) [8-10] SGK1 並びに PH ドメインを欠く PKBαの
突然変異体 (ΔPH-PKBα) をリン酸化しかつ活性化するのに、PDK1のPIF結合ポ
ケットが重要な役割を担うことを証明する。我々は、また、S6K1， SGK1 及び
ΔPH-PKBαがインビトロ及びインビボにおいてPDK1によりリン酸化された状態に
なるのを許容するのに、これらキナーゼの疎水性モチーフが重要な役割を担うこ
とを証明する。対称的に、ホスファチジルイノシトール (3,4,5) P3 (phosphati
dylinositol(3,4,5)P3) 存在下では、PDK1 の PIF 結合ポケット又は PKBαの疎
水性モチーフは、どちらもPDK1 による PKBαのリン酸化を必要としない。我々
は、また、PDK1に代わる劣等 (poor) 基質となる非リン酸化 (non-phosphorylat
ed) 型 S6K1 及び SGK1 が PDK1 と相互作用しないという証拠を提供する。S6K1
の C 末端自己 (autoinhibitory) 阻害ドメインを除去すると、PDK1 は S6K1
に相互作用し S6K1 をリン酸化できる。自己の疎水性モチーフでリン酸化を模倣
する SGK1 の突然変異体においても、PDK1 は SGK1 の突然変異体に相互作用し
この突然変異体をリン酸化できる。PKB を除いてこれまでのところ同定されてき
ている PDK1 基質のリン酸化は、それら基質の疎水性モチーフにおける PDK1 の
PIF 結合ポケットとの直接的な相互作用により調節されるというモデルを、我
々は示唆する。
【０２１７】
PKBは、通常インスリン及び成長因子で刺激された細胞に存すると 2 分以内に
活性化される [11-13] 。PKB は、細胞膜に対して PKB の補充 (recruitment)
を導く PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 と相互作用する N 末端プレクストリン
ホモロジー (PH) を保持する。なお、PKB は、細胞膜で 2 個の残基のリン酸化
により活性化された状態になる。2 個の残基のうち一つは、キナーゼドメインの
T- ループ (T-loop) に存在し (PKBα中の Thr308) 、もう一つは、触媒ドメイ
ン、すなわち「疎水性モチーフ」と称される領域よりも C 末端に位置する (PKB
中のSer473) [14] 。S6K [6] 及び SGK [8-10]は、また、Thr308 (S6K1 中の Th
r252 及び SGK1中の Thr256) 及び Ser473 (S6K1 中の Thr412 及び SGK1 中の
Thr422) に等価な残基を保持する。インビボでのこれらキナーゼの活性化には、
これら二つの残基がリン酸化される必要がある。T ループ及び疎水性モチーフ両
方での S6K 及び SGK リン酸化は、PKB 同様、PI 3-キナーゼ活性化に依存する
。PKB とは対称的に、S6K 及び SGK は、PH ドメインを保持せず、更に PtdIns(
3,4,5)P3/ PtdIns(3,4)P2 とも相互作用しない。S6K 及び SGK はまた、細胞刺
激に引き続いて PKB よりも著しく遅く活性化され、その最大活性化は、10-40
分後に起こる [9, 10, 12] 。
活性化される [11-13] 。PKB は、細胞膜に対して PKB の補充 (recruitment)
を導く PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 と相互作用する N 末端プレクストリン
ホモロジー (PH) を保持する。なお、PKB は、細胞膜で 2 個の残基のリン酸化
により活性化された状態になる。2 個の残基のうち一つは、キナーゼドメインの
T- ループ (T-loop) に存在し (PKBα中の Thr308) 、もう一つは、触媒ドメイ
ン、すなわち「疎水性モチーフ」と称される領域よりも C 末端に位置する (PKB
中のSer473) [14] 。S6K [6] 及び SGK [8-10]は、また、Thr308 (S6K1 中の Th
r252 及び SGK1中の Thr256) 及び Ser473 (S6K1 中の Thr412 及び SGK1 中の
Thr422) に等価な残基を保持する。インビボでのこれらキナーゼの活性化には、
これら二つの残基がリン酸化される必要がある。T ループ及び疎水性モチーフ両
方での S6K 及び SGK リン酸化は、PKB 同様、PI 3-キナーゼ活性化に依存する
。PKB とは対称的に、S6K 及び SGK は、PH ドメインを保持せず、更に PtdIns(
3,4,5)P3/ PtdIns(3,4)P2 とも相互作用しない。S6K 及び SGK はまた、細胞刺
激に引き続いて PKB よりも著しく遅く活性化され、その最大活性化は、10-40
分後に起こる [9, 10, 12] 。
【０２１８】
PKB, S6K1 及び SGK は、3 ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ 1 (P
DK1) によりそれら自身のTループでリン酸化される [14] 。この酵素は、また、
AGC ファミリーメンバーであって、触媒ドメインよりも C 末端に PtdIns(3,4,5
)P3/ PtdIns(3,4)P2 結合 PH ドメインを保持する。PI 3 キナーゼ活性化に引き
続いて、PDK1 及び PKBは、PtdIns(3,4,5)P3/ PtdIns(3,4)P2 との相互作用を介
して細胞膜に共局在 (co-localise) するようである。細胞膜に PKB を補充する
のに加え、PKB の PH ドメインへの PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 の結合は
、PDK1 にそれをリン酸化させるコンホメーション変化を誘導する可能性がある
[14] 。S6K 及び SGK が PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 と相互作用せず、こ
れらがインビトロにおいて PDK1 によりリン酸化される速度も PtdIns(3,4,5)P3 / PtdIns(3,4)P2 が存在する状態においては増強されない [9, 15] ので、PI 3
キナーゼの活性化が S6K 及び SGK の活性化を誘導するメカニズムは、PKB から
明確にしなければならない。
DK1) によりそれら自身のTループでリン酸化される [14] 。この酵素は、また、
AGC ファミリーメンバーであって、触媒ドメインよりも C 末端に PtdIns(3,4,5
)P3/ PtdIns(3,4)P2 結合 PH ドメインを保持する。PI 3 キナーゼ活性化に引き
続いて、PDK1 及び PKBは、PtdIns(3,4,5)P3/ PtdIns(3,4)P2 との相互作用を介
して細胞膜に共局在 (co-localise) するようである。細胞膜に PKB を補充する
のに加え、PKB の PH ドメインへの PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 の結合は
、PDK1 にそれをリン酸化させるコンホメーション変化を誘導する可能性がある
[14] 。S6K 及び SGK が PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 と相互作用せず、こ
れらがインビトロにおいて PDK1 によりリン酸化される速度も PtdIns(3,4,5)P3 / PtdIns(3,4)P2 が存在する状態においては増強されない [9, 15] ので、PI 3
キナーゼの活性化が S6K 及び SGK の活性化を誘導するメカニズムは、PKB から
明確にしなければならない。
【０２１９】
PDK1 のキナーゼドメインは、PDK1 相互作用断片 (PIF) と称したプロテイン
キナーゼ C 関連 (related) キナーゼ 2 (PRK2) の一つの領域と相互作用する酵
母 2 ハイブリッドスクリーンにおいて発見された [16] 。PIFは、PRK2 のキナ
ーゼドメインよりも C 末端に位置し、更に PKBαの Ser473 に等価な残基が As
p であることを除いては PKBαで発見された疎水性モチーフ (Phe-Xaa-Xaa-Phe-
Ser-Tyr) と同様の疎水性モチーフ (Phe-Xaa-Xaa-Phe-Asp-Tyr) を含む。PIF の
疎水性モチーフ中に保存された芳香族残基の突然変異体、又は、Asp を Ala 若
しくは Ser のどちらかに変異させた突然変異体は、PDK1 との PIF の相互作用
を妨げた [16] 。
キナーゼ C 関連 (related) キナーゼ 2 (PRK2) の一つの領域と相互作用する酵
母 2 ハイブリッドスクリーンにおいて発見された [16] 。PIFは、PRK2 のキナ
ーゼドメインよりも C 末端に位置し、更に PKBαの Ser473 に等価な残基が As
p であることを除いては PKBαで発見された疎水性モチーフ (Phe-Xaa-Xaa-Phe-
Ser-Tyr) と同様の疎水性モチーフ (Phe-Xaa-Xaa-Phe-Asp-Tyr) を含む。PIF の
疎水性モチーフ中に保存された芳香族残基の突然変異体、又は、Asp を Ala 若
しくは Ser のどちらかに変異させた突然変異体は、PDK1 との PIF の相互作用
を妨げた [16] 。
【０２２０】
続く研究は、PRK2 の疎水性モチーフを取り巻く PIF の24個のアミノ酸断片 (
PIFtideという) が、「PIF結合ポケット」と称した PDK1 キナーゼドメインの小
さいローブに係る疎水性ポケットに結合することを証明した [17] 。三つの証拠
から、この相互作用が「ドッキング (docking) 部位」として働き、PDK1による
リン酸化に必須なPRK2に対してPDK1の補充を可能とすることが示唆される。第一
に、PDK1 が PIF と相互作用できないように PIF 結合ポケットにおける中央の
残基 (Leu155) を突然変異させた PDK1 突然変異体 [17] は、PRK2 に対して著
しく低いアフィニティーを保持した [18] 。第二に、293 細胞における PIF の
過剰発現は、PRK2 の T ループ残基での PRK2 のリン酸化を妨げた。第三に、PR
K2 の疎水性モチーフについて Phe を Ala に代えて保存した突然変異体は、PDK
1 に対する PRK2 のアフィニティーを著しく減少させ、更に、この突然変異体は
、細胞で発現しても自己の T ループ残基でリン酸化されなかった [18] 。他の
PDK1 基質、すなわちプロテインキナーゼ C ζ (PKCζ) についても同様の発見
がなされた。この PKCζは、PRK2 と同様の構造であって、更に自己の疎水性モ
チーフにおいて PKBαの Ser473 に等価な残基位置に酸性残基を保持する [18]
。
PIFtideという) が、「PIF結合ポケット」と称した PDK1 キナーゼドメインの小
さいローブに係る疎水性ポケットに結合することを証明した [17] 。三つの証拠
から、この相互作用が「ドッキング (docking) 部位」として働き、PDK1による
リン酸化に必須なPRK2に対してPDK1の補充を可能とすることが示唆される。第一
に、PDK1 が PIF と相互作用できないように PIF 結合ポケットにおける中央の
残基 (Leu155) を突然変異させた PDK1 突然変異体 [17] は、PRK2 に対して著
しく低いアフィニティーを保持した [18] 。第二に、293 細胞における PIF の
過剰発現は、PRK2 の T ループ残基での PRK2 のリン酸化を妨げた。第三に、PR
K2 の疎水性モチーフについて Phe を Ala に代えて保存した突然変異体は、PDK
1 に対する PRK2 のアフィニティーを著しく減少させ、更に、この突然変異体は
、細胞で発現しても自己の T ループ残基でリン酸化されなかった [18] 。他の
PDK1 基質、すなわちプロテインキナーゼ C ζ (PKCζ) についても同様の発見
がなされた。この PKCζは、PRK2 と同様の構造であって、更に自己の疎水性モ
チーフにおいて PKBαの Ser473 に等価な残基位置に酸性残基を保持する [18]
。
【０２２１】
加えて、PDK1がPKBαのTループ由来のペプチド基質をリン酸化した速度を、PI
Ftide が4倍増加させたことから、PRK2 及び PKCζの疎水性モチーフとのPDK1の
相互作用は、PDK1を直接活性化するだろう[17]。更に、T308tide は、PDK1 とし
ては劣等 (poor) 基質であるが、PIFtide (PDKtide) に融合した場合、はるかに
優れた基質になる [17] 。最近、Frodin 及び同僚 [19] もまた、PDK1は、自己
の疎水性モチーフがリン酸化されたときのみp90RSKと称した他のAGCキナーゼ基
質と相互作用するということを証明しており、更に、この相互作用が p90RSKにP
DK1を補充しかつPDK1を活性化するという今現在の証拠をも証明してきている。
Ftide が4倍増加させたことから、PRK2 及び PKCζの疎水性モチーフとのPDK1の
相互作用は、PDK1を直接活性化するだろう[17]。更に、T308tide は、PDK1 とし
ては劣等 (poor) 基質であるが、PIFtide (PDKtide) に融合した場合、はるかに
優れた基質になる [17] 。最近、Frodin 及び同僚 [19] もまた、PDK1は、自己
の疎水性モチーフがリン酸化されたときのみp90RSKと称した他のAGCキナーゼ基
質と相互作用するということを証明しており、更に、この相互作用が p90RSKにP
DK1を補充しかつPDK1を活性化するという今現在の証拠をも証明してきている。
【０２２２】
ここで、我々は、PDK1に係る疎水性PIF結合ポケットの役割、すなわち、PDK1
が、PHを欠くPKBαの突然変異体(ΔPH-PKBα)だけでなくインスリンに応答して
活性化される3つのAGCキナーゼ、つまり、S6K1, SGK1, PKBをリン酸化し更に活
性化するか調査した。なお、ΔPH-PKBαは、S6K 及び SGKと同様、PtdIns(3,4,5
)P3/PtdIns(3,4)P2と相互作用しない。我々のデータから、PDK1 の PIF 結合ポ
ケットは、PDK1 が野生型 PKBαではなく S6K1, SGK1 及び ΔPH-PKBαをリン酸
化しかつ活性化するのに重要な役割を担うことが示される。我々の結果からはPK
B以外のPDK1基質のリン酸化モデル (model) が示唆されるが、このリン酸化は、
PDK1と相互作用するこれら基質の疎水性モチーフの能力により調節されるだろう
。
が、PHを欠くPKBαの突然変異体(ΔPH-PKBα)だけでなくインスリンに応答して
活性化される3つのAGCキナーゼ、つまり、S6K1, SGK1, PKBをリン酸化し更に活
性化するか調査した。なお、ΔPH-PKBαは、S6K 及び SGKと同様、PtdIns(3,4,5
)P3/PtdIns(3,4)P2と相互作用しない。我々のデータから、PDK1 の PIF 結合ポ
ケットは、PDK1 が野生型 PKBαではなく S6K1, SGK1 及び ΔPH-PKBαをリン酸
化しかつ活性化するのに重要な役割を担うことが示される。我々の結果からはPK
B以外のPDK1基質のリン酸化モデル (model) が示唆されるが、このリン酸化は、
PDK1と相互作用するこれら基質の疎水性モチーフの能力により調節されるだろう
。
【０２２３】
材料及び方法
完全な（Complete）プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（cocktail tablets
）及びアンチ（anti-）Mycモノクローナル抗体をRocheから、組織培養試薬及び
ミクロシスチンLR（microcystin-LR）はLife Technologiesから、グルタチオン
セファロース（glutathione-Sepharose）及び ECL試薬はAmersham Pharmacia Bi
otechから提供された。プレキャスト（Precast）勾配（gradient）SDS ポリアク
リルアミドゲル（polyacrylamide gels）はinvitrogenから提供された。 抗体。T256-Pと名付けられたT-loop (Thr256)においてリン酸化されるSGKを認
識するホスホ特異性(phospho-specific)抗体の特徴付け（characterisatio）は
、あらかじめ記載されている[]。ペプチド KDGATMKTFCGTP (ヒトPKBαの残基301
-313に対応する)に対して、Thr308 (T308-Pと名付けられた)においてリン酸化さ
れるPKBαを認識するホスホ特異性抗体をヒツジで養った。下線を引いた残基は
ホスホトレオニン(phosphothreonine)である。ペプチドHDGTVTHTFCGTIEY (ヒトS
6K1の長スプライス突然変異体 (long splice variant)の残基245-259に対応する
)に対して、Thr229においてリン酸化されるS6K1を認識する抗体をヒツジで養っ
た。下線を引いた残基はホスホトレオニンである。CHセファロースでアフィニテ
ィー精製された(affinity purified)抗体をリン酸化されたペプチドに共有結合
（covalently）で結合し、その後、リン酸化されていないペプチドに結合するCH
セファロースのカラムに通した。後者のカラムに結合しなかった抗体を選択した
。Mycエピトープを認識するモノクローナル抗体はRocheから提供され、GST及びF
LAGエピトープを認識するモノクローナル抗体をSigmaから購入した。二次抗体を
共役したワサビペルオキシダーゼ (Horse radish peroxidase) はPierceから提
供された。 一般的な方法。標準的なプロトコルを用いて、分子生物学的な技術を行った。
製造業者により提供された使用説明書に従い、クイックチェンジキット（QuickC
hange Kit）（ストレイトジーン（Strategene））を用いて、部位特異的変異（S
ite-directed mutagenesis）を行った。製造業者のプロトコールに従い、キアゲ
ンプラスミドメガキット（Qiagen plasmid Mega kit）を用いて、トランスフェ
クション（transfection）に用いたDNA構築物を細菌から精製し、それらの配列
が確認された（verified）。10％（体積で）胎児ウシ血清を含有するダルベコズ
モディファイイーグルズ（Dulbecco's Modified Eagle's）培地で直径10cmの皿
を用いて、ヒト腎臓胚（Human kidney embryonic）293細胞を培養した。修飾リ
ン酸カルシウム法及び各皿につき10 μgのプラスミドを用いて、トランスフェク
ションを行った。ホスファチヂルコリン（phosphatidiylcholine）、ホスファチ
ヂルセリン（phosphatidylserine）及びsn-1- ステアロイル (stearoyl) -2- ア
ラキドノイル (arachidonoyl) -D-PtdIns (3, 4, 5) P3[20]を含むリン脂質小胞
（phospholipid vesicles）を、上記しているようにして調製した[21]。 緩衝液。緩衝液A : 50 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EGTA、1 mM EDTA、 1% (質
量で) Triton-X 100、1 mM オルトバナジウムナトリウム（sodium orthovanadat
e），50 mM フッ化ナトリウム，5 mM ピロリン酸ナトリウム，0.27 M スクロー
ス，1 μM ミクロシスチン-LR，0.1% (体積で) βメルカプトエタノール及び‘
完全な（complete）’プロテイナーゼ阻害剤カクテル(25mlあたり１タブレット,
Roche)。緩衝液B: 50 mM Tris/HCl pH 7.5，0.1 mM EGTA，10 mM β-メルカプ
トエタノール及び0.27M スクロース。 プロテインの発現及び精製。野生株（Wild type）-PDK1 [22], PDK1[L155E],
PDK1[K115A], PDK1[I119A], PDK1[Q150A] [17],及びPDK1[L155A] [18]において
、野生株及びそれらのN末端を介してグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)に
融合される上記PDK1の突然変異体を発現するために、pEBG2Tベクターを用いた。
野生株PDK1 [22] 及び突然変異体PDK1[L155E] [17]において、N末端がMyc標識す
ることでこれらのプロテインを発現するために、pCMV5ベクターを用いた。
）及びアンチ（anti-）Mycモノクローナル抗体をRocheから、組織培養試薬及び
ミクロシスチンLR（microcystin-LR）はLife Technologiesから、グルタチオン
セファロース（glutathione-Sepharose）及び ECL試薬はAmersham Pharmacia Bi
otechから提供された。プレキャスト（Precast）勾配（gradient）SDS ポリアク
リルアミドゲル（polyacrylamide gels）はinvitrogenから提供された。 抗体。T256-Pと名付けられたT-loop (Thr256)においてリン酸化されるSGKを認
識するホスホ特異性(phospho-specific)抗体の特徴付け（characterisatio）は
、あらかじめ記載されている[]。ペプチド KDGATMKTFCGTP (ヒトPKBαの残基301
-313に対応する)に対して、Thr308 (T308-Pと名付けられた)においてリン酸化さ
れるPKBαを認識するホスホ特異性抗体をヒツジで養った。下線を引いた残基は
ホスホトレオニン(phosphothreonine)である。ペプチドHDGTVTHTFCGTIEY (ヒトS
6K1の長スプライス突然変異体 (long splice variant)の残基245-259に対応する
)に対して、Thr229においてリン酸化されるS6K1を認識する抗体をヒツジで養っ
た。下線を引いた残基はホスホトレオニンである。CHセファロースでアフィニテ
ィー精製された(affinity purified)抗体をリン酸化されたペプチドに共有結合
（covalently）で結合し、その後、リン酸化されていないペプチドに結合するCH
セファロースのカラムに通した。後者のカラムに結合しなかった抗体を選択した
。Mycエピトープを認識するモノクローナル抗体はRocheから提供され、GST及びF
LAGエピトープを認識するモノクローナル抗体をSigmaから購入した。二次抗体を
共役したワサビペルオキシダーゼ (Horse radish peroxidase) はPierceから提
供された。 一般的な方法。標準的なプロトコルを用いて、分子生物学的な技術を行った。
製造業者により提供された使用説明書に従い、クイックチェンジキット（QuickC
hange Kit）（ストレイトジーン（Strategene））を用いて、部位特異的変異（S
ite-directed mutagenesis）を行った。製造業者のプロトコールに従い、キアゲ
ンプラスミドメガキット（Qiagen plasmid Mega kit）を用いて、トランスフェ
クション（transfection）に用いたDNA構築物を細菌から精製し、それらの配列
が確認された（verified）。10％（体積で）胎児ウシ血清を含有するダルベコズ
モディファイイーグルズ（Dulbecco's Modified Eagle's）培地で直径10cmの皿
を用いて、ヒト腎臓胚（Human kidney embryonic）293細胞を培養した。修飾リ
ン酸カルシウム法及び各皿につき10 μgのプラスミドを用いて、トランスフェク
ションを行った。ホスファチヂルコリン（phosphatidiylcholine）、ホスファチ
ヂルセリン（phosphatidylserine）及びsn-1- ステアロイル (stearoyl) -2- ア
ラキドノイル (arachidonoyl) -D-PtdIns (3, 4, 5) P3[20]を含むリン脂質小胞
（phospholipid vesicles）を、上記しているようにして調製した[21]。 緩衝液。緩衝液A : 50 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EGTA、1 mM EDTA、 1% (質
量で) Triton-X 100、1 mM オルトバナジウムナトリウム（sodium orthovanadat
e），50 mM フッ化ナトリウム，5 mM ピロリン酸ナトリウム，0.27 M スクロー
ス，1 μM ミクロシスチン-LR，0.1% (体積で) βメルカプトエタノール及び‘
完全な（complete）’プロテイナーゼ阻害剤カクテル(25mlあたり１タブレット,
Roche)。緩衝液B: 50 mM Tris/HCl pH 7.5，0.1 mM EGTA，10 mM β-メルカプ
トエタノール及び0.27M スクロース。 プロテインの発現及び精製。野生株（Wild type）-PDK1 [22], PDK1[L155E],
PDK1[K115A], PDK1[I119A], PDK1[Q150A] [17],及びPDK1[L155A] [18]において
、野生株及びそれらのN末端を介してグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)に
融合される上記PDK1の突然変異体を発現するために、pEBG2Tベクターを用いた。
野生株PDK1 [22] 及び突然変異体PDK1[L155E] [17]において、N末端がMyc標識す
ることでこれらのプロテインを発現するために、pCMV5ベクターを用いた。
【０２２４】
この研究で使用された全てのS6K1, SGK1及びPKBα基質は、図１７に図示され
ている。C末端の104個の残基を欠いている全てのS6K1をS6K1-T2と名付けた。N末
端がFLAGエピトープで標識されたS6K1, S6K1-T2, S6K1[T412E], S6K1-T2[T412E]
及びpCMT2-T2-S6K1[T412E]は、pCMT2ベクター[23]において発現された。N末端が
GSTで標識されたS6K1, S6K1-T2 [9], S6K1-T2[F411A] は、pEBG2Tベクターにお
いて発現された。
ている。C末端の104個の残基を欠いている全てのS6K1をS6K1-T2と名付けた。N末
端がFLAGエピトープで標識されたS6K1, S6K1-T2, S6K1[T412E], S6K1-T2[T412E]
及びpCMT2-T2-S6K1[T412E]は、pCMT2ベクター[23]において発現された。N末端が
GSTで標識されたS6K1, S6K1-T2 [9], S6K1-T2[F411A] は、pEBG2Tベクターにお
いて発現された。
【０２２５】
この研究で発現された全てのSGK1突然変異体は、N末端の60個のアミノ酸を欠
いている。. N末端がHAエピトープで標識されたSGK1, SGK1[T422E] [9], SGK1[F
421A] は、pEBG2Tベクターにおいて発現された。
いている。. N末端がHAエピトープで標識されたSGK1, SGK1[T422E] [9], SGK1[F
421A] は、pEBG2Tベクターにおいて発現された。
【０２２６】
N末端がGSTで標識されたPKBα [21], PKBα [S473D] [16], PKBα [F472A], (
PH-PKBα [22], (PH-PKBα[S473D], (PH-PKBα[F472A]は、pEBG2Tベクターにお
いて発現された。
PH-PKBα [22], (PH-PKBα[S473D], (PH-PKBα[F472A]は、pEBG2Tベクターにお
いて発現された。
【０２２７】
GST融合プロテインは、ヒト腎臓胚293細胞において発現された。各構築物の発
現のために、修飾リン酸カルシウム法[24]を用いて、20枚の直径10 cmの皿にて2
93細胞を培養し、そして、各皿に10 μgのpEBG-2T構築物をトランスフェクトし
た。24時間のポスト（post）トランスフェクションの後、細胞を 16 時間血清飢
餓させて、その後、0.6 mlのよく冷えた（ice-cold）緩衝液A中にて溶菌し、溶
菌物を4oCで10分間、13, 000 x gで遠心分離することでプールして（pooled）、
グルタチオンセファロースにおけるアフィニティクロマトグラフィーによりGST
融合体プロテインを精製し、上記したように[21]、50 mM Tris pH 7.5, 0.1 mME
GTA、0.27 M スクロース、0.1% (by vol) 2-メルカプトエタノール及び20 mM グ
ルタチオン中に溶出した。典型的には、取得された各GST融合体プロテインの0.3
〜1.0 mgの間では、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、各プロテイ
ンの相同性が75%よりも大きくなっていることが判断された(データは図示されて
ない)。
現のために、修飾リン酸カルシウム法[24]を用いて、20枚の直径10 cmの皿にて2
93細胞を培養し、そして、各皿に10 μgのpEBG-2T構築物をトランスフェクトし
た。24時間のポスト（post）トランスフェクションの後、細胞を 16 時間血清飢
餓させて、その後、0.6 mlのよく冷えた（ice-cold）緩衝液A中にて溶菌し、溶
菌物を4oCで10分間、13, 000 x gで遠心分離することでプールして（pooled）、
グルタチオンセファロースにおけるアフィニティクロマトグラフィーによりGST
融合体プロテインを精製し、上記したように[21]、50 mM Tris pH 7.5, 0.1 mME
GTA、0.27 M スクロース、0.1% (by vol) 2-メルカプトエタノール及び20 mM グ
ルタチオン中に溶出した。典型的には、取得された各GST融合体プロテインの0.3
〜1.0 mgの間では、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、各プロテイ
ンの相同性が75%よりも大きくなっていることが判断された(データは図示されて
ない)。
【０２２８】
293細胞で発現されたSGK1[T422E]を、Thr256[9]においてリン酸化し、精製さ
れたGST-SGK1[T412E]を、PP2A 30 mU/mlとともに30 oCで1時間培養することによ
り脱リン酸化した。そして、ミクロシスチンLR(1μM)を添加して反応を終了させ
て、試料を30oCで5分以上放置して、液体窒素で凍結して、必要とされるまで-80 o Cで保存された。GST-SGK1はThr256においてリン酸化されませんが、GST-SGK1も
、SGK1及びSGK1[T422E]におけるリン酸化の比較を可能にするために、PP2Aとの
処理に被験した。さらに、S6K1-T2 及びS6K1-T2[T412E]を、バキュロウイルス／
昆虫細胞発現システム（bacuolovirus/insect cell expression system）におい
て、His標識された（His-tag）プロテインとして発現し、上記したようなニッケ
ルアガロースアフィニティークロマトグラフィー[25]によって精製した。この方
法で発現されたS6K1-T2[T412E]は、Thr252においてリン酸化されません。
れたGST-SGK1[T412E]を、PP2A 30 mU/mlとともに30 oCで1時間培養することによ
り脱リン酸化した。そして、ミクロシスチンLR(1μM)を添加して反応を終了させ
て、試料を30oCで5分以上放置して、液体窒素で凍結して、必要とされるまで-80 o Cで保存された。GST-SGK1はThr256においてリン酸化されませんが、GST-SGK1も
、SGK1及びSGK1[T422E]におけるリン酸化の比較を可能にするために、PP2Aとの
処理に被験した。さらに、S6K1-T2 及びS6K1-T2[T412E]を、バキュロウイルス／
昆虫細胞発現システム（bacuolovirus/insect cell expression system）におい
て、His標識された（His-tag）プロテインとして発現し、上記したようなニッケ
ルアガロースアフィニティークロマトグラフィー[25]によって精製した。この方
法で発現されたS6K1-T2[T412E]は、Thr252においてリン酸化されません。
【０２２９】
PDK1によるAGCキナーゼ基質のリン酸化。50 mM Tris-HCl pH 7.5、0.1% (体積
で) 2メルカプトエタノール、10 mM 塩化マグネシウム、100 μM [(-32P]ATP (~
1000 c.p.m./pmol)、0.5 μM ミクロシスチンLR、0.6 μM AGCキナーゼ基質、及
び0.6-30 nM 野生株PDK1又は示唆された PDK1の突然変異体を含む緩衝液におい
て、最終体積を20 μlとしてPDK1基質のリン酸化を行った。10分間の反応を、ラ
エンムリサンプル緩衝液（Laemmli Sample Buffer） (100 mM Tris-HCl pH 6.8
、4% (質量で) SDS、20% (体積で) グリセロール及び200 mM ヂチオスレイトー
ル(DTT))を添加することで停止した後、煮沸し、試料をSDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分離に被験した。ゲルを、データの数量化を可能にするブラ
ンク（blank）ゲル上に点在させられた[(-32P]ATPの量を知ることができるフジ
ホスホイメージャー（Fuji PhosphoImager）に曝露して分析した。PDK1の量が基
質を20%よりも多くリン酸化しないようにして、試験を行った。PDK1が反応から
除かれた対照を、ブランク値（blank value）として得た。
で) 2メルカプトエタノール、10 mM 塩化マグネシウム、100 μM [(-32P]ATP (~
1000 c.p.m./pmol)、0.5 μM ミクロシスチンLR、0.6 μM AGCキナーゼ基質、及
び0.6-30 nM 野生株PDK1又は示唆された PDK1の突然変異体を含む緩衝液におい
て、最終体積を20 μlとしてPDK1基質のリン酸化を行った。10分間の反応を、ラ
エンムリサンプル緩衝液（Laemmli Sample Buffer） (100 mM Tris-HCl pH 6.8
、4% (質量で) SDS、20% (体積で) グリセロール及び200 mM ヂチオスレイトー
ル(DTT))を添加することで停止した後、煮沸し、試料をSDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分離に被験した。ゲルを、データの数量化を可能にするブラ
ンク（blank）ゲル上に点在させられた[(-32P]ATPの量を知ることができるフジ
ホスホイメージャー（Fuji PhosphoImager）に曝露して分析した。PDK1の量が基
質を20%よりも多くリン酸化しないようにして、試験を行った。PDK1が反応から
除かれた対照を、ブランク値（blank value）として得た。
【０２３０】
AGCキナーゼPDK1基質の活性化。[(-32P]ATPに代替された非放射性（non-radio
active）ATPを除いて、リン酸化は上記のようにして行われた。50 mM Tris-HCl
pH 7.5、0.1% (by vol) 2メルカプトエタノール、10 mM 塩化マグネシウム、100
μM [(-32P]ATP (~1000 c.p.m./pmol),、0.5 μM ミクロシスチンLR 及び100
μM ペプチド基質クロスタイド (GRPRTSSFAEG) 及び[(-32P]ATP (~600 c.p.m./p
mol)を含むカクテル(30 μl)を、10分間、30 oCに維持した。反応を、25 μlの0
.2 M EDTA pH 8.0を添加することで停止して、P81ホスホセルロース紙上に点在
させて、洗浄して、MAPキナーゼ[26]のアッセイにおいて記載したようにして分
析した。アッセイが線形の範囲内に納まるように、アッセイにおけるPDK1の量を
変更した。活性の1ユニットを、1分間当たりの1nmolの基質のリン酸化として規
定した。
active）ATPを除いて、リン酸化は上記のようにして行われた。50 mM Tris-HCl
pH 7.5、0.1% (by vol) 2メルカプトエタノール、10 mM 塩化マグネシウム、100
μM [(-32P]ATP (~1000 c.p.m./pmol),、0.5 μM ミクロシスチンLR 及び100
μM ペプチド基質クロスタイド (GRPRTSSFAEG) 及び[(-32P]ATP (~600 c.p.m./p
mol)を含むカクテル(30 μl)を、10分間、30 oCに維持した。反応を、25 μlの0
.2 M EDTA pH 8.0を添加することで停止して、P81ホスホセルロース紙上に点在
させて、洗浄して、MAPキナーゼ[26]のアッセイにおいて記載したようにして分
析した。アッセイが線形の範囲内に納まるように、アッセイにおけるPDK1の量を
変更した。活性の1ユニットを、1分間当たりの1nmolの基質のリン酸化として規
定した。
【０２３１】
PDK1のSGK1及びS6K1への結合。 図22に表されたデータについては、 293細胞
を、10 μgの野生株又はPDK1突然変異プラスミド、及び10 μg の野生株かS6K1
又はSGK1の突然変異体に、共トランスフェクトした。36時間ポストトランスフェ
クションされた細胞を、0.6 mlの緩衝液A中にて溶菌し、そして、溶菌物を13 00
0 x gで10分間、2 oCで遠心分離することでクリアーにし（cleared）、0.5 mlの
上清を30 μlのグルタチオンセファロースとともに2時間、4oCで培養した。0.5
M塩化ナトリウムを含む緩衝液Aで2回洗浄して、続けて、さらに緩衝液Aで2回洗
浄した。ビーズを30 μlのラエンムリサンプル緩衝液に再懸濁して、SDSポリア
クリルアミドゲル電機泳動に被験した。ゲルをクーマシーブルー（Coomassie bl
ue）を用いて染色するか、アンチFlag又はアンチMyc抗体(以下に記載されている
)のどちらかを用いて免疫ブロットにより分析した。
を、10 μgの野生株又はPDK1突然変異プラスミド、及び10 μg の野生株かS6K1
又はSGK1の突然変異体に、共トランスフェクトした。36時間ポストトランスフェ
クションされた細胞を、0.6 mlの緩衝液A中にて溶菌し、そして、溶菌物を13 00
0 x gで10分間、2 oCで遠心分離することでクリアーにし（cleared）、0.5 mlの
上清を30 μlのグルタチオンセファロースとともに2時間、4oCで培養した。0.5
M塩化ナトリウムを含む緩衝液Aで2回洗浄して、続けて、さらに緩衝液Aで2回洗
浄した。ビーズを30 μlのラエンムリサンプル緩衝液に再懸濁して、SDSポリア
クリルアミドゲル電機泳動に被験した。ゲルをクーマシーブルー（Coomassie bl
ue）を用いて染色するか、アンチFlag又はアンチMyc抗体(以下に記載されている
)のどちらかを用いて免疫ブロットにより分析した。
【０２３２】
免疫ブロット。Myc及びFlagブロット（blots）のために、5 μgの細胞溶菌物
プロテインを用いた。50 mM Tris/HCl pH 7.5、0.15M NaCl、0.5% (体積当たり)
Tween (TBS-Tween) を含む50 mM Tris/HCl pH 7.5、0.15M NaCl、 0.5% (体積
当たり) Tween (TBS-Tween) 5% (質量当たり) スキムミルク（skimmed milk）に
おいて、抗体を養うのに使われる抗原に対応する10 μg/mlの脱リン酸化ペプチ
ド（dephospho peptide）の存在下にて、ホスホ特異性抗体 (0.5-2 μg/ml)を免
疫ブロットした。二次抗体を共役したワサビペルオキシダーゼ (Horse radish p
eroxidase)、及び増強化学発光試薬 (enhanced chemiluminescence reagent) (A
mersham Pharmacia Biotech) を用いて検定を行った。
プロテインを用いた。50 mM Tris/HCl pH 7.5、0.15M NaCl、0.5% (体積当たり)
Tween (TBS-Tween) を含む50 mM Tris/HCl pH 7.5、0.15M NaCl、 0.5% (体積
当たり) Tween (TBS-Tween) 5% (質量当たり) スキムミルク（skimmed milk）に
おいて、抗体を養うのに使われる抗原に対応する10 μg/mlの脱リン酸化ペプチ
ド（dephospho peptide）の存在下にて、ホスホ特異性抗体 (0.5-2 μg/ml)を免
疫ブロットした。二次抗体を共役したワサビペルオキシダーゼ (Horse radish p
eroxidase)、及び増強化学発光試薬 (enhanced chemiluminescence reagent) (A
mersham Pharmacia Biotech) を用いて検定を行った。
【０２３３】
T816-Pブロット（blots）のために、 25 μgの細胞溶菌物プロテインを用いた
。T410-P ブロットのために、5 μlのFlagアフィニティーゲルを用いて、150 μ
gの細胞溶菌物プロテインを免疫沈降し、そして、上記したようにして洗浄した
。細胞溶菌物及び免疫沈降物をSDSにて1%にし、SDS/ポリアクリルアミドゲル電
機泳動に被験して、そして、ニトロセルロースに移した。ニトロセルロース膜に
、アンチMyc (0.4 μg/ml )又はアンチFlag抗体 (0.4 μg/ml)のどちらかと、10
% (質量で) スキムミルクを用いて、免疫ブロットした。
。T410-P ブロットのために、5 μlのFlagアフィニティーゲルを用いて、150 μ
gの細胞溶菌物プロテインを免疫沈降し、そして、上記したようにして洗浄した
。細胞溶菌物及び免疫沈降物をSDSにて1%にし、SDS/ポリアクリルアミドゲル電
機泳動に被験して、そして、ニトロセルロースに移した。ニトロセルロース膜に
、アンチMyc (0.4 μg/ml )又はアンチFlag抗体 (0.4 μg/ml)のどちらかと、10
% (質量で) スキムミルクを用いて、免疫ブロットした。
【０２３４】
結果
本研究において使用された AGC キナーゼ基質の野生型及び突然変異体型の全て
を、図１７に規定している。本研究で適用された S6K 型は、C 末端の 104 個の
残基を欠くことを除いては、完全長 S6K1 同様、インビトロにおいて PDK1 に適
する有効な基質とはならない [15, 27] 。本研究に適用された SGK1 型は、N 末
端の 61 個のアミノ酸残基を欠いており、完全長 SGK1 プロテイン同様、はっき
りとしたレベルで安定化したり発現することはない [9] 。
を、図１７に規定している。本研究で適用された S6K 型は、C 末端の 104 個の
残基を欠くことを除いては、完全長 S6K1 同様、インビトロにおいて PDK1 に適
する有効な基質とはならない [15, 27] 。本研究に適用された SGK1 型は、N 末
端の 61 個のアミノ酸残基を欠いており、完全長 SGK1 プロテイン同様、はっき
りとしたレベルで安定化したり発現することはない [9] 。
【０２３５】
PDK1 によるS6K1, SGK1 及び PKB のリン酸化及び活性化に係る PDK1「PIF ポ
ケット」の役割。 我々は、第一に、PDK1に係る疎水性PIF結合ポケットの役割、すなわち、PDK1が
、インスリンに応答して活性化される3つのAGCキナーゼ、つまり、S6K1, SGK1,
PKBをリン酸化し更に活性化するかを調査した。我々は、最初に、疎水性 PIF 結
合ポケットが崩壊されている PDK1 突然変異体 (PDK1[L155E]) [17] が、これら
AGC キナーゼ基質をリン酸化しかつ活性化できるかどうかをテストした。際立
ったことに、PDK1 [L155E] による S6K1 及び SGK1 のリン酸化は、野生型 PDK1
に比較して急激に減少した (図１８及び表１) 。我々は、また、自己の疎水性
モチーフリン酸化部位を酸性残基に変えた S6K1 (S6K1[T422E]) 及び SGK1 (SGK
1[T422D]) の突然変異体を適用した。酸性残基は、これら突然変異体がPDK1によ
りリン酸化されかつ活性化される速度を非常に増加させる (表３及び [9, 15, 2
7] ) 。S6K1[T422E] 及び SGK1[T422D] の両方は、また、野生型 PDK1 に比較し
て PDK1[L155E] によってはほとんどリン酸化されず更に活性化もされなかった
(図１８) 。対称的に、PKBα及びその酸性を有する疎水性モチーフ突然変異体 P
KBα[S473D] は、平等に、野生型及び PDK1[L155E] の好適な基質となった。し
かしながら興味深いことに、PH ドメインを欠き更に S6K1 及び SGK1 (図１７)
と同様の構造を存する PKBα及び PKBα [S473D] の突然変異体 (ΔPH-PKBα及
びΔPH-PKBα[S473D]) は、野生型 PDK1 に比較した PDK1[L155E] にはとても劣
等な基質である。ΔPH-PKBαは、完全長 PKBαよりも 50-100 倍遅い速度で PDK
1 によりリン酸化され (表３)、そのリン酸化は、PDK1による S6K1 及び SGK1
のリン酸化と同様に、PtdIns(3,4,5)P3 には影響されない [9, 15] 。しかしな
がら、ΔPH-PKBαが、S6K1 及び SGK1よりも 10 倍遅い初期速度で PDK1 により
リン酸化され、更にΔPH-PKBα[S473D] が、S6K1[T412E] 及び SGK1[T422E] よ
りも ~100 倍遅い速度でリン酸化されることには、注目すべきである (表３) 。
ケット」の役割。 我々は、第一に、PDK1に係る疎水性PIF結合ポケットの役割、すなわち、PDK1が
、インスリンに応答して活性化される3つのAGCキナーゼ、つまり、S6K1, SGK1,
PKBをリン酸化し更に活性化するかを調査した。我々は、最初に、疎水性 PIF 結
合ポケットが崩壊されている PDK1 突然変異体 (PDK1[L155E]) [17] が、これら
AGC キナーゼ基質をリン酸化しかつ活性化できるかどうかをテストした。際立
ったことに、PDK1 [L155E] による S6K1 及び SGK1 のリン酸化は、野生型 PDK1
に比較して急激に減少した (図１８及び表１) 。我々は、また、自己の疎水性
モチーフリン酸化部位を酸性残基に変えた S6K1 (S6K1[T422E]) 及び SGK1 (SGK
1[T422D]) の突然変異体を適用した。酸性残基は、これら突然変異体がPDK1によ
りリン酸化されかつ活性化される速度を非常に増加させる (表３及び [9, 15, 2
7] ) 。S6K1[T422E] 及び SGK1[T422D] の両方は、また、野生型 PDK1 に比較し
て PDK1[L155E] によってはほとんどリン酸化されず更に活性化もされなかった
(図１８) 。対称的に、PKBα及びその酸性を有する疎水性モチーフ突然変異体 P
KBα[S473D] は、平等に、野生型及び PDK1[L155E] の好適な基質となった。し
かしながら興味深いことに、PH ドメインを欠き更に S6K1 及び SGK1 (図１７)
と同様の構造を存する PKBα及び PKBα [S473D] の突然変異体 (ΔPH-PKBα及
びΔPH-PKBα[S473D]) は、野生型 PDK1 に比較した PDK1[L155E] にはとても劣
等な基質である。ΔPH-PKBαは、完全長 PKBαよりも 50-100 倍遅い速度で PDK
1 によりリン酸化され (表３)、そのリン酸化は、PDK1による S6K1 及び SGK1
のリン酸化と同様に、PtdIns(3,4,5)P3 には影響されない [9, 15] 。しかしな
がら、ΔPH-PKBαが、S6K1 及び SGK1よりも 10 倍遅い初期速度で PDK1 により
リン酸化され、更にΔPH-PKBα[S473D] が、S6K1[T412E] 及び SGK1[T422E] よ
りも ~100 倍遅い速度でリン酸化されることには、注目すべきである (表３) 。
【０２３６】
【表３】
PDK1基質の相対的なリン酸化
【０２３７】
PDK1 基質の相対的なリン酸化。PDK1 基質をインビトロでリン酸化し、SDS-PA
GE に被検し、更にホスホイメージャー (Phospho-Imager) 及び周知の標準ATP量
を用いてバンドに係る放射能を測定した。PtdIns (3,4,5)P3 が存在する状態に
おける PKB[S473D] のリン酸化速度を 2.6 mol/mol PDK1/分とし、これを相対値
100 とした。２回行った代表実験からの平均値を示す。
GE に被検し、更にホスホイメージャー (Phospho-Imager) 及び周知の標準ATP量
を用いてバンドに係る放射能を測定した。PtdIns (3,4,5)P3 が存在する状態に
おける PKB[S473D] のリン酸化速度を 2.6 mol/mol PDK1/分とし、これを相対値
100 とした。２回行った代表実験からの平均値を示す。
【０２３８】
PDK1 は、PIFtide が存在する状態ではもはや S6K1 をリン酸化できないが、P
KBαを活性化する能力を維持することを我々は観測した [25] (図１９Ａ及び１
９Ｃ並びに表３も参照) 。ここで、我々は、PIFtide が存在する状態においては
、疎水性モチーフ突然変異体、すなわち S6K1[T412E], SGK1[T422D] 及びΔPH-P
KBα[S473D] だけでなくSGK1, ΔPH-PKBαをリン酸化しかつ活性化する PDK1 の
能力もまた著しく阻害されることを証明する。これらの結果から、S6K1, SGK1
及びΔPH-PKBαをリン酸化しかつ活性化するために PDK1 は疎水性 PIF 結合ポ
ケットを必要とすることが証明される。
KBαを活性化する能力を維持することを我々は観測した [25] (図１９Ａ及び１
９Ｃ並びに表３も参照) 。ここで、我々は、PIFtide が存在する状態においては
、疎水性モチーフ突然変異体、すなわち S6K1[T412E], SGK1[T422D] 及びΔPH-P
KBα[S473D] だけでなくSGK1, ΔPH-PKBαをリン酸化しかつ活性化する PDK1 の
能力もまた著しく阻害されることを証明する。これらの結果から、S6K1, SGK1
及びΔPH-PKBαをリン酸化しかつ活性化するために PDK1 は疎水性 PIF 結合ポ
ケットを必要とすることが証明される。
【０２３９】
PDK1によるS6K1, SGK1 及び PKBのリン酸化に係る疎水性モチーフの役割。我
々は、次に、PDK1がS6K1, SGK1 及び PKBαをリン酸化するかについてこれらキ
ナーゼの疎水性モチーフの役割を調査した。これを行うため、我々は、保存され
た Phe (S6K1 中の Phe411, SGK1 中の Phe421 及び PKBα中のPhe472) を、こ
れら AGC キナーゼに係る疎水性モチーフリン酸化部位よりも前に存する Ala に
突然変異させて、これにより PDK1 がこれらキナーゼのリン酸化及び活性化を行
うかについての突然変異の有効性を測定した。この突然変異を、PRK2 及び PKC
ζでの突然変異と同等なものとして選択したが、この突然変異は、PDK1がこれら
突然変異体と相互作用しかつこれら突然変異体をリン酸化するのを妨げた。PDK1
が野生型酵素に比較して S6K1[F411A], SGK1[F421A] 及びΔPH-PKBα[F472A]
をリン酸化した速度は著しく減少した。興味深いことに、PDK1 がこれら酵素を
リン酸化した基礎速度は、PIFtide により阻害され、更にこれら酵素が PDK1[L1
55E] によりリン酸化された速度と同等だった。対称的に、PKB[F472A] は、野生
型 PKB と同じ速度でリン酸化された。
々は、次に、PDK1がS6K1, SGK1 及び PKBαをリン酸化するかについてこれらキ
ナーゼの疎水性モチーフの役割を調査した。これを行うため、我々は、保存され
た Phe (S6K1 中の Phe411, SGK1 中の Phe421 及び PKBα中のPhe472) を、こ
れら AGC キナーゼに係る疎水性モチーフリン酸化部位よりも前に存する Ala に
突然変異させて、これにより PDK1 がこれらキナーゼのリン酸化及び活性化を行
うかについての突然変異の有効性を測定した。この突然変異を、PRK2 及び PKC
ζでの突然変異と同等なものとして選択したが、この突然変異は、PDK1がこれら
突然変異体と相互作用しかつこれら突然変異体をリン酸化するのを妨げた。PDK1
が野生型酵素に比較して S6K1[F411A], SGK1[F421A] 及びΔPH-PKBα[F472A]
をリン酸化した速度は著しく減少した。興味深いことに、PDK1 がこれら酵素を
リン酸化した基礎速度は、PIFtide により阻害され、更にこれら酵素が PDK1[L1
55E] によりリン酸化された速度と同等だった。対称的に、PKB[F472A] は、野生
型 PKB と同じ速度でリン酸化された。
【０２４０】
我々は、また、293 細胞においてS6K1, SGK, PKBα 及びΔPH-PKBαの野生型
及び疎水性モチーフ突然変異体を発現させ、更に、適切なホスホ特異性 (phosph
o-specific) 抗体を用い IGF1 による細胞刺激の前後でのこれら酵素の T ルー
プ部位のリン酸化を測定した。野生型キナーゼがリン酸化された状態になったに
もかかわらず、細胞の IGF1 刺激により、S6K1[F411A], SGK1[F421A] 及びΔPH-
PKBα[F472A] の T ループ残基のリン酸化は誘導されなかった (図２１Ｄ及び２
１Ｅ) 。S6K1[F411A] 及び SGK1[F421A] は、また、IGF1 刺激に引き続いて著し
くは活性化されなかったが、これら酵素の自己の T ループ残基がリン酸化され
ないことに一致する (データは示さない) 。対称的に、PKBα[F472A] は、IGF1
に応答して野生型PKBαと同程度にリン酸化された (図１８Ｆ) 。PKBα[F472A]
は、刺激されていない細胞において野生型 PKBαの基礎活性の ~50 ％を保持し
たが、その活性は、Thr308 をリン酸化したにもかかわらず IGF1 刺激に引き続
いて更には増加しなかった (データは示さない) 。平行実験において、IGF1 は
、野生型PKBαの Thr308 と同等のリン酸化を誘導し、更に 10 倍より多くその
活性を増加させた。これらの結果から、S6K1, SGK1 及びΔPH-PKBαにとって自
己の T ループモチーフが有効に PDK1 によりリン酸化された状態になるには、
自己の疎水性モチーフを必要とすることが証明される。
及び疎水性モチーフ突然変異体を発現させ、更に、適切なホスホ特異性 (phosph
o-specific) 抗体を用い IGF1 による細胞刺激の前後でのこれら酵素の T ルー
プ部位のリン酸化を測定した。野生型キナーゼがリン酸化された状態になったに
もかかわらず、細胞の IGF1 刺激により、S6K1[F411A], SGK1[F421A] 及びΔPH-
PKBα[F472A] の T ループ残基のリン酸化は誘導されなかった (図２１Ｄ及び２
１Ｅ) 。S6K1[F411A] 及び SGK1[F421A] は、また、IGF1 刺激に引き続いて著し
くは活性化されなかったが、これら酵素の自己の T ループ残基がリン酸化され
ないことに一致する (データは示さない) 。対称的に、PKBα[F472A] は、IGF1
に応答して野生型PKBαと同程度にリン酸化された (図１８Ｆ) 。PKBα[F472A]
は、刺激されていない細胞において野生型 PKBαの基礎活性の ~50 ％を保持し
たが、その活性は、Thr308 をリン酸化したにもかかわらず IGF1 刺激に引き続
いて更には増加しなかった (データは示さない) 。平行実験において、IGF1 は
、野生型PKBαの Thr308 と同等のリン酸化を誘導し、更に 10 倍より多くその
活性を増加させた。これらの結果から、S6K1, SGK1 及びΔPH-PKBαにとって自
己の T ループモチーフが有効に PDK1 によりリン酸化された状態になるには、
自己の疎水性モチーフを必要とすることが証明される。
【０２４１】
S6K1, SGK1 の活性化に係る PDK1「PIF-ポケット」での Lys115, Ile119 及び
Gln150 の役割。Leu155に加えて、PDK1 に係る PIF 結合ポケット部分を構成す
ると予測された残基、すなわち Lys115, Ile119 及び Gln150 が他にも存在する
[17] 。PDK1[L155A] (未公開データ) に加えて PDK1[K115A], PDK1[I119A], PD
K1[Q150A] [] は、PIF 結合ポケットと相互作用しないペプチド基質に対して活
性を維持し触媒機能は害されないが、PIFtide が原因でアフィニティーが 10 倍
減少する。PDK1[K115A], PDK1[I119A], PDK1[Q150A] 及び PDK1[L155A] が S6K1
[412E] を活性化する速度は、野生型PDK1より少しだけ減少した。対称的に、PDK
1 のこれら突然変異体が SGK1[T422D] を活性化する速度は著しく減少したが、
これは、PDK1 が S6K1[T412E] よりも SGK1[T422D] をリン酸化するということ
に関与しては、Lys115, Ile119 及び Gln150 が最も優れた役割を担う可能性が
あることを示している。PIFtide が原因で PDK1 のこれら突然変異体のアフィニ
ティーが減少することに一致して、低濃度の PIFtide (2 μM) は ~50 ％だけ S
6K1-T2[T412E] 及び SGK1[T422D] の活性化を阻害し、高濃度の PIF tide (35
μM) は 95 ％を上回ってこれら酵素を阻害するのに必要とされた。同じ条件下
で、2 μM PIFtide は、野生型による S6K1[T412E] の活性化を 20 倍を上回っ
て阻害した。
ると予測された残基、すなわち Lys115, Ile119 及び Gln150 が他にも存在する
[17] 。PDK1[L155A] (未公開データ) に加えて PDK1[K115A], PDK1[I119A], PD
K1[Q150A] [] は、PIF 結合ポケットと相互作用しないペプチド基質に対して活
性を維持し触媒機能は害されないが、PIFtide が原因でアフィニティーが 10 倍
減少する。PDK1[K115A], PDK1[I119A], PDK1[Q150A] 及び PDK1[L155A] が S6K1
[412E] を活性化する速度は、野生型PDK1より少しだけ減少した。対称的に、PDK
1 のこれら突然変異体が SGK1[T422D] を活性化する速度は著しく減少したが、
これは、PDK1 が S6K1[T412E] よりも SGK1[T422D] をリン酸化するということ
に関与しては、Lys115, Ile119 及び Gln150 が最も優れた役割を担う可能性が
あることを示している。PIFtide が原因で PDK1 のこれら突然変異体のアフィニ
ティーが減少することに一致して、低濃度の PIFtide (2 μM) は ~50 ％だけ S
6K1-T2[T412E] 及び SGK1[T422D] の活性化を阻害し、高濃度の PIF tide (35
μM) は 95 ％を上回ってこれら酵素を阻害するのに必要とされた。同じ条件下
で、2 μM PIFtide は、野生型による S6K1[T412E] の活性化を 20 倍を上回っ
て阻害した。
【０２４２】
S6K1 及び SGK1 の PDK1 との相互作用。完全長 S6K1 は、自己の調節ドメイ
ンにおいて C 末端の 104 個のアミノ酸を欠く S6K1 に比較して PDK1 には劣等
な基質となる [15, 27] 。我々は、それ故、完全長S6K1はPDK1と相互作用できな
いことでこのことが説明されるかをテストした。この仮説をテストするため、我
々は、293 細胞において完全長 S6K1， 完全長 S6K1[T412E] 及びフラグ抗原タ
グ (Flag epitope tags) を有する C 末端切断型突然変異体 (S6K1-T2 及び S6K
1-T2[T412E]) を共発現させた。これら抽出物由来の GST-PDK1 のグルタチオン
セファロース「プルダウン (pull-downs) 」をフラグ抗原タグ S6K1 が存在する
間に免疫ブロットした (immunoblotted) 。GST-PDK1 並びに S6K1 の野生型及び
突然変異体型を同じレベルで発現させたが、完全長 S6K1 及び完全長 S6K1[T412
E] は GST-PDK1 と相互作用せず、一方、S6K1-T2 及び S6K1-T2[T412E] は両方
とも GST-PDK1 と相互作用した。S6K1-T2[T412E] は、S6K1-T2 に比較して好適
に GST-PDK1 と相互作用した。同じ条件下で、我々は、GST-PDK1[L155E] と S6K
1-T2 及び S6K1-T2[T412E] との間の相互作用を検出できなかったが、これは、P
DK1 が PIF 結合ポケットを介して S6K1-T2 と相互作用することを示す。
ンにおいて C 末端の 104 個のアミノ酸を欠く S6K1 に比較して PDK1 には劣等
な基質となる [15, 27] 。我々は、それ故、完全長S6K1はPDK1と相互作用できな
いことでこのことが説明されるかをテストした。この仮説をテストするため、我
々は、293 細胞において完全長 S6K1， 完全長 S6K1[T412E] 及びフラグ抗原タ
グ (Flag epitope tags) を有する C 末端切断型突然変異体 (S6K1-T2 及び S6K
1-T2[T412E]) を共発現させた。これら抽出物由来の GST-PDK1 のグルタチオン
セファロース「プルダウン (pull-downs) 」をフラグ抗原タグ S6K1 が存在する
間に免疫ブロットした (immunoblotted) 。GST-PDK1 並びに S6K1 の野生型及び
突然変異体型を同じレベルで発現させたが、完全長 S6K1 及び完全長 S6K1[T412
E] は GST-PDK1 と相互作用せず、一方、S6K1-T2 及び S6K1-T2[T412E] は両方
とも GST-PDK1 と相互作用した。S6K1-T2[T412E] は、S6K1-T2 に比較して好適
に GST-PDK1 と相互作用した。同じ条件下で、我々は、GST-PDK1[L155E] と S6K
1-T2 及び S6K1-T2[T412E] との間の相互作用を検出できなかったが、これは、P
DK1 が PIF 結合ポケットを介して S6K1-T2 と相互作用することを示す。
【０２４３】
野生型 SGK1 は、SGK1[T422D] よりも 10 倍遅い速度でリン酸化される (表３
及び[9]) 。我々は、それ故、このことが、PDK1に対する野生型SGK1 及び SGK1[
T422D] のアフィニティーの違いによって説明されるかどうかテストした。これ
を調査するため、293 細胞において Myc-PDK1 とともに GST-SGK1 及び GST-SGK
1[T422D] を共発現させた。GST-SGK1 のグルタチオンセファロース「プルダウン
(pull-downs) 」をMyc-PDK1が存在する間に免疫ブロットした。図２０Ｂに示す
通り、Myc-PDK1は、SGK1[T422D] とだけ相互作用し、野生型 SGK1 とは相互作用
しなかった。予想通り、SGK1[T422D] は Myc-PDK1[L155E] と相互作用しなかっ
た。
及び[9]) 。我々は、それ故、このことが、PDK1に対する野生型SGK1 及び SGK1[
T422D] のアフィニティーの違いによって説明されるかどうかテストした。これ
を調査するため、293 細胞において Myc-PDK1 とともに GST-SGK1 及び GST-SGK
1[T422D] を共発現させた。GST-SGK1 のグルタチオンセファロース「プルダウン
(pull-downs) 」をMyc-PDK1が存在する間に免疫ブロットした。図２０Ｂに示す
通り、Myc-PDK1は、SGK1[T422D] とだけ相互作用し、野生型 SGK1 とは相互作用
しなかった。予想通り、SGK1[T422D] は Myc-PDK1[L155E] と相互作用しなかっ
た。
【０２４４】
考察
本実施例で示した結果から、S6K1 及び SGK1 の疎水性モチーフは、PDK1 の PIF
結合ポケットと結合する PDK1 ドッキング (docking) 部位として機能すること
が示唆される。これにより、S6K1 及び SGK1 に PDK1 が補充され、これら酵素
は、PDK1 に自己の T ループ部位をリン酸化させることを可能にする。この結論
は、PIF 結合ポケットを崩壊させた PDK1 の突然変異体 (PDK1[L155E]) が、S6K
1 又は SGK1 をリン酸化できず (図１８)、更に疎水性モチーフを崩壊させた S6
K1 及び SGK1 の突然変異体が、野生型 PDK1 によりリン酸化されない (図１９)
という発見から支持される。これら観測から、PIFtide が S6K1 及び SGK1 の
リン酸化を阻害する (図２０) のは、PIFtide が PDK1 の PIF 結合ポケットと
相互作用しこれにより PDK1 が S6K1 及び SGK1 に結合するのを妨げるためと説
明される。概して、これらの結果は更なる証拠を提供する。つまり、AGC キナー
ゼ (PKBを除く) は、自己の C 末端非触媒 (non-catalytic) 残基を介して PDK1
の PIF 結合ポケットと相互作用する。これら相互作用は、PDK1 の基質への接
近 (access) を調節するのに重要な役割を担うだろう。
結合ポケットと結合する PDK1 ドッキング (docking) 部位として機能すること
が示唆される。これにより、S6K1 及び SGK1 に PDK1 が補充され、これら酵素
は、PDK1 に自己の T ループ部位をリン酸化させることを可能にする。この結論
は、PIF 結合ポケットを崩壊させた PDK1 の突然変異体 (PDK1[L155E]) が、S6K
1 又は SGK1 をリン酸化できず (図１８)、更に疎水性モチーフを崩壊させた S6
K1 及び SGK1 の突然変異体が、野生型 PDK1 によりリン酸化されない (図１９)
という発見から支持される。これら観測から、PIFtide が S6K1 及び SGK1 の
リン酸化を阻害する (図２０) のは、PIFtide が PDK1 の PIF 結合ポケットと
相互作用しこれにより PDK1 が S6K1 及び SGK1 に結合するのを妨げるためと説
明される。概して、これらの結果は更なる証拠を提供する。つまり、AGC キナー
ゼ (PKBを除く) は、自己の C 末端非触媒 (non-catalytic) 残基を介して PDK1
の PIF 結合ポケットと相互作用する。これら相互作用は、PDK1 の基質への接
近 (access) を調節するのに重要な役割を担うだろう。
【０２４５】
S6K1 は、活性化されるのに T ループ及び疎水性モチーフの両方のリン酸化を
必要とし [6]、従って、PDK1 による S6K1 の T ループのリン酸化だけでは、著
しく自己を活性化しない。インビボおいて五つの Ser-Pro/Thr-Pro リン酸化部
位を取り巻く C 末端の 104 個の残基を欠く S6K1 の突然変異体に比較して、完
全長 S6K1 は PDK1 に対してとても劣等 (poor) な基質となる [15, 27] 。我々
は、完全長 S6K1 又は S6K1[T412E] と PDK1 との間の相互作用を検出できなか
ったが、疎水性モチーフリン酸化部位 (Thr412) 及び五つのリン酸化 C 末端残
基全てを酸性残基に突然変異させた完全長 S6K1 突然変異体は、PDK1 には結合
でき PDK1[L155E] には結合できなかった。
必要とし [6]、従って、PDK1 による S6K1 の T ループのリン酸化だけでは、著
しく自己を活性化しない。インビボおいて五つの Ser-Pro/Thr-Pro リン酸化部
位を取り巻く C 末端の 104 個の残基を欠く S6K1 の突然変異体に比較して、完
全長 S6K1 は PDK1 に対してとても劣等 (poor) な基質となる [15, 27] 。我々
は、完全長 S6K1 又は S6K1[T412E] と PDK1 との間の相互作用を検出できなか
ったが、疎水性モチーフリン酸化部位 (Thr412) 及び五つのリン酸化 C 末端残
基全てを酸性残基に突然変異させた完全長 S6K1 突然変異体は、PDK1 には結合
でき PDK1[L155E] には結合できなかった。
【０２４６】
S6K1 のうち C 末端の 104 個の残基を除去すると、S6K1-T2 及び S6K1-T2[T4
12E] は、PDK1 と相互作用し PDK1[L155E] とは相互作用しない。S6K1-T2[T412E
] は、S6K1-T2 よりも 5 倍速い初期速度で PDK1 によりリン酸化される。これ
は、S6K1-T2[T412E] が S6K1-T2 よりも高いアフィニティーを有した状態で PDK
1 に相互作用したという我々の先の研究 [25] に一致する。これらの発見から、
第一工程がプロリンダイレクトキナーゼ (proline directed kinase) による C
末端 Ser-Pro/Thr-Pro のリン酸化と関与する S6K1 活性化モデルが提案される
。これは、S6K1 を直接活性化するものではないが、PDK1 の PIF 結合ポケット
と相互作用できるように S6K1 に対して自己の疎水性モチーフを露出するコンホ
メーション変化を誘導し、PDK1 に S6K1 の T ループ残基をリン酸化させるとい
うものである。これは、細胞のインスリン刺激に応答して S6K1 の C 末端の Se
r-Pro/Thr-Pro がリン酸化された状態となり、それから T ループ及び疎水性モ
チーフのリン酸化が起こるという発見に一致する [6, 23] 。PDK1 の S6K1 との
相互作用は、S6K1 が自己の疎水性モチーフでリン酸化されると更に増強される
だろう。しかしながら、これは、T ループリン酸化には必須ではないだろう。何
故なら、野生型 S6K1 は、自己の T ループでほとんどリン酸化されないにもか
かわらず、Thr412 を Ala に変異させた S6K1 の突然変異体は、自己の T ルー
プでなおもリン酸化される [23] からである。
12E] は、PDK1 と相互作用し PDK1[L155E] とは相互作用しない。S6K1-T2[T412E
] は、S6K1-T2 よりも 5 倍速い初期速度で PDK1 によりリン酸化される。これ
は、S6K1-T2[T412E] が S6K1-T2 よりも高いアフィニティーを有した状態で PDK
1 に相互作用したという我々の先の研究 [25] に一致する。これらの発見から、
第一工程がプロリンダイレクトキナーゼ (proline directed kinase) による C
末端 Ser-Pro/Thr-Pro のリン酸化と関与する S6K1 活性化モデルが提案される
。これは、S6K1 を直接活性化するものではないが、PDK1 の PIF 結合ポケット
と相互作用できるように S6K1 に対して自己の疎水性モチーフを露出するコンホ
メーション変化を誘導し、PDK1 に S6K1 の T ループ残基をリン酸化させるとい
うものである。これは、細胞のインスリン刺激に応答して S6K1 の C 末端の Se
r-Pro/Thr-Pro がリン酸化された状態となり、それから T ループ及び疎水性モ
チーフのリン酸化が起こるという発見に一致する [6, 23] 。PDK1 の S6K1 との
相互作用は、S6K1 が自己の疎水性モチーフでリン酸化されると更に増強される
だろう。しかしながら、これは、T ループリン酸化には必須ではないだろう。何
故なら、野生型 S6K1 は、自己の T ループでほとんどリン酸化されないにもか
かわらず、Thr412 を Ala に変異させた S6K1 の突然変異体は、自己の T ルー
プでなおもリン酸化される [23] からである。
【０２４７】
S6K1同様、SGK1 も細胞において活性化されるには、自己の T ループ及び疎水
性モチーフの両方のリン酸化を必要とするが、SGK1 は、自己の疎水性モチーフ
の後には Ser-Pro/Thr-Pro モチーフでリン酸化された状態になる C 末端尾部 (
tail) を保持していない。自己の疎水性モチーフ (Thr422) でリン酸化されなか
った野生型 SGK1 は、PDK1 には劣等な (poor) 基質であり、Thr412 を酸性残基
に変えた突然変異体は、PDK1 によりリン酸化された状態になる速度を 10 倍増
加させる (表３及び [9] ) 。更に、SGK1[T422D] を刺激されていない 293 細胞
で発現させると、野生型 SGK1 とは異なり、SGK1[T422D] は、自己の T ループ
残基 (Thr256) で著しくリン酸化される [8, 9] 。野生型 PDK1 と SGK1 との間
の相互作用を検出できなかった (図２１) のとは対称的に、SGK1[T422D] が PDK
1 と (PDK1[L155E]とではない) 相互作用するという発見は、Kobayashi & Cohen
[9] の結論と一致する。Kobayashi & Cohen [9] は、自己の疎水性モチーフで
の SGK1 リン酸化が、自己の T ループ残基での SGK1 リン酸化を調節するのに
重要な役割を担うと報告している。これに一致して、疎水性モチーフリン酸化部
位 (THr422) を Ala に変えた SGK1 の突然変異体は、IGF1 刺激に引き続いて自
己の T ループリン酸化部位 (THr256) がリン酸化された状態とはならないが、T
422 を Asp に変えた場合には SGK1 は刺激されていない細胞において Thr256
がリン酸化される。
性モチーフの両方のリン酸化を必要とするが、SGK1 は、自己の疎水性モチーフ
の後には Ser-Pro/Thr-Pro モチーフでリン酸化された状態になる C 末端尾部 (
tail) を保持していない。自己の疎水性モチーフ (Thr422) でリン酸化されなか
った野生型 SGK1 は、PDK1 には劣等な (poor) 基質であり、Thr412 を酸性残基
に変えた突然変異体は、PDK1 によりリン酸化された状態になる速度を 10 倍増
加させる (表３及び [9] ) 。更に、SGK1[T422D] を刺激されていない 293 細胞
で発現させると、野生型 SGK1 とは異なり、SGK1[T422D] は、自己の T ループ
残基 (Thr256) で著しくリン酸化される [8, 9] 。野生型 PDK1 と SGK1 との間
の相互作用を検出できなかった (図２１) のとは対称的に、SGK1[T422D] が PDK
1 と (PDK1[L155E]とではない) 相互作用するという発見は、Kobayashi & Cohen
[9] の結論と一致する。Kobayashi & Cohen [9] は、自己の疎水性モチーフで
の SGK1 リン酸化が、自己の T ループ残基での SGK1 リン酸化を調節するのに
重要な役割を担うと報告している。これに一致して、疎水性モチーフリン酸化部
位 (THr422) を Ala に変えた SGK1 の突然変異体は、IGF1 刺激に引き続いて自
己の T ループリン酸化部位 (THr256) がリン酸化された状態とはならないが、T
422 を Asp に変えた場合には SGK1 は刺激されていない細胞において Thr256
がリン酸化される。
【０２４８】
S6K1 及び SGK1 の活性化は、インビボにおいては PI 3キナーゼに依存するけ
れども、PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 がどのようにしてこのプロセスを調節
しているかは明らかにされていない。インビトロでの PDK1 による S6K1 及び S
GK1 のリン酸化は、PDK1 の PH ドメインと相互作用する PtdIns(3,4,5)P3/PtdI
ns(3,4)P2 の存在によっては増強されない。これは、PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3
,4)P2への PDK1 の結合によってこれら酵素は直接活性化しない可能性があるこ
とを示している。PDK1の活性を調節する代わりに、PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4
)P2 は、S6K1 及び SGK1 の疎水性モチーフをリン酸化するキナーゼ並びに／又
は S6K1 の C 末端尾部 (tail) をリン酸化するプロリンダイレクトキナーゼの
活性化を誘導するかもしれない。このメカニズムがインビボで操作したなら、S6
K1 又は SGK1が自己の疎水性モチーフ／ C 末端尾部でリン酸化されるまで、PDK
1 はこれら酵素をリン酸化できないだろうから、細胞での PDK1 活性は、インス
リン又は成長因子によって活性化される必要は無いだろう。
れども、PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 がどのようにしてこのプロセスを調節
しているかは明らかにされていない。インビトロでの PDK1 による S6K1 及び S
GK1 のリン酸化は、PDK1 の PH ドメインと相互作用する PtdIns(3,4,5)P3/PtdI
ns(3,4)P2 の存在によっては増強されない。これは、PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3
,4)P2への PDK1 の結合によってこれら酵素は直接活性化しない可能性があるこ
とを示している。PDK1の活性を調節する代わりに、PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4
)P2 は、S6K1 及び SGK1 の疎水性モチーフをリン酸化するキナーゼ並びに／又
は S6K1 の C 末端尾部 (tail) をリン酸化するプロリンダイレクトキナーゼの
活性化を誘導するかもしれない。このメカニズムがインビボで操作したなら、S6
K1 又は SGK1が自己の疎水性モチーフ／ C 末端尾部でリン酸化されるまで、PDK
1 はこれら酵素をリン酸化できないだろうから、細胞での PDK1 活性は、インス
リン又は成長因子によって活性化される必要は無いだろう。
【０２４９】
PDK1 が PKB を活性化するのには PDK1 の PIF 結合ポケットは必要とされず
、そしてまた、PKB が自己の T ループでリン酸化されるのにも PKB の疎水性モ
チーフは必要とされないという本研究の発見は、PDK1 及び PKB の PtdIns(3,4,
5)P3/PtdIns(3,4)P2 への結合が、おそらくこれら分子を集めるための一次決定
要素になる [14] という先の研究の結論を支持する。これは、更に、PI 3- キナ
ーゼの活性化同様、PKB の活性化が細胞で迅速に起こる、例えば PtdIns(3,4,5)
P3/PtdIns(3,4)P2 形成後すぐに PKB の活性化が起こるという発見によって支持
される。一方、S6K1 (及び SGK1) の活性化は、PKB よりも非常にゆっくり起こ
ることから、PI 3- キナーゼの活性化と S6K1 及び SGK1 の活性化との間に実質
的な遅延 (a substantial delay) が存在する。この遅延は、細胞でのキナーゼ
活性の律速段階 (the rate limiting step) となるであろう、PtdIns(3,4,5)P3/
PtdIns(3,4)P2 が S6K1-C- 末端 Ser-Pro/Thr-Pro キナーゼ及び S6K1/SGK1 疎
水性モチーフキナーゼを活性化するのにかかる時間によって説明されるであろう
。Ser473 を Ala 又は Asp のどちらかに変えた突然変異体が、PKBαの Thr308
のインスリン/IGF1 誘導リン酸化について何一つ有効性を持たなかった [24] よ
うに、PKBαの Ser473のリン酸化がThr308のリン酸化を促進するという証拠は何
処にも無い。PDK1 が PIF 結合ポケット以外のドメインを介して PKBαと相互作
用し、更に PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 への PKB 及び／又は PDK1 の結合
がこの結合ポケットを露出するということは、認められないわけではない。実際
に、PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 への PKB の結合が、Thr308 リン酸化部位
の露出、ひょっとしたら Ser473 リン酸化部位の露出をも導出する (leading)
コンホメーション変化を誘導する可能性がある [14] という証拠も存する。VanO
bberghen 及び同僚は、また、PDK1 の PH ドメインが PKBαのリン酸化を阻害す
ると結論付けている [28] 。これは、PH ドメインを欠くか又は PtdIns(3,4,5)P 3 と相互作用できない PH を保持する PDK1 突然変異体が、野生型 PDK1 よりも
、共トランスフェクション実験においてΔPH-PKBαを活性化するのにとても有効
だったという発見に基づく。ここで観測されたインビボでの有効性はおそらくも
っと複雑であるだろうと気付くべきだが、ΔPH-PDK1 及び野生型 PDK1 がΔPH-P
KBαをリン酸化する速度は、インビトロにおいて同じである [22,29] 。
、そしてまた、PKB が自己の T ループでリン酸化されるのにも PKB の疎水性モ
チーフは必要とされないという本研究の発見は、PDK1 及び PKB の PtdIns(3,4,
5)P3/PtdIns(3,4)P2 への結合が、おそらくこれら分子を集めるための一次決定
要素になる [14] という先の研究の結論を支持する。これは、更に、PI 3- キナ
ーゼの活性化同様、PKB の活性化が細胞で迅速に起こる、例えば PtdIns(3,4,5)
P3/PtdIns(3,4)P2 形成後すぐに PKB の活性化が起こるという発見によって支持
される。一方、S6K1 (及び SGK1) の活性化は、PKB よりも非常にゆっくり起こ
ることから、PI 3- キナーゼの活性化と S6K1 及び SGK1 の活性化との間に実質
的な遅延 (a substantial delay) が存在する。この遅延は、細胞でのキナーゼ
活性の律速段階 (the rate limiting step) となるであろう、PtdIns(3,4,5)P3/
PtdIns(3,4)P2 が S6K1-C- 末端 Ser-Pro/Thr-Pro キナーゼ及び S6K1/SGK1 疎
水性モチーフキナーゼを活性化するのにかかる時間によって説明されるであろう
。Ser473 を Ala 又は Asp のどちらかに変えた突然変異体が、PKBαの Thr308
のインスリン/IGF1 誘導リン酸化について何一つ有効性を持たなかった [24] よ
うに、PKBαの Ser473のリン酸化がThr308のリン酸化を促進するという証拠は何
処にも無い。PDK1 が PIF 結合ポケット以外のドメインを介して PKBαと相互作
用し、更に PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 への PKB 及び／又は PDK1 の結合
がこの結合ポケットを露出するということは、認められないわけではない。実際
に、PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 への PKB の結合が、Thr308 リン酸化部位
の露出、ひょっとしたら Ser473 リン酸化部位の露出をも導出する (leading)
コンホメーション変化を誘導する可能性がある [14] という証拠も存する。VanO
bberghen 及び同僚は、また、PDK1 の PH ドメインが PKBαのリン酸化を阻害す
ると結論付けている [28] 。これは、PH ドメインを欠くか又は PtdIns(3,4,5)P 3 と相互作用できない PH を保持する PDK1 突然変異体が、野生型 PDK1 よりも
、共トランスフェクション実験においてΔPH-PKBαを活性化するのにとても有効
だったという発見に基づく。ここで観測されたインビボでの有効性はおそらくも
っと複雑であるだろうと気付くべきだが、ΔPH-PDK1 及び野生型 PDK1 がΔPH-P
KBαをリン酸化する速度は、インビトロにおいて同じである [22,29] 。
【０２５０】
ΔPH-PKBαは、293 細胞で発現したとき、インスリンに応答して Thr308 及び
Ser473 でリン酸化され、これは、PI 3- キナーゼの阻害剤により妨げられる [
30, 31] 。この観測は、元来、PDK1 及び Ser473 をリン酸化する酵素が PtdIns
(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 によってインビボで活性化されたものとして解釈され
た。しかしながら、本研究において、我々は、ΔPH-PKBαが PDK1[L155E] によ
ってリン酸化されず、更にΔPH-PKBαの疎水性モチーフを崩壊すると PDK1 によ
るΔPH-PKBαのリン酸化が大きく妨げられた (図１８〜１９) ことから、ΔPH-P
KBαは、野生型 PKBαと同じメカニズムでは PDK1 によりリン酸化されないとい
うことを証明している。従って、PDK1がΔPH-PKBαをリン酸化するメカニズムは
、PKBαよりも S6K1 及び SGK1 により類似している。ΔPH-PKBαにおいて Ser4
73 を Asp に変えた突然変異体は、PDK1 によりリン酸化される速度が増加する
(表３) ので、ΔPH-PKBαを細胞で発現したとき、PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)
P2 は、PDK1 を活性化するのではなく、代わりに S6K1 及び SGK1 をリン酸化す
るのと同じ疎水性モチーフキナーゼを介して Ser473 のリン酸化を誘導し、その
後ΔPH-PKBαを PDK1 基質に変換することが可能となる。
30, 31] 。この観測は、元来、PDK1 及び Ser473 をリン酸化する酵素が PtdIns
(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)P2 によってインビボで活性化されたものとして解釈され
た。しかしながら、本研究において、我々は、ΔPH-PKBαが PDK1[L155E] によ
ってリン酸化されず、更にΔPH-PKBαの疎水性モチーフを崩壊すると PDK1 によ
るΔPH-PKBαのリン酸化が大きく妨げられた (図１８〜１９) ことから、ΔPH-P
KBαは、野生型 PKBαと同じメカニズムでは PDK1 によりリン酸化されないとい
うことを証明している。従って、PDK1がΔPH-PKBαをリン酸化するメカニズムは
、PKBαよりも S6K1 及び SGK1 により類似している。ΔPH-PKBαにおいて Ser4
73 を Asp に変えた突然変異体は、PDK1 によりリン酸化される速度が増加する
(表３) ので、ΔPH-PKBαを細胞で発現したとき、PtdIns(3,4,5)P3/PtdIns(3,4)
P2 は、PDK1 を活性化するのではなく、代わりに S6K1 及び SGK1 をリン酸化す
るのと同じ疎水性モチーフキナーゼを介して Ser473 のリン酸化を誘導し、その
後ΔPH-PKBαを PDK1 基質に変換することが可能となる。
【０２５１】
PtdIns(3,4,5)P3が存在しても存在しなくてもΔPH-PKBαは、PDK1 によりリン
酸化されるが、PtdIns(3,4,5)P3 存在下で、ΔPH-PKBαは、野生型 PKBαよりも
~50 倍遅い速度で PDK1 によりリン酸化されるということは重要視すべきであ
る。更に、インビトロで、ΔPH-PKBαは、SGK1 及び S6K1 よりも 10-100 倍遅
い速度で PDK1 によりリン酸化される (表３) 。これは、疎水性モチーフ周辺の
ΔPH-PKBαの C 末端領域が、PDK1 に対して S6K1 及び SGK1 の同等領域よりも
著しく小さいアフィニティーを有した状態で相互作用したかどうかで説明される
だろう。S6K1 及び SGK1 のこの領域は、これら酵素を PDK1 に結合させる可能
性がある。しかしながら、PKB の同等残基は、PDK1 の PIF 結合ポケットとは結
合させずに、別のメカニズムにより PKB を調節することを可能にしているかも
しれない。
酸化されるが、PtdIns(3,4,5)P3 存在下で、ΔPH-PKBαは、野生型 PKBαよりも
~50 倍遅い速度で PDK1 によりリン酸化されるということは重要視すべきであ
る。更に、インビトロで、ΔPH-PKBαは、SGK1 及び S6K1 よりも 10-100 倍遅
い速度で PDK1 によりリン酸化される (表３) 。これは、疎水性モチーフ周辺の
ΔPH-PKBαの C 末端領域が、PDK1 に対して S6K1 及び SGK1 の同等領域よりも
著しく小さいアフィニティーを有した状態で相互作用したかどうかで説明される
だろう。S6K1 及び SGK1 のこの領域は、これら酵素を PDK1 に結合させる可能
性がある。しかしながら、PKB の同等残基は、PDK1 の PIF 結合ポケットとは結
合させずに、別のメカニズムにより PKB を調節することを可能にしているかも
しれない。
【０２５２】
S6K1, SGK1 及び PKB と違って、PKCζ及び PRK2 を刺激されていない 293 細
胞で発現すると、これらは、高化学量論をもって自己の T ループでリン酸化さ
れるが、これらキナーゼは、細胞から単離されるとインビトロでは PDK1 により
更にはリン酸化されない。我々は、また、PRK2 及び PKCζが、自己の疎水性モ
チーフを介して PDK1 の PIF 結合ポケットに直接相互作用することを証明した
[18] 。これらの観測は、S6K1, SGK1 及び PKB とは対称的に、PKCζ又は PRK2
が刺激されていない細胞で過剰発現すると、これらの疎水性モチーフが、内因性
PDK1 と直接相互作用することができ、その結果、これらの T ループがリン酸
化された状態になると暗示している。しかしながら、内因的に発現した PKCζ及
び PRK2 の T ループ残基のリン酸化は、おそらく細胞中でいくつかの調節下に
存することになるだろう。Parker 及び同僚は、GTP に複合化した低分子 GTP 結
合プロテイン Rho (small GTP binding protein Rho) との PRK2 の相互作用が
、PRK2 の PDK1 との相互作用を促進し、PRK2 の T ループ残基のリン酸化を高
めるという証拠を示している [32] 。PKCζの場合、どのように自己の T ループ
のリン酸化が調節されているか明らかにされていない。PKCζは、細胞中でイン
スリン及び成長因子により活性化され、これらアゴニストが PKCζの T ループ
残基のリン酸化を誘導するという報告がいくつか存在するが、我々は、これまで
のところ、293 細胞中での内因性PKCζ又はトランスフェクトされた PKCζのど
ちらかの如何なる活性化をも証明できていない。刺激されていないマウス胚性幹
細胞 (unstimulated mouse embryonic stem cells) において、PKCζは、自己の
T ループ残基で著しくリン酸化されるが、これは、IGF1 刺激によっても又は我
々が試用した他のアゴニストのいずれによっても更に増大することはない [33]
。PDK1を欠くマウス胚性幹細胞において、PKCζは自己の T ループ残基でリン酸
化されないが、これは、PDK1 がインビボで PKCζのリン酸化を仲介するという
遺伝的証拠を提供するものである [33] 。最近の研究から、細胞中のPKCζを hP
ar3 及び hPar6 と称する他のプロテインに複合化すると、この複合体における
hPar6 は低分子 GTP 結合プロテイン Rac 及び CDC42 と相互作用できることが
証明されている ([34]論評) 。この証拠は、これらプロテインが、PKCζの活性
を調節するのに重要な役割を担うことを示している。しかしながら、hPar3/hPar
6/CDC42/Rac1 が、PDK1 のPKCζリン酸化を調節することによって機能するかど
うかは未だ調査されてはいない。この複合体は、特異的シグナルに応答して PDK
1 相互作用を行う PKCζの疎水性モチーフの接近 (access) をコントロールする
ことで作用するだろう。例えば、この複合体に対して Rac/CDC42 が結合すると
、PDK1 は、PKCζと相互作用しPKCζをリン酸化する。
胞で発現すると、これらは、高化学量論をもって自己の T ループでリン酸化さ
れるが、これらキナーゼは、細胞から単離されるとインビトロでは PDK1 により
更にはリン酸化されない。我々は、また、PRK2 及び PKCζが、自己の疎水性モ
チーフを介して PDK1 の PIF 結合ポケットに直接相互作用することを証明した
[18] 。これらの観測は、S6K1, SGK1 及び PKB とは対称的に、PKCζ又は PRK2
が刺激されていない細胞で過剰発現すると、これらの疎水性モチーフが、内因性
PDK1 と直接相互作用することができ、その結果、これらの T ループがリン酸
化された状態になると暗示している。しかしながら、内因的に発現した PKCζ及
び PRK2 の T ループ残基のリン酸化は、おそらく細胞中でいくつかの調節下に
存することになるだろう。Parker 及び同僚は、GTP に複合化した低分子 GTP 結
合プロテイン Rho (small GTP binding protein Rho) との PRK2 の相互作用が
、PRK2 の PDK1 との相互作用を促進し、PRK2 の T ループ残基のリン酸化を高
めるという証拠を示している [32] 。PKCζの場合、どのように自己の T ループ
のリン酸化が調節されているか明らかにされていない。PKCζは、細胞中でイン
スリン及び成長因子により活性化され、これらアゴニストが PKCζの T ループ
残基のリン酸化を誘導するという報告がいくつか存在するが、我々は、これまで
のところ、293 細胞中での内因性PKCζ又はトランスフェクトされた PKCζのど
ちらかの如何なる活性化をも証明できていない。刺激されていないマウス胚性幹
細胞 (unstimulated mouse embryonic stem cells) において、PKCζは、自己の
T ループ残基で著しくリン酸化されるが、これは、IGF1 刺激によっても又は我
々が試用した他のアゴニストのいずれによっても更に増大することはない [33]
。PDK1を欠くマウス胚性幹細胞において、PKCζは自己の T ループ残基でリン酸
化されないが、これは、PDK1 がインビボで PKCζのリン酸化を仲介するという
遺伝的証拠を提供するものである [33] 。最近の研究から、細胞中のPKCζを hP
ar3 及び hPar6 と称する他のプロテインに複合化すると、この複合体における
hPar6 は低分子 GTP 結合プロテイン Rac 及び CDC42 と相互作用できることが
証明されている ([34]論評) 。この証拠は、これらプロテインが、PKCζの活性
を調節するのに重要な役割を担うことを示している。しかしながら、hPar3/hPar
6/CDC42/Rac1 が、PDK1 のPKCζリン酸化を調節することによって機能するかど
うかは未だ調査されてはいない。この複合体は、特異的シグナルに応答して PDK
1 相互作用を行う PKCζの疎水性モチーフの接近 (access) をコントロールする
ことで作用するだろう。例えば、この複合体に対して Rac/CDC42 が結合すると
、PDK1 は、PKCζと相互作用しPKCζをリン酸化する。
【０２５３】
図２２で我々が提案するモデルは、PKB を除いてこれまで同定されている PDK
1 基質のリン酸化のキーステップを例証するものである。なお、それら基質のリ
ン酸化は、自己の疎水性モチーフと PDK1 の PIF 結合ポケットとの直接的な相
互作用により調節されている。また、PKB 及び PDK1 は、その代わりに、PtdIns
(3,4,5)P3 との相互作用により主に集められる。PRK2 及び PKCζは、293 細胞
で過剰発現すると PDK1 と直接相互作用するが、S6K1 及び SGK1 の相互作用は
、これら酵素の C 末端残基のリン酸化により調節される。このモデルは、IGF1
/ 成長因子刺激細胞でのS6K1, SGK1 及び PKB 活性化の時間経過の違いを説明す
るだろう。これら発見から、プロテインキナーゼに係る特異的非触媒部位に向け
たドラッグは、おそらく一つのグループの基質のリン酸化を阻害し、他のグルー
プの基質には影響を与えないということが示される。従って、PDK1 に係る PIF
結合ポケットと相互作用する化合物は、S6K1 及び SGK1 の活性化には影響を与
え PKB の活性化には影響を与えないだろうし、更に、全下流標的のリン酸化を
阻害する ATP 競合 PDK1 阻害剤よりもより特異的であろう。従って、このよう
なドラッグは、おそらく副作用をほとんど有さないだろう。
1 基質のリン酸化のキーステップを例証するものである。なお、それら基質のリ
ン酸化は、自己の疎水性モチーフと PDK1 の PIF 結合ポケットとの直接的な相
互作用により調節されている。また、PKB 及び PDK1 は、その代わりに、PtdIns
(3,4,5)P3 との相互作用により主に集められる。PRK2 及び PKCζは、293 細胞
で過剰発現すると PDK1 と直接相互作用するが、S6K1 及び SGK1 の相互作用は
、これら酵素の C 末端残基のリン酸化により調節される。このモデルは、IGF1
/ 成長因子刺激細胞でのS6K1, SGK1 及び PKB 活性化の時間経過の違いを説明す
るだろう。これら発見から、プロテインキナーゼに係る特異的非触媒部位に向け
たドラッグは、おそらく一つのグループの基質のリン酸化を阻害し、他のグルー
プの基質には影響を与えないということが示される。従って、PDK1 に係る PIF
結合ポケットと相互作用する化合物は、S6K1 及び SGK1 の活性化には影響を与
え PKB の活性化には影響を与えないだろうし、更に、全下流標的のリン酸化を
阻害する ATP 競合 PDK1 阻害剤よりもより特異的であろう。従って、このよう
なドラッグは、おそらく副作用をほとんど有さないだろう。
【０２５４】
引用文献
ADDIN ENBbu 1 Leevers, S. J., Vanhaesebroeck, B. and Waterfield,
M. D. (1999) Curr Opin Cell Biol 11, 219-225 2 Peterson, R. T. and Schreiber, S. L. (1999) Curr Biol 9, R521-R52
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N., Norman, D. G., Gaffney, P., Reese, C. B., MacDougall, C. N., Harbis
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d Avruch, J. (1998) J Biol Chem 273, 16621-16629 24 Alessi, D. R., Andjelkovic, M., Caudwell, B., Cron, P., Morrice,
N., Cohen, P. and Hemmings, B. A. (1996) Embo J 15, 6541-6551 25 Balendran, A., Currie, R. A., Armstrong, C. G., Avruch, J. and Al
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Downes, C. P., Cohen, P., Alessi, D. R. and Lucocq, J. (1999) Biochem J
337, 575-583 30 Andjelkovic, M., Alessi, D. R., Meier, R., Fernandez, A., Lamb, N
. J., Frech, M., Cron, P., Cohen, P., Lucocq, J. M. and Hemmings, B. A.
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21920-21926 32 Flynn, P., Mellor, H., Casamassima, A. and Parker, P. J. (2000) J
Biol Chem 275, 11064-11070 33 Balendran, A., Hare, G. R., Kieloch, A., Williams, M. R. and Ales
si, D. R. (2000) FEBS Lett 484, 217-223 34 Brazil, D. P. and Hemmings, B. A. (2000) Curr Biol 10, R592-594
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(2000) Mol Cell Biol 20, 5712-5721 29 Currie, R. A., Walker, K. S., Gray, A., Deak, M., Casamayor, A.,
Downes, C. P., Cohen, P., Alessi, D. R. and Lucocq, J. (1999) Biochem J
337, 575-583 30 Andjelkovic, M., Alessi, D. R., Meier, R., Fernandez, A., Lamb, N
. J., Frech, M., Cron, P., Cohen, P., Lucocq, J. M. and Hemmings, B. A.
(1997) J Biol Chem 272, 31515-31524 31 Kohn, A. D., Takeuchi, F. and Roth, R. A. (1996) J Biol Chem 271,
21920-21926 32 Flynn, P., Mellor, H., Casamassima, A. and Parker, P. J. (2000) J
Biol Chem 275, 11064-11070 33 Balendran, A., Hare, G. R., Kieloch, A., Williams, M. R. and Ales
si, D. R. (2000) FEBS Lett 484, 217-223 34 Brazil, D. P. and Hemmings, B. A. (2000) Curr Biol 10, R592-594
【図１】
PIF は、PDK1 が p70 S6K をインビトロでリン酸化するのを妨げる。野生型 (
wt) GST-PIF 若しくは D978A GST-PIF (1.5μM) のどちらか、又は、示された P
IF ペプチド (4 μM) が存在するか又は存在しない状態において、最終体積20
μl で、Mg [γ32P] ATP 及び GST-PDK1 (50nM) とともに、C 末端の 104 個の
アミノ酸 を欠く GST-p70 S6K (GST-p70 S6KT2) (1μg) を 30 ℃で 30 分間イ
ンキュベートした。1 ％ SDS 溶液により反応を止め、試料を SDS ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に被検し、更に、ゲルのオートラジオグラフィーによりリン
酸化を評価した。GST-p70 S6KT2 (73 kDa) が移動する (migrates) ゲル中の位
置を矢印で示す。図示しないゲルの他の 32P 標識されたプロテインのみが、PIF
の存在しない状態において、PDK1 の自己リン酸化 ( autophosphorylation )
に対応し、かつ、PDK1 によりリン酸化された GST-p70 S6T2 の 32P ラジオ活性
( 32P-radioactivity ) よりも ~10 倍低いレベルの 32P ラジオ活性を含んだ
。この実験では、GST-p70 S6T2 の略最高のリン酸化を得るため、多量の PDK1
を用いる。PDK1 による GST-p70 S6T2 のリン酸化が時間及び用いた基質の量に
比例する条件下で、PDK1 の濃度を 10 倍小さい濃度にしてこの反応を実施して
も、PIF は GST-p70 S6T2 のリン酸化を妨げた (データは示さない) 。wt は野
生型 (wild type) を示し、更に、 PSer はホスホセリン (phospho-serine) を
示す。各条件が重複する実験の結果を示すが、5 回に分けた実験において同様で
あった。
wt) GST-PIF 若しくは D978A GST-PIF (1.5μM) のどちらか、又は、示された P
IF ペプチド (4 μM) が存在するか又は存在しない状態において、最終体積20
μl で、Mg [γ32P] ATP 及び GST-PDK1 (50nM) とともに、C 末端の 104 個の
アミノ酸 を欠く GST-p70 S6K (GST-p70 S6KT2) (1μg) を 30 ℃で 30 分間イ
ンキュベートした。1 ％ SDS 溶液により反応を止め、試料を SDS ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に被検し、更に、ゲルのオートラジオグラフィーによりリン
酸化を評価した。GST-p70 S6KT2 (73 kDa) が移動する (migrates) ゲル中の位
置を矢印で示す。図示しないゲルの他の 32P 標識されたプロテインのみが、PIF
の存在しない状態において、PDK1 の自己リン酸化 ( autophosphorylation )
に対応し、かつ、PDK1 によりリン酸化された GST-p70 S6T2 の 32P ラジオ活性
( 32P-radioactivity ) よりも ~10 倍低いレベルの 32P ラジオ活性を含んだ
。この実験では、GST-p70 S6T2 の略最高のリン酸化を得るため、多量の PDK1
を用いる。PDK1 による GST-p70 S6T2 のリン酸化が時間及び用いた基質の量に
比例する条件下で、PDK1 の濃度を 10 倍小さい濃度にしてこの反応を実施して
も、PIF は GST-p70 S6T2 のリン酸化を妨げた (データは示さない) 。wt は野
生型 (wild type) を示し、更に、 PSer はホスホセリン (phospho-serine) を
示す。各条件が重複する実験の結果を示すが、5 回に分けた実験において同様で
あった。
【図２】
PDK1 はインビトロにおいて Thr412 で p70 S6K をリン酸化するが、これは P
IF により阻害される。 野生型 PIF ペプチド (4 μM) が存在する (+) 又は存在しない (-) 状態におい
て 293 細胞又は細菌のどちらかで発現した野生型 (wt) 又はキナーゼ死滅 (kin
ase-dead (kd) ) GST-PDK1 が存在するか又は存在しない状態において、最終体
積20 μl で、MgATP とともに、野生型 GST-p70 S6K-T2 (wt), T252A-GST-p70 S
6K-T2 (252A) 又は T412A-GST-p70 S6K-T2 (412A) のどちらかの 0.5 μgを 30
℃で 90 分間インキュベートした。1 ％ SDS 溶液により反応を止め、試料を SD
S ポリアクリルアミドゲル電気泳動に被検し、更に、T-412P 抗体を用いた免疫
ブロッティングにより Thr412 での p70 S6K のリン酸化を評価した。3 回に分
けた実験において同様の結果を得た。
IF により阻害される。 野生型 PIF ペプチド (4 μM) が存在する (+) 又は存在しない (-) 状態におい
て 293 細胞又は細菌のどちらかで発現した野生型 (wt) 又はキナーゼ死滅 (kin
ase-dead (kd) ) GST-PDK1 が存在するか又は存在しない状態において、最終体
積20 μl で、MgATP とともに、野生型 GST-p70 S6K-T2 (wt), T252A-GST-p70 S
6K-T2 (252A) 又は T412A-GST-p70 S6K-T2 (412A) のどちらかの 0.5 μgを 30
℃で 90 分間インキュベートした。1 ％ SDS 溶液により反応を止め、試料を SD
S ポリアクリルアミドゲル電気泳動に被検し、更に、T-412P 抗体を用いた免疫
ブロッティングにより Thr412 での p70 S6K のリン酸化を評価した。3 回に分
けた実験において同様の結果を得た。
【図３】
PIF は、p70 S6K 活性化並びに Thr252 及び Thr412 のリン酸化を阻害する。
GST-PIF, GST-F977A-PIF, 又は GST のどれかとともに、野生型 (wt) 完全長 HA
-p70 S6K (A) 又は完全長 HA-T412E p70 S6K (B) を発現する構築物 (construct
s) を用いて、293 細胞を共トランスフェクトした (co-transfected) 。 24 時間 (24h) のトランスフェクション後に、細胞を 16 時間 (16h) 血清飢餓
させ、更に、それらを 100 nM IGF1 を用いて 40 分間刺激した。細胞を溶菌し
、HA-p70 S6K を免疫沈降させ、方法に記載したように検定した。各溶菌液から
のプロテイン (HA ブロット (blots) 用 10 μg 又は T412-P ブロット用 20 μ
g) を 10 ％ SDS / ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、更にHA- 抗体又は
T412-P 抗体を用いて免疫ブロットした (immunoblotted) 。Thr412 でリン酸化
された p70 S6K の残基 401-418 に対応する合成ペプチド (phosph-412E ペプチ
ド) 、又は、リン酸化していないペプチド (de-phospho-Thr412 ペプチド) のど
ちらかとともに、T412-P 抗体をインキュベートした。T412-P 抗体は、トランス
フェクトした細胞又はトランスフェクトしていない細胞由来の (75 kDa) に移動
する細胞溶菌液において、絶えず「非特異的バンド」と称されるプロテインを認
識する。このバンドの強さ (intensity) は IGF1 では変化しない。HA-p70 S6K
を用いて共免疫沈降しない (データは示さない)。図示のHA-p70 S6K 活性は、3
回実施した単一実験としての平均値±標準誤差 (SEM) である。8 回に分けた実
験 (A) 及び 2 回の実験 (B) において同様の結果を得た。免疫ブロッティング
を 3 回に分けた実験において行ったが、同様の結果を得た。
GST-PIF, GST-F977A-PIF, 又は GST のどれかとともに、野生型 (wt) 完全長 HA
-p70 S6K (A) 又は完全長 HA-T412E p70 S6K (B) を発現する構築物 (construct
s) を用いて、293 細胞を共トランスフェクトした (co-transfected) 。 24 時間 (24h) のトランスフェクション後に、細胞を 16 時間 (16h) 血清飢餓
させ、更に、それらを 100 nM IGF1 を用いて 40 分間刺激した。細胞を溶菌し
、HA-p70 S6K を免疫沈降させ、方法に記載したように検定した。各溶菌液から
のプロテイン (HA ブロット (blots) 用 10 μg 又は T412-P ブロット用 20 μ
g) を 10 ％ SDS / ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、更にHA- 抗体又は
T412-P 抗体を用いて免疫ブロットした (immunoblotted) 。Thr412 でリン酸化
された p70 S6K の残基 401-418 に対応する合成ペプチド (phosph-412E ペプチ
ド) 、又は、リン酸化していないペプチド (de-phospho-Thr412 ペプチド) のど
ちらかとともに、T412-P 抗体をインキュベートした。T412-P 抗体は、トランス
フェクトした細胞又はトランスフェクトしていない細胞由来の (75 kDa) に移動
する細胞溶菌液において、絶えず「非特異的バンド」と称されるプロテインを認
識する。このバンドの強さ (intensity) は IGF1 では変化しない。HA-p70 S6K
を用いて共免疫沈降しない (データは示さない)。図示のHA-p70 S6K 活性は、3
回実施した単一実験としての平均値±標準誤差 (SEM) である。8 回に分けた実
験 (A) 及び 2 回の実験 (B) において同様の結果を得た。免疫ブロッティング
を 3 回に分けた実験において行ったが、同様の結果を得た。
【図４】
PIF は、PKBα 活性化又は Ser473 でのそれのリン酸化を阻害しない。293 細
胞を、GST-PIF 又は GST のどちらかとともに野生型完全長HA-PKBαを発現する
構築物で共トランスフェクトした。24 時間のトランスフェクション後に、細胞
を 16 時間血清飢餓させて、その後 100 nM IGF1 を用いて 15 分間刺激した。
細胞を溶菌し、HA-PKBαを免疫沈降させ、方法に記載したように検定した。各溶
菌液からのプロテイン (10 μg) を 10 ％ SDS / ポリアクリルアミドゲル上で
電気泳動し、更にHA- 抗体又は S473-P 抗体を用いて免疫ブロットした。図示の
HA-PKBα活性は、3 回実施した単一実験としての平均値±標準誤差 (SEM) であ
って、3 回に分けた実験において同様の結果を得た。
胞を、GST-PIF 又は GST のどちらかとともに野生型完全長HA-PKBαを発現する
構築物で共トランスフェクトした。24 時間のトランスフェクション後に、細胞
を 16 時間血清飢餓させて、その後 100 nM IGF1 を用いて 15 分間刺激した。
細胞を溶菌し、HA-PKBαを免疫沈降させ、方法に記載したように検定した。各溶
菌液からのプロテイン (10 μg) を 10 ％ SDS / ポリアクリルアミドゲル上で
電気泳動し、更にHA- 抗体又は S473-P 抗体を用いて免疫ブロットした。図示の
HA-PKBα活性は、3 回実施した単一実験としての平均値±標準誤差 (SEM) であ
って、3 回に分けた実験において同様の結果を得た。
【図５】
キナーゼ死滅 PDK1 は、p70 S6K 活性化並びに Thr252 及び Thr412 でのリン
酸化を阻害する。 野生型PDK1, キナーゼ死滅 (kd) 突然変異体 若しくは PDK1 若しくはエンプテ
ィー (empty) pCMV5 ベクターのどれかとともに、野生型 (wt) 完全長 HA-p70 S
6K (A) 完全長 (A) 完全長 HA-252A p70 S6K (B), 完全長 HA-412A p70 S6K (C)
若しくは 完全長 HA-412E p70 S6K (D) を発現する構築物で、293 細胞を共ト
ランスフェクトした。24 時間のトランスフェクション後に、細胞を 16 時間血
清飢餓させて、その後 100 nM IGF1 を用いて 40 分間刺激した。細胞を溶菌し
、HA-p70 S6K の野生型及び突然変異体 (mutant forms) を免疫沈降させ、方法
に記載したように検定した。HA-252A p70 S6K 又は HA-412A p70 S6K は、以前
報告した [6] ような全ての条件下において、本質的に不活性である (データは
示さない) 。各溶菌液からのプロテイン (HA ブロット (blots) 用 10 μg 又は
T412-P ブロット用 20 μg) を 10 ％ SDS / ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動し、更にHA- 抗体又は T412-P 抗体を用いて免疫ブロットした。p70 S6K の
残基 401-418 に対応する、リン酸化していないペプチドが存在する状態におい
て、T412-P 抗体をインキュベートした。図示のHA-p70 S6K 活性は、3 回実施し
た単一実験としての平均値±標準誤差 (SEM) である。少なくとも 3 回に分けた
実験において同様の結果を得た。ここで図示した HA 及び T412-P ブロットに同
等な結果も、3 回に分けた実験において得られた。
酸化を阻害する。 野生型PDK1, キナーゼ死滅 (kd) 突然変異体 若しくは PDK1 若しくはエンプテ
ィー (empty) pCMV5 ベクターのどれかとともに、野生型 (wt) 完全長 HA-p70 S
6K (A) 完全長 (A) 完全長 HA-252A p70 S6K (B), 完全長 HA-412A p70 S6K (C)
若しくは 完全長 HA-412E p70 S6K (D) を発現する構築物で、293 細胞を共ト
ランスフェクトした。24 時間のトランスフェクション後に、細胞を 16 時間血
清飢餓させて、その後 100 nM IGF1 を用いて 40 分間刺激した。細胞を溶菌し
、HA-p70 S6K の野生型及び突然変異体 (mutant forms) を免疫沈降させ、方法
に記載したように検定した。HA-252A p70 S6K 又は HA-412A p70 S6K は、以前
報告した [6] ような全ての条件下において、本質的に不活性である (データは
示さない) 。各溶菌液からのプロテイン (HA ブロット (blots) 用 10 μg 又は
T412-P ブロット用 20 μg) を 10 ％ SDS / ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動し、更にHA- 抗体又は T412-P 抗体を用いて免疫ブロットした。p70 S6K の
残基 401-418 に対応する、リン酸化していないペプチドが存在する状態におい
て、T412-P 抗体をインキュベートした。図示のHA-p70 S6K 活性は、3 回実施し
た単一実験としての平均値±標準誤差 (SEM) である。少なくとも 3 回に分けた
実験において同様の結果を得た。ここで図示した HA 及び T412-P ブロットに同
等な結果も、3 回に分けた実験において得られた。
【図６】
p70 S6K に対する PDK1 の結合の定量的分析。
方法に記載したようなBiaCore機器で表面プラズモン共鳴法を実施した。(A) ア
ミンカップリング (amine coupling) によりCM5 センサーチップに固定化した20
00 RUs の p70 S6K-T2 (閉四角形) 又は 412Ep70 S6K-T2 (閉円形) を覆って、
図示した濃度でHis-PDK1を注入した。10 μM 野生型 PIF ペプチド (六角形) 又
は 10 μM D978A 突然変異体 PIF ペプチド (三角形) のどちらかが存在する状
態において実施した実験を示す。定常状態での結合の応答を記録した。データは
全て代表実験から決定した単一のものである。代表実験を少なくとも3 回繰り返
したが、同様の結果を得た。野生型 p70 S6K に結合する 2 μM を上回る濃度の
PDK1 に係るデータは示さないが、このデータを分析すると、非特異的プロテイ
ンの結合が観測された結合応答に寄与すると示唆された。
ミンカップリング (amine coupling) によりCM5 センサーチップに固定化した20
00 RUs の p70 S6K-T2 (閉四角形) 又は 412Ep70 S6K-T2 (閉円形) を覆って、
図示した濃度でHis-PDK1を注入した。10 μM 野生型 PIF ペプチド (六角形) 又
は 10 μM D978A 突然変異体 PIF ペプチド (三角形) のどちらかが存在する状
態において実施した実験を示す。定常状態での結合の応答を記録した。データは
全て代表実験から決定した単一のものである。代表実験を少なくとも3 回繰り返
したが、同様の結果を得た。野生型 p70 S6K に結合する 2 μM を上回る濃度の
PDK1 に係るデータは示さないが、このデータを分析すると、非特異的プロテイ
ンの結合が観測された結合応答に寄与すると示唆された。
【図７】
PDK1 並びに PKA の野生型及び突然変異体 C 末端断片のツーハイブリッド (T
wo hybrid) 相互作用。 (A) PIF 又は Ga14 活性化ドメイン (GAD) に融合した PKA の C 末端断片 (PKA CT 残基 129-350) の野生型若しくは図示した突然変異体のどれかをエンコード
するベクターとともに、Ga14 DNA 結合ドメイン (GBD) に融合したPDK1 を発現
するベクターで、Y190 酵母菌株を形質転換した。コントロールとして、酵母菌
も単独の GBD ドメイン及び単独の GAD ドメインで共形質転換した (co-transfo
rmed) 。酵母菌を 30 ℃で一晩成長させ、ガラクトシダーゼフィルターリフト (
galactosidase filter lift) 検定を 30 ℃で 4 時間行った。GBD-PDK1 と GAD-
PKACT との間の相互作用は、フィルターリフト検定において青色として検出され
るβガラクトシダーゼの発現を誘導する。(B) PKA の C 末端 77 個のアミノ酸
のアミノ酸配列の、AGC サブファミリーキナーゼの等価領域との整列 (Alignmen
t) を図示した。同一残基を背景が黒の白文字により示し、更に類似残基をグレ
ーボックスにより示す。疎水性モチーフ (motif) における芳香族残基を矢印に
より示す。
wo hybrid) 相互作用。 (A) PIF 又は Ga14 活性化ドメイン (GAD) に融合した PKA の C 末端断片 (PKA CT 残基 129-350) の野生型若しくは図示した突然変異体のどれかをエンコード
するベクターとともに、Ga14 DNA 結合ドメイン (GBD) に融合したPDK1 を発現
するベクターで、Y190 酵母菌株を形質転換した。コントロールとして、酵母菌
も単独の GBD ドメイン及び単独の GAD ドメインで共形質転換した (co-transfo
rmed) 。酵母菌を 30 ℃で一晩成長させ、ガラクトシダーゼフィルターリフト (
galactosidase filter lift) 検定を 30 ℃で 4 時間行った。GBD-PDK1 と GAD-
PKACT との間の相互作用は、フィルターリフト検定において青色として検出され
るβガラクトシダーゼの発現を誘導する。(B) PKA の C 末端 77 個のアミノ酸
のアミノ酸配列の、AGC サブファミリーキナーゼの等価領域との整列 (Alignmen
t) を図示した。同一残基を背景が黒の白文字により示し、更に類似残基をグレ
ーボックスにより示す。疎水性モチーフ (motif) における芳香族残基を矢印に
より示す。
【図８】
PKA の C 末端 Phe-Xaa-Xaa-Phe 残基は、PKA キナーゼドメインに係る疎水性
ポケットと相互作用し、PDK1 に保存されていると予測される。 PKA/PKI/ATP テナリー (tenary) 複合体 [33: 実施例 2]; PKI 及び ATP 分子の
リボン (Ribbon) 構造を示す。C 末端 Phe 347 及び Phe 350 を示す。T ループ
(loop) における phospho-Thr 197 (PDK1 リン酸化部位) の位置を示す。(B) P
KA の C 末端 Phe-Xaa-Xaa-Phe と相互作用する PKA のキナーゼドメインに係る
疎水性ポケットの詳細な構造。Lys76 (PDK1 における Lys115 に等価) 、Leu 11
6 (PDK1における Leu155に等価)、Phe347 及び Phe350 、並びに特定のアミノ酸
残基を示す。(C) PDK1 キナーゼドメインの構造を方法に記載したようにモデル
化した (modelled)。PIF 結合ポケット (binding pocket) と称した PKA の疎水
性ポケットに等価なPDK1 の領域を示す。PIF への結合において関係すると予測
される残基を強調する (highlighted) 。(D) PIF 結合ポケット近傍の PDK1 の
アミノ酸残基と PKA の等価領域との整列。同一残基を背景が黒の白文字により
示し、更に類似残基をグレーボックスにより示す。C 末端 Phe-Xaa-Xaa-Phe モ
チーフと相互作用する PKA の残基を星印でマークした。
ポケットと相互作用し、PDK1 に保存されていると予測される。 PKA/PKI/ATP テナリー (tenary) 複合体 [33: 実施例 2]; PKI 及び ATP 分子の
リボン (Ribbon) 構造を示す。C 末端 Phe 347 及び Phe 350 を示す。T ループ
(loop) における phospho-Thr 197 (PDK1 リン酸化部位) の位置を示す。(B) P
KA の C 末端 Phe-Xaa-Xaa-Phe と相互作用する PKA のキナーゼドメインに係る
疎水性ポケットの詳細な構造。Lys76 (PDK1 における Lys115 に等価) 、Leu 11
6 (PDK1における Leu155に等価)、Phe347 及び Phe350 、並びに特定のアミノ酸
残基を示す。(C) PDK1 キナーゼドメインの構造を方法に記載したようにモデル
化した (modelled)。PIF 結合ポケット (binding pocket) と称した PKA の疎水
性ポケットに等価なPDK1 の領域を示す。PIF への結合において関係すると予測
される残基を強調する (highlighted) 。(D) PIF 結合ポケット近傍の PDK1 の
アミノ酸残基と PKA の等価領域との整列。同一残基を背景が黒の白文字により
示し、更に類似残基をグレーボックスにより示す。C 末端 Phe-Xaa-Xaa-Phe モ
チーフと相互作用する PKA の残基を星印でマークした。
【図９】
PIF との相互作用能力について PDK1 の PIF 結合ポケットに保存された残基
の突然変異体の有効性。 GST-PIF 及び野生型 Myc-PDK1 又は図示した PDK1 の突然変異体のどちらかを発
現する DNA 構築物で 293 細胞を絶えずトランスフェクトした。36 時間のトラ
ンスフェクション後に細胞を溶菌し、グルタチオンセファロースビーズ (glutat
hione-Sepharose beads) を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより GS
T-PIF を精製した。各プロテインの 2 μg を 10 ％ SDS / ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動し、クーマシーブルー (Coomassie blue) で染色する (A 及び E
) か又は Myc-PDK1 を検出するためのアンチ (anti) Myc 抗体を用いて免疫ブロ
ットした (B and F) 。野生型 PDK1 と突然変異体プロテインとが同じレベルで
発現したかを立証するために、全細胞溶菌液の 10 μgを10 ％ SDS / ポリアク
リルアミドゲルで電気泳動し、更にアンチ Myc 抗体を用いて免疫ブロットした(
C 及び G)。各条件の複製物 (Duplicates) を示す。3 - 5 回に分けた実験にお
いて同様の結果を得た。配列が PIFtide と称した PIF に係る PDK1 結合部位を
取り囲む (encompasses) 24 個の残基からなる合成ペプチド [24: 実施例 2] と
の野生型及び突然変異体 GST-PDK1 調製物の相互作用を測定するために、方法に
記載したような BiaCore 機器で表面プラズモン共鳴測定を実施した。PIFtide
を SA センサーチップに固定化し、PDK1 の野生型 (wt) 又は図示の突然変異体
を 40nM の濃度で注入した。データは全て代表実験から決定した単一のものであ
る。代表実験を少なくとも3 回繰り返したが、同様の結果を得た。明確にするた
め、注入の始め及び終わりの 10 秒に係る容積 (bulk) 、屈折率変化を除いてい
る。
の突然変異体の有効性。 GST-PIF 及び野生型 Myc-PDK1 又は図示した PDK1 の突然変異体のどちらかを発
現する DNA 構築物で 293 細胞を絶えずトランスフェクトした。36 時間のトラ
ンスフェクション後に細胞を溶菌し、グルタチオンセファロースビーズ (glutat
hione-Sepharose beads) を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより GS
T-PIF を精製した。各プロテインの 2 μg を 10 ％ SDS / ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動し、クーマシーブルー (Coomassie blue) で染色する (A 及び E
) か又は Myc-PDK1 を検出するためのアンチ (anti) Myc 抗体を用いて免疫ブロ
ットした (B and F) 。野生型 PDK1 と突然変異体プロテインとが同じレベルで
発現したかを立証するために、全細胞溶菌液の 10 μgを10 ％ SDS / ポリアク
リルアミドゲルで電気泳動し、更にアンチ Myc 抗体を用いて免疫ブロットした(
C 及び G)。各条件の複製物 (Duplicates) を示す。3 - 5 回に分けた実験にお
いて同様の結果を得た。配列が PIFtide と称した PIF に係る PDK1 結合部位を
取り囲む (encompasses) 24 個の残基からなる合成ペプチド [24: 実施例 2] と
の野生型及び突然変異体 GST-PDK1 調製物の相互作用を測定するために、方法に
記載したような BiaCore 機器で表面プラズモン共鳴測定を実施した。PIFtide
を SA センサーチップに固定化し、PDK1 の野生型 (wt) 又は図示の突然変異体
を 40nM の濃度で注入した。データは全て代表実験から決定した単一のものであ
る。代表実験を少なくとも3 回繰り返したが、同様の結果を得た。明確にするた
め、注入の始め及び終わりの 10 秒に係る容積 (bulk) 、屈折率変化を除いてい
る。
【図１０】
ツーハイブリッドシステム (the two hybrid system) において、PDK1 のLeu1
55 突然変異体は、PIF 又は PKA の C 末端断片のどちらかとは相互作用しない
。 PRK2 の 77 個の C 末端残基 (PIF) 又は PKA の C 末端断片 (Gal4 活性化ドメ
イン (GAD) に融合した PKACT 残基 129-350) のどちらかの発現をエンコードす
るベクターとともに、野生型 PDK1 又は Ga14 DNA 結合ドメイン (GBD) に融合
した PDK1 の図示した突然変異体を発現するベクターで、Y190 酵母菌株を形質
転換した。コントロールとして、酵母菌も同様に、GAD 及び GBD ドメインのみ
を発現するベクターで共形質転換した。酵母菌を 30 ℃で一晩成長させ、ガラク
トシダーゼフィルターリフト検定を 30 ℃で 4 時間行った。GBD-PDK1 と、GAD-
PIF 又は GAD-PKACT のどちらかと、の間の相互作用は、フィルターリフト検定
において青色として検出されるβガラクトシダーゼの発現を誘導する。
55 突然変異体は、PIF 又は PKA の C 末端断片のどちらかとは相互作用しない
。 PRK2 の 77 個の C 末端残基 (PIF) 又は PKA の C 末端断片 (Gal4 活性化ドメ
イン (GAD) に融合した PKACT 残基 129-350) のどちらかの発現をエンコードす
るベクターとともに、野生型 PDK1 又は Ga14 DNA 結合ドメイン (GBD) に融合
した PDK1 の図示した突然変異体を発現するベクターで、Y190 酵母菌株を形質
転換した。コントロールとして、酵母菌も同様に、GAD 及び GBD ドメインのみ
を発現するベクターで共形質転換した。酵母菌を 30 ℃で一晩成長させ、ガラク
トシダーゼフィルターリフト検定を 30 ℃で 4 時間行った。GBD-PDK1 と、GAD-
PIF 又は GAD-PKACT のどちらかと、の間の相互作用は、フィルターリフト検定
において青色として検出されるβガラクトシダーゼの発現を誘導する。
【図１１】
PDK1 の野生型及び PIF 結合ポケット突然変異体による、PKB の Thr308 のリ
ン酸化。 GST-PDK1の野生型又は突然変異体を、293細胞で発現させ、グルタチオンセファ
ロースビーズを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。100
μMホスファチジルコリン (phosphatidycholine) を含むリン脂質小胞 (phospho
lipid vesicles) が存在するか又は存在しない状態において、GST-S473D-PKBα
及び MgATP とともに、各 GST 融合プロテイン (0.2 ng) を 30 ℃で 30 分間イ
ンキュベートした。PDK1 を除外したコントロールインキュベーションと比較し
て、100 μM ホスファチジルセリン (phosphatidyylserine) 及び 10 μM sn-1-
ステアロイル (stearoyl) -2- アラキドノイル (arachidonoyl) -D-PtdIns (3,
4, 5) P3 並びに GST-S473D-PKBαの特異的活性の増加を測定した (6 回の測定
、3 回の独立実験の平均) 。GST-S473D-PKBαの基礎活性 (The basal activity)
は、1.5 U/mg であった。適用した条件下では、GST-473D-PKBαの活性化は検定
のために添加した PDK1 の量に比例する (データは示さない) と証明された。(
−は、PDK1 を除外したものを示す。
ン酸化。 GST-PDK1の野生型又は突然変異体を、293細胞で発現させ、グルタチオンセファ
ロースビーズを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。100
μMホスファチジルコリン (phosphatidycholine) を含むリン脂質小胞 (phospho
lipid vesicles) が存在するか又は存在しない状態において、GST-S473D-PKBα
及び MgATP とともに、各 GST 融合プロテイン (0.2 ng) を 30 ℃で 30 分間イ
ンキュベートした。PDK1 を除外したコントロールインキュベーションと比較し
て、100 μM ホスファチジルセリン (phosphatidyylserine) 及び 10 μM sn-1-
ステアロイル (stearoyl) -2- アラキドノイル (arachidonoyl) -D-PtdIns (3,
4, 5) P3 並びに GST-S473D-PKBαの特異的活性の増加を測定した (6 回の測定
、3 回の独立実験の平均) 。GST-S473D-PKBαの基礎活性 (The basal activity)
は、1.5 U/mg であった。適用した条件下では、GST-473D-PKBαの活性化は検定
のために添加した PDK1 の量に比例する (データは示さない) と証明された。(
−は、PDK1 を除外したものを示す。
【図１２】
PIFtideとの相互作用を通じて、PDK1は活性化し更に安定化する。
(A) 材料及び方法に記載したように、T308tideと称した合成ペプチド基質を用い
、野生型 (wt) PIFtide (閉円形) 又は 突然変異体 D978A PIFtide (開円形)の
濃度を増加させる状態における、GST-PDK1 活性を測定した。カレイダグラフ (
商標) ソフトウェア (the Kaleidagraph（商標） software) を用いて、データ
を双曲線に合わせた。PDK1 の 50 ％の活性化を得るのに必要な連結 (connectio
n) は、野生型 PIFtide については 0.14 μM であり、D978A-PIFtide について
は1.1 μM であった。検定を 3 回行ったが、各検定間での違いは 5 ％よりも少
なかった。更なる 2 回の実験において同様の結果を得た。(B) 100 μM PIFtife
が存在する (閉記号) か又は存在しない (開記号) 状態において、野生型 GS
T-PDK1 (円形) 又は GST-PDK1 の L155D 突然変異体 (四角形)を、図示した温
度で 2 分間インキュベートし、素早く 0 ℃にうつし（材料及び方法参照）、更
に 2 分後、基質としての T308tide を用いて 30 ℃で 10 分間検定した。30 ℃
のインキュベートにより得た PDK1 の活性を 100 ％とした。図示した検定を 2
回行ったが、2 回に分けた実験において同様の結果を得た。
、野生型 (wt) PIFtide (閉円形) 又は 突然変異体 D978A PIFtide (開円形)の
濃度を増加させる状態における、GST-PDK1 活性を測定した。カレイダグラフ (
商標) ソフトウェア (the Kaleidagraph（商標） software) を用いて、データ
を双曲線に合わせた。PDK1 の 50 ％の活性化を得るのに必要な連結 (connectio
n) は、野生型 PIFtide については 0.14 μM であり、D978A-PIFtide について
は1.1 μM であった。検定を 3 回行ったが、各検定間での違いは 5 ％よりも少
なかった。更なる 2 回の実験において同様の結果を得た。(B) 100 μM PIFtife
が存在する (閉記号) か又は存在しない (開記号) 状態において、野生型 GS
T-PDK1 (円形) 又は GST-PDK1 の L155D 突然変異体 (四角形)を、図示した温
度で 2 分間インキュベートし、素早く 0 ℃にうつし（材料及び方法参照）、更
に 2 分後、基質としての T308tide を用いて 30 ℃で 10 分間検定した。30 ℃
のインキュベートにより得た PDK1 の活性を 100 ％とした。図示した検定を 2
回行ったが、2 回に分けた実験において同様の結果を得た。
【図１３】
PDK1 ポケット突然変異体に係る PIFtide の有効性。
2 mM PIFtide (ダッシュバー (dashed bars) ) 若しくは 35 μM PIFtide (フィ
ルドバー (filled bars) ) が、存在しない状態 (ドットバー (dotted bars) )
か若しくは存在する状態において、GST-PDK1の野生型及び図示した突然変異体を
T308tideにより検定した。適用した条件下では、PDK1 による T308tide のリン
酸化は時間に比例した (データは示さない) 。(A) は、PIFtide が存在しない状
態において活性化された PDK1 突然変異体を示し、更に (B) は、高濃度の PIFt
ide により活性化された突然変異体を示す。検定を 3 回行ったが、3 つの試料
間での違いは 10 ％にも満たなかった。3 回に分けた実験において同様の結果を
得た。
ルドバー (filled bars) ) が、存在しない状態 (ドットバー (dotted bars) )
か若しくは存在する状態において、GST-PDK1の野生型及び図示した突然変異体を
T308tideにより検定した。適用した条件下では、PDK1 による T308tide のリン
酸化は時間に比例した (データは示さない) 。(A) は、PIFtide が存在しない状
態において活性化された PDK1 突然変異体を示し、更に (B) は、高濃度の PIFt
ide により活性化された突然変異体を示す。検定を 3 回行ったが、3 つの試料
間での違いは 10 ％にも満たなかった。3 回に分けた実験において同様の結果を
得た。
【図１４】
PDK1 の PIF 結合ポケットと相互作用するという理由から、PDKtide は、T308
tide に比べて、PDK1 に適する非常に優れた基質である。 (A) 基質として、図示した濃度のPDKtide (開三角形) 又は T308tide (開円形)
のどちらかを用い、His-PDK1の活性を検定した。(B) 図示した濃度の PIFtide
が存在する状態で、PDKtide (25 μM 閉三角形) 又は T308tide (100 μM 閉円
形) が存在する場合の HIS-PDK1 の活性を検定した。検定を 3 回行ったが、3
つの試料間での違いは 5 ％にも満たなかった。3 回に分けた実験において同様
の結果を得た。
tide に比べて、PDK1 に適する非常に優れた基質である。 (A) 基質として、図示した濃度のPDKtide (開三角形) 又は T308tide (開円形)
のどちらかを用い、His-PDK1の活性を検定した。(B) 図示した濃度の PIFtide
が存在する状態で、PDKtide (25 μM 閉三角形) 又は T308tide (100 μM 閉円
形) が存在する場合の HIS-PDK1 の活性を検定した。検定を 3 回行ったが、3
つの試料間での違いは 5 ％にも満たなかった。3 回に分けた実験において同様
の結果を得た。
【図１５】
AGCプロテインキナーゼファミリーメンバーの整列。
マウス PKA の Lys 76 (又はヒト PKAαの残基 Lys77 ) に等価な残基を示す。
マウス PKA の Val80, Lys111 及び Leu116 に等価な残基も同様に示す。疎水性
ポケットモチーフ (hydrophobic motif) Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr の位置を二
重線により示す。
マウス PKA の Val80, Lys111 及び Leu116 に等価な残基も同様に示す。疎水性
ポケットモチーフ (hydrophobic motif) Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr の位置を二
重線により示す。
【図１６】
更なるAGCプロテインキナーゼファミリーメンバーの整列。
マウス PKA の Lys 76 (又はヒト PKAαの残基 Lys77 ) に等価な残基を示す。
マウス PKA の Val80, Lys111 及び Leu116 に等価な残基も同様に示す。疎水性
ポケットモチーフ Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr の位置を二重線により示す。
マウス PKA の Val80, Lys111 及び Leu116 に等価な残基も同様に示す。疎水性
ポケットモチーフ Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr の位置を二重線により示す。
【図１７】
PDK1 の基質に適用したプロテイン。
【図１８】
PDK1 PIF ポケット突然変異体 Leu155Glu による基質のリン酸化及び活性化。
他の基質をリン酸化しかつ活性化する能力について、GST-PDK1 及び GST-PDK1 L
155E をテストした (tested) 。PDK1 L155E は、疎水性 PIF ポケットを崩壊す
ると知られている。PDK1 又は PDK1 L155Eが存在しないか又は存在する状態にお
いて、基質 (0.6 μM) をインビトロでインキュベートした。[γ-32P]ATP 及び
ペプチド基質クロスチド (Crosstide) との反応混液を更にインキュベートする
ことにより基質の活性化を評価した。図示した濃度のPDK1が無いときの活性と、
図示した濃度のPDK1が存在するときの活性との間の差として、基質プロテインの
活性化を観測している。[γ-32P]ATP が存在する状態においてリン酸化反応を行
い、反応産物を SDS-PAGE により分離し、続いてリン酸化イメージャー分析を行
うことにより、基質のリン酸化を定量化した。S6K1 に係る 256 部位、SGK1 に
係る 252 部位及び PKB に係る 308 部位のリン酸化型 (phosphorylated form)
を特に検出する抗体を用いて、平行実験をブロットした (blotted) 。S6K1 及び
PKBの疎水性モチーフ部位のリン酸化型を検出する免疫ブロットは、これら条件
下では、いずれのバンドも示さなかった (示さない)。適用した条件下では、PDK
1による基質のリン酸化は、時間及び酵素量に比例した。実験を少なくとも2回重
複させて行った。図示した結果は、ある特定の実験に対応する。一つの実験にお
ける複製物は 10 ％も異ならず、通常 5 ％より少なかった。テストした基質は
、(A) His-tag S6K1 T2 及び S6K1 T2 412Eを発現したバキュロウイルス (Bacul
ovirus), (B) 先に PP2A で脱リン酸化した (dephosphorylated) GST-SGK1 及び
GST-SGK1 422D, (C) GST-FL-PKB 及び GST-FL-PKB 473D, (D) GST-PKB-ΔPH 及
び GST-PKB-ΔPH であった。
他の基質をリン酸化しかつ活性化する能力について、GST-PDK1 及び GST-PDK1 L
155E をテストした (tested) 。PDK1 L155E は、疎水性 PIF ポケットを崩壊す
ると知られている。PDK1 又は PDK1 L155Eが存在しないか又は存在する状態にお
いて、基質 (0.6 μM) をインビトロでインキュベートした。[γ-32P]ATP 及び
ペプチド基質クロスチド (Crosstide) との反応混液を更にインキュベートする
ことにより基質の活性化を評価した。図示した濃度のPDK1が無いときの活性と、
図示した濃度のPDK1が存在するときの活性との間の差として、基質プロテインの
活性化を観測している。[γ-32P]ATP が存在する状態においてリン酸化反応を行
い、反応産物を SDS-PAGE により分離し、続いてリン酸化イメージャー分析を行
うことにより、基質のリン酸化を定量化した。S6K1 に係る 256 部位、SGK1 に
係る 252 部位及び PKB に係る 308 部位のリン酸化型 (phosphorylated form)
を特に検出する抗体を用いて、平行実験をブロットした (blotted) 。S6K1 及び
PKBの疎水性モチーフ部位のリン酸化型を検出する免疫ブロットは、これら条件
下では、いずれのバンドも示さなかった (示さない)。適用した条件下では、PDK
1による基質のリン酸化は、時間及び酵素量に比例した。実験を少なくとも2回重
複させて行った。図示した結果は、ある特定の実験に対応する。一つの実験にお
ける複製物は 10 ％も異ならず、通常 5 ％より少なかった。テストした基質は
、(A) His-tag S6K1 T2 及び S6K1 T2 412Eを発現したバキュロウイルス (Bacul
ovirus), (B) 先に PP2A で脱リン酸化した (dephosphorylated) GST-SGK1 及び
GST-SGK1 422D, (C) GST-FL-PKB 及び GST-FL-PKB 473D, (D) GST-PKB-ΔPH 及
び GST-PKB-ΔPH であった。
【図１９】
インビトロでのPDK1基質のリン酸化及び活性化に係るPIFtideの有効性。PIFti
de が存在するか又は存在しない状態において、図示の通り、GST-PDK1 とともに
、基質 (0.6 μM) をインビトロでインキュベートした (2)。
de が存在するか又は存在しない状態において、図示の通り、GST-PDK1 とともに
、基質 (0.6 μM) をインビトロでインキュベートした (2)。
【図２０】
PDK1 PIF ポケット突然変異体 (155A, 115A, 119A, 150A) による S6K1 及び
SGK1 の活性化に係る PIFtide の有効性。His-S6K1 412E 及び GST-SGK1 422D
を活性化する能力について、GST-PDK1, GST-PDK1 L155E, 155A, 115A, 119A 及
び 150A をテストした。基質のリン酸化及び活性化は、図１７に記載の通り行っ
た。この反応において、PIFtide をインキュベートするとき、ATP-Mgの添加によ
り反応を開始するまでこれを氷上で ~15 分プレインキュベートした (pre-incub
ated) 。
SGK1 の活性化に係る PIFtide の有効性。His-S6K1 412E 及び GST-SGK1 422D
を活性化する能力について、GST-PDK1, GST-PDK1 L155E, 155A, 115A, 119A 及
び 150A をテストした。基質のリン酸化及び活性化は、図１７に記載の通り行っ
た。この反応において、PIFtide をインキュベートするとき、ATP-Mgの添加によ
り反応を開始するまでこれを氷上で ~15 分プレインキュベートした (pre-incub
ated) 。
【図２１】
S6K1 及び SGK1のPDK1との相互作用。
HA 標識された S6K1 の野生型若しくは図示した突然変異体若しくはトランケー
ション (truncations) (A)、又は、野生型 GST-(N-SGK1 若しくは 422D 突然変
異体のどちらかを発現する構築物とともに、GST, GST-PDK1 野生型 又は PDK1 L
155E を発現する DNA 構築物で、293 細胞を絶えずトランスフェクトした。36
時間のトランスフェクション後に細胞を溶菌し、グルタチオンセファロースビー
ズを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより GST 融合プロテインを精
製した。アリコート (Aliquots) を 10 ％ SDS ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動し、クーマシーブルーで染色し、又は、FLAG-S6K1 を検出するアンチ (anti
)-FLAG 抗体及び Myc-PDK1 を検出するアンチ (anti)-Myc 抗体を用いて免疫ブ
ロットした。野生型及び突然変異体プロテインが同様のレベルで発現したかを確
かめるために、10 mg の全溶菌液を 10 ％ SDS ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動し、更に図示した抗体を用いて免疫ブロットした。各条件の複製物を示す。
2回の異なる実験において同様の結果を得た。
ション (truncations) (A)、又は、野生型 GST-(N-SGK1 若しくは 422D 突然変
異体のどちらかを発現する構築物とともに、GST, GST-PDK1 野生型 又は PDK1 L
155E を発現する DNA 構築物で、293 細胞を絶えずトランスフェクトした。36
時間のトランスフェクション後に細胞を溶菌し、グルタチオンセファロースビー
ズを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより GST 融合プロテインを精
製した。アリコート (Aliquots) を 10 ％ SDS ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動し、クーマシーブルーで染色し、又は、FLAG-S6K1 を検出するアンチ (anti
)-FLAG 抗体及び Myc-PDK1 を検出するアンチ (anti)-Myc 抗体を用いて免疫ブ
ロットした。野生型及び突然変異体プロテインが同様のレベルで発現したかを確
かめるために、10 mg の全溶菌液を 10 ％ SDS ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動し、更に図示した抗体を用いて免疫ブロットした。各条件の複製物を示す。
2回の異なる実験において同様の結果を得た。
【図２２】
PDK1 特異性のモデル (Model)。293 細胞での PDK1 の基質の過剰発現は、本
質的にリン酸化されるプロテインキナーゼ (PKCζ 及び PRK2) を、IGF1 刺激 (
stimulation) の 1-2 以内にリン酸化されかつ活性化される他のプロテインキナ
ーゼ (PKB) を、更に同じ刺激に対する暴露の 10-40 後にリン酸化されかつ活性
化される他のプロテインキナーゼ (S6K 及び SGK) を産生する。従って、この特
別な特異性を確立するメカニズム (mechanism) が存在するはずである。ここで
、我々は、PDK1 基質のリン酸化にふさわしいモデルを描写する。このリン酸化
は、本明細書に記載の結果により支持され、更に公表された観測に一致する。こ
のモデルにおいて、PDK1活性は、調節される必要は無い。むしろ、PKB 以外の基
質に係る修飾 (modifications)、これらキナーゼの C 末端疎水性ポケットの、P
DK1 の PIF 結合ポケットとの直接的な相互作用を許容できるだろう。これら基
質との相互作用が、ここでいう PDK1 の時間的及び空間的特異性を確立する調節
工程になるだろう。合成後、PKCζは、PDK1 との直接的な相互作用を可能とする
コンホメーション (conformation) になるだろう。従って、PKCζは本質的にリ
ン酸化される []。293 細胞において PRK2 の過剰発現は、同様の活性な (リン
酸化された) 酵素を導き出すが、PRK2 の PDK1 との相互作用が Rho により調節
されうると示唆される []。SGK 及び S6K は、PDK1 との相互作用を許容するた
めにリン酸化により修飾されるはずであって、自己リン酸化及び自己活性化を促
す。PKBとPDK1との間の主な相互作用は、PtdIns(3,4,5)P3に依存し、おそらく共
局在化を仲介した脂質による可能性がある。ΔPH-PKB リン酸化が、疎水性モチ
ーフ− PIF 結合ポケット相互作用に依存するという理由から、PKB 相互作用に
おいては、PDK1 PIF ポケットは比較的重要でない役割を担うだろう。
質的にリン酸化されるプロテインキナーゼ (PKCζ 及び PRK2) を、IGF1 刺激 (
stimulation) の 1-2 以内にリン酸化されかつ活性化される他のプロテインキナ
ーゼ (PKB) を、更に同じ刺激に対する暴露の 10-40 後にリン酸化されかつ活性
化される他のプロテインキナーゼ (S6K 及び SGK) を産生する。従って、この特
別な特異性を確立するメカニズム (mechanism) が存在するはずである。ここで
、我々は、PDK1 基質のリン酸化にふさわしいモデルを描写する。このリン酸化
は、本明細書に記載の結果により支持され、更に公表された観測に一致する。こ
のモデルにおいて、PDK1活性は、調節される必要は無い。むしろ、PKB 以外の基
質に係る修飾 (modifications)、これらキナーゼの C 末端疎水性ポケットの、P
DK1 の PIF 結合ポケットとの直接的な相互作用を許容できるだろう。これら基
質との相互作用が、ここでいう PDK1 の時間的及び空間的特異性を確立する調節
工程になるだろう。合成後、PKCζは、PDK1 との直接的な相互作用を可能とする
コンホメーション (conformation) になるだろう。従って、PKCζは本質的にリ
ン酸化される []。293 細胞において PRK2 の過剰発現は、同様の活性な (リン
酸化された) 酵素を導き出すが、PRK2 の PDK1 との相互作用が Rho により調節
されうると示唆される []。SGK 及び S6K は、PDK1 との相互作用を許容するた
めにリン酸化により修飾されるはずであって、自己リン酸化及び自己活性化を促
す。PKBとPDK1との間の主な相互作用は、PtdIns(3,4,5)P3に依存し、おそらく共
局在化を仲介した脂質による可能性がある。ΔPH-PKB リン酸化が、疎水性モチ
ーフ− PIF 結合ポケット相互作用に依存するという理由から、PKB 相互作用に
おいては、PDK1 PIF ポケットは比較的重要でない役割を担うだろう。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年２月１５日（２００２．２．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 9/10 Ｃ０７Ｋ 14/00 ４Ｃ０８４
35/00 19/00 ４Ｈ０４５
Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ１２Ｎ 1/15
19/00 1/19
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21
1/19 9/12
1/21 9/96
5/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ
9/12 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
9/96 33/50 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/48 33/543 ５９５
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
33/50 5/00 Ａ
33/543 ５９５ Ａ６１Ｋ 37/02
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FA11 FB01 FB03
4B024 AA01 AA11 BA10 CA02 GA11
GA25 HA01 HA03 HA17
4B050 CC01 CC04 DD11 EE10 HH02
LL01 LL03
4B063 QA18 QQ20 QQ35 QR07 QR48
QR57 QR76 QR77 QR80 QR82
QS38
4B065 AA01X AA57X AA72X AA88X
AA90X AA91Y AB01 AC14
BA02 CA29 CA44 CA46
4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 BA01
BA02 BA22 CA62 NA14 ZB21
ZB26 ZC35
4H045 AA10 AA20 AA30 BA13 BA14
CA40 DA89 EA20 FA33 FA74
【要約の続き】
Claims (63)
- 【請求項１】 完全長マウスプロテインキナーゼ A (PKA) の Lys76, Leu116, Val80 及び／
又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロテインキナーゼ A の疎
水性ポケットに等価な位置において、前記疎水性ポケットを有するプロテインキ
ナーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法であって、 前記化合物が、前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼと相互作用ポリ
ペプチドとの相互作用を阻害、促進又は模倣する能力を測定して、前記相互作用
を阻害、促進又は模倣する化合物を選択し、 前記相互作用ポリペプチドが、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列
Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、前記プロテインキナーゼの前記
疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr を有する方法。 - 【請求項２】 前記ポリペプチドがアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr を
有し、Zaa が負に荷電したアミノ酸残基を示す、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記ポリペプチドがアミノ酸配列 Phe-Xaa-Xaa-Phe を有する、請求項１記載
の方法。 - 【請求項４】 前記プロテインキナーゼが PDK1 である、請求項１、２又は３記載の方法。
- 【請求項５】 前記プロテインキナーゼが SGK, PKB, PKA, p70 S6 キナーゼ, p90 RSK, PKC
α, PKCδ, PKCζ 又は PRK2 である、請求項１、２又は３記載の方法。 - 【請求項６】 前記相互作用が、前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットとアミノ酸配
列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するポリペプチドとの相互作用である、前項
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 前記相互作用ポリペプチドが、前記プロテインキナーゼと同じポリペプチド鎖
の一部である、前項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 前記相互作用が分子内相互作用である、請求項７記載の方法。
- 【請求項９】 前記化合物が、前記プロテインキナーゼと前記相互作用ポリペプチドとの相互
作用を阻害、促進又は模倣する能力を、表面プラズモン共鳴を用いて測定する、
先行する請求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのプロテ
インキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法であって、 前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリン酸化
速度又はリン酸化度に係る前記化合物の有効性を、相互作用ポリペプチドの存在
下で前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼにより測定して、前記リン酸
化速度又はリン酸化度を調整する化合物を選択し、 前記相互作用ポリペプチドが、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、前記プロテインキナーゼの前記
疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr を有し、かつ、前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのセパレート
ポリペプチド鎖に有され、 前記基質ポリペプチドが 400 個のアミノ酸より少ない、方法。 - 【請求項１１】 前記基質ポリペプチドが、前記相互作用ポリペプチドの一部分を有する、請求
項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 前記プロテインキナーゼが PDK1 であり、かつ、前記基質ポリペプチドが配列 KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC を有するか、又は、この配列から
なる、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 基質部分及び相互作用部分が、セパレートポリペプチド鎖に存する、請求項１
０記載の方法。 - 【請求項１４】 前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼがPDK1 であり、前記基質ポリ
ペプチドが配列 KTFCGTPEYLAPEV を有するか又はこの配列からなり、更に、前記
相互作用ポリペプチドが配列 EPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC を有するか又はこの配
列からなる、請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのプロテ
インキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法であって、 前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリン酸化
速度又はリン酸化度に係る前記化合物の有効性を、前記疎水性ポケットを含むプ
ロテインキナーゼにより測定して、前記リン酸化速度又はリン酸化度を調整する
化合物を選択し、 前記化合物の前記有効性を、相互作用ポリペプチドの不存在下において決定し
、 相互作用ポリペプチドが、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、前記プロテインキナーゼの前記
疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr を有し、 前記基質ポリペプチドが 400 個のアミノ酸より少ない、方法。 - 【請求項１６】 疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼが PDK1 であり、かつ、前記基質ポ
リペプチドが、アミノ酸配列 KTFCGTPEYLAPEV 又は KTFCGTPEYLAPEVRR からなる
か又はこの配列を有する、請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 先行する請求項のいずれかに規定したような疎水性ポケットを含むプロテイン
キナーゼの活性を調整する化合物を選択又は設計する方法であって、 前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼと相互作用すると予測される化
合物を選択又は設計する分子モデリング手段を用いる工程を有し、 化合物の三次元構造を、前記疎水性ポケットの三次元構造、及び／又は、先行
する請求項のいずれかに規定したような相互作用ポリペプチドの三次元構造と比
較し、 前記疎水性ポケットと相互作用すると予測される化合物を選択する、方法。 - 【請求項１８】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのプロテ
インキナーゼ活性を調整可能な化合物であって、 前記化合物が、 前記プロテインキナーゼと相互作用ポリペプチドとの相互作用を阻害し、 前記相互作用ポリペプチドが、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、又は、前記プロテインキナーゼの前記疎水
性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr
を有し、 前記化合物が、 アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr を有するポリペプチド
を有さず、更に、PKA でもない、化合物。 - 【請求項１９】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのプロテ
インキナーゼ活性を調整可能な化合物であって、 前記化合物が、 前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリン酸化
速度又はリン酸化度を、相互作用ポリペプチドの不存在下で前記疎水性ポケット
を含むプロテインキナーゼによって調整し、 相互作用ポリペプチドが、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列
Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、又は、前記プロテインキナーゼの疎水性ポケ
ットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、 前記基質ポリペプチドが、400 個のアミノ酸より少ない、化合物。 - 【請求項２０】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのプロテ
インキナーゼ活性を調整する化合物であって、 前記化合物が、 前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの基質ポリペプチドのリン酸化
速度又はリン酸化度を、相互作用ポリペプチドの存在下で前記疎水性ポケットを
含むプロテインキナーゼによって調整し、 相互作用ポリペプチドが、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列
Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、又は、前記プロテインキナーゼの疎水性ポケ
ットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、
かつ、前記疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのセパレートポリペプチド
鎖に有され、 前記基質ポリペプチドが、 400 個のアミノ酸より少ない、化合物。 - 【請求項２１】 前記化合物が、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr を有す
るポリペプチドでもなく、完全長 PKA でもないという条件下で、請求項１〜１
７のいずれか一つに記載の方法により同定可能な化合物。 - 【請求項２２】 突然変異したプロテインキナーゼであって、 突然変異前のプロテインキナーゼが、 完全長マウスプロテインキナーゼ A のLys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys
111 を含む残基により規定されるマウスプロテインキナーゼ A (PKA) の疎水性
ポケットに等価な位置に疎水性ポケットを有し、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットを規定する一つ又はそれ以上の 残基が、突然変異する、突然変異したプロテインキナーゼ。 - 【請求項２３】 突然変異前のプロテインキナーゼが PDK1, SGK, p70 S6 キナーゼ 又は PKB
である、請求項２２記載の突然変異したプロテインキナーゼ。 - 【請求項２４】 突然変異した残基が、完全長マウス PKA の残基 Lys76, Val80, Lys111 及び
／又は Leu116 に等価な残基である、請求項２３記載の突然変異したプロテイン
キナーゼ。 - 【請求項２５】 完全長マウス PKA の残基 Lys76 に等価な位置の残基が Ala に突然変異しか
つ完全長マウス PKA の残基 Leu116 に等価な位置の残基が Ser, Asp 若しくは
Gluに突然変異するか、又は、完全長マウス PKA の残基 Lys76 に等価な位置の
残基が Ala に突然変異するか若しくは完全長マウス PKA の残基 Leu116 に等価
な位置の残基が Ser, Asp 若しくは Gluに突然変異する、請求項２４記載の突然
変異したプロテインキナーゼ。 - 【請求項２６】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼ、及び第
二の、相互作用化合物を有する調製であって、 前記相互作用化合物が、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列
Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、前記プロテインキナーゼの前記
疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr を有し、 前記調製が、更に、 請求項１０〜１６のいずれかに規定したような基質ポリペプチドを有し、かつ
、前記プロテインキナーゼ又は化合物が天然に発見された細胞において発見され
た全ての成分を有さない、調製。 - 【請求項２７】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼ、及び第
二の、相互作用化合物を有する調製であって、 前記相互作用化合物が、前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互
作用し、 前記調製が、前記プロテインキナーゼ又は化合物が天然に発見された細胞にお
いて発見された全ての成分を有さず、 前記プロテインキナーゼが PDK1 である場合、前記相互作用化合物が、アミノ
酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr を有するポリペプチドではない
、調製。 - 【請求項２８】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼに適した
基質ポリペプチドをリン酸化する方法であって、 請求項２７記載の調製を用いる、方法。 - 【請求項２９】 完全長ヒト p70 S6 キナーゼの Thr412 に等価な残基について p70 S6 キナー
ゼをリン酸化する方法であって、 前記 p70 S6 キナーゼを組換え PDK1 に暴露する、方法。 - 【請求項３０】 完全長ヒト p70 S6 キナーゼのThr412 に等価な残基について p70 S6 キナー
ゼの活性化及び／又はリン酸化を PDK1 によって調整する化合物を同定する方法
であって、 前記化合物が一濃度よりも大きい濃度で存在する状態において、完全長ヒト p
70 S6 キナーゼのThr412 に等価な残基について p70 S6 キナーゼの PDK1 によ
る前記活性化及び／又はリン酸化を測定する、方法。 - 【請求項３１】 請求項３０記載の方法により同定した又は同定可能な化合物。
- 【請求項３２】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼを安定化
させる方法での、請求項１に規定したような相互作用ポリペプチド、又は、請求
項１８〜２１のいずれかに規定したような化合物の用途であって、 前記プロテインキナーゼを前記化合物又はポリペプチドに暴露する、用途。 - 【請求項３３】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼのプロテ
インキナーゼ活性を細胞中で調整する方法であって、 組換え相互作用ポリペプチドを細胞中で発現させ、 この相互作用ポリペプチドが、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列
Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、前記プロテインキナーゼの前記
疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr を有する、方法。 - 【請求項３４】 アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するポリペプチドであって、 前記ポリペプチドが、 アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr 又は Phe/Tyr-Xaa-Xaa-
Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyr を有さず、更に、完全長 PKA ではない、ポリペプチ
ド。 - 【請求項３５】 完全長 PKA の C 末端 223 個のアミノ酸を有するか、又は、本質的に完全長
PKA の C 末端 223 個のアミノ酸からなる、請求項３４記載のポリペプチド。 - 【請求項３６】 請求項３４又は３５記載のポリペプチドの融合ポリペプチドにおいて、 前記融合ポリペプチドが完全長 PKA ではない、融合ポリペプチド。
- 【請求項３７】 請求項３４〜３６のいずれかに記載のポリペプチド、又は、請求項２２〜２５
のいずれかに記載の突然変異したプロテインキナーゼをエンコードするポリヌク
レオチド。 - 【請求項３８】 請求項３４〜３６のいずれか一つに記載のポリペプチド、又は、請求項２２〜
２５のいずれかに記載の突然変異したプロテインキナーゼを発現するのに適した
組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項３９】 請求項３７又は３８記載のポリヌクレオチドを有する宿主細胞。
- 【請求項４０】 請求項３４〜３６のいずれか一つに記載のポリペプチド、又は、請求項２２〜
２５のいずれかに記載の突然変異したプロテインキナーゼを作製する方法であっ
て、 前記ポリペプチド又は前記突然変異したプロテインキナーゼを発現する請求項
３９記載の宿主細胞の培養と、前記ポリペプチドの単離とを有する、方法。 - 【請求項４１】 請求項４０記載の方法により入手可能なポリペプチド。
- 【請求項４２】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼを発現す
るのに適した組換え核酸、及び、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有
する第二のポリペプチドを発現するのに適した組換え核酸を含む細胞であって、 前記プロテインキナーゼが PDK1 である場合、前記第二のポリペプチドが EDV
KKHPFFRLIDWSALMDKKVKPPFIPTIRGREDVSNFDDEFTSEAPILTPPREPRILSEEEQEMFRDFDYIAD
WC (PIF) ではなく、更に、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Ph
e/Tyr も有さない、細胞。 - 【請求項４３】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼ、及び、
第二の、相互作用ポリペプチドを有する調製を行う方法であって、 前記相互作用ポリペプチドが、前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケット
と相互作用し、 前記調製が、前記プロテインキナーゼ又は化合物が天然に発見された細胞にお
いて発見された全ての成分を有さず、 前記プロテインキナーゼが PDK1 である場合、前記相互作用ポリペプチドが、
アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr を有するポリペプチドで
はなく、 前記プロテインキナーゼ及び前記相互作用ポリペプチドが、請求項４２記載の
細胞で共発現する、方法。 - 【請求項４４】 請求項１〜１６のいずれか一つに記載の方法を実施するのに有用なパーツキッ
トであって、 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼ及びセパ
レート相互作用ポリペプチドを有し、 前記相互作用ポリペプチドが、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列
Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、前記プロテインキナーゼの前記
疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr を有し、かつ、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Zaa-Phe/Tyr 又は P
he/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr-Ser/Thr-Phe/Tyr を有さない、パーツキット。 - 【請求項４５】 請求項１０〜１６のいずれか一つに記載の方法を実施するのに有用なパーツキ
ットであって、 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼと、請求
項１０〜１６のいずれか一つに規定したような基質ポリペプチドとを有し、更に
、任意にセパレート相互作用ポリペプチドを有し、 前記相互作用ポリペプチドが、 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列
Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか、又は、前記プロテインキナーゼの前記
疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr を有する、パーツキット。 - 【請求項４６】 請求項１８〜２１若しくは３１記載の医薬用の化合物、請求項３４〜３６のい
ずれかに記載の医薬用のポリペプチド又は請求項３７若しくは３８記載の医薬用
のポリヌクレオチド。 - 【請求項４７】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼによるシ
グナリングの調整を必要とする患者の治療用薬剤の製造において、請求項４６に
規定したような化合物、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの用途。 - 【請求項４８】 前記患者が、がん又は糖尿病を患っているか、又は、アポトーシスの阻害を必
要としており、例えば、発作を含めて組織損傷又は虚血性損傷を既に患っている
、請求項４７記載の用途。 - 【請求項４９】 非重複相互作用部分及び基質部分を有するポリペプチドであって、 前記相互作用部分が、アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有し、かつ
、前記基質部分が、請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテイン
キナーゼによるリン酸化のための共通配列を有し、 前記アミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr 及びリン酸化のための共通配列
を、略 5 個から 100 個の間のアミノ酸に分離する、ポリペプチド。 - 【請求項５０】 請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの疎水性
ポケットと相互作用しかつアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/Tyr を有するか
、又は、請求項１に規定したような疎水性ポケットを含むプロテインキナーゼの
疎水性ポケットと相互作用するか若しくはアミノ酸配列 Phe/Tyr-Xaa-Xaa-Phe/T
yr を有し、表面プラズモン共鳴法において測定表面としての用途に適した粒子
の表面に固定化される相互作用ポリペプチドであって、PIF 又は PIFtide では
ない、相互作用ポリペプチド。 - 【請求項５１】 完全長マウスプロテインキナーゼ A ( PKA ) の Lys76, Leu116, Val80 及び
／又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロテインキナーゼ A の
疎水性ポケットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナ
ーゼのプロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方法であって、 (1) 前記プロテインキナーゼ及び／又はその突然変異体のプロテインキナーゼ
活性に係る検定化合物の有効性を決定する工程と、 (2) ( i ) 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットに結合する基質 (
疎水性ポケット依存性基質 ) 、及び ( ii ) 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットに結合しないか、又は
、第一の前記基質よりも狭い範囲で前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケッ
トに結合する ( PKB のような ) 基質 ( 疎水性ポケット非依存性基質 ) に対して異なる範囲で、前記プロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を
調整可能な化合物を選択する工程と、 を有する、方法。 - 【請求項５２】 前記疎水性ポケット非依存性基質に対してよりも前記疎水性ポケット依存性基
質に対して広い範囲で、前記プロテインキナーゼの前記プロテインキナーゼ活性
を阻害する化合物を選択する、請求項５１記載の方法。 - 【請求項５３】 前記プロテインキナーゼが PDK1 である、請求項５１又は５２記載の方法。
- 【請求項５４】 前記疎水性ポケット依存性基質が SGK, PRK2, S6K1 又は PKCζである、請求
項５３記載の方法。 - 【請求項５５】 前記疎水性ポケット非依存性基質が PKB である、請求項５３又は５４記載の
方法。 - 【請求項５６】 完全長マウスプロテインキナーゼ A (PKA) の Lys76, Leu116, Val80 及び／
又は Lys111 を含む残基によって規定されるマウスプロテインキナーゼ A の疎
水性ポケットに等価な位置において、疎水性ポケットを有するプロテインキナー
ゼ ( 例えば PDK1 ) のプロテインキナーゼ活性を調整する化合物を同定する方
法であって、 下記 ( 1 ) のプロテインキナーゼ活性に係る前記化合物の有効性、又は、下
記 ( 1 ) に対する前記化合物の結合能力を決定する工程を有する、方法。 ( 1 ) 前記プロテインキナーゼの前記疎水性ポケットのうちの少なくとも一部
分を規定する残基、例えば完全長マウス PKA の lysine76 に等価な残基を突然
変異させたプロテインキナーゼ - 【請求項５７】 PDK1 の前記疎水性ポケットのうちの少なくとも一部分を規定する残基を突然
変異させないプロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性に係る前記化合物の
有効性、又は、PDK1 の前記疎水性ポケットのうちの少なくとも一部分を規定す
る残基を突然変異させないプロテインキナーゼに対する前記化合物の結合能力を
決定する工程を更に有する、請求項５６記載の方法。 - 【請求項５８】 疎水性ポケット依存性基質のリン酸化速度又はリン酸化度に係る前記化合物の
有効性を決定する、請求項５１〜５７のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項５９】 疎水性ポケット依存性基質に対するプロテインキナーゼのプロテインキナーゼ
活性を減少させ、かつ、疎水性ポケット非依存性基質に対するプロテインキナー
ゼのプロテインキナーゼ活性に影響を与えないか又は増加させる化合物を選択す
る、請求項５１〜５７のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項６０】 請求項５１〜５９のいずれか一つに記載の方法を実施するのに有用なパーツキ
ットにおいて、 ( 1 ) 請求項５６に規定したような突然変異させたプロテインキナーゼ、及び
／又は、請求項５６に規定したような前記プロテインキナーゼを突然変異させて
いないプロテインキナーゼと、 ( 2 ) 前記プロテインキナーゼの疎水性ポケット依存性基質、及び、前記プロ
テインキナーゼの疎水性ポケット非依存性基質と、 を有する、パーツキット。 - 【請求項６１】 ( 1 ) プロテインキナーゼの疎水性ポケット依存性基質を含む基質のリン酸化
及び ( 2 ) プロテインキナーゼの疎水性ポケット依存性基質を含む基質のリン
酸化の阻害を異なる程度まで必要とする患者の医療用薬剤の製造において、 ( 1 ) プロテインキナーゼの疎水性ポケット依存性基質及び ( 2 ) プロテイ
ンキナーゼの疎水性ポケット非依存性基質のうち、完全長マウスプロテインキナ
ーゼ A (PKA) の Lys76, Leu116, Val80 及び／又は Lys111 を含む残基によっ
て規定されるマウスプロテインキナーゼ A の疎水性ポケットに等価な位置にお
いて疎水性ポケットを有するプロテインキナーゼ ( 例えば PDK1 ) によるリン
酸化速度又はリン酸化度を異なる程度まで阻害可能な化合物の用途。 - 【請求項６２】 前記化合物又は合成物が、 ( 2 ) プロテインキナーゼの疎水性ポケット非依存性基質のプロテインキナー
ゼによるリン酸化速度又はリン酸化度よりも ( 1 ) プロテインキナーゼの疎水
性ポケット依存性基質のプロテインキナーゼによるリン酸化速度又はリン酸化度
を大きく阻害する、請求項６１記載の用途。 - 【請求項６３】 前記患者が糖尿病又はがんを患っている、請求項６１又は６２記載の用途。
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