ES2328033T3 - Modulacion de la actividad quinasa s6 para el tratamiento de la obesidad. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar un agente efectivo en el tratamiento de trastornos de peso que dependen de acumulación de grasa, dicho método comprende las etapas de: i) incubar la quinasa S6 1 con un compuesto; ii) detectar la actividad 1 de quinasa 36; y iii) determinar una modulación inducida por el compuesto en actividad 1 de la quinasa S6 relacionada cuando dicho compuesto está ausente, en donde una alteración de la actividad 1 de la quinasa S6 en la presencia del compuesto es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de trastornos de peso que dependen de acumulación de grasa.
Description
Modulación de la actividad quinasa S6 para el
tratamiento de la obesidad.
La presente invención se relaciona con la
obesidad, en particular el tratamiento de la obesidad con
moduladores de la actividad quinasa S6 (S6K).
La obesidad es una enfermedad metabólica
asociada frecuentemente con resistencia a la insulina y constituye
factor de riesgo para el desarrollo tardío de la diabetes tipo II y
enfermedades cardiovasculares. La resistencia a la insulina ocurre
bien antes del desarrollo de la diabetes tipo II, y hay
sobreproducción de insulina para compensar la resistencia a la
insulina y para mantener los niveles de glucosa normales. La
resistencia a la insulina se puede desarrollar después en la
diabetes tipo II, cuando el páncreas no puede producir más
suficiente insulina para mantener los niveles de glucosa normales.
Las etapas tempranas de la diabetes tipo II se asocian con niveles
elevados de insulina pero como la enfermedad mejora los niveles de
insulina, y la enfermedad avanza el páncreas puede fallar en
producir insulina, que resulta en niveles de glucosa sanguínea
incrementados. La diabetes es un factor de riesgo significativo
para la enfermedad cardiaca y apoplejía y es la causa que conduce a
ceguera y falla renal de fase final.
Existe alrededor del mundo 1 billón de
individuos con sobrepeso con 100 millones clínicamente obesos. Los
costos del cuidado de la salud incrementados para tratar la obesidad
relacionados con enfermedades de los Estados Unidos solo se estiman
en más de \textdollar100 mil millones anualmente. Los métodos
actuales para tratar la obesidad incluyen modificación del
comportamiento, dieta, cirugía (gastroplastia), administración de
agentes farmacéuticos que bloquean el apetito estimulando las
señales o la absorción de los nutrientes (grasa), y administración
de agentes que incrementan termogenia o metabolismo de grasa.
Algunos de estos métodos tienen desventajas ya que ellos se basan
en pacientes resolutivos, son invasivos, o tienen efectos
colaterales indeseados. Un entendimiento de los mecanismos por los
que la obesidad se regula puede proporcionar información terapéutica
importante.
Las rutas de señalización intracelulares se han
implicado en varias funciones celulares y el involucramiento de
quinasas en tales rutas proporciona objetivos de fármaco potenciales
para modular una ruta de señalización. Se han llevado a cabo muchos
trabajos con el fin de delinear la ruta de señalización quinasa S6
(S6K). La quinasa S6 es una quinasa que fosforila la proteína
ribosómica, S6. La eliminación del gen S6K1 (también conocido como
p70/p85 S6K) en ratones conduce a la identificación de un homólogo
S6K1, S6K2, que puede compensar parcialmente la función S6K1
bioquímicamente para fosforilar el S6 (Shima et al., 1998,
EMBO J., 17, 6649-6659). No se conoce hasta fecha
la función precisa del S6K2 in vivo.
Ratones deficientes de S6K1 son viables y
fértiles pero exhiben una reducción visible en el tamaño corporal
durante embriogenia, un efecto superado en mayor parte en la etapa
adulta. Una comparación de ratones mutantes homozigotos de 3.5
semanas de edad demuestran que los pesos de todos los órganos son
proporcionales para la reducción del peso corporal. El tamaño
pequeño de los ratones mutantes homozigotos es consistente con un
defecto en la capacidad de conversión (Shima et al., 1998,
EMBO J., 17, 6649-6659).
Ratones deficientes de S6K1 son
hipoinsulinémicos y medianamente intolerantes a la glucosa, no
debida a una lesión en la producción de insulina o sensibilidad de
glucosa, pero si a una reducción en la masa endocrina pancreática,
que se cuenta por una reducción selectiva en el tamaño de células
beta. Así, la hipoinsulinemia y la no resistencia a la insulina se
considera es la lesión principal de la predisposición de ratones
deficientes de S6K1 a la hiperglucemia. El fenotipo observado
cercanamente paralelo forma de diabetes mellitus tipo 2 preclínica,
donde la hipoinsulinemia inducida por mal nutrición predispone a los
individuos a intolerancia a la glucosa (Pende et al., 2000,
Nature, 408, 994-997).
La actividad S6K ha estado implicada en cáncer y
angiogenia. La WO93/19752 describe el uso de rapamicina y sus
derivados como inhibidores de quinasa S6 p70 y su uso para inhibir
la proliferación o la respuesta inmune de una célula. La US
2003/0083284 describe los compuestos anticodificantes para la
inhibición de la expresión de quinasa S6 p70 (que se refiere a las
isoformas 70kDa y nucleares 85kDa). Los ácidos nucleicos
anticodificantes se proponen por ser potencialmente útiles en
tratar infecciones, inflamación y formación de tumor, así como
también trastornos metabólicos. La US2003/0143656 propone que los
compuestos capaces de incrementar la actividad de S6K p70 puede ser
útil en tratar diabetes u obesidad, o puede ser útil en la
inhibición de apoptosis.
Attoub et al. (2001, Faseb J., 14,
2329-2338) muestra que la rapamicina bloquea la
función de leptina, en particular invasión inducida por leptina de
células en geles de colágeno (como un modelo de carcinogenia). La
terapia de leptina se ha utilizado para promover la pérdida de peso
mientras se preserva la masa magra en pacientes obesos con
deficiencia de leptina congénita, que sugiere la leptina en el
tratamiento de obesidad o diabetes.
Subsiste una necesidad de terapias no invasivas
para promover la pérdida de peso en individuos obesos con
especificidad mejorada para evitar efectos colaterales y la presente
invención satisface esta necesidad.
De acuerdo con un primer aspecto de la
invención, se proporciona un método para identificar un agente
efectivo en el tratamiento de trastornos de peso que dependen de
acumulación de grasa, el método comprende las etapas de: i) incubar
la quinasa S6 con un compuesto; ii) detectar la actividad quinasa
S6; y iii) determinar una modulación inducida por el compuesto en
la actividad quinasa S6 relacionada cuando el compuesto está
ausente, en donde una alteración de la actividad quinasa S6 en la
presencia del compuesto es indicadora de un agente efectivo en el
tratamiento de trastornos de peso que dependen de acumulación de
grasa. La modulación inducida por el compuesto es preferiblemente
independiente de un efecto de la actividad de Objetivo Mamífero de
Rapamicina (mTOR). En una realización, la modulación es la
inhibición de la actividad 1 de la quinasa S6 y el trastorno de
peso es obesidad o una afección de sobrepeso. En una realización
alternativa, la modulación es la activación de la actividad 1 de la
quinasa S6 y el trastorno de peso es una afección de bajo peso que
resulta de la insuficiente acumulación de grasa. La actividad
quinasa S6 se puede evaluar convenientemente utilizando S6 o un
péptido como un sustrato y es fácilmente susceptible de análisis de
alto rendimiento.
También se proporcionan por la invención métodos
para la detección de un agente efectivo en el tratamiento de
trastornos de peso, que comprende poner en contacto los componentes
celulares transcripcionalmente activos con un ácido nucleico que
codifica un gen S6K unido operablemente a una secuencia promotora o
una secuencia promotora S6K unida operablemente a un gen indicador
en la presencia de por lo menos un compuesto; y detectar un efecto
del compuesto en la expresión de la quinasa S6 o la actividad
promotora de la quinasa S6, en donde la detección de un incremento
o una reducción en la expresión de quinasa S6 o la actividad
promotora es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de
trastornos de peso que dependen de acumulación de grasa. Tales
ensayos pueden ser ensayos con base en célula, en donde los
componentes celulares transcripcionalmente activos y el ácido
nucleico están presentes en una célula. En realizaciones preferidas,
la quinasa S6 es la quinasa S6 1.
Los ensayos de detección de la invención
incluyen preferiblemente la etapa de detectar un efecto en
acumulación de grasa, metabolismo de grasa o tamaño de adipocito
por el compuesto.
También se abarcan agentes identificados por los
métodos de la invención.
En un aspecto adicional, se proporciona un
método para reducir tamaño de adipocito, que comprende poner en
contacto un adipocito con una cantidad efectiva de un inhibidor 1 de
quinasa S6 (un inhibidor que reduce preferiblemente la actividad 1
de la quinasa S6 que se compara con la quinasa S6 2).
En todavía otro aspecto, se proporcionan los
métodos para tratar un trastorno de peso que depende de acumulación
de grasa, que comprenden administrar a un sujeto una cantidad
farmacéuticamente efectiva de un modulador de quinasa S6. El
modulador S6 pueden ser un inhibidor S6K1, en particular donde el
trastorno de peso es obesidad o una afección de sobrepeso y pueden
incluir anticuerpos inhibidores o fragmentos de los mismos
específicos para la quinasa S6 1 (por ejemplo, preferiblemente
reducir la actividad catalítica de S6K1 comparado con S6K2) o un
anticodificante, ribozima o siARN que preferiblemente reduce la
expresión de la quinasa S6 1 comparado con la quinasa S6 2.
Así, también se proporciona el uso de
moduladores específicos de la quinasa S6 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o tratamiento profiláctico de un
trastorno de peso que depende de la acumulación de grasa, tal como
un inhibidor selectivo de la quinasa S6 1 (por ejemplo, una molécula
anticodificante, una ribozima, un siARN, un anticuerpo o fragmento
del mismo) para el tratamiento o tratamiento profiláctico de una
afección de sobrepeso, tal como obesidad.
También se proporciona por la invención por lo
menos un ARN parcialmente bicatenario que comprende una secuencia
de ácido nucleico de AGUGUUUGACAUAGACCUG (SEQ ID NO: 1) o
AAGGGGGCUAUGGAAAG
GUUU (SEQ ID NO: 2) para uso como un medicamento.
GUUU (SEQ ID NO: 2) para uso como un medicamento.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método para diagnosticar una predisposición a un
trastorno de peso que depende de acumulación de grasa, que
comprende: obtener una muestra de un individuo, detectar el nivel
de la actividad quinasa S6, preferiblemente la actividad 1 de la
quinasa S6, en la muestra y correlacionar un cambio en la actividad
quinasa S6 en la muestra cuando se compara con un valor de control
normal o rango de valores con una predisposición a un trastorno de
peso que dependen de acumulación de grasa. Por ejemplo, un
incremento en la actividad 1 de la quinasa S6 cuando se compara con
un valor de control normal o rango de valores es indicadora de una
predisposición a la obesidad.
La presente invención se basa en el hallazgo que
los ratones deficientes de S6K1 mantienen su bajo peso corporal
relacionado con ratones tipo intacto ya que ellos maduran, aún
cuando se colocan en un dieta alta en grasa. Los ratones
deficientes de S6K1 comen la misma cantidad total de alimento, pero
comparado con el peso corporal, ellos comen mucho más. La disección
de ratones deficientes de S6K1 revela una severa reducción de grasa
blanca y grasa marrón (por ejemplo, en grasa epidedímica), mientras
no se afecta el tamaño del órgano. La reducción en la grasa se debe
a una reducción en el tamaño de la célula de grasa (adipocito). Los
ratones S6K1-/- se protegen contra la acumulación de grasa, debido
a un incremento agudo en la lipolisis basal y una velocidad
metabólica altamente elevada. Así, se espera que la modulación de la
actividad S6K1 será útil en el tratamiento de trastornos de peso.
Aunque el mTOR (objetivo mamífero de rapamicina, que fosforila y
activa la quinasa S6) se puede objetivar directamente para modular
la actividad S6K1, dirigir el objetivo de S6K1 evita la mayor parte
de efectos los colaterales generales de inhibir la actividad mTOR,
por lo que se proporciona más especificidad para el tratamiento de
pacientes con trastornos de peso. En particular, el mTOR se conoce
por activar S6K1 y S6K2, mientras los actuales inventores han
encontrado que es deseable la inhibición selectiva de S6K1.
De acuerdo con lo anterior, la presente
invención proporciona un método para identificar un agente efectivo
en el tratamiento de trastornos de peso que dependen de la
acumulación de grasa, tal como obesidad, con base en la modulación
de la actividad quinasa S6, en particular la actividad 1 de la
quinasa S6. Típicamente tal un método comprenderá las etapas de
incubar la quinasa S6 (o un equivalente funcional o un derivado del
mismo) con un compuesto; detectar la actividad quinasa S6; y
determinar la modulación inducida por el compuesto en la actividad
quinasa S6 relacionada cuando el compuesto está ausente. Una
alteración de la actividad quinasa S6 en la presencia del compuesto
es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de trastornos
de peso. Un ensayo de control en la ausencia del compuesto se puede
correr en paralelo.
A menos que se indique otra cosa clara del
contexto, el "S6K" o "la quinasa S6" se utiliza aquí para
abarcar S6K1 (p70 y p85) y S6K2 (ver, por ejemplo, No. de Acceso
Genebank M57428, AJ007938, AB019245, NM003952 y secuencias
relacionadas), aunque el S6K1 es un objetivo preferido. Los
equivalentes funcionales de ejemplo (variantes) o derivados de S6K
incluyen moléculas donde el S6K se modifica covalentemente mediante
sustitución química, enzimática, u otros medios apropiados con un
grupo funcional diferente a un aminoácido de ocurrencia natural.
Generalmente hablando tales variantes serán
sustancialmente homólogas a la secuencia "tipo intacto" u otras
secuencias especificadas aquí es decir compartirá identidad o
similitud de secuencia en estas. La similitud o identidad puede
estar en la secuencia de nucleótido y/o el nivel de secuencia de
aminoácido codificado, y será preferiblemente, por lo menos
aproximadamente 50%, 60%, o 70%, o 80%, más preferiblemente por lo
menos aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. La comparación
de la secuencia se pueden hacer utilizando FASTA y FASTP (ver
Pearson & Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183:
63-98). Los parámetros se establecen
preferiblemente, utilizando la matriz por defecto, como sigue:
Gapopen (penalidad para el primer residuo en un espacio): -12 para
las proteínas/-16 para el ADN; Gapext (penalidad para residuos
adicionales en un espacio): -2 para las proteínas/-4 para el ADN;
KTUP longitud de palabra: 2 para las proteínas/6 para el ADN. El
análisis para similitud también se puede llevar a cabo utilizando
hibridación. Una fórmula común para calcular las condiciones
restrictivas requeridas para alcanzar la hibridación entre las
moléculas de ácido nucleico de una homología de secuencia
especificada es: Tm = 81.5ºC + 16.6Log [Na+] + 0.41 (% G+C) - 0.63
(% formamida) - 600/#bp en dúplex (Molecular Cloning: a Laboratory
Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring
Harbor Laboratory Press).
Las variantes que retienen características
estructurales comunes pueden ser fragmentos de S6K, en particular
fragmentos que mantienen la actividad catalítica o características
específicas de isoforma. Por ejemplo, las secuencias de terminal
carboxi de S6K1 y S6K2 exhiben solo aproximadamente 20% de identidad
y por lo tanto pueden ser útiles al incluir tales características
específicas de isoforma en fragmentos cuando se desean los ensayos
específicos de isoforma. De forma similar, el S6K1 se puede
fosforilar a T447, que está ausente en S6K2 proporcionando una
característica específica de isoforma adicional o alternativa.
Preferiblemente, los fragmentos estarán entre 50 y 350 aminoácidos
en longitud.
Las variantes de S6K también comprenden mutantes
de las mismas, que pueden contener eliminaciones, adiciones o
sustituciones de aminoácido, sometido al requerimiento para mantener
por lo menos una característica de S6K, preferiblemente la
actividad catalítica y/o características específicas de isoforma
como se describió anteriormente. Así, las sustituciones de
aminoácido conservadoras se pueden hacer sustancialmente sin alterar
la naturaleza de S6K, como muchas truncaciones. Las adiciones y
sustituciones se pueden hacer más aún para los fragmentos de S6K
utilizados en los métodos de detección de la invención, en
particular aquellos que mejoran la actividad catalítica de S6K o
proporciona alguna otra propiedad deseable. Por ejemplo, T389, T229
y S371 en ratones S6K1 (también conocido como p70S6K) son homólogos
a T389, T238 y S380 en Drosophila p70S6K. El T389 particularmente
se indica para la mutación a un residuo de aminoácido acídico con el
fin de producir una quinasa constitutivamente activa. Las proteínas
de fusión con los fragmentos S6K o S6K referidas anteriormente
también pueden ser deseables.
Los ensayos de detección de la invención no se
limitan a cualquier método particular para determinar la actividad
quinasa S6. Los ensayos de quinasa S6 son bien conocidos en la
técnica (ver por ejemplo USPN 6,372,467, que se incorpora aquí como
referencia en su totalidad). En resumen, la quinasa S6 se incubará
con un sustrato adecuado, tal como S6, en un amortiguador que
permite la fosforilación de S6. La fosforilación del sustrato se
puede detectar utilizando un grupo de fosfato marcado, tal como el
uso de la marca radioactiva 32P presente como la fuente ATP en el
amortiguador. Alternativamente, los anticuerpos específicos para los
productos fosforilados de la actividad catalítica S6K se puede
utilizar para detectar la actividad. Como será evidente para
aquellos medianamente expertos en la técnica, los ensayos son
susceptibles a tecnologías de alto rendimiento utilizando procesos
robóticos y automatizados.
Alternativamente, la actividad quinasa S6 se
puede ensayar utilizando un sustrato sintético, tal como aquellos
que comprenden
Arg-(Arg)-Arg-X-X-Ser-X
(por ejemplo, KRRRLASLAA, SEQ ID NO: 3; o KRRRLSSLRASTSK
SESSQK, SEQ ID NO: 4) (Flowtow y Thomas (1992) J. Biol. Chem. 267: 3074-3078.
SESSQK, SEQ ID NO: 4) (Flowtow y Thomas (1992) J. Biol. Chem. 267: 3074-3078.
La actividad S6K también se puede evaluar al
detectar los objetivos de la quinasa en la dirección 3'. Por
ejemplo, el S6K se conoce por afectar la transcripción y traducción
de objetivos específicos, tal como genes con tracto polipirimidina
(5'TOP) y genes ribosómicos. (Fumagalli S, Thomas G. (1999) Ribosmal
Protein S6 Phosphorylation and Signal Transduction. In:
Translational Control. Eds. Hershey, J, Mathews, M, Sonenberg, N.
Cold Spring Harbor Press. pp 695-717).
Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la
invención, se proporciona un método para la detección de un agente
efectivo en el tratamiento de trastornos de peso que dependen de la
acumulación de grasa (por ejemplo obesidad), al identificar
compuestos que modulan la expresión de un gen S6K o un gen expresado
bajo el control de las secuencias reguladoras S6K.
Los métodos comprenden poner en contacto los
componentes celulares transcripcionalmente activos, preferiblemente
en una célula, con un ácido nucleico que codifica un gen S6K unido
operablemente a una secuencia promotora o una secuencia promotora
S6K (u otras regiones reguladoras S6K que permiten la expresión del
gen indicador) unido operablemente a un gen indicador en la
presencia de por lo menos un compuesto; y detectar un efecto del
compuesto en la expresión de la región codificante, por ser la
expresión de quinasa S6 o expresión del gen indicador. Una
reducción o un incremento en la expresión de la quinasa S6 o la
actividad promotora es indicadora de un agente efectivo en el
tratamiento de trastornos de peso. Tales ensayos pueden ser ensayos
con base en célula, donde los componentes celulares
transcripcionalmente activos y el ácido nucleico están presentes en
una célula, aunque los ensayos de transcripción in vitro
también se conocen en la técnica. En realizaciones preferidas, la
quinasa S6 es la quinasa S6.
El gen indicador codifica cualquier molécula
capaz de proporcionar un cambio detectable. Tales moléculas
indicadoras incluyen grupos funcionales fluorescentes (por ejemplo,
proteínas fluorescentes, tal como, proteína fluorescente ciano,
CFP; proteína fluorescente amarilla, YFP; proteína fluorescente
azul, BFP; o proteína fluorescente verde, GFP; todas disponibles
comercialmente, Clontech Living Colors User Manual, antígenos,
enzimas indicadoras y similares. Las enzimas indicadoras incluyen,
pero no se limitan a, los siguientes:
beta-galactosidasa, glucosidasas, cloramfenicol
acetiltransferasa (CAT), glucoronidasas, luciferasa, peroxidasas,
fosfatasas, oxidoreductasas, deshidrogenasas, transferasas,
isomerasas, quinasas, reductasas, desaminasas, catalasas y ureasa.
Al seleccionar una molécula indicadora para ser utilizada en el
método reivindicado actualmente, la molécula indicadora en sí misma
no se debe inactivar mediante cualquier agente putativo u otro
componente presente en el ensayo de detección, que incluye
inactivación mediante cualquier actividad proteasa presente en la
mezcla de ensayo. La selección de una molécula indicadora apropiada
será fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica.
El ácido nucleico proporcionará típicamente en
un vector que permite la replicación en una o más células
anfitrionas seleccionadas, como se conoce bien para una variedad de
bacterias, levadura, y células de mamífero. Por ejemplo, varios
orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles
para vectores de clonación en células de mamífero. El vector puede,
por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula
vírica, fago, o cualquier otro vector adecuado o construcción que
se puede tomar mediante una célula y se utiliza para expresar la
secuencia de interés o gen indicador.
Los vectores de expresión contienen usualmente
un promotor unido operablemente a la secuencia de ácido nucleico
que codifica la proteína de interés, con el fin de dirigir la
síntesis de mARN. Los promotores reconocidos por una variedad de
células anfitrionas potenciales son bien conocidos, como los
promotores S6K1 y S6K2 (secuencias reguladoras en la dirección 5').
"Unido operablemente" significa la unión como parte de la misma
molécula de ácido nucleico, posicionada adecuadamente y orientada
para la transcripción a ser iniciada desde el promotor. El ADN
unido operablemente a un promotor está "bajo control
transcripcional" del promotor. La transcripción de los vectores
en células anfitrionas de mamífero se controla, por ejemplo,
mediante promotores obtenidos de los genomas de los virus tal como
virus polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como
Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar,
citomegalovirus, un retrovirus, virus de la
hepatitis-B y Virus del Simio 40 (SV40), a partir
de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo el promotor
actina o un promotor inmunoglobulina, y de promotores de choque por
calor, dado que tales promotores son compatibles con los sistemas
de célula anfitriona. Los vectores de expresión de la invención
también pueden contener uno o más genes de selección, tal como
genes que confieren resistencia a los antibióticos u otras
toxinas.
Los métodos de la invención pueden por lo tanto
incluir adicionalmente introducir el ácido nucleico en una célula
anfitriona. La introducción, que puede (particularmente para la
introducción in vitro) generalmente referirse sin limitación
como "transformación", puede emplear cualquier técnica
disponible. Para células eucarióticas, las técnicas adecuadas
pueden incluir transfección de fosfato de calcio,
DEAE-Dextrano, electroporación, transfección y
transducción mediada por liposoma utilizando retrovirus u otros
virus, por ejemplo vacuna, como se conoce en la técnica. Ver, por
ejemplo, Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527 537
(1990) y Mansour et al., Nature 336: 348-352
(1988).
Las células anfitrionas transfectadas o
transformadas con vectores de expresión o clonación descritos aquí
se pueden cultivar en el medio de nutriente convencional. Las
condiciones de cultivo, tal como medio, temperatura, pH y
similares, se pueden seleccionar por el artesano experto sin la
debida experimentación. En general, los principios, protocolos, y
técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos
celulares se puede encontrar en "Mammalian Cell Biotechnology: a
Practical Approach", M. Butler, ed. JRL Press, (1991) y Sambrook
et al, supra.
Los ensayos específicos para S6K1 también se
pueden detectar por la unión de las proteínas específicas, tal como
nerabina en el dominio del terminal C de S6K1, como se conoce bien
en la técnica (Burnett PE, Blackshaw S, Lai MM, Qureshi IA, Burnett
AF, Sabatini DM, Snyder SH. La neurabina es una proteína sináptica
unidad a la quinasa S6p70 y el citoesqueleto neuronal. Proc Natl
Acad Sci U S A. 1998 Jul 7; 95 (14): 8351-6).
Así, en otra realización de la invención se
evalúa la inhibición de la interacción de S6K1 con un patrón de
unión. Esto puede comprender (i) poner en contacto S6K1 con un
patrón de unión del mismo en la presencia y ausencia de una
sustancia de prueba; y (ii) determinar si la presencia de una
sustancia de prueba inhibe la interacción entre S6K1 y su patrón de
unión.
Los métodos para evaluar la interacción entre un
polipéptido y un patrón de unión pueden ser cualquiera de los
métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica y que se
describen aquí. Cualquiera de estos métodos se puede utilizar para
evaluar si una sustancia de prueba inhibe la interacción entre un
polipéptido (en este caso S6K1) y un patrón de unión.
En una realización, los ensayos son aquellos con
base en S6K1 y su interacción con neurabina y que comprende la
etapa de determinar si la sustancia de prueba inhibe la interacción
entre S6K1 y neurabina. Esto se puede logar al detectar la
asociación física entre S6K1 y su patrón de unión aunque se marca
con una marca detectable y se pone en contacto con la otra que se
ha inmovilizado en un soporte sólido. Las marcas detectables
adecuadas incluyen 35S-metionina que se puede
incorporar en el S6K1 recombinantemente producido y/o el patrón de
unión del mismo. El S6K1 recombinantemente producido y/o el patrón
de unión también se puede expresar como una proteína de fusión que
contiene un epítopo que se puede marcar con un anticuerpo.
Alternativamente, la marca doble se puede utilizar como se conoce
bien en la técnica, por ejemplo, utilizando una marca radioactiva y
un cintillante.
Generalmente, una proteína que se inmoviliza en
un soporte sólido se puede inmovilizar utilizando un anticuerpo
contra el que la proteína se une a un soporte sólido o por vía de
otras tecnologías que se conocen per se. Una interacción
in vitro preferida puede utilizar una proteína de fusión que
incluye una etiqueta, tal como
glutationa-S-transferasa (GST) o
His6. La etiqueta se puede inmovilizar mediante interacción de
afinidad, por ejemplo en glóbulos de glutationa agarosa o matrices
Ni, respectivamente.
En un formato de ensayo in Vitro del tipo
descrito anteriormente el compuesto inhibidor putativo se puede
evaluar al determinar su capacidad para modular la cantidad de S6K1
marcado o el patrón de unión que une al patrón de unión
inmovilizado, por ejemplo, el patrón de unión GST o
GST-S6K1 como puede ser el caso. Esto se puede
determinar al fraccionar los glóbulos de
glutationa-agarosa mediante electrofóresis de gel
SDS-poliacrilamida. Alternativamente, los glóbulos
se pueden enjuagar para remover la proteína no unida y la cantidad
de proteína que ha unido se puede determinar al contar la cantidad
de marca presente en, por ejemplo, un contador de cintilleo
adecuado.
Alternativamente un anticuerpo adherido a un
soporte sólido y dirigido contra uno de S6K1 o el patrón de unión
se puede utilizar en lugar de GST para adherir la molécula al
soporte sólido. Los anticuerpos contra S6K1 y sus patrones de unión
se pueden obtener en una variedad de formas conocidas como tal en la
técnica. En un modo alternativo, uno de S6K1 y su patrón de unión
se puede marcar con un grupo funcional donante fluorescente y la
otra marcada con un receptor, que es capaz de reducir la emisión del
donante. Esto permite un ensayo de acuerdo con la invención a ser
conducido mediante transferencia de energía de resonancia
fluorescente (FRET). En este modo, la señal de fluorescencia del
donante se alterará cuando el S6K1 y su patrón de unión interactúan.
La presencia de un inhibidor candidato que modula la interacción
incrementará la cantidad de señal de fluorescencia del donante.
El FRET es una técnica conocida per se en
el arte y así el donante preciso y las moléculas receptoras y los
medios por los cuales ellos se ligan a S6K1 y su patrón de unión se
puede realizar por la referencia de la literatura.
Los grupos funcionales donantes fluorescentes
adecuados son aquellos capaces de transferir energía fluorogénica a
otra molécula fluorogénica o parte de un compuesto e incluye, pero
no se limita a, coumarinas y tintes relacionados tal como
fluoresceínas, rodoles y rodaminas, resorufinas, tintes cianina,
bimanes, acridinas, isoindoles, tintes dansilo, hidrazinas
aminoftálicas tal como luminol y derivados isoluminol,
aminoftlimidas, aminonaftalimidas, aminobenzofuranos,
aminoquinolinas, dicianohidroquinonas, y europio y complejos terbio
y compuestos relacionados.
Los receptores adecuados incluyen, pero no se
limitan a, coumarinas y fluoroforos relacionados, xantenos tal como
fluoresceínas, rodoles y rodaminas, resorufinas, cianinas,
difluoroboradiazaindacenos, y ftalocianinas.
Un donante preferido es fluoresceína y los
receptores preferidos incluyen rodamina y carbocianina. Los
derivados isotiocianato de esta fluoresceína y rodamina,
disponibles de Aldrich Chemical Company Ltd, Gillingham, Dorset,
UK, se pueden utilizar para marcar el S6K1 y su patrón de unión.
Para la adhesión de carbocianina, ver por ejemplo Guo et al,
J. Biol. Chem., 270; 27562-8, 1995.
Los ensayos de la invención también se pueden
desarrollar in vivo. Tal un ensayo se puede desarrollar en
cualquier célula anfitriona adecuada, por ejemplo una bacteria,
levadura, insecto o células anfitrionas de mamífero y las células
anfitrionas de mamífero son particularmente adecuadas. Para
desarrollar tal un ensayo in vivo, las construcciones
capaces de expresar S6K1 y su patrón de unión y una construcción de
gen indicador se pueden introducir en las células. Esto se puede
llevar a cabo mediante cualquier técnica adecuada, por ejemplo
precipitación o electroporación de fosfato de calcio. Las
construcciones se pueden expresar transitoriamente o como episomas
estables, o se integran en el genoma de la célula anfitriona.
Los ensayos In vivo también pueden tomar
la forma de ensayos de dos híbridos. Los ensayos de dos híbridos
pueden ser de acuerdo con aquellos descritos por Fields and Song,
1989, Nature 340; 245-246. En tal un ensayo el
dominio de unión de ADN (DBD) y el dominio de activación
transcripcional (TAD) de la levadura del factor de transcripción
GAL4 se fusionan a la primera y segunda moléculas respectivamente
cuya interacción se investiga. Un factor de transcripción GAL4
funcional se almacena solo cuando dos moléculas de interés
interactúan. Así, la interacción de las moléculas se puede medir
mediante el uso de un gen indicador unido operablemente a un sitio
de unión de ADN GAL4, que es capaz de activar la transcripción de
dicho gen indicador. Otros dominios de activador transcripcional se
pueden utilizar en lugar del GAL4 TAD, por ejemplo el dominio de
activación VP16 vírico.
Independiente de la forma del ensayo utilizado,
ellos típicamente correrán con los controles de rutina adecuados
para aquellos expertos en la técnica y se utiliza preferiblemente
para detectar los compuestos que pueden estar presentes en
colección de molécula pequeña, colecciones de péptido, colección de
presentación de fago o colección de producto natural. Los
inhibidores putativo o actual u otros moduladores se pueden
proporcionar de cualquier fuente que se desea para detectar, y
pueden o no pueden ser de ocurrencia natural o sintético, y pueden
o no pueden ser péptidos o polipéptidos (por ejemplo anticuerpos) o
los ácidos nucleicos (por ejemplo siARN). Los inhibidores
preferidos más adecuados para las aplicaciones terapéuticas serán
moléculas pequeñas por ejemplo de una colección combinatorial tal
como ahora se conocen bien en la técnica (ver por ejemplo Newton
(1997) Expert Opinion Therapeutic Patents, 7 (10):
1183-1194). Las sustancias candidato preferidas
pueden incluir moléculas pequeñas tal como inhibidores PKC.
Una modulación inducida por el compuesto de la
actividad S6K significa que existe un cambio en la actividad S6K
(actividad enzimática, actividad de señalización para objetivos en
la dirección 3', la actividad promotora o expresión) en la
presencia del compuesto relacionado cuando el compuesto está
ausente. En particular un compuesto que induce la inhibición de la
actividad S6K se refleja por una reducción en la actividad S6K
relacionada cuando el compuesto está ausente. Por el contrario, un
compuesto que induce la activación de la actividad S6 se refleja
por un incremento en la actividad S6K.
Los activadores e inhibidores se refieren
colectivamente aquí como moduladores y preferiblemente la influencia
de la actividad quinasa de S6K directamente. Los ensayos se llevan
a cabo utilizando componentes reconstituidos que se pueden diseñar
fácilmente para lograr inhibición directa (es decir, inhibición
específica de la actividad catalítica de S6K y la no inhibición de
la formación de la quinasa activa, por ejemplo, a través de la
acción de mTOR). Típicamente, la actividad 1 de la quinasa S6 se
inhibirá selectivamente (es decir, preferiblemente sobre la
actividad 2 de quinasa S6 y otras quinasas y enzimas.), en
particular cuando se desea la inhibición 1 de la señalización de
quinasa S6 en tejido adiposo y pérdida de peso. Por el contrario, la
actividad S6K1 se puede activar o la actividad S6K2 se inhibe
cuando el trastorno de peso es una afección de bajo peso que
resulta de la acumulación de grasa insuficiente.
Los inhibidores S6K son compuestos que reducen
la actividad S6K, por ejemplo, la actividad S6K1 o S6K2. Por
ejemplo, los compuestos que inhiben la actividad enzimática S6K se
unen típicamente a un sitio de unión ATP en S6K o se unen a un
dominio catalítico de S6K. El compuesto inhibe preferiblemente S6K1
comparado con S6K2 u otras isoformas S6K, dada la diferencia en los
fenotipos observada entre ratones transgénicos S6K1 y S6K2. Así,
aunque los compuestos que inhiben S6K2 o S6K1 y S6K2 (tal como
rapamicina, sus derivados u otros inhibidores mTOR) pueden ser
útiles, la inhibición selectiva de S6K1 es deseable para el
tratamiento de acumulación de grasa excesiva, tal como en obesidad.
Por lo tanto, los inhibidores S6K1 reducirán típicamente la
actividad S6K1 mediante por lo menos 10%, más preferiblemente 20%,
50%, 100% y 200% comparado con el nivel de reducción de la
actividad S6K2. Los ensayos de control se pueden por lo tanto llevar
a cabo, por ejemplo con S6K2 inmunoprecipitado y comparado con S6K1
inmunoprecipitado para establecer la selectividad de un
modulador.
Los métodos de detección de la invención
opcionalmente pueden comprender adicionalmente un ensayo funcional,
que comprende detectar un efecto del modulador en la acumulación de
grasa, metabolismo de grasa o tamaño de adipocito mediante dicho
agente. Los métodos adecuados se establecen en los Ejemplos
adelante.
Los métodos de detección opcionalmente pueden
incluir la etapa de administrar un modulador potencial para un
animal no humano que tiene un gen de quinasa S6 y determinar si la
pérdida o ganancia de peso (en particular acumulación de grasa) se
afecta con relación cuando el compuesto está ausente. Los animales
no humanos serán típicamente mamíferos de laboratorio tal como
ratones o ratas y varias dosis se pueden administrar oralmente
mezcladas con el alimento o mediante cualesquier otros medios
apropiados, que se pueden seleccionar dependiendo de las
propiedades del compuesto, tal como estabilidad y suministro
objetivo. El gen de quinasa S6 puede ser de una especie diferente
como el mamífero de laboratorio, por ejemplo, el uso de un ratón
comprende un gen S6K humano, que reemplaza el gen del ratón S6K,
será particularmente útil para determinar los efectos de los
agentes en S6K humano sin utilizar sujetos humanos.
La potencia y eficacia de los compuestos para
inhibición del S6K1 también se pueden evaluar utilizando un modelo
de animal para la obesidad (por ejemplo ratones ob/ob) y se compara
con ratones transgénicos S6K1.
Los equipos útiles para la detección de tales
compuestos también se pueden preparar de acuerdo con la invención,
y comprenderán esencialmente S6K o un fragmento del mismo útil para
la detección, e instrucciones. Típicamente el polipéptido S6K se
proporcionará junto con medios para detectar la actividad S6K y por
lo menos un compuesto (agente putativo) u otra sustancia descrita
aquí útil para llevar a cabo los métodos de detección.
El S6K para uso en equipos de acuerdo con la
invención se puede proporcionar en la forma de una proteína, por
ejemplo en solución, suspensión o liofilizada, o en la forma de una
secuencia de ácido nucleico que permite la producción de S6K o un
fragmento del mismo en un sistema de expresión, opcionalmente in
situ.
Los compuestos (por ejemplo, agentes putativos)
pueden ser inorgánicos u orgánicos, por ejemplo, un antibiótico,
anticuerpo, polipéptido o péptido, y se aíslan típicamente o se
purifican. Una composición "aislada" o "purificada" es
sustancialmente libre de material celular u otras proteínas
contaminantes de la fuente de célula o tejido del que este se
deriva, o sustancialmente libre de los precursores químicos u otros
químicos cuando se sintetizan químicamente. Un polipéptido que es
sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones del
polipéptido en el que el polipéptido se separa de los componentes
celulares de las células de las cuales este se aísla, por ejemplo,
el polipéptido se produce recombinantemente. Preferiblemente, una
preparación de un compuesto terapéutico, por ejemplo, un inhibidor
S6K, es por lo menos 75%, más preferiblemente 80%, más
preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente
95%, más preferiblemente 98%, y más preferiblemente 99 o 100% del
peso seco de la preparación. Las mezclas de los compuestos también
se pueden probar durante las etapas iniciales de
detección.
detección.
Los compuestos por lo tanto pueden incluir
anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales, que son
específicos para S6K, en particular S6K1, en el sentido de ser
capaces de distinguir entre el polipéptido que es capaz de unión y
otros polipéptidos de la misma especie para el que este no tiene o
sustancialmente no tiene afinidad de unión (por ejemplo una
afinidad de unión de por lo menos aproximadamente 1000x peor). Los
anticuerpos específicos unen un epítopo en la molécula que no está
presente o no es accesible en otras moléculas. Por ejemplo, para la
inhibición específica de isoforma (inhibición selectiva de la
actividad S6K1 sobre la actividad S6K2), el anticuerpo puede
interferir con el dominio de terminal C de S6K, que no se conserva
altamente entre S6K1 y S6K2. Los anticuerpos se pueden obtener
utilizando técnicas que son estándar en el arte. Por ejemplo, los
anticuerpos se pueden obtener de animales inmunizados utilizando
cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en el arte, y
detectándolos, preferiblemente utilizando la unión del anticuerpo
al antígeno de interés. Por ejemplo, se pueden utilizar las técnicas
Western blott o inmunoprecipitación (Armitage et al, Nature,
357: 80-82, 1992).
Como una alternativa o complemento para
inmunizar un mamífero con un péptido, un anticuerpo específico para
una proteína se puede obtener de una colección producida
recombinantemente de dominios variables de inmunoglobulina
expresada, por ejemplo utilizando bacteriófago lambda o bacteriófago
filamentoso que exhibe los dominios de unión de inmunoglobulina
funcionales en sus superficies; por ejemplo ver WO92/01047.
Los anticuerpos se pueden modificar en un número
de formas e incluyen fragmentos de anticuerpo, derivados,
equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, que incluyen
moléculas sintéticas y moléculas cuyas formas imitan aquella de un
anticuerpo que le permite unirse a un antígeno o epítopo. Los
fragmentos de anticuerpo de ejemplo, capaces de unir un antígeno u
otro patrón de unión son el fragmento Fab que consiste de los
dominios VL, VH, Cl y CHl; el fragmento Fd consiste de los dominios
VH y CHl; el fragmento Fv consiste de los dominios VL y VH de un
brazo único de un anticuerpo; el fragmento dAb que consiste de un
dominio VH; las regiones CDR aisladas y los fragmentos
F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos
Fab unidos a un puente disulfuro en la región de articulación.
También se incluyen los fragmentos Fv de cadena.
También se incluyen dentro de la presente
invención, los anticuerpos humanizados en los que los CDR de una
fuente no humana se injertan en regiones de estructura humana,
típicamente con la alteración de algunos de los residuos de
estructura de aminoácido, proporciona anticuerpos que son menos
inmunogénicos que los anticuerpos no humanos padre.
Como es evidente para un experto en la técnica,
un anticuerpo monoclonal se puede someter a técnicas de tecnología
de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas
quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original.
Tales técnicas pueden involucrar introducir el ADN que codifica la
región variable inmunoglobulina, o las regiones determinantes
complementarias (CDR), de un anticuerpo en las regiones constantes,
o regiones constantes más regiones de estructura, de una
inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo,
EP-A-184187,
GB-A-2188638 o
EP-A-0239400. La clonación y la
expresión de anticuerpos quiméricos se describen en la
EP-A-0120694 y
EP-A-0125023.
También se pueden utilizar péptidos como
inhibidores de la actividad S6K, tal como un péptido sintético que
contiene un dominio autoinhibidor putativo (residuos quinasa S6 1
400-432; Flowtow y Thomas, 1992) o de hecho los
sustratos sintéticos referidos anteriormente (por ejemplo, S6
230-249, Ala 235), que se pueden utilizar
adicionalmente para modelar nuevos inhibidores.
Alternativamente, la actividad S6K en una célula
se puede reducir utilizando los ácidos nucleicos, por ejemplo
mediante silenciamiento pre- o post-transcripcional.
Así, la secuencia S6K (en particular las secuencias específicas a
S6K1) se puedn insertar en los vectores como se describió
anteriormente en una orientación anticodificante con el fin de
proporcionar la producción de ARN anticodificante o ribozimas.
Las secuencias de ácido nucleico selectivas para
S6K1 sobre S6K2 incluyen aquellas que codifican los aminoácidos 33
-77 y los aminoácidos 454-525 (numeración que se
refiere a la SEQ ID NO: 3 en US2003/0083284, que se incorpora aquí
como referencia) o porciones del mismo, que son típicamente por lo
menos 15, 18 o más nucleótidos en longitud. Las comparaciones de
secuencia se pueden hacer esencialmente como se describió
anteriormente utilizando FASTA y FASTP (ver Pearson & Lipman,
1988. Methods in Enzymology 183: 63-98) para
establecer la especificidad de las secuencias.
Una alternativa para anticodificar es el uso de
ARN bicatenario (dsARN), que se ha encontrado que es aún más
efectivo en el silenciamiento de gen que el anticodificante solo
(Fire A. et al Nature, Vol 391, (1998)). El dsARN que media
el silenciamiento es el gen específico y frecuentemente se denomina
interferencia de ARN (ARNi) (ver también Fire (1999) Trends Genet.
15: 358-363, Sharp (2001) Genes Dev. 15:
485-490, Hammond et al. (2001) Nature Rev.
Genes 2: 1110-1119 y Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2:
239-245).
La interferencia de ARN es un proceso de dos
etapas. Primero, el dsARN se divide dentro de la célula para
producir los ARN de interferencia corto (siARN) de aproximadamente
21-23nt de longitud con fosfato de terminal 5' y
salientes cortas 3' (\sim2nt). Los siARN objetivan la secuencia
mARN correspondiente específicamente para la destrucción (Zamore
P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750,
(2001). Así en una realización, la inhibición se logra utilizando
ARN bicatenario que comprende una secuencia que codifica S6K, en
particular una secuencia selectiva para S6K1, que puede ser por
ejemplo un ARN bicatenario (que se procesará para siARN, por
ejemplo, como se describió anteriormente). Los mecanismos de
defensa celular, tal como la ruta PKR típicamente necesitarán ser
eludidas, por ejemplo utilizando siARN dirigido contra los
componentes individuales. Estos productos de ARN se pueden
sintetizar in vitro, por ejemplo, mediante métodos de
síntesis química convencionales.
Sin embargo, para evitar la ruta PKR, se
utilizan preferiblemente los dúplex de siARN sintetizados
químicamente de aproximadamente 21-23 nucleótidos
en longitud con extremos salientes 3' (Zamore PD et al Cell,
101, 25-33, (2000)). Los dúplex de siARN sintéticos
se han mostrado por suprimir específicamente la expresión de genes
endógenos y heterológos en un amplio rango de estirpes celulares de
mamífero (Elbashir SM. et al. Nature, 411,
494-498, (2001)).
Así, los dúplex siARN que contienen entre 20 y
25 bps, más preferiblemente entre 21 y 23 bps, de la secuencia S6K,
en particular secuencias selectivas para S6K1 sobre S6K2, incluyen
formar un aspecto de la invención por ejemplo cuando se producen
sintéticamente, opcionalmente en forma protegida para evitar la
degradación.
Alternativamente el siARN se puede producir de
un vector, in vitro (para recuperación y uso) o in
vivo. De acuerdo con lo anterior, el vector puede comprender
una secuencia de ácido nucleico que codifica S6K (que incluye una
secuencia de ácido nucleico que codifica una variante o fragmento de
la misma), adecuada para introducir un siARN en la células en
cualquiera de las formas conocidas en la técnica, por ejemplo, como
se describe en cualquiera de las referencias citadas aquí, cuyas
referencias se incorporan específicamente aquí como referencia.
En una realización, el vector puede comprender
una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención en la
orientación codificante y anticodificante, de tal manera que cuando
se expresa como las secciones codificantes y anticodificantes de
ARN se asociarán para formar un ARN bicatenario. Esto puede ser por
ejemplo un ARN bicatenario largo (por ejemplo, más de 23nts), que
se puede procesar in vitro con Dicer para producir los siARN
(ver por ejemplo Myers (2003) Nature Biotechnology 21:
324-328) o siARN, las estructuras de pinza.
Alternativamente, las secuencias codificantes o anticodificantes se
proporcionan en diferentes vectores. Estos vectores y los productos
de ARN son útiles, por ejemplo, para inhibir la producción de novo
del polipéptido S6K en una célula. Tales ácidos nucleicos y
vectores se pueden introducir en una célula anfitriona o se
administran a un mamífero en una forma
adecuada.
adecuada.
Así, los ácido nucleicos, tal como siARN se
pueden administrar para inhibir la actividad S6K1. La tecnología de
siARN se puede aplicar rutinariamente con base en las secuencias
específicas para S6K1, tal como AGTGTTTGACA
TAGACCTG (SEQ ID NO: 1) o preferiblemente AAGGGGGCTATGGAAAGGTTT (SEQ ID NO: 2). La expresión objetivo de los siARN se puede lograr utilizando promotores específicos de tejido, tal como promotores específicos para tejido adiposo o hígado.
TAGACCTG (SEQ ID NO: 1) o preferiblemente AAGGGGGCTATGGAAAGGTTT (SEQ ID NO: 2). La expresión objetivo de los siARN se puede lograr utilizando promotores específicos de tejido, tal como promotores específicos para tejido adiposo o hígado.
Para el caso de administración, sin embargo, el
compuesto es preferiblemente una molécula pequeña, que puede unir
al sitio catalítico o sitio de unión ATP. Para la inhibición
específica de isoforma, el compuesto puede interferir con el
dominio de terminal C de S6K, que no se conserva altamente entre
S6K1 y S6K2.
Con el fin de mejorar potencialmente los
moduladores S6K, el S6K aislado se puede utilizar para establecer
la estructura secundaria y terciaria de la proteína completa o por
lo menos de las áreas responsables de la actividad enzimática. Los
métodos convencionales para la identificación de la estructura
dimensional 3 son, por ejemplo, estudios de rayos X o estudios de
RMN. Los datos obtenidos con estos métodos o métodos comparables se
pueden utilizar directamente o indirectamente para la identificación
o mejoramiento de los moduladores de S6K, tal como para
proporcionar selectividad entre S6K1 y S6K2. Un método comúnmente
utilizado a este respecto es, por ejemplo, modelamiento molecular o
diseño de fármaco asistido por computador.
\newpage
Los compuestos de acuerdo con la invención se
pueden identificar mediante detección utilizando las técnicas
descritas aquí anteriormente, y se preparan mediante extracción de
fuentes naturales o genéticamente modificadas de acuerdo con los
procedimientos establecidos, o mediante síntesis, especialmente en
el caso de compuestos químicos de bajo peso molecular. Los
compuestos proteináceos se pueden preparar mediante la expresión en
sistemas de expresión recombinantes, por ejemplo un sistema
baculovirus o en un sistema bacteriano. Los compuestos proteináceos
son principalmente útiles para investigación en la función de las
rutas de señalización, aunque ellos pueden tener una aplicación
terapéutica, tal como anticuerpos inhibidores humanizados dirigidos
contra la quinasa S6 1.
Los compuestos de bajo peso molecular, de otra
parte, se producen preferiblemente mediante síntesis química de
acuerdo con los procedimientos establecidos. Ellos se indican
principalmente como agentes terapéuticos. Los inhibidores PKC, o
derivados o modificaciones de los mismos, se pueden utilizar como
agentes potenciales efectivos en inhibir selectivamente el S6K1 y
en tratar la obesidad u otros trastornos del peso que dependen de
la acumulación de grasa. Los compuestos de bajo peso molecular y los
compuestos inorgánicos en general pueden ser útiles como agentes
para uso en el tratamiento de la obesidad (o afecciones asociadas
con trastornos de peso).
La presente invención también proporciona un
método para reducir el tamaño de adiposito que comprende poner en
contacto un adipocito con una cantidad efectiva de un inhibidor 1 de
quinasa S6. Así, también se proporcionan por la invención
compuestos que modulan directamente la actividad quinasa S6 para uso
en el tratamiento de trastornos de peso que dependen de la
acumulación de grasa, tal como obesidad. En particular, se
proporcionan los compuestos que inhiben selectivamente la actividad
1 de la quinasa S6 sobre la actividad S6K2 para uso en el
tratamiento de afecciones de sobrepeso, tal como obesidad, o para
tratar mamíferos tal como humanos en riesgo de llegar a ser
obesos.
obesos.
Las mujeres quienes tienen sobrepeso o son
obesas antes de la menopausia se considera que tienen una
predisposición al cáncer de mama. Sin desear estar limitado por la
teoría, los actuales inventores consideran que el tejido adiposo
incrementado en individuos con un Mayor Índice de Masa puede
proporcionar energía para llevar al crecimiento de la masa de
cáncer y así los individuos con un Índice de Masa Corporal mayor
están en riesgo de desarrollar cáncer en general. Así, los
compuestos que inhiben selectivamente la actividad S6K1 sobre la
actividad S6K2 pueden ser útiles en tratar una predisposición al
cáncer o una afección cancerosa en individuos obesos en necesidad
de tal tratamiento. Así la descripción aquí se refiere al
tratamiento de obesidad que también aplica a las afecciones
asociadas con los trastornos de peso, tal como afecciones cancerosas
(por ejemplo, cáncer de mama) en individuos con sobrepeso u
obesos.
La obesidad de define normalmente a través de la
determinación del Índice de Masa Corporal (IMC), que se calcula
utilizando una simple fórmula (peso en kg dividido por el cuadrado
del peso en metros). Un IMC calculado de 18.5 a 24.9 se considera
es el peso normal; un IMC de 25-29.9 kg/m^{2}
indica sobrepeso; un IMC de 30-39.9 indica
obesidad; y un IMC de 40 y hacia arriba indica obesidad mórbida. De
forma similar, un IMC calculado de menos de 18.5 se puede
considerar una afección de bajo peso. Alternativamente, se puede
medir la circunferencia de la cintura (distribución de grasa
estimada), relación cintura a cadera (distribución de grasa
estimada), espesor de pliegue de piel (si se mide en varios sitios,
distribución de grasa estimada), o bioimpedancia (con base en el
principio que la masa magra conduce mejor que la masa grasa, es
decir, la masa grasa impide la corriente, % de grasa estimado). Los
individuos con sobrepeso se caracterizan por tener una
circunferencia de cintura de > 94 cm para hombres o > 80 cm
para mujeres y una relación de cintura cadera de > 0.95 en
hombres y > 0.80 en mujeres. Los individuos obesos se
caracterizan por tener una circunferencia de cintura > 102 cm
(40 pulgadas) para hombres o 88 cm (35 pulgadas) para mujeres.
Los moduladores S6K (por ejemplo, inhibidores)
para uso en el tratamiento de trastornos de peso que dependen de la
acumulación de grasa (por ejemplo afecciones de sobrepeso, tal como
obesidad) así se pueden formular como medicamentos de acuerdo con
la metodología convencional, que depende de la naturaleza exacta del
modulador, y típicamente comprenderán el modulador o un precursor
del mismo en asociación con un portador biológicamente aceptable.
Al considerar varias terapias, se entiende que tales terapias se
pueden dirigir a los tejidos que demuestran expresión del S6K1, en
particular en adipocitos.
Los compuestos se administran en una dosis que
es terapéuticamente efectiva. El término "cantidad
terapéuticamente efectiva" como se utiliza aquí significa que la
cantidad de los compuestos o la composición farmacéutica provoca
una respuesta biológica o medicinal benéfica en un tejido, sistema,
animal o humano. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente
efectiva de un compuesto inhibidor S6K1 en una dosis que conduce a
un mejoramiento clínicamente detectable en la pérdida de peso que
resulta de la pérdida de tejido graso.
El tratamiento incluye la administración y el
cuidado de un individuo para el propósito de aliviar un síntoma de
un trastorno de peso que depende de la acumulación de grasa. El
tratamiento incluye la administración de un compuesto para evitar
el inicio de los síntomas o complicaciones del trastorno, aliviar
los síntomas o complicaciones, o eliminar la afección o
trastorno.
El suministro del modulador a las células y
tejidos afectados se pueden llevar a cabo utilizando el empaque
apropiado o los sistemas de administración. Por ejemplo, el
modulador se puede formular para uso terapéutico con agentes
aceptables para la administración farmacéutica y suministrar al
sujeto mediante rutas aceptables para producir un efecto
fisiológico deseado. Una cantidad efectiva es aquella cantidad que
produce el efecto fisiológico deseado, tal como, pérdida de
peso.
En un aspecto adicional de la invención, la
invención también proporciona un modulador (por ejemplo, el
inhibidor selectivo de la quinasa S6 1) para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o tratamiento profiláctico de un
trastorno de peso que depende de la acumulación de grasa (por
ejemplo, obesidad). Los moduladores adecuados, en particular
inhibidores, tal como aquellos identificados en los ensayos
funcionales u otros ensayos discutidos anteriormente, se pueden
incorporar en los medicamentos por ejemplo después de prueba
adicional para toxicidad. Así los métodos relevantes pueden incluir
la etapa adicional de formular un modulador seleccionado como un
medicamento para una enfermedad por ejemplo en el que se desea
controlar trastornos de peso que dependen de la acumulación de
grasa. Tales inhibidores y medicamentos para uso en el tratamiento
de estas enfermedades, y métodos de tratamiento que comprenden su
uso forman aspectos adicionales de la invención.
Las composiciones pueden incluir, en adición a
los constituyentes anteriores, excipientes farmacéuticamente
aceptables, agentes conservantes, solubilizantes, sustancias que
incrementan la viscosidad, agentes estabilizantes, agentes
humectantes, agentes emulsificantes, agentes endulzantes, agentes
colorantes, agentes saborizantes, sales para variar la presión
osmótica, amortiguantes, o agentes de recubrimiento. Tales
materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la
eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador
u otro material puede depender de la ruta de administración.
Ejemplos de técnicas y protocolos se puede encontrar en
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 16th edition, Osol, A.
(ed.), 1980.
Cuando se formula la composición en una
composición farmacéutica, la administración de la misma se puede
efectuar parenteralmente tal como oralmente, nasalmente (por
ejemplo en la forma de pulverizadores nasales) o rectalmente (por
ejemplo en la forma de supositorios). Sin embargo, la administración
también se puede efectuar parenteralmente tal como
intramuscularmente, intravenosamente, cutáneamente, subcutáneamente,
o intraperitonealmente (por ejemplo en la forma de soluciones de
inyección).
Así, por ejemplo, cuando la composición
farmacéutica está en la forma de un comprimido, esto puede incluir
un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Para la
fabricación de comprimidos, comprimidos recubiertos, grajeas y
cápsulas de gelatina dura, los compuestos activos y sus sales de
adición farmacéuticamente aceptables se pueden procesar con
excipientes orgánicos o inorgánicos, farmacéuticamente inertes. Se
pueden utilizar lactosa, maíz, almidón o derivados de los mismos,
talco, ácido esteárico o sus sales etc., por ejemplo, como tales
excipientes para comprimidos, grajeas y cápsulas de gelatina dura.
Los excipientes adecuados para cápsulas de gelatina blanda son, por
ejemplo, aceites vegetales, ceras, grasas, polioles líquidos y
semisólidos etc. Cuando la composición está en la forma de una
formulación farmacéutica líquida, generalmente incluirá un portador
líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales,
aceite mineral o aceite sintético. También se pueden incluir
solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución sacárida o
glicoles tal como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Otros excipientes adecuados para la fabricación de soluciones y
jarabes son, por ejemplo, agua, polioles, sacarosa, azúcar
invertida, glucosa, trehalosa, etc. Los excipientes adecuados para
soluciones de inyección son, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles,
glicerol, aceites vegetales, etc. Para la inyección intravenosa,
cutánea o subcutánea, o infusión intracatéter en el cerebro, el
ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa
parenteralmente aceptable que está libre de pirógeno y tiene pH,
isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos medianamente expertos
son bien capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por
ejemplo, vehículos isotónicos tal como inyección de Cloruro de
Sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactada,
conservantes, estabilizantes, amortiguantes y/o se pueden incluir
otros aditivos, según se requiera.
También se proporcionan métodos para evaluar
tratamientos de trastornos de peso que dependen de la acumulación
de grasa, el método comprende administrar un agente terapéutico (por
ejemplo, identificado por los métodos de detección proporcionados
aquí) a un animal no humano que comprende un gen quinasa S6, en
particular S6K1, y determinar el efecto del agente en ganancia o
pérdida de peso. Alternativamente, una muestra, tal como tejido
adiposo o sangre periférica se pueden retirar y probar para niveles
de S6K o niveles de actividad para establecer un efecto modulador
en S6K.
Adicionalmente, se proporcionan métodos para
evaluar los tratamientos de trastornos de peso, que comprende
administrar un agente terapéutico para un animal no humano
deficiente en la quinasa S6 (tal como un animal transgénico), en
particular deficiente en S6K1, y determinar el efecto del agente.
Tales métodos se pueden utilizar para establecer si cualquiera de
los efectos colaterales indeseados del agente terapéutico están
presentes.
Los actuales inventores han mostrado que los
ratones tipo intacto alimentados con una dieta alta en grasa tienen
actividad S6K1 sorprendentemente elevada, como lo hacen ratones
ob/ob, un modelo de ratón genético de obesidad (ver Ejemplo 9). La
invención por lo tanto también proporciona un método para
diagnosticar una predisposición a un trastorno de peso, que
comprende: obtener una muestra de un individuo, detectar el nivel
de la quinasa S6, preferiblemente la quinasa S6 1, en la muestra y
correlacionar un cambio en la cantidad de la quinasa S6 en la
muestra cuando se compara con un valor de control normal o rango de
valores con una predisposición a un trastorno de peso. La presencia
de la quinasa S6 se puede determinar fácilmente utilizando
anticuerpos o utilizando ensayos de actividad como se describió
anteriormente. La expresión S6K también se puede detectar en el
nivel transcripcional, por ejemplo, utilizando técnicas PCR. Cuando
se detectan los niveles de proteína, los anticuerpos específicos
para S6K2 se pueden utilizar como un control cuando se desean las
mediciones específicas de S6K1. En general, un incremento en la
actividad 1 de la quinasa S6 de por lo menos 10%, preferiblemente
por lo menos 20%, 30%, 40% o 50% cuando se compara con un valor de
control normal o rango de valores es indicadora de una
predisposición a obesidad. Más preferiblemente, el incremento en la
actividad es por lo menos 2 veces que la de un valor de control. La
muestra puede ser cualquier muestra de tejido o fluido corporal,
pero es preferiblemente tejido
adiposo.
adiposo.
Para determinar la actividad quinasa de S6K 1
(independiente de otras isoformas S6K tal como S6K2), se obtiene
una muestra de un sujeto de prueba. Las células presentes en la
muestra se pueden lisar y se extraen las proteínas. Opcionalmente,
se pueden llevar a cabo etapas de purificación adicionales. La
muestra luego se puede someter a inmunoprecipitación utilizando un
anticuerpo específico S6K1, que se conoce en la técnica. Luego de
inmunoprecipitación de S6K1, se puede desarrollar un ensayo de
quinasa estándar como se describió anteriormente.
La invención se describe adicionalmente, solo
para propósitos de ilustración, en los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Métodos de genética molecular, proteína y
bioquímica de péptido e inmunología referidos a pero no descritos
explícitamente en esta descripción y los ejemplos se reportan en la
literatura científica y son bien conocidos por aquellos expertos en
la técnica. Por ejemplo, los métodos estándar en ingeniería genética
se llevan a cabo esencialmente como se describe en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Los ratones deficientes de S6K1 se muestran
previamente por tener una reducción en el tamaño corporal durante
embriogenia pero el efecto se considera que se supera en mayor parte
en la etapa adulta, disminuyendo de 20 a 15% por 11 semanas de
edad. Este Ejemplo demuestra que cuando ellos maduran, los ratones
deficientes de S6K1 mantienen un peso corporal bajo con relación a
los ratones tipo intacto. Los ratones macho en una dieta de
concentrado normal (NCD, 4% de calorías totales derivadas de grasa,
3035 kcal kg-1, KLIBA-NAFAG, Suiza)
son seguidas de un periodo de diecisiete semanas a partir de las
diez semanas de edad.
Los ratones deficientes de S6K1 se generan como
se describe por Shima et al. (1998, EMBO J., 17,
6649-6659). Los ratones se mantienen en un fondo
híbrido derivado de las cepas de ratón C57BI/6 y 129Oia, se alojan
en grupos de 12 (en cajas de 3) y se mantienen en un ciclo de 12
horas de luz/12 horas de oscuridad (se enciende la luz a 06: 00
GMT). El peso corporal se registra semanalmente en los ratones tipo
intacto (p) y ratones deficientes de S6K1 de dieta alimento de
concentrado regular. Inesperadamente, los resultados muestran que
la velocidad en la que los ratones S6K1-/- ganan peso es mucho más
lenta que los ratones intactos, de tal manera que la diferencia en
peso a las veintisiete semanas, cuando se compara con diez semanas,
ha incrementado en 25%. Se debe notar también que los ratones
S6K1-/- exhiben poca variación en el peso cuando se compara con
ratones tipo intacto (p).
Los datos se proporcionan en las Tablas I y II
adelante y muestran que los ratones deficientes de S6K1 son más
pequeños y tienen peso corporal más bajo comparado con el peso.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\newpage
Ejemplo
2
Se diseccionan ratones para determinar la causa
del bajo peso corporal exhibido por los ratones deficientes de S6K1
descritos en el Ejemplo 1. Se muestran ratones deficientes de S6K1
por tener menos almohadillas de grasa
intra-abdominales. Cada masa de grasa y masa de
órgano se pesan del tejido removido de los ratones macho de 6 meses
de edad. La disección de los ratones S6K1 revela una reducción
severa del tejido de grasa adiposo blanco epididímico relacionado
con ratones tipo intacto (0.8% +/- 0.1% comparado con 3.4% +/- 0.1%;
los valores promedian los valores +/- de la media de error
estándar; S.E.M). El porcentaje de tejido adiposo marrón/peso
corporal también se reduce en ratones deficientes de S6K1 (0.5% +/-
0.05% comparado con 1: 0 +/- 0.1%), mientras que el tamaño del
órgano no se afecta esencialmente (ver Tabla III adelante). Se
encuentran también resultados similares en ratones hembra. La
reducción en la grasa no se asocia con una reducción selectiva en
la deposición de la grasa en el hígado o los
músculos.
músculos.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los datos establecen que los ratones S6K1 -/-
han reducido la grasa corporal blanca y la grasa marrón relacionada
con los ratones tipo intacto.
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Ejemplo
3
Para establecer porqué los ratones deficientes
S6K1 exhiben menos grasa, las secciones de tejido adiposo se tiñen
con hematoxilina y eosina y se visualizan por magnificación 20 veces
utilizando un microscopio de histología. El tejido adiposo blanco
epididímico (WAT) y el tejido adiposo marrón de ratones deficientes
de S6K1 exhiben tamaño celular más pequeño cuando se compara con
ratones tipo intacto.
La densidad celular y el tamaño se cuantifican
en las secciones de tejido adiposo de WAT. Los números celulares se
cuentan dentro de un área de 120 x 120 mm en seis secciones de los
tres animales individuales para cada genotipo utilizando el
software ImageProPlus (Media Cybernetics). Los datos se presentan
adelante en la Tabla IV:
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\vskip1.000000\baselineskip
El análisis del tamaño de las células de grasa
en las almohadillas de grasa epididímica mediante microscopía de
electrón de exploración o mediante teñido de hematoxilinoeosina
muestra una sorprendente reducción en el tamaño celular, con la
cuantificación que revela que los adipocitos de ratones S6K1-/- son
71% más pequeños que aquellos ratones del tipo intacto (peso: 3129
904, n=3; S6K1-/-: 918 189 mm2, n=3, P< 0.05), con muchos
adipositos que exhiben un fenotipo multilocular. Estos estudios
también revelan que la distribución del tamaño celular, peso
corporal ligero, es mucho más homogéneo en ratones S6K1-/- cuando se
compara con ratones tipo intacto y un cálculo aproximado de las
áreas de superficie celular versus la masa total sugiere que existe
poco efecto en el número celular. En resumen, los resultados de la
microscopía de electrón, histología y densidad celular/análisis de
tamaño establece que la reducción en la grasa en animales
deficientes de S6K1 se debe a una reducción en el tamaño celular de
la grasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Para establecer si los ratones S6K1 exhiben
diferencias dietarias sobre los ratones tipo intacto, que pudieran
explicar la reducción en la grasa en los ratones S6K1, la captación
de alimento por ratón se mide cada dos días durante 15 días
utilizando concentrado alto en grasa o normal. Independiente si se
coloca en la dieta de alta grasa o normal, los ratones deficientes
S6K1 comen la misma cantidad total de alimento como los tipo
intacto (aproximadamente 4.6 +/- 0.1 g alimento/ratón/día), pero se
compara con el peso corporal, ellos comen mucho más
(aproximadamente 17% o más, o 0.18 se compara con 0.15 g alimento/g
peso corporal/día).
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Ejemplo
5
La captación de alimento incrementada, combinada
con WAT reducido, eleva la posibilidad de mejorar la actividad
metabólica. La velocidad metabólica de los ratones deficientes de
S6K1 y los ratones tipo intacto se examinan mediante calorimetría
indirecta para monitorear el consumo de oxígeno y la producción de
óxido de carbono cada 15 min durante un periodo de ayuno de ocho
horas empleando un Oxymax (Columbus Instruments, Columbus, OH).
Los resultados muestran un sorprendente 27% de
incremento en la velocidad del consumo de oxígeno en ratones
S6K1-/- versus ratones tipo intacto a lo largo del experimento. El
cálculo de la velocidad de intercambio respiratorio (RER =
velocidad de CO_{2} producido a O2 consumido) da los valores de
0.713 - 0.004 para los ratones tipo intacto y
0.709-0.003 para ratones S6K1-/-; P< 0.01),
argumentando que ambos animales utilizan grandemente los ácidos
grasos como una fuente de energía.
Los ensayos de metabolito se llevan a cabo como
sigue. Se recolecta sangre de seno retroorbital después de ayuno
durante la noche o 1 hr después del inicio de la comida seguido por
ayuno durante la noche. Los ácidos grasos no esterificados, y
triglicéridos se determinan mediante ensayos enzimáticos
(Boehringer-Mannheim, Alemania). Se mide la leptina
en el plasma utilizando el equipo Rat leptina RIA (Linco Research,
St Louis, MO.). Los resultados se muestran en la Tabla V. Los
niveles de leptina en el plasma son significativamente reducidos en
ratones S6K1-/- (Tabla V) al mantener el consumo de alimento
incrementado de los ratones relacionado con el peso corporal.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque no se desea estar limitado por la teoría,
dada la masa de tejido adiposo reducida, la velocidad metabólica
incrementada, y el hecho que cuando es correcto para el peso
corporal, los triglicéridos en el plasma y los ácidos grasos libres
son similares entre genotipos (Tabla V), se razona que en la
ausencia de S6K1, los triglicéridos en el tejido adiposo que se han
utilizado rápidamente o los ácidos grasos libres nunca alcanzan el
tejido adiposo para almacenamiento, pero se toman inmediatamente
por el músculo y se oxidan.
Aunque el WAT no es normalmente un tejido que
consume energía, no existe diferencia en los niveles basales de
ácidos grasos circulantes en los ratones S6K1-/-, cuando se compara
con ratones tipo intacto (Tabla V), lo que sugiere que los ácidos
grasos libres se pueden oxidar directamente en WAT. Consistente con
esta hipótesis, los micrógrafos de electrón revelan la presencia de
muchos adipocitos multiloculares, que exhiben un incremento
dramático en el tamaño y número de mitocondria, los fenotipos están
completamente ausentes en los adipocitos de los ratones tipo
intacto. Otros han mostrado que la sobreexpresión de UCP1 en WAT
induce un fenotipo similar, y los niveles UCP1, medidos por PCR en
tiempo real cuantitativo, se sobreregulan dramáticamente en WAT de
los ratones S6K1-/- cuando se compara con WAT de los ratones tipo
intacto.
\newpage
Ejemplo
6
La degradación de los triglicéridos en el tejido
adiposo (lipólisis) se mide al monitorear la liberación de ácidos
grasos o glicerol de adipositos maduros. Los adipositos principales
se preparan de almohadillas de grasa epididímica mediante digestión
de colagenasa como se describió previamente (Marette et al.,
1991). Las células se incuban durante 30 min a 37ºC con o sin
norepinefrina (Sigma-Aldrich SARL,
St-Quentin Fallavier, Francia) en concentraciones
diferentes (10-8 a 10-5M). La
norepineferina es un agonista beta-adrenérgico y
estimula la degradación del triglicérido de adiposito a glicerol y
los ácidos grasos libres (lipólisis) e incrementan la velocidad
basal metabólica (termogenia). A pesar de la reducción en el tamaño
celular de los adipocitos epididímicos (ver Ejemplo 3), los
resultados muestran que la velocidad basal de la liberación de
ácido graso es aproximadamente 5 veces mayor en los adipocitos de
ratones S6K1-/-cuando se compara con ratones tipo intacto. La
velocidad de la liberación de ácidos grasos se incrementa en ambos
genotipos en una manera dependiente de dosis luego de la adición de
norepinefrina, que alcanza valores máximos similares, con el
incremento mucho más pronunciado en ratones tipo intacto. Se
obtienen resultados similares para la liberación de glicerol. Por
lo tanto, los ratones S6K1-/- se protegen contra la acumulación de
grasa parcialmente debido a un agudo incremento en la lipólisis
basal.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Durante el aislamiento de adipositos maduros
para los estudios de lipólisis, es evidente que existen pocos
preadipocitos presentes en WAT epididímico de ratones S6K1-/-. Esto,
junto con la incapacidad de los adipocitos para almacenar los
triglicéridos, presenta experimentos para comparar la capacidad de
fibroblastos de ratones embriónicos (MEF) de embriones S6K1-/- y
embriones tipo intacto para diferenciarlos en adipocitos utilizando
una mezcla de diferenciación de adipocito.
En resumen, la diferenciación de adiposito se
induce esencialmente como se describió previamente (Hansen et
al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 2386-2393)
utilizando ratones deficientes de S6K1 tipo silvestre de
fibroblastos embriónicos (MEF). El número de los pasajes de los MEF
está dentro de un pasaje. Para diferenciación, las células
postconfluentes de dos días (día 0) se tratan con medio de
crecimiento que contiene 1 \muM de dexametasona (Sigma), 0.5 mM
de metilisobutilxantina (Aldrich), 5 \mug/ml de insulina
(Boehringer Mannheim), y Ciglitazona (tiazolinediona, agonista
PPAR: BIOMOL, GR-205, 0.5 \muM) durante 2 días.
Del día 2, el medio que contiene 5 \mug/ml de insulina y
Ciglitazona y renovado cada dos días. Se filtra teñido O de aceite
rojo: solución de Teñido O de aceite rojo (0.5% de O aceite rojo en
solución de alcohol isopropílico-agua destilada (60:
40). Las células se lavan con PBS y se tiñen durante 30 min y luego
se lavan con agua destilada dos veces. Las células deficientes en
S6K1 muestran mucho menor teñido. Por lo tanto, los MEF que carecen
de S6K1 tienen un potencial adipogénico reducido, como se evalúa
por el teñido lípido O de Aceite Rojo reducido, consistente con
menores niveles de mARN aP2. Tomados juntos los resultados sugieren
que los ratones S6K1-/- han reducido el WAT debido a la adipogenia
deteriorada y una incapacidad de almacenar grasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
La falla de los ratones S6K1-/- para acumular
grasa con la edad combinado con su incremento general en la
velocidad metabólica sugiere que ellos se pueden proteger contra la
obesidad inducida por dieta. En este ejemplo, se registra el peso
corporal semanalmente en ratones deficientes de S6K1 y tipo intacto
alimentados con dietas altas en grasa (HFD, 60% de las colorías
totales derivadas de grasa, 4057 kcal kg-1, Research
diets, USA). Cuando los ratones S6K1 se colocan en una dieta alta
en grasa, la ganancia de peso corporal absoluta de ratones
deficientes de S6K1 es aproximadamente 10.5 g durante el periodo de
alimentación de dieta alta en grasa (de la semana 7 a 27 de edad)
que se compara con aproximadamente 14.4 g en ratones tipo intacto.
Similar a la situación en el NCD (Ejemplo 1), los ratones S6K1-/-
exhiben poca variación en el peso en un HFD cuando se compara con
ratones tipo intacto. Dado el tamaño corporal más pequeño de los
transgénicos, la ganancia de peso relativa es similar entre
genotipos (58.9% de incremento de peso corporal de ratones
deficientes de S6K1 se compara con 58.0% del incremento de peso
corporal en el tipo intacto después de alimentación de dieta alta
en grasa durante 5 meses. Aunque el porcentaje relativo de la
ganancia de peso corporal en ratones deficientes de S6K1 es similar
al tipo intacto, ellos fallan en poner grasa al mismo grado como los
ratones tipo intacto. Durante un periodo de tres meses, los ratones
tipo intacto ganan 0.1 g/g comparado con 0.02 g/g grasa/peso
corporal por ratones deficientes de S6K1.
Los ratones de ambos genotipos consumen menos
alimento en un HFD que en un NCD, probablemente debido a la
densidad calórica mayor del HFD cuando se compara con el NCD. Aunque
en términos absolutos, los ratones S6K1-/- consumen la misma
cantidad de alimento como los ratones tipo intacto, cuando se
normaliza con el peso corporal ellos consumen 44% de más alimento.
Así, aunque los ratones S6K1 comen más, ellos no ponen grasa al
mismo grado como los ratones tipo intacto.
Se conducen mediciones de calorimetría
indirectas durante un periodo de ayuno de ocho horas en ratones HFD
y NCD. En ambos genotipos de consumo de oxígeno incrementados en el
HFD, cuando se compara con el NCD, pero el efecto es más
pronunciado para los ratones S6K1-/-, de tal manera que la
diferencia entre los ratones S6K1-/- y los ratones tipo intacto se
incrementa de 25% a 30%. Los datos muestran adicionalmente que el
RER permanece sin cambio en los ratones S6K1-/- en un HFD versus un
NCD, 0.708-0.002 vs 0.709-0.004,
respectivamente, mientras en los ratones tipo intacto el RER se
incrementa de 0.713-0.004 en NCD a
0.729-0.002 (n=6, P< 0.01) en una dieta HFD,
indicativo de un incremento en carbohidrato relacionado con la
oxidación del ácido graso. A pesar del hecho que los ratones
S6K1-/-en dieta exhiben una velocidad metabólica alta, en un HFD
ellos exhiben un incremento de tres veces en los niveles de ácido
graso circulantes, mientras que en los ratones tipo intacto no
existe cambio significativo en los niveles de ácidos grasos libres
(Tabla V). Por lo tanto, los ratones S6K1-/- fallan en acumular
grasa en una velocidad apreciable cuando se expone con un HFD.
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Ejemplo
9
Para examinar si el S6K1 se afecta en el tejido
adiposo de modelos genéticos normales y obesos, se detecta la
fosforilación de S6K1. Esto se puede llevar a cabo fácilmente
utilizando anticuerpos fosfoespecíficos. Se determina el nivel de
S6K1 T389 y la fosforilación S6 S240/S244 en el tejido adiposo del
ayuno de ratones tipo intacto durante un periodo corto. Luego de la
estimulación del factor de crecimiento, el S6 se fosforila
multiplicado en el Terminal carboxi en cinco residuos serina en una
forma ordenada empezando con Ser236, seguido secuencialmente por
> Ser235 > Ser240 > Ser244 y Ser247. Los valores basales de
la fosforilación S6K1 T389 y S6 S240/S244 son bajos en ratones en
ayuno durante un corto periodo después de ser mantenido en un NCD.
En contraste agudo, los mismos ratones mantenidos en un HFD y
tratados bajo las condiciones idénticas, mantienen niveles elevados
de fosforilación S6K1 T389 y S6 S240/S244.
Los actuales inventores también examinan la
actividad S6K1 en ratones ob/ob, un modelo genético para la
obesidad. Los resultados muestran que los ratones ob/ob mantenidos
en NCD tienen fosforilación S6K1 T389 y S6 S240/S244 elevada cuando
se compara con ratones tipo intacto en un NCD. Los datos de humanos
preliminares son consistentes con estos datos y proporcionan
soporte adicional para S6K1 como una fármaco objetivo promisorio en
el tratamiento de pacientes que sufren de obesidad y como un
marcador de diagnóstico potencial.
<110> Novartis Forschungsstiftung,
Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical
Research
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Modulación de la actividad quinasa
S6 para el tratamiento de la obesidad
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1-32727A/FMI
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido (ARN o ADN)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgtttgac atagacctg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido (ARN o ADN)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipaagggggcta tggaaaggtt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
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<213> homo sapiens
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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Claims (10)
1. Un método para identificar un agente efectivo
en el tratamiento de trastornos de peso que dependen de acumulación
de grasa, dicho método comprende las etapas de:
- i)
- incubar la quinasa S6 1 con un compuesto;
- ii)
- detectar la actividad 1 de quinasa 36; y
- iii)
- determinar una modulación inducida por el compuesto en actividad 1 de la quinasa S6 relacionada cuando dicho compuesto está ausente, en donde una alteración de la actividad 1 de la quinasa S6 en la presencia del compuesto es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de trastornos de peso que dependen de acumulación de grasa.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde dicha modulación es la inhibición de la actividad 1 de la
quinasa S6 y dicho trastorno de peso es obesidad o una afección de
sobrepeso.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde dicha modulación es la activación de la actividad 1 de la
quinasa S6 y dicho trastorno de peso es una afección de bajo peso
que resulta de la acumulación de grasa insuficiente.
4. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende determinar la actividad
1 de la quinasa S6 utilizando S6 como un sustrato.
5. El método de las reivindicaciones 1 a 3, que
comprende determinar la actividad 1 de la quinasa S6 utilizando un
sustrato de péptido.
6. Un método para la detección de un agente
efectivo en el tratamiento de trastornos de peso, el método
comprende (a) poner en contacto los componentes celulares
transcripcionalmente activos ex vivo con un ácido nucleico
que codifica un gen 1 de quinasa S6 unido operablemente a una
secuencia promotora o una secuencia promotora 1 de la quinasa S6
unido operablemente a un gen indicador en la presencia de por lo
menos un compuesto; y (b) detectar un efecto de dicho compuesto en
la expresión 1 de la quinasa S6 o la actividad promotora 1 de la
quinasa S6, en donde la detección de, una expresión 1 de la quinasa
S6 se incrementa o reduce o la actividad promotora es indicadora de
un agente efectivo en el tratamiento de trastornos de peso que
dependen de acumulación de grasa.
7. El método de la reivindicación 6, en donde
dichos componentes celulares transcripcionalmente activos y dicho
ácido nucleico están presentes en una célula.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente detectar
un efecto en la acumulación de grasa, metabolismo de grasa o tamaño
de adipocito mediante dicho agente.
9. Un método para diagnosticar una
predisposición a un trastorno de peso que depende de la acumulación
de grasa, que comprende:
- \quad
- proporcionar una muestra obtenida de un individuo,
- \quad
- detectar el nivel de la actividad 1 de la quinasa S6 en dicha muestra, y
- \quad
- correlacionar un cambio en la actividad 1 de la quinasa S6 cuando se compara con un valor de control normal o rango de valores con una predisposición a un trastorno de peso que depende de la acumulación de grasa.
10. El método de la reivindicación 9, en donde
dicho cambio es un incremento en la actividad 1 de la quinasa S6
cuando se compara con un valor de control normal o rango de valores
y dicho trastorno de peso es una afección de sobrepeso u
obesidad.
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