ES2313029T3 - Metodo para evaluar la actividad de fosforilacion de lkb1. - Google Patents
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Abstract
Método in vitro para evaluar la actividad de LKB1, que comprende (i) proporcionar una muestra que comprende LKB1, (ii) poner en contacto dicha muestra con una quinasa sustrato, en condiciones que permitan la fosforilación, en el que dicha quinasa sustrato es o deriva de AMPK, y (iii) monitorizar la incorporación de fosfato en dicha quinasa sustrato, en el que la incorporación de fosfato en dicha quinasa sustrato indica la actividad de LKB1.
Description
Método para evaluar la actividad de
fosforilación de LKB1.
El síndrome de Peutz-Jeghers
(PSJ) es un síndrome cancerígeno hereditario que se caracteriza por
una predisposición a tumores tanto benignos como malignos de muchos
sistemas orgánicos. Se piensa que este síndrome está relacionado
con mutaciones de pérdida de función en la proteína quinasa LKB1
(número de acceso de Gen-Bank U63333 - véase
Hemminki et al., 1998, Nature, Vol. 391, p.
185-187).
En la técnica anterior no existe ningún ensayo
satisfactorio para determinar la actividad de quinasa intermolecular
de LKB1.
Los ensayos de la técnica anterior para
determinar la actividad de LKB1 incluyen ensayos de
autofosforilación, tales como los presentados por Boudeau et
al., 2003, Human Mutation: Mutation in Brief 583. A pesar de la
importancia fisiológica de la autofosforilación en Thr336 de LKB1,
que en el mejor de los casos no está clara, en la técnica anterior
no se conocen sustratos fisiológicos de LKB1 (véase, por ejemplo
Boudeau, página 8 y en otras partes), y mucho menos ningún sustrato
de quinasa de LKB1.
Además, los intentos de la técnica anterior por
estudiar la actividad de LKB1 se centran en mutantes de pérdida de
función, tales como supresiones bastas de una parte o partes
catalíticas de la molécula. Se sabe tan poco sobre LKB1 en la
técnica anterior, que las mejores rutas disponibles de investigación
son tales experimentos toscos. El progreso está obstaculizado por
la falta de conexión de LKB1 con componentes aguas abajo de las
rutas de señalización/metabólicas.
Incluso si la autofosforilación de LKB1 es un
suceso biológico significativo, la destrucción de esta actividad y
el estudio de los efectos negativos es un instrumento tosco de
investigación, y no puede conducir al análisis de componentes aguas
abajo sin los sustratos importantes y biológicamente significativos
para LKB1.
Puesto que no se conocen en la técnica anterior
sustratos significativos de LKB1, es imposible diseñar un ensayo
robusto para determinar la actividad o activación de LKB1. Tampoco
es posible analizar e interpretar de forma minuciosa el significado
de las partes del propio LKB1, tal como el suceso de la
autofosforilación, el cual puede ser meramente permisivo en vez de
regulador.
La investigación del síndrome de
Peutz-Jeghers (PJS) está limitada por lo que se sabe
sobre la base genética subyacente de la enfermedad. La técnica
anterior discute sobre las relaciones con LKB1 (véase, por ejemplo,
Hemminki et al., 1998, Nature, vol. 391, p.
185-187). Sin embargo, en la técnica anterior no se
han establecido las relaciones con dianas o efectores aguas abajo.
Además, en la técnica anterior no se han establecido dianas o
efectores de LKB1 aguas abajo. De este modo, hay una falta de dianas
adecuadas para la intervención, tal como en el tratamiento o
prevención del PJS.
Se sabe que la activación de AMPK está
correlacionada con su estado de fosforilación (véase, por ejemplo
Neumann et al., 2003, Protein Expression and Purification
"Mammalian AMP-activated protein kinase:
functional, heterotrimeric complexes by
co-expression of subunits in E. coli").
Sin embargo, no se ha identificado la quinasa responsable de esta
fosforilación.
La técnica anterior ha intentado proporcionar
técnicas para la activación de AMPK, pero, en ausencia de un
activador conocido de AMPK, estas técnicas están confinadas a la
purificación parcial de extractos celulares, los cuales se aplican
entonces a AMPK in vitro con la esperanza de que dichos
extractos comprendan alguna forma activa de una quinasa aguas
arriba desconocida que pueda dar como resultado la activación de
AMPK. Estos experimentos, aunque representan el estado de la
técnica, requieren no obstante un gran esfuerzo y necesariamente
tienen una naturaleza tosca, basándose en extractos celulares
incompletamente caracterizados. Además, estos experimentos implican
el sacrificio de animales que, aunque se minimiza, no obstante es
indeseable.
Baas et al. (2003, EMBO, vol. 22, p.
3062-3072) describe la activación de la quinasa
supresora de tumores LKB1 mediante la pseudoquinasa STRAD de tipo
STE20.
El documento EP1036844A1 describe un método de
examen, un reactivo para examen, y un remedio para enfermedades
provocadas por la variación en el gen de LKB1.
El documento WO 01/93874 describe un método para
tratar la obesidad y el músculo paralizado, y describe ayudas
ergogénicas.
Hardie y Hawley (2001, Bioessays, Vol. 23,
páginas 1112-1119) describen la proteína quinasa
activada por AMP, y su implicación en la hipótesis de la carga de
energía.
La presente invención busca superar el problema
o problemas asociados con la técnica anterior.
La presente invención se basa en el hallazgo
sorprendente de que LKB fosforila quinasa o quinasas aguas abajo.
Además, LKB1 está en la misma ruta relacionada que AMPK.
Más particularmente, la invención se basa en el
hallazgo sorprendente de que LKB1 actúa sobre AMPK. Además, como se
demuestra en la presente memoria, LKB1 provoca la fosforilación y
activación de AMPK. Como se explica más abajo, LKB1 puede ejercer
su acción mediante fosforilación directa de AMPK, y se muestra por
primera vez que LKB1 tiene un sustrato de quinasa celular
específico (por ejemplo AMPK), y, contrariamente, que AMPK es
seleccionada como diana y es activada por la quinasa LKB1 aguas
arriba.
Estos hallazgos sorprendentes han permitido la
provisión de numerosos ensayos, composiciones y tratamientos, los
cuales se detallan a continuación y en las reivindicaciones
anejas.
De este modo, en un aspecto, la invención
proporciona un método in vitro para evaluar la actividad de
LKB1, que comprende:
- (i)
- proporcionar una muestra que comprende LKB1,
- (ii)
- poner en contacto dicha muestra con una quinasa sustrato en condiciones que permitan la fosforilación, en el que dicha quinasa sustrato es o deriva de AMPK, y
- (iii)
- monitorizar la incorporación de fosfato en dicha quinasa sustrato,
en el que la incorporación de fosfato en dicha
quinasa sustrato indica la actividad de LKB1.
Se muestra que AMPK es una quinasa sustrato
particularmente buena para LKB1. De este modo, en otro aspecto, la
invención se refiere a un método como se describe anteriormente, en
el que dicha quinasa sustrato es o deriva de AMPK.
Se considera que AMPK es un complejo
heterotrimérico in vivo. Por lo tanto, es ventajoso usar AMPK
heterotrimérica cuando se evalúa LKB1. De este modo, en otro
aspecto, la invención se refiere a un método como se describe
anteriormente, en el que la AMPK comprende AMPK heterotrimérica.
Preferentemente, la AMPK comprende AMPK de ratón o humana,
preferentemente AMPK humana.
La fosforilación de AMPK se puede evaluar
mediante cualquier método adecuado, tal como el ensayo de activación
de AMPK. En otro aspecto, la invención se refiere a un método como
se describe anteriormente, en el que la incorporación de fosfato en
AMPK se monitoriza evaluando la actividad de AMPK. Preferentemente,
la actividad de AMPK se evalúa vía la fosforilación del péptido
SAMS.
La fosforilación de AMPK también se puede
evaluar mediante lectura directa del estado de fosforilación de
AMPK. Esto se puede hacer usando cualquier método adecuado, tal como
fosfato marcado radiactivamente, o usando reactivos específicos
para evaluar directamente el estado de fosforilación de AMPK.
Preferentemente, se usan los reactivos específicos. De este modo,
en otro aspecto, la invención se refiere a un método como se
describe anteriormente, en el que la incorporación de fosfato en
AMPK se monitoriza evaluando la fosforilación de
T-172 de AMPK, o su equivalente. El equivalente
significa el mismo resto en una isoforma u homólogo de AMPK, o puede
incluir un resto diferente (por ejemplo serina) en la misma
posición en AMPK. Preferentemente, equivalente significa
funcionalmente equivalente, es decir, indicativo de la activación de
AMPK.
Ventajosamente, la incorporación de fosfato en
AMPK se puede cuantificar para dar una estimación de la actividad
de LKB1. En la técnica son bien conocidas las técnicas para el
ensayo cuantitativo de quinasas. La incorporación de fosfato se
puede cuantificar mediante formación de fosforoimagen o mediante
densitometría, o mediante técnicas similares aplicadas a un ensayo
inmunológico directo de T-172. De este modo, en otro
aspecto, la invención se refiere a un método como se describe
anteriormente, que comprende además cuantificar la cantidad de
fosfato incorporado por mol de AMPK, en el que dicho nivel de
fosfato indica el nivel de LKB1 presente en dicha muestra.
Sorprendentemente se describe en la presente
memoria que se puede usar LKB1 para fosforilar y activar AMPK. De
este modo, en otro aspecto, la invención se refiere a un uso in
vitro de LKB1 recombinante o aislado, en la activación de
AMPK.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
uso in vitro de LKB1 recombinante o aislado, como una
AMPKK.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
uso in vitro de LKB1 recombinante o aislado, en la
fosforilación de AMPK.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de LKB1 en la preparación de un medicamento para la prevención o
tratamiento del síndrome de Peutz-Jeghers (PJS).
Sorprendentemente se describe en la presente
memoria que AMPK se encuentra en la misma ruta similar que LKB1, y
es activada directamente por la acción de LKB1.
Se describe en la presente memoria que LKB1
incrementa la fosforilación de AMPK.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de AMPK en la preparación de un medicamento para la prevención o
tratamiento de hipercardiomiotrofia (HCM).
Es conocido que existen ciertas moléculas que
estabilizan y/o activan LKB1. Por lo tanto, es ventajoso usar estas
moléculas en la activación y/o mantenimiento de AMPK. De este modo,
la presente invención se refiere al uso in vitro de
moduladores de LKB1, en la modulación de AMPK. En otro aspecto, la
invención se refiere a un método in vitro para modular AMPK,
que comprende modular LKB1.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
uso in vitro de HSP90 en la modulación de la actividad de
AMPK.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
uso in vitro de Cdc37 en la modulación de la actividad de
AMPK.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
uso in vitro de la proteína STRAD en la modulación de la
actividad de AMPK.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de LKB1 en la preparación de un medicamento para la prevención o
tratamiento del síndrome de Peutz-Jeghers (PJS).
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método in vitro para fosforilar AMPK, que comprende poner en
contacto AMPK con LKB1 recombinante o aislado.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método in vitro para incrementar la fosforilación de AMPK en
un sistema, que comprende incrementar la actividad de LKB1 en dicho
sistema.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método in vitro para activar AMPK en un sistema, que
comprende activar LKB1 en dicho sistema.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método in vitro para activar AMPK, que comprende poner en
contacto dicho AMPK con LKB1 recombinante o aislado.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método in vitro para fosforilar AMPK, que comprende poner en
contacto dicho AMPK con LKB1 recombinante o aislado.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método in vitro para la identificación de un modulador o
moduladores de LKB1, que comprende proporcionar una primera y
segunda muestra de LKB1, poner en contacto dicha primera muestra
con un modulador candidato de LKB1, poner en contacto dichas primera
y segunda muestras con un sustrato en condiciones que permitan la
fosforilación, monitorizar la incorporación de fosfato en dicho
sustrato, y comparar la incorporación de fosfato en dicho sustrato
en dichas primera y segunda muestras, en el que, si la
incorporación de fosfato en el sustrato difiere entre dichas primera
y segunda muestras, el modulador candidato se identifica como un
modulador de la actividad de LKB1. Preferentemente, el sustrato es
una quinasa sustrato. Preferentemente, la quinasa sustrato es o
deriva de AMPK. En otro aspecto, la invención se refiere a
moduladores de LKB1 identificados mediante este método.
Preferentemente, dichos moduladores son activadores.
En otro aspecto, la invención se refiere a
eucariotas recombinantes para el estudio de AMPK/AMPKK. Por ejemplo,
la invención proporciona ventajosamente células de levadura
destruidas por las AMPKK. De este modo, en otro aspecto, la
invención se refiere a una célula de levadura recombinante que
comprende perturbaciones génicas en por lo menos dos de Pak1, Tos3
y Elm1. Preferentemente, la célula de levadura recombinante
comprende perturbaciones génicas en Pak1, Tos3 y Elm1.
Preferentemente, la célula de levadura recombinante comprende además
una perturbación génica en Snf1. Preferentemente, la célula de
levadura recombinante comprende además una perturbación génica en
Snf4. Preferentemente, la célula de levadura recombinante comprende
además una perturbación génica en SIP1, SIP2 y GAL83.
Preferentemente, la célula de levadura recombinante es capaz de
expresar AMPK de mamífero. Preferentemente, la célula de levadura
recombinante expresa AMPK de levadura. Preferentemente, la AMPK de
mamífero es AMPK de ratón o humana, preferentemente AMPK humana.
Sin embargo, la AMPK humana comprende subunidades alfa, beta y
gamma. Preferentemente, la levadura es Saccharomyces
cerevisiae. Las perturbaciones génicas se pueden realizar
mediante cualquier técnica adecuada, o se pueden ensamblar juntas en
la misma célula a partir de cepas individuales mediante cruzamiento
genético. En otro aspecto, la invención se refiere a la clonación
de las AMPKK y/o AMPK por complementación mediante el uso de estas
cepas, por ejemplo mediante transformación con una AMPK/AMPKK
candidata, o su librería, y selección sobre fuentes de carbono, para
aislar las AMPK y/o AMPKK funcionales. En otro aspecto, la
invención se refiere a las AMPK/AMPKK aisladas de esta
manera.
manera.
Se ha identificado una proteína quinasa que
fosforila y activa a la proteína quinasa activada por AMP. Ésta
forma una diana terapéutica para compuestos dirigidos a modular
AMPK, en particular activar AMPK.
La invención encuentra una utilidad particular
en el tratamiento o prevención de uno o más de diabetes de tipo 2,
el síndrome de Peutz-Jeghers, cáncer y obesidad. Más
abajo se proporcionan otras aplicaciones y detalles.
La identificación de AMPK como un sustrato de
LKB1 aguas abajo proporciona la provisión de un sistema de ensayo
para identificar sistemáticamente compuestos que modulan y/o activan
la quinasa aguas arriba, y que pueden tener un papel terapéutico en
el tratamiento de cáncer u otros trastornos, según se explica en la
presente memoria.
La identificación de una quinasa aguas arriba en
la cascada de AMPK proporciona una diana para la identificación de
fármacos candidatos dirigidos a tratar diabetes de tipo 2 y
obesidad, así como otros trastornos descritos en la presente
memoria.
La identificación de AMPK como sustrato para
LKB1 proporciona además un ensayo para identificar sistemáticamente
fármacos candidatos que activan LKB1. Esto tiene aplicación en la
terapia contra el cáncer, así como en enfermedades metabólicas y
otros trastornos.
En un aspecto amplio, la invención se refiere a
un método para evaluar la actividad de LKB1, que comprende
proporcionar una muestra de LKB1, poner en contacto dicha muestra
con un sustrato en condiciones que permitan la fosforilación, y
monitorizar la incorporación de fosfato en dicho sustrato, en el que
la incorporación de fosfato en dicho sustrato indica la actividad
de LKB1. En este aspecto, el sustrato significa cualquier sustrato
biológicamente significativo, tal como aquel que tiene un efecto
biológico demostrable tal como los demostrados en la presente
memoria (véase la sección de Ejemplos). Preferentemente, dicho
sustrato es propiamente una quinasa (es decir, una "quinasa
sustrato"); preferentemente, dicho sustrato es o deriva de AMPK;
preferentemente, dicho sustrato es AMPK.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"quinasa sustrato" tiene su significado normal. En particular,
la "quinasa" significa una quinasa reconocible mediante
comparación de secuencias, tal como la que posee el motivo o
motivos distintivos de quinasa según se definen por Hunter (por
ejemplo, véase Hanks, Quinn y Hunter, 1988, Science, vol. 241, p.
42). Naturalmente, "quinasa" no implica la exclusión de
variantes muertas de quinasa o un fragmento o fragmentos
catalíticamente inactivos, sino que se usa para describir esa
familia de proteínas que se clasifica normalmente como quinasas con
referencia a Hanks et al. Preferentemente, quinasa significa
proteína y/o azúcar y/o lípido quinasa, preferentemente proteína
quinasa.
Como se usa en la presente memoria,
"sistema" tiene su significado natural, y puede incluir un
sistema o sistemas biológicos complejos, tal como una célula o
células completas.
La expresión "deriva de" tiene su
significado normal en la técnica, en la que una sustancia se
considera que "deriva de" una primera sustancia cuando parte
de la sustancia se ha creado o construido a través de una cadena de
sucesos que incorpora toda o parte de la primera sustancia en la
sustancia en cuestión. Naturalmente, es probable que las dos
sustancias difieran, por ejemplo, a través de una mutación, adición
o supresión, o modificación similar, pero si la sustancia en
cuestión tiene rasgos heredados de la primera sustancia entonces
deriva de ella. En particular, cuando se usa en relación con
biopolímeros tales como polinucleótidos o polipéptidos, una
sustancia se considera que deriva de una primera sustancia cuando
posee una identidad de secuencia suficiente para ser reconocida
como relacionada con la primera sustancia. En este contexto, si una
sustancia deriva de una primera sustancia, entonces dicha sustancia
tiene preferentemente por lo menos 10 restos contiguos que poseen
por lo menos un 25% de identidad con la primera sustancia,
preferentemente un 30% de identidad, preferentemente un 40% de
identidad, preferentemente un 50% de identidad, preferentemente un
60% de identidad, preferentemente un 70% de identidad,
preferentemente un 80% de identidad, preferentemente un 90% de
identidad, preferentemente un 95% de identidad, preferentemente un
96% de identidad, preferentemente un 97% de identidad,
preferentemente un 98% de identidad, preferentemente un 99% de
identidad, o incluso más. Preferentemente, dicha sustancia tiene
por lo menos 15 restos contiguos con dicha identidad,
preferentemente por lo menos 20 restos, preferentemente por lo
menos 30 restos, preferentemente por lo menos 50 restos,
preferentemente por lo menos 100 restos, preferentemente por lo
menos 200 restos, o incluso más. Para entidades multiméricas, la
expresión se puede aplicar al complejo y/o a los componentes
individuales, como será manifiesto a partir del contexto.
Generalmente, será suficiente si una de las subunidades deriva de
la entidad
dada.
dada.
Un homólogo es como se entiende habitualmente en
la técnica. Preferentemente, homólogo se refiere al equivalente de
otro organismo, tal como otra especie de organismo.
El término "aislado" puede significar
recombinante y/o purificado. Cuando significa purificado, el término
se refiere a la sustancia cuando se separa de por lo menos un
componente de la composición en la que se encuentra
naturalmente.
\newpage
El agente/modulador de la presente invención se
refiere a entidades implicadas en la activación de y/o fosforilación
de AMPK. Un agente/modulador ejemplar de la presente invención es
LKB1. Éste se puede usar en combinación con un agente o agentes
estabilizantes, tales como HSP90 y/o Cdc37, o 37, o sus
combinaciones. Otro modulador es la proteína STRAD, que puede
activar LKB1 y, por lo tanto, activar AMPK. De este modo, la
invención se refiere al uso de la proteína STRAD en la modulación
de AMPK, preferentemente en la activación de AMPK.
Existe una variedad de formas en las que se
puede evaluar la AMPK por una persona experta en la técnica. Según
la presente invención, se puede emplear cualquier técnica adecuada
para evaluar la actividad de AMPK.
La actividad de AMPK se puede determinar
directamente (por ejemplo, evaluando la actividad de quinasa de
AMPK) o indirectamente (por ejemplo, evaluando el estado de
fosforilación de treonina 172 de AMPK). Preferentemente, la
actividad de AMPK se mide directamente.
La mayoría de las técnicas para evaluar AMPK se
basan en la medición de la fosforilación de un sustrato capaz de
ser fosforilado por AMPK. Este sustrato puede ser cualquier sustrato
adecuado, tal como un polipéptido (por ejemplo un polipéptido
sustrato relativamente corto (por ejemplo 50 restos de aminoácidos o
menos), o un polipéptido más largo/proteína o fragmento o dominio
del mismo.
La actividad de AMPK se puede evaluar midiendo
la transferencia de fosfato a un sustrato de AMPK por AMPK. También
es posible evaluar la actividad de AMPK determinando el estado de
fosforilación del resto 172 (preferentemente la treonina 172 de
tipo natural) dentro de la subunidad alfa de AMPK. Los ejemplos de
este ensayo se dan más abajo, por ejemplo como se muestra en la
Fig. 4e.
Usando este método, se fosforila AMPK por la
quinasa aguas arriba, y la fosforilación de treonina 172 se
determina mediante transferencia Western, usando un anticuerpo que
reconoce específicamente fosfotreonina 172 (comercialmente
disponible de Cell Signalling Technologies).
La actividad de AMPK se evalúa preferentemente
midiendo la fosforilación de un sustrato (por ejemplo un péptido o
un sustrato proteínico). Este procedimiento es muy estándar para las
proteína quinasas. La AMPK se puede evaluar usando sustratos
proteínicos (por ejemplo acetil-CoA carboxilasa),
así como también péptidos más cortos.
La transferencia de fosfato se monitoriza
preferentemente usando un radioisótopo o radioisótopos de fósforo.
Por ejemplo, se puede usar ATP marcado con 32-P,
pero podría ser cualquier fosfato marcado radiactivamente, por
ejemplo 33-P. Preferentemente se usa ATP marcado con
32-P gamma.
El sustrato de AMPK es preferentemente un
péptido. Este péptido puede ser cualquier sustrato peptídico que
sea capaz de ser fosforilado por AMPK.
Preferentemente, el péptido comprende una
secuencia de consenso para la fosforilación por AMPK, comprendiendo
dicho consenso un resto hidrófobo 5 aminoácidos
N-terminales a un resto fosforilable (que es una
serina o una treonina), un resto básico en una posición 2, 3 ó 4
aminoácidos N-terminales al resto fosforilable, con
un resto hidrófobo 4 aminoácidos C-terminales al
resto fosforilable, que se puede representar según:
- hidrófobo-(básico,X,X)-X-serina o treonina-X-X-X-hidrófobo
en el que el orden de los aminoácidos entre
paréntesis no es crítico.
En Weekes, J., Ball, K.L., Caudwell, F.B. y
Hardie, D.G., FEBS Lett. 334, 335-339 (1993), que se
incorpora en la presente memoria como referencia, se puede
encontrar una guía adicional sobre el motivo de consenso para la
fosforilación por AMPK.
Estos péptidos se pueden sintetizar fácilmente
mediante cualquier técnica adecuada, o se pueden obtener a partir
de compañías comerciales o laboratorios, o simplemente se pueden
obtener según las necesidades en base al fin o caso particular.
Un ejemplo preferido de un sustrato de AMPK
adecuado es el péptido SAMS (HMRSAMSGLHLVKRR) (Davies, S.P.,
Carling, D. y Hardie, D.G., Eur. J. Biochem. 186,
123-128 (1989)). Éste está comercialmente disponible
de Upstate Biotechnology Inc.
Preferentemente, la actividad de AMPK se evalúa
como se describe en la presente memoria (por ejemplo como se
muestra en la Figura 4d).
La AMPK también se puede evaluar por medios
genéticos. Por ejemplo, se puede usar o adaptar un ensayo para AMPK
de levadura (Snf1), en el que la transcripción de un informador
lexAop-lacZ depende de la actividad
catalítica de LexA-Snf1p unido al promotor (Kuchin,
2000-Kuchin, S., Treich, I. y Carlson, M. A
regulatory shortcut between the Snf1 protein kinase and RNA
polymerase II holoenzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,
7916-7920 (2000) -
incorporado en la presente memoria como referencia). Este y otros ensayos genéticos se explican de forma más completa más abajo, tal como en la sección de ejemplos.
incorporado en la presente memoria como referencia). Este y otros ensayos genéticos se explican de forma más completa más abajo, tal como en la sección de ejemplos.
Con relación al uso de AMPK en los ensayos de la
presente invención, hay muchos métodos alternativos para producir
las proteínas disponibles para la persona experta.
En un ensayo según la presente invención, se
podría usar AMPK, u homólogos de AMPK, que contienen el resto
fosforilable necesario para la activación, y que contiene aquellos
restos de aminoácidos necesarios para la actividad.
Preferentemente, el resto de la activación es 172, preferentemente
treonina 172. El que un resto sea necesario o no para la actividad
se puede determinar mediante pruebas en un ensayo o ensayos de AMPK
como se describen en la presente memoria, por ejemplo usando el
péptido SAMS.
La AMPK es activada por fosforilación en el
bucle de activación. En particular, la AMPK es activada por
fosforilación en el sitio 172 de activación. La AMPK de origen
natural habitualmente posee treonina en este sitio; sin embargo, se
apreciará que se puede sustituir en este sitio por un aminoácido
fosfoaceptor similar, por ejemplo serina. Además, se pueden
construir mutantes constitutivamente activos mediante mutación
posterior en este sitio, como se sabe en la técnica, por ejemplo
introduciendo restos cargados negativamente. En el contexto de la
presente invención, la AMPK posee preferentemente un resto
fosfoaceptor en el bucle de activación en la posición 172 como se
juzga con referencia a la secuencia de mamífero de tipo natural, y
preferentemente la posición 172 es treonina.
A este respecto, se puede usar cualquier
preparación activa de LKB1, por ejemplo LKB1 recombinante expresada
en un sistema adecuado con o sin una secuencia o secuencias de
etiquetas, para fosforilar y activar cualquier forma de AMPK que
retenga el sitio de activación (equivalente a treonina 172) y/o que
fue capaz de presentar actividad catalítica de AMPK tras la
fosforilación.
Se apreciará que AMPK está compuesta
naturalmente de múltiples subunidades. De este modo, como se usa en
la presente memoria, el término "AMPK" se refiere a aquella
proteína o asociación de proteínas que tiene la actividad de AMPK.
Actualmente hay por lo menos 12 posibles combinaciones de
subunidades en asociación para formar AMPK. Este número surge del
hecho de que hay actualmente 2 subunidades alfa, 2 subunidades beta
y 3 subunidades gamma, dando de ese modo 12 posibles formas
heterotriméricas diferentes de AMPK. La subunidad alfa es
seleccionada como diana por LKB1.
La fuente preferida de AMPK útil en la presente
invención es un complejo de AMPK de mamífero expresado de forma
bacteriana. En Neumann et al., 2003, Protein Expression and
Purification "Mammalian AMP-activated protein
kinase:functional, heterotrimeric complexes by
co-expression of subunits in E. coli" se
detalla una estrategia preferida usada para la expresión del
complejo. De este modo, en una forma de realización preferida, la
AMPK usada en los ensayos de la presente invención se prepara según
Neumann et al.
Se apreciará que aunque Neumann et al.
trabaja a partir de subunidades de AMPK de ratón codificadas por
ADNc detallados en los números de acceso GenBank X95578, X95577 y
U40819, la preparación de subunidades de AMPK humana está también
dentro de la capacidad de la persona experta en la técnica siguiente
Neumann y modificando simplemente los cebadores de la PCR usados
para las etapas de clonación para hacer un seguimiento de la
secuencia humana según sea necesario, y usando para la etapa de la
PCR un ácido nucleico molde humano adecuado. De este modo, en otra
forma de realización, preferentemente la AMPK es AMPK humana
preparada según Neumann
et al.
et al.
También es posible usar una versión o versiones
truncadas de la subunidad alfa de AMPK en la presente invención,
preferentemente aquellas que contienen la subunidad catalítica,
preferentemente que incluyen treonina 172. Truncando la AMPK alfa,
es posible producir una proteína que se puede fosforilar en la
treonina 172 por la quinasa aguas arriba y es activa en ausencia de
las otras 2 subunidades de AMPK reguladoras (beta y gamma).
Preferentemente, la AMPK alfa truncada, para uso en la presente
invención, se prepara según Hamilton, S.R., O'Donnell, J.B.,
Hammet, A., Stapleton, D., Habinowski, S.A., Means, A.R., Kemp,
B.E., y Witters, L.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 293,
892-898 (2002). Este material comprende los primeros
312 aminoácidos de alfa1 expresada bacterianamente y purificada
usando Ni-NTA. Este material se puede usar entonces
como un sustrato para la quinasa aguas arriba, en los ensayos de la
presente invención.
También es posible usar AMPK purificada de
tejidos de animales. Por ejemplo, la AMPK se puede purificar a
partir de hígado de rata, según Carling, D., Clarke, P.R., Zammit,
V.A. y Hardie, D.G. Eur. J. Biochem. 186, 123-128
(1989). Naturalmente, se apreciará por el lector experto que es
posible usar en los ensayos de la presente invención AMPK
purificada de cualquier fuente que contenga la enzima. Por ejemplo,
la AMPK purificada, para uso en la presente invención, está
comercialmente disponible de Upstate Biotechnology Inc.
Adicionalmente, se apreciará que el homólogo o
los homólogos de AMPK procedentes de otras especies también serían
útiles en la presente invención, por ejemplo SNF1 de levadura.
En una forma de realización preferida, la AMPK
se puede preparar para uso en los ensayos de la presente invención
como se describe en Neumann et al. (Neumann, Woods, Carling,
Wallimann y Schlattner Protein Expression and Purification 2003
"Mammalian AMP-activated protein kinase:
functional, heterotrimeric complexes by
co-expression of subunits in E.
coli").
En otra forma de realización preferida, la AMPK
se puede preparar según Hamilton et al. (Hamilton et
al. 2002, BBRC, vol. 293, p. 892-898), que
describe la expresión de una forma truncada de AMPK adecuada para
uso en la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Con respecto al uso de LKB1 en los ensayos de la
presente invención, hay muchos métodos alternativos para producir
LKB1 disponibles para el lector experto. Naturalmente, puede que no
se sepa que la muestra comprende LKB1, por ejemplo si el ensayo se
está usando cualitativamente para determinar si está presente la
actividad de LKB1 en dicha muestra.
Se podría usar cualquier preparación activa de
LKB1 (por ejemplo expresada en un sistema adecuado con o sin una
secuencia o secuencias de etiquetas) para fosforilar y activar
cualquier preparación de AMPK, tal como AMPK que retiene el sitio
de activación (equivalente a treonina 172 de AMPK) y/o que fue capaz
de mostrar actividad catalítica tras la fosforilación (véase la
sección de AMPK anterior).
Específicamente, Sapkota et al. (Sapkota
et al. 2001, JBC, vol. 276, p. 19469-19482)
proporciona ejemplos de diferentes formas etiquetadas de LKB1,
adecuadas para uso en la presente invención. Preferentemente, la
LKB1 se produce en E. coli y se purifica según Sapkota et
al., que se incorpora en la presente memoria como
referencia.
El lector experto apreciará que también serían
adecuados diferentes clones de LKB1 procedentes de diferentes
especies. Estos pueden incluir homólogos de LKB1. Los preferidos son
aquellos homólogos que muestran la mayor identidad de secuencia con
LKB1 humana o de ratón, preferentemente con LKB1 humana.
Sapkota usa como molde la secuencia de ratón
NCBI AA542163/IMAGE 550355 en la clonación de LKB1 mediante PCR.
Naturalmente, la persona experta en la técnica apreciará que Sapkota
se adapta fácilmente para proporcionar la LKB1 humana siguiendo los
mismos procedimientos, y adaptando simplemente las secuencias
cebadoras según sea necesario a la secuencia humana, y usando un
ácido nucleico molde humano adecuado. De este modo, en una forma de
realización, LKB es preferentemente LKB humana.
Puede ser deseable usar una versión truncada de
LKB1 que retenga actividad. La retención de la actividad de LKB se
determina fácilmente usando los ensayos de la presente
invención.
La LKB se puede activar como se describe más
abajo, por ejemplo mediante expresión en una estirpe o estirpes
celulares particulares.
Puede ser deseable expresar LKB1 directamente en
una forma activa, y esto se podría usar entonces en los ensayos de
la presente invención. La LKB1 se puede activar y/o estabilizar como
se sabe en la técnica, por ejemplo usando la proteína HSP90 y/o
Cdc37 y/o STRAD.
Se sabe que LKB1 es activa cuando se expresa en
células COS7, HEK293, de melanoma G361, de hepatoma hepático CCL13,
de músculo esquelético H2K, HeLa o Sf9.
En una forma de realización preferida, la LKB y
la AMPK procederían de, o derivarían de, la misma especie.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de LKB1 quinasa se realiza usando
condiciones estándar para ensayos de quinasa. El comentario a
continuación se refiere a concentraciones finales en el ensayo.
El pH se tampona preferentemente para los
ensayos de LKB1 quinasa. Preferentemente, el pH se tampona entre 6
y 9, preferentemente entre 6,5 y 8,5, preferentemente 7,5.
El agente tamponante puede ser Tris, HEPES,
MOPS, MES, u otro agente tampón adecuado. Preferentemente, el
agente es HEPES. Preferentemente, el agente tampón es 50 mM.
Se incluye un ion metálico. Preferentemente, un
ion metálico 2+. Preferentemente, un ion manganeso y/o magnesio.
Preferentemente, un ion magnesio. Preferentemente, el ion metálico
se proporciona como cloruro metálico. Preferentemente, el ion
metálico está presente en una concentración de 1-10
mM, preferentemente 5 mM.
\newpage
Opcionalmente se incluye un estabilizante. El
estabilizante puede ser glicerina, por ejemplo glicerina al 10%, o
puede ser un detergente, tal como Tritón, por ejemplo Tritón al 1%,
o Tween, por ejemplo Tween al 0,1%.
Ventajosamente se incluye un agente reductor. El
agente reductor puede ser DTT, glutationa,
b-mercaptoetanol, u otro agente adecuado.
Preferentemente, el agente se usa en una concentración de 1 mM.
Preferentemente, el agente es DTT.
Opcionalmente se usa un agente quelante.
Preferentemente, el agente quelante es EDTA, preferentemente EDTA 1
mM.
Se incluye ATP. Preferentemente, el ATP está
presente en una concentración de 10 uM a 10 mM, preferentemente 10
uM a 5 mM, preferentemente 100 uM. El ATP está marcado
radiactivamente (preferentemente marcado gamma), por ejemplo con
33P o 32P, preferentemente 32P, o puede no estar marcado
radiactivamente, dependiendo de las necesidades y de la lectura
escogida. Si no está marcado radiactivamente, la lectura se lleva a
cabo preferentemente mediante inmunodetección de
P-T172 de AMPK.
Opcionalmente se puede incluir un activador o
activadores de LKB1. Estos pueden incluir la proteína STRAD y/o
AMP.
Si se desea, se pueden incluir otros factores de
LKB1, por ejemplo HSP90, Cdc37 u otros.
Preferentemente, las condiciones para el ensayo
de LKB1 son como se explican en la sección de ejemplos,
particularmente se prefieren aquellas condiciones dadas en el
Ejemplo 7, tal como 100 uM de ATP.
\vskip1.000000\baselineskip
La perturbación génica se puede lograr mediante
cualquier técnica conocida por los expertos en la materia, tal como
interrupción, mutación o supresión. Preferentemente, la perturbación
génica se logra mediante supresión de por lo menos parte de la
secuencia codificante del genoma, preferentemente mediante supresión
de toda la secuencia codificante del genoma.
La destrucción también se puede lograr mediante
modificación de elementos transcripcionales, tal como un elemento o
elementos promotores, o mediante la sobreexpresión de un ácido o
ácidos nucleicos antisentido o inhibidores, para reducir o suprimir
la traducción de un ARN transcrito, o por cualquier otro medio
adecuado conocido en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos útiles en la presente invención
se pueden preparar con una etiqueta de epítopo, tal como myc, HA,
glutationa-S-transferasa, flag, u otra etiqueta.
Preferentemente es flag.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención encuentra utilidad
particular en el tratamiento, prevención y/o mejora del síndrome de
Peutz-Jeghers (PJS), obesidad, diabetes,
preferentemente diabetes de tipo II, hipercardiomiotrofia (HCM),
mantenimiento de la homeostasia de la energía celular, estrés,
incluyendo choque térmico, hipoxia e isquemia, fatiga muscular y
otros estados conectados con niveles alterados de ATP celular,
cáncer, particularmente cánceres que se producen en sujetos con
PJS, poliposis intestinal, resistencia a la transformación y
supresión del crecimiento celular, por ejemplo inversión/detección
de un estado o estados de crecimiento desregulado, inducción de o
permisión de muerte
apoptótica.
apoptótica.
La familia de Snf1/AMPK de quinasas es
importante para las respuestas al estrés metabólico en eucariotas.
En mamíferos, la AMPK es activada por múltiples estreses, muchos de
los cuales conducen a un incremento en la relación de AMP:ATP
celular, y también por leptina y por el agente hipoglucémico
metformina. La AMPK tiene un papel central coordinando la
homeostasia energética, y es un regulador importante del metabolismo
lipídico, del almacenamiento de glucógeno, y del transporte de
glucosa. Se ha implicado a la AMPK en el desarrollo y tratamiento
de trastornos metabólicos, incluyendo diabetes de tipo 2 y obesidad,
y las mutaciones en AMPK producen anormalidades cardíacas en seres
humanos.
En particular, los tratamientos de la presente
invención se pueden usar en un régimen combinado con fármacos
dirigidos contra p53 (por ejemplo, véase Bardeesy et al.,
Nature, vol. 419, p. 162), para un efecto potenciado.
\newpage
Se han identificado tres quinasas, Tos3p, Pak1p,
y Elm1p, que funcionan como quinasas aguas arriba en la cascada de
la quinasa Snf1. Se presentan datos genéticos y bioquímicos de que
estas quinasas fosforilan y activan Snf1 quinasa in vitro e
in vivo (véase la sección de ejemplos). Las células de
levadura mutantes, que carecen de estas tres quinasas, son
defectuosas en la utilización de fuentes de carbono distintas de la
glucosa, una función distintiva de la ruta de Snf1 quinasa. Esta es
la primera identificación de quinasas aguas arriba en la cascada de
Snf1/AMPK quinasa con papeles/funciones fisiológicas
demostradas.
Estas tres quinasas muestran claramente una
redundancia funcional significativa, puesto que las tres deben de
estar mutadas para conferir los fenotipos de Snf examinados en la
presente memoria. Sin embargo, parece probable que demostrarán
tener algunas funciones distintas con respecto a la regulación de
Snf1. Cada una de las tres quinasas aguas arriba puede mostrar
cierta preferencia por Snf1 quinasa que contiene una isoforma de la
subunidad \beta específica. Otra posibilidad es que las tres
quinasas respondan preferentemente a diferentes tipos de estrés
metabólico, o a diferentes señales que resulten de un único estrés,
tal como la limitación de glucosa.
Como se explica en la presente memoria, la
identificación de estas quinasas también tiene importancia más allá
de la levadura, al permitir diseñar y refinar ensayos según la
presente invención, tales como ensayos y/o detecciones sistemáticas
para la identificación de quinasas aguas arriba en la cascada de
AMPK.
El examen de la quinasa LKB1 (una quinasa
supresora de tumores) de mamífero estrechamente relacionada, dio
pruebas de que la LKB1 es una quinasa aguas arriba para AMPK.
Se demuestra en la presente memoria que LKB1
fosforila y activa in vitro AMPK en el resto de treonina del
bucle de activación.
De este modo, se demuestra que LKB1 es una diana
valiosa para fármacos candidatos que influyan sobre la actividad de
AMPK en las células.
Además, estos hallazgos apoyan el papel descrito
para AMPK en la regulación del crecimiento y transformación así
como del metabolismo, e igualmente el papel fisiológico de LKB1 en
la regulación de AMPK in vivo.
Se apreciará que otras quinasas de mamíferos,
que están relacionadas con las quinasas aguas arriba de levaduras,
también son candidatas para quinasas genuinas de la cascada de AMPK
según la presente invención. Estas quinasas aguas arriba de
mamíferos representan dianas terapéuticas según la presente
invención, particularmente para el tratamiento de trastornos
metabólicos humanos, incluyendo obesidad y diabetes de tipo 2, y
cánceres.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz del agente o agentes y/o del modulador o moduladores de la
presente invención, y un vehículo, diluyente o excipiente
(incluyendo sus combinaciones) farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser para
uso humano o animal, en medicina humana y veterinaria, y
comprenderán típicamente uno cualquiera o más de un diluyente,
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o
diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la
técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publising Co. (A. R. Gennaro edit.
1985). La elección del vehículo, excipiente o diluyente
farmacéutico se puede seleccionar con respecto a la ruta pretendida
de administración y a la práctica farmacéutica estándar. Las
composiciones farmacéuticas pueden comprender como el vehículo,
excipiente o diluyente - o además de él - cualquier aglutinante o
aglutinantes, lubricante o lubricantes, agente o agentes de
suspensión, agente o agentes de revestimiento, agente o agentes
solubilizantes, adecuados.
En la composición farmacéutica se pueden
proporcionar conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso
agentes saborizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen
benzoato de sodio, ácido sórbico, y ésteres del ácido
p-hidroxibenzoico. También se pueden usar
antioxidantes y agentes de suspensión.
Puede haber diferentes requisitos de
composición/formulación, dependiendo de los diferentes sistemas de
suministro. A título de ejemplo, la composición farmacéutica de la
presente invención se puede formular para ser administrada usando
una minibomba o mediante una ruta mucosal, por ejemplo como un
pulverizador nasal o aerosol para inhalación o disolución
ingerible, o parenteralmente, en la que la composición se formula
mediante una forma inyectable, para el suministro, por ejemplo,
mediante una ruta intravenosa, intramuscular o subcutánea. Como
alternativa, la formulación se puede diseñar para ser administrada
mediante un número de rutas.
Cuando el agente se administra de forma mucosal
a través de la mucosa gastrointestinal, debería de ser capaz de
permanecer estable durante el tránsito a través del tubo digestivo;
por ejemplo, debería de ser resistente a la degradación
proteolítica, estable a pH ácido, y resistente a los efectos
detergentes de la bilis.
Cuando sea apropiado, las composiciones
farmacéuticas se pueden administrar mediante inhalación, en forma
de un supositorio o pesario, tópicamente en forma de una loción,
disolución, crema, ungüento o polvo muy fino, mediante el uso de un
parche para la piel, oralmente en forma de comprimidos que contienen
excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos,
ya sea solos o en mezcla con excipientes, o en forma de elixires,
disoluciones o suspensiones que contienen agentes saborizantes o
colorantes, o se pueden inyectar parenteralmente, por ejemplo
intravenosa, intramuscular o subcutáneamente. Para la administración
parenteral, las composiciones se deben de usar mejor en forma de
una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias,
por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para que la
disolución sea isotónica con la sangre. Para la administración
bucal o sublingual, las composiciones se pueden administrar en forma
de comprimidos o pastillas para chupar, que se pueden formular de
manera convencional.
Para algunas formas de realización, los agentes
y/o factores de crecimiento de la presente invención también se
pueden usar en combinación con una ciclodextrina. Se sabe que las
ciclodextrinas forman complejos de inclusión y de no inclusión con
moléculas farmacéuticas. La formación de un complejo de
fármaco-ciclodextrina puede modificar la
solubilidad, la velocidad de disolución, la biodisponibilidad y/o la
propiedad de estabilidad de una molécula farmacéutica. Los
complejos de fármaco-ciclodextrina generalmente son
útiles para la mayoría de las formas de dosificación y rutas de
administración. Como una alternativa a la complejación directa con
el fármaco, la ciclodextrina se puede usar como un aditivo auxiliar,
por ejemplo como un vehículo, diluyente o solubilizante. Las más
usadas habitualmente son las alfa-, beta- y
gamma-ciclodextrinas, y los ejemplos adecuados se
describen en los documentos
WO-A-91/11172,
WO-A-94/02518 y
WO-A-98/55148.
Si el agente/modulador es una proteína, entonces
dicha proteína se puede preparar in situ en el sujeto
tratado. A este respecto, se pueden suministrar secuencias
nucleotídicas, que codifican dicha proteína, mediante el uso de
técnicas no víricas (por ejemplo mediante el uso de liposomas) y/o
mediante técnicas víricas (por ejemplo mediante el uso de vectores
retrovíricos), de forma que dicha proteína se exprese a partir de
dicha secuencia nucleotídica.
En una forma de realización preferida, el
fármaco de la presente invención se administra tópicamente.
Por tanto, preferentemente, el fármaco está en
una forma que es adecuada para el suministro tópico.
El término "administrar" incluye el
suministro mediante técnicas víricas o no víricas. Los mecanismos de
suministro vírico incluyen pero no se limitan a vectores
adenovíricos, vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores
víricos del herpes, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, y
vectores baculovíricos. Los mecanismos de suministro no vírico
incluyen la transfección mediada por lípidos, liposomas,
inmunoliposomas, lipofectina, anfífilos faciales catiónicos (CFA),
y sus combinaciones.
Los componentes de la presente invención se
pueden administrar solos, pero generalmente se administrarán como
una composición farmacéutica - por ejemplo, cuando los componentes
están en mezcla con un excipiente, diluyente o vehículo
farmacéutico adecuado, seleccionado con respecto a la ruta
pretendida de administración y a la práctica farmacéutica
estándar.
Por ejemplo, los componentes se pueden
administrar (por ejemplo oral o tópicamente) en forma de
comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, disoluciones o
suspensiones, que pueden contener agentes saborizantes o colorantes,
para aplicaciones de liberación inmediata, retrasada, modificada,
sostenida, pulsada o controlada.
Si el fármaco es un comprimido, entonces el
comprimido puede contener excipientes tales como celulosa
microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio,
carbonato cálcico dibásico, y glicina, agentes disgregantes tales
como almidón (preferentemente almidón de maíz, de patata o de
tapioca), glicolato de almidón sódico, croscarmelosa sódica, y
algunos silicatos complejos, y aglutinantes de la granulación tales
como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC),
hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y goma arábiga.
Adicionalmente, se pueden incluir agentes lubricantes tales como
estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo, y
talco.
También se pueden utilizar como cargas en
cápsulas de gelatina composiciones sólidas de un tipo similar. Los
excipientes preferidos a este respecto incluyen lactosa, almidón,
una celulosa, azúcar de leche, o polietilenglicoles de alto peso
molecular. Para las suspensiones acuosas y/o elixires, el agente se
puede combinar con diversos agentes edulcorantes o saborizantes,
materia colorante o tintes, con agentes emulsionantes y/o de
suspensión, y con diluyentes tales como agua, etanol,
propilenglicol y glicerina, y sus combinaciones.
Las vías de administración (suministro)
incluyen, pero no se limitan a, uno o más de: oral (por ejemplo como
un comprimido, cápsula, o como una disolución ingerible), tópica,
mucosal (por ejemplo como una pulverización nasal o un aerosol para
inhalación), nasal, parenteral (por ejemplo mediante una forma
inyectable), gastrointestinal, intraespinal, intraperitoneal,
intramuscular, intravenosa, intrauterina, intraocular, intradérmica,
intracraneal, intratraqueal, intravaginal, intracerebroventricular,
intracerebral, subcutánea, oftálmica (incluyendo intravítrea o
intracameral), transdérmica, rectal, bucal, vaginal, epidural,
sublingual.
En un aspecto preferido, la composición
farmacéutica se suministra tópicamente.
Se entenderá que no todos los componentes del
fármaco necesitan ser administrados por la misma vía. Igualmente,
si la composición comprende más de un componente activo, entonces
esos componentes se pueden administrar por vías diferentes.
Si un componente de la presente invención se
administra parenteralmente, entonces los ejemplos de tal
administración incluyen uno o más de: la administración
intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal,
intraventricular, intrauretral, intraestémica, intracraneal,
intramuscular o subcutánea del componente, y/o usando técnicas de
infusión.
Para la administración parenteral, el componente
se usa mejor en forma de una disolución acuosa estéril que puede
contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o glucosa
para que la disolución sea isotónica con la sangre. Las
disoluciones acuosas se deberían tamponar adecuadamente
(preferentemente hasta un pH de 3 a 9), si es necesario. La
preparación de formulaciones parenterales adecuadas, en condiciones
estériles, se logra fácilmente mediante técnicas farmacéuticas
estándar, bien conocidas por los expertos en la materia.
Como se ha indicado, el componente o componentes
de la presente invención se pueden administrar intranasalmente o
mediante inhalación, y se suministra convenientemente en forma de un
inhalador de polvo seco o en una presentación de un pulverizador de
aerosol desde un recipiente a presión, bomba, pulverizador o
nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo
diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano tal como
1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A^{TM}) o
1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA
227EA^{TM}), dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de
un aerosol a presión, la unidad de dosificación se puede determinar
proporcionando una válvula para que suministre una cantidad medida.
El recipiente a presión, bomba, pulverizador o nebulizador puede
contener una disolución o suspensión del compuesto activo, por
ejemplo usando una mezcla de etanol y el propelente como disolvente,
que adicionalmente puede contener un agente lubricante, por ejemplo
trioleato de sorbitán. Se pueden formular cápsulas y cartuchos
(hechos de, por ejemplo, gelatina) para uso en un inhalador o
in-
suflador, para que contengan una mezcla en polvo del agente y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
suflador, para que contengan una mezcla en polvo del agente y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
Como alternativa, el componente o componentes de
la presente invención se pueden administrar en forma de un
supositorio o un pesario, o se pueden aplicar tópicamente en forma
de un gel, hidrogel, loción, disolución, crema, ungüento o polvo
muy fino. El componente o componentes de la presente invención
también se pueden administrar dérmica o transdérmicamente, por
ejemplo mediante el uso de un parche para la piel. También se pueden
administrar mediante las vías pulmonar o rectal. También se pueden
administrar mediante la vía ocular. Para uso oftálmico, los
compuestos se pueden formular como suspensiones micronizadas en
disolución salina estéril, isotónica, de pH ajustado, o,
preferentemente, como disoluciones en disolución salina estéril,
isotónica, de pH ajustado, opcionalmente en combinación con un
agente conservante, tal como cloruro de benzalconio. Como
alternativa, se pueden formular en un ungüento, tal como
vaselina.
Para la aplicación tópica a la piel, el
componente o componentes de la presente invención se pueden formular
como un ungüento adecuado que contiene el compuesto activo
suspendido o disuelto en, por ejemplo, una mezcla con uno o más de
los siguientes: aceite mineral, aceite de vaselina, vaselina blanca,
propilenglicol, un compuesto de polioxietileno y polioxipropileno,
cera emulsionante, y agua. Como alternativa, se puede formular como
una loción o crema adecuada, suspendida o disuelta en, por ejemplo,
una mezcla de uno o más de los siguientes: aceite mineral,
monoestearato de sorbitán, un polietilenglicol, parafina líquida,
polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico,
2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Típicamente, un médico determinará la dosis real
que será la más adecuada para un individuo. El nivel de dosis
específico y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente
particular se pueden variar, y dependerán de una variedad de
factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado,
de la estabilidad metabólica y de la duración de la acción de ese
compuesto, de la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta,
modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación
de fármacos, la gravedad de la afección particular, y la terapia
individual que se sigue.
Dependiendo de las necesidades, el agente se
puede administrar a una dosis de 0,01 a 30 mg/kg de peso corporal,
tal como de 0,1 a 10 mg/kg, más preferentemente de 0,1 a 1 mg/kg de
peso corporal.
El componente o componentes de la presente
invención se pueden formular en una composición farmacéutica, tal
como mezclando con uno o más de un vehículo, diluyente o excipiente
adecuado, usando técnicas que son conocidas en la técnica.
El agente de la presente invención se puede
administrar como una sal farmacéuticamente aceptable. Típicamente,
una sal farmacéuticamente aceptable se puede preparar fácilmente
usando un ácido o base deseado, según sea apropiado. La sal puede
precipitar de la disolución y se puede recoger por filtración, o se
puede recuperar por evaporación del disolvente.
Se apreciará que todas las referencias en la
presente memoria a tratamiento incluyen uno o más de un tratamiento
curativo, paliativo y profiláctico. Preferentemente, el término
tratamiento incluye por lo menos un tratamiento curativo y/o un
tratamiento profiláctico.
El tratamiento puede ser de uno o más de los
trastornos mencionados en la presente memoria, o una dolencia
relacionada.
Los agentes/moduladores identificados por los
métodos de la presente invención se pueden usar como agentes
terapéuticos - es decir, en aplicaciones de terapia.
Al igual que el término "tratamiento", el
término "terapia" incluye efectos curativos, efectos de alivio,
y efectos profilácticos.
La terapia se puede realizar sobre seres humanos
o animales.
La terapia puede incluir el tratamiento de uno o
más de los trastornos mencionados en la presente memoria, o una
dolencia relacionada.
La invención se describe a continuación mediante
los ejemplos, en los que la referencia se hace a las figuras
siguientes.
Fig. 1. Sobreexpresión y fenotipos mutantes. (A)
La sobreexpresión de Tos3p, Pak1p, y Elm1p estimula la función de
Snf1 en un ensayo informador. Los transformantes de la cepa TAT7
(ura3::lexAop-lacZ) expresaron GST o
GST-Tos3p, -Pak1p, o -Elm1p a partir de un promotor
(pRH95, pRH98, pRH94, respectivamente, purificados de una librería
(Martzen, 1999)), inducible por cobre, y LexA-Snf1p
(pOV8 (vincent, 2001)). La síntesis de
\beta-galactosidasa a partir del informador
dependió de la actividad de LexA-Snf1p (Kuchin,
2000). Los transformantes (n = 3) se hicieron crecer hasta la fase
logarítmica media en medio completo sintético (SC) selectivo + 2% de
glucosa, se cambiaron a un medio que contiene 0,5 mM de CuSO_{4}
y 2% de glucosa (barras en blanco) o 0,05% de glucosa (barras en
negro) durante 3 h, y se evaluaron para determinar la actividad de
\beta-galactosidasa (Kuchin, 2000). Los
transformantes del control, que expresan LexA con cada
GST-quinasa, tuvieron valores de <0,3 U. (B) Los
mutantes tos3\Deltapak1\Deltaelm1\Delta triples
mostraron defectos de crecimiento. Los mutantes dobles derivados de
W303, MCY5117 (MAT\alpha, tos3\Delta::KanMX4
pak1\Delta::KanMX4 ura3) y MCY5122 (MATa
tos3\Delta::KanMX4 ELM1\Delta::URA3 ura3), se cruzaron y
se sometieron a análisis de tétradas. Los segregantes se replicaron
a partir de medio rico hasta SC-Ura + 2% de glucosa
y SC + 2% de glicerina/3% de etanol. Se muestran cinco tétradas. Se
observó el mismo patrón de crecimiento en SC + 2% de rafinosa +
antimicina A (1 \mug/ml). Los asteriscos indican segregantes de
mutantes triples; los genotipos se determinaron mediante análisis
por PCR de ADN genómico. Cepas de control: de tipo natural (WT);
mutante snf1\Delta; mutantes dobles progenitores.
Fig. 2. Ensayos de la actividad de Snf1 quinasa.
(A, B) Se hicieron crecer, en SC selectivo + 2% de glucosa, células
de tipo natural y de mutantes triples que expresan
LexA-Snf1p o sus derivados mutantes T210A y K84R
(pRJ55, pRJ217, y pRJ215 (Jiang, 1996)). Las proteínas se
inmunoprecipitaron de los extractos (200 \mug) con
anti-LexA. Los inmunoprecipitados (A) se incubaron
en tampón de quinasa que contiene
\gamma-^{32}P-ATP, y después se
analizaron mediante SDS-PAGE y autorradiografía, y
(B) se analizaron mediante inmunotransferencia con
anti-LexA. (C, D) Los extractos se prepararon por
duplicado a partir de células que se hicieron crecer en medio rico.
La Snf1 quinasa se purificó parcialmente mediante cromatografía
sobre DEAE-Sepharose, y las fracciones del pico se
reunieron y se concentraron. Las fracciones reunidas (C) se
evaluaron por triplicado para determinar la fosforilación del
péptido SAMS (HMRSAMSGLHLVKRR) en presencia de
\gamma-^{32}P-ATP (Woods, 1994;
Davies, 1989), y (D) se inmunotransfirieron con
anti-Snf1. También, un extracto de mutante
snf1-K84R no mostró actividad.
Fig. 3. Tos3p y Elm1p fosforilan Snf1p en T210
in vitro. Snf1KD-K84R y
Snf1KD-T210A, etiquetados con His, se expresaron
bacterianamente a partir de pRH89 y pRH90, y derivados de pET32c
(Novagen), y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con
cobalto sobre una resina TALON (Clontech). Los extractos se
prepararon a partir de células de levadura que expresan
GST-Tos3p (Martzen, 1999), GST-Pak1p
(Martzen, 1999) y GST-Elm1p (Zhu, 2000), y la
GST-quinasa se purificó sobre
glutationa-Sepharose. La GST-quinasa
inmovilizada se incubó con la proteína mutante Snf1KD indicada (0,2
\mug) o sin sustrato, en presencia de
\gamma-^{32}P-ATP durante 20
minutos a 25ºC. Las proteínas se separaron mediante
SDS-PAGE. Se muestra un autorradiograma. Una
GST-quinasa arbitraria, YPL141C, sirvió como
control. Las flechas representan Snf1KD. Los asteriscos muestran la
GST-quinasa de longitud completa autofosforilada. Se
indican los marcadores de tamaño molecular (kDa).
Fig. 4. Tos3p y LKB1 fosforilan y activan AMPK
in vitro. (A) Se incubó AMPK expresada bacterianamente
(\alpha1\beta1\gamma1 (Neumann, 2003)) con MgATP y
GST-quinasa unida a
glutationa-Sepharose, durante 30 minutos a 30ºC.
Tras la centrifugación para eliminar la resina, se midió la
actividad de AMPK en el sobrenadante usando el ensayo del péptido
SAMS (Davies, 1989). (B) Se incubó una forma catalíticamente
inactiva de AMPK (2 \mug), que contiene una mutación D157A en la
subunidad \alpha (Stein, 2000), con GST-Tos3p o
GST unida a perlas de glutationa-Sepharose, en
presencia de \gamma-^{32}P-ATP
durante 30 minutos a 30ºC. Las perlas se eliminaron por
centrifugación, y las proteínas en el sobrenadante se analizaron
mediante SDS-PAGE y autorradiografía. Se indican
los marcadores de tamaño molecular (kDa). (C) Se fosforiló AMPK
expresada bacterianamente (0,15 \mug) mediante
GST-Tos3p, y se analizó mediante inmunotransferencia
con anticuerpo específico anti-fosfotreonina 172
(Cell Signalling Technologies). La AMPK también se incubó con GST o
con AMPKK de hígado de rata parcialmente purificada (Hawley, 1996).
(D) Se purificó LKB1 (de tipo natural, WT) etiquetada con FLAG, o un
mutante catalíticamente inactivo (D194A), a partir de lisados de
células COS7 mediante la unión a gel de afinidad por FLAG (Sigma).
La AMPK expresada bacterianamente se incubó con las perlas, y se
midió la actividad de AMPK como en (A). La fosforilación de T172 se
determinó mediante inmunotransferencia.
Snf1 y la proteína quinasa activada por AMP
(AMPK) son los componentes aguas abajo de las cascadas de proteínas
quinasas que desempeñan papeles fundamentales en las respuestas
celulares al estrés metabólico, y parece que se conservan en todas
las células eucariotas. En seres humanos, se ha propuesto que la
AMPK desempeña un papel en trastornos metabólicos, incluyendo la
diabetes y la obesidad. La quinasa o quinasas aguas arriba en la
cascada han sido esquivas, a pesar de los esfuerzos considerables.
Se han identificado tres quinasas, Pak1p, Tos3p y Elm1p, que
activan Snf1 quinasa en levadura. La supresión triple de los genes
emparentados provoca un fenotipo mutante, y elimina la actividad
catalítica de Snf1. Las tres quinasas fosforilan Snf1p recombinante
en la treonina del bucle de activación. Además, Tos3p fosforila y
activa AMPK recombinante de mamífero, sugiriendo la conservación de
la función de las quinasas aguas arriba. No hay homólogos claros de
mamífero de Pak1p, Tos3p y Elm1p, aunque sus dominios catalíticos
están muy estrechamente relacionados con los miembros de la familia
de proteínas quinasas quinasas dependientes de Ca^{2+}/calmodulina
(CaMKK). Sin embargo, estudios previos indican que la principal
quinasa aguas arriba en la cascada de AMPK (AMPKK) no depende de
Ca^{2+}/calmodulina.
Se demostró en la presente memoria que la
proteína quinasa LKB1 relacionada con CamKK fosforila y activa AMPK
in vitro. Las mutaciones en LKB humana provoca el síndrome de
Peutz-Jeghers, un cáncer hereditario. Estos
resultados sugieren que la misma cascada de proteína quinasas está
implicada en la regulación del metabolismo, así como en el
crecimiento y la transformación.
La familia de quinasas Snf1/AMPK es importante
para las respuestas frente al estrés metabólico en eucariotas. En
mamíferos, la AMPK es activada por múltiples estrés, muchos de los
cuales conducen a un incremento en la relación AMP:ATP celular, y
también por leptina y el agente hipoglucémico metformina. La AMPK
tiene un papel central coordinando la homeostasia energética, y es
un regulador principal del metabolismo de lípidos, del
almacenamiento de glucógeno, y del transporte de glucosa. Se ha
implicado a la AMPK en el desarrollo y tratamiento de trastornos
metabólicos, incluyendo diabetes de tipo 2 y obesidad, y las
mutaciones en AMPK provocan anormalidades cardíacas en seres
humanos.
En la levadura S. cerevisiae, la Snf1
quinasa también es necesaria para respuestas frente al estrés,
notablemente la adaptación de las células al estrés del carbono.
Snf1 regula la transcripción de muchos genes en respuesta a la
limitación de la glucosa, y es necesaria para la utilización de
fuentes alternativas de carbono. La Snf1 también tiene papeles en
la meiosis y esporulación, en el crecimiento invasivo filamentoso, y
en el envejecimiento.
La Snf1 quinasa comprende la subunidad
catalítica Snf1p (subunidad \alpha de AMPK), Snf4p (subunidad
\gamma de AMPK), y una de tres subunidades \beta (codificada
por SIP1, SIP2 y GAL83). Snf4 estimula la actividad de quinasa
neutralizando la autoinhibición mediante el dominio regulador de
Snf1p. La subunidad \beta regula la localización subcelular de la
quinasa, y media las interacciones con dianas aguas abajo. Las
señales que controlan la actividad de Snf1 en respuesta a niveles
de glucosa no están resueltas en la técnica anterior, aunque la
relación AMP:ATP puede tener cierto papel.
A pesar de los profundos esfuerzos, la identidad
de las quinasas aguas arriba que fosforilan Snf1 y AMPK ha seguido
siendo evasiva. En levadura, los enfoques genéticos han fracasado a
la hora de producir mutaciones en el gen emparentado, sugiriendo
que múltiples quinasas activan Snf1.
Snf1 es activada por fosforilación, y el resto
de treonina del bucle de activación, T210, es crítico para la
actividad de quinasa.
El análisis espectrométrico de masas de
complejos proteínicos de levadura indicó que Tos3p (YGL179C) se
copurifica con Snf4p, y que Pak1p (no relacionada con la quinasa
activada por p21 de mamífero) se copurifica con Snf1p y con Snf4p.
Tos3p y Pak1p están estrechamente relacionadas, pero sus funciones
son desconocidas, excepto que Pak1 suprime mutaciones de la ADN
polimerasa.
Se demuestra que Tos3p, Elm1p y Pak1p activan
Snf1.
Se demuestra la activación de AMPK de levadura
(Snf1) por las quinasas aguas arriba (Elm1p, Tos3p y Pak1p).
Se describe un ensayo ejemplar de AMPK de
levadura (Snf1).
Para confirmar que Tos3p interactúa con Snf1p,
se expresó una fusión de glutationa-S-transferasa (GST) a
Tos3p en levadura, y se demostró que Snf1p etiquetada con LexA
copurificó en glutationa-Sepharose.
Se introdujeron las mutaciones
tos3\Delta y pak1\Delta en células de levadura, y
se ensayaron para determinar los fenotipos característicos de un
mutante snf1\Delta. Los mutantes individual y doble no
mostraron defecto en el crecimiento sobre rafinosa o
glicerina/etanol (véase Fig. 1B).
Se buscó entonces otra prueba genética de que
Tos3p y Pak1p están funcionalmente relacionadas con la Snf1
quinasa. Se razonó que si activan Snf1, su sobreexpresión puede
compensar la ausencia de la subunidad estimulante Snf4p. La
sobreexpresión de GST-Tos3p o
GST-Pak1p suprimió parcialmente los defectos del
mutante snf4\Delta en la expresión génica de SUC2
(invertasa), y GST-Tos3p restauró el crecimiento
sobre rafinosa en un mutante snf4\Delta, pero no evitó el
requisito de Snf1.
También se usó un ensayo en el que la
transcripción de un informador lexAop-lacZ
depende de la actividad catalítica de LexA-Snf1p
unida al promotor (Kuchin, 2000 - incorporada en la presente memoria
como referencia).
La sobreexpresión de GST-Tos3p o
GST-Pak1p estimuló la síntesis de
\beta-galactosidasa en respuesta a la limitación
de glucosa, implicando un efecto positivo sobre la actividad
catalítica de LexA-Snf1p (Fig. 1A).
La falta de fenotipo en el mutante doble sugirió
que otra quinasa proporciona la función redundante. La quinasa más
estrechamente relacionada con Pak1p y Tos3p es Elm1p, que se
identificó mediante una mutación que provoca una morfología celular
alargada, y afecta al desarrollo pseudohífico. Elm1p desempeña
papeles en el control del crecimiento y citoquinesis del
capullo.
Se introdujo elm1\Delta en las cepas de
los mutantes anteriores, mediante perturbación génica. Las cepas de
tos3\Delta elm1\Delta y pak1\Delta
elm1\Delta crecieron sobre rafinosa y glicerina/etanol,
pero el mutante triple tos3\Delta
pak1\Deltaelm1\Delta no lo hizo. Para confirmar
este resultado, se cruzaron las cepas de
tos3\Deltapak1\Delta y tos3\Delta
elm1\Delta, y se llevó a cabo un análisis de tétradas.
Catorce segregantes de mutantes triples procedentes de trece
tétradas fueron defectuosos en el crecimiento sobre
glicerina/etanol y rafinosa (Fig. 1B). Los ensayos de la actividad
de invertasa mostraron que la expresión de SUC2 estaba
eliminada (95 U en células de tipo natural desreprimidas, y <1 U
en células del mutante snf1 y del mutante triple). El mutante
triple también manifestó un defecto en la acumulación de glucógeno,
otro fenotipo del mutante de snf1\Delta. Estos hallazgos
genéticos apoyan el punto de vista de que, para la función de Snf1
quinasa in vivo, es necesaria una función proporcionada
redundantemente por Tos3p, Pak1p y Elm1p.
Para determinar si estas tres quinasas activan
AMPK (Snf1), se usó un ensayo de quinasa in vitro. Los
extractos proteínicos se prepararon a partir de células de tipo
natural y de mutantes triples que expresan
LexA-Snf1p. Se inmunoprecipitó
LexA-Snf1p con anti-LexA, y se
incubó en presencia de
\gamma-^{32}P-ATP. Cuando se
inmunoprecipitó a partir del extracto de tipo natural,
LexA-Snf1p se fosforiló in vitro, y los
controles con LexA-Snf1K84R y
LexA-Snf1T210A catalíticamente inactivos (que poseen
sustituciones de la lisina del sitio de unión a ATP y de la
treonina del bucle de activación, respectivamente) confirmaron que
la actividad de Snf1 quinasa fue la responsable. Por el contrario,
cuando LexA-Snf1p se precipitó a partir del mutante
triple, no se detectó fosforilación (Fig. 2A), a pesar de los
niveles proteínicos equivalentes (Fig. 2B).
También se ensayó la actividad catalítica de
AMPK (Snf1) in vitro mediante fosforilación del sustrato
peptídico sintético SAMS [Woods, 1994 #507; Davies, 1989 #526]. Se
purificó parcialmente Snf1 a partir de extractos celulares, en
condiciones que activan la quinasa [Wilson, 1996 #463; Woods, 1994
#507], y se incubó con el péptido SAMS en presencia de
\gamma-^{32}P-ATP. El péptido se
fosforiló en ensayos de tipo natural, pero no con extractos de
snf1\Delta. No se detectó actividad en el mutante
tos3\Deltapak1\Deltaelm1\Delta (Fig.
2C); el análisis de inmunotransferencia confirmó la presencia de
Snf1p (Fig. 2D). Estos resultados indican que Snf1 permanece
inactiva en presencia de una quinasa aguas arriba, tal como Tos3p,
Pak1p y Elm1p.
Para demostrar que estas tres quinasas
fosforilan directamente Snf1p, se usó como sustrato una forma
inactiva del dominio catalítico de Snf1 aislado, denominado
Snf1KD-K84R (Fig. 3). Se purificaron
GST-Tos3p, GST-Pak1p, y
GST-Elm1p a partir de levadura, y se incubaron con
Snf1KD-K84R, expresado bacterianamente, en presencia
de \gamma-^{32}P-ATP.
GST-Tos3p y GST-Elm1p y
GST-Pak1p fosforilaron Snf1KD-K84R.
GST-Pak1p fosforiló débilmente el sustrato, quizás
debido a que sólo se recuperaron cantidades mínimas de la proteína
de fusión de longitud completa. La incubación con una
GST-quinasa no relacionada, YPL141C, confirmó que
Snf1KD-K84R no se había autofosforilado.
Para demostrar que Tos3p y Elm1p fosforilan la
treonina del bucle de activación, se usó un sustrato mutante que
carece de T210, Snf1KD-T210A. No se detectó
fosforilación (Fig. 3).
Seguidamente, se demostró la capacidad de las
GST-quinasas purificadas de levadura para fosforilar
y activar AMPK de mamífero. Se incubó AMPK recombinante
(\alpha1\beta1\gamma1), expresada en bacterias (Neumann,
2003), con cada una de las quinasas y MgATP, y se determinó la
actividad de AMPK usando el ensayo del péptido SAMS.
La incubación con GST-Tos3p
condujo a un incremento notable de la actividad de AMPK, mientras
que GST-Elm1p y GST-Pak1p sólo
provocaron un pequeño incremento (Fig. 4A).
GST-Tos3p fosforiló la subunidad
\alpha de una forma catalíticamente inactiva de AMPK, pero no la
subunidad \beta ni la subunidad \gamma (Fig. 4B). El análisis
de inmunotransferencia mostró que GST-Tos3p
fosforila AMPK en T172 (Fig. 4C). Estos hallazgos sugieren la
conservación funcional de las quinasas aguas arriba entre la
levadura y los mamíferos.
Tos3p, Pak1p y Elm1p están muy estrechamente
relacionadas con la proteína quinasa quinasa dependiente de
Ca^{2+}/calmodulina (CaMKK), aunque pueden haberse bifurcado del
grupo de levaduras de las CaMK. La CaMKK de mamífero fosforila
débilmente y activa AMPK in vitro, pero la principal quinasa
de AMPK (AMPKK) es distinta de CaMKK.
Como se describe en la presente memoria, estos
hallazgos confirman que AMPKK corresponde a otra quinasa o quinasas
relacionadas con CaMK. Por lo menos una AMPKK principal es la
quinasa supresora de tumores LKB1 (STK11), que está mutada en el
síndrome de Peutz-Jeghers.
Se purificó LKB1 etiquetada con FLAG (de tipo
natural, WT, de longitud completa, o un mutante catalíticamente
inactivo (D 194A); (ADNc de ratón en el vector pCDNA3, etiquetado
con flag) a partir de lisados de células COS7, mediante unión a gel
de afinidad por FLAG (Sigma). Se incubó con las perlas AMPK
expresada bacterianamente, y se midió la actividad de AMPK.
Se incubó AMPK expresada bacterianamente
(\alpha1\beta1\gamma1 (Neumann, 2003)) con MgATP y
FLAG-LKB1 quinasa unida a un gel de afinidad por
FLAG, durante 30 minutos a 30ºC. En otro aspecto, la invención se
refiere a un incubador de agitación.
Específicamente, las condiciones de tampón de
AMPK se ajustan hasta la concentración final de 100 uM de ATP, 5 mM
de MgCl_{2}, 50 mM de HEPES pH 7,5, 10% de glicerina, 1 mM de
EDTA, 1 mM de DTT, en el momento en el que se añade el gel con
FLAG-LKB1.
Tras la centrifugación para eliminar la resina,
se midió la actividad de AMPK en el sobrenadante, usando el ensayo
del péptido SAMS (Davies, 1989).
LKB1, expresada en células de mamífero,
fosforiló T172 y activó AMPK recombinante in vitro (Fig.
4D).
La fosforilación de T172 se determinó mediante
inmunotransferencia (Fig. 4E).
De este modo, se demostró que LKB1 fosforila y
activa AMPK.
Se usó una estrategia a base de la reacción en
cadena de la polimerasa para preparar un constructo de ADNc
etiquetado con el epítopo FLAG N-terminal que
codifica LKB1 de ratón, usando, como molde, una etiqueta de
secuencia expresada que codifica LKB1 de ratón de longitud completa
(número de acceso NCBI AA542163, número IMAGE 550355), obtenida del
consorcio IMAGE. El constructo se obtuvo usando el cebador 59:
atgcatactagtgccaccatggactactacaaggacgacgatgacaaggacgtggcggaccccgagccgttggg
y el cebador 39:
gacagaactagttcactgctgcttgcaggccgaga.
Para preparar el mutante catalíticamente
inactivo de LKB1, denominado LKB1 (KD), en el que KD quiere decir
quinasa muerta, se mutó Asp194, en el subdominio VII del dominio de
quinasa, a Ala.
Naturalmente, cualquier homólogo, tal como un
homólogo de mamífero de LKB1, podría ser usado en lugar del de
ratón, tal como LKB1 humana. Igualmente, la LKB1 se podría expresar
con o sin la etiqueta del epítopo de LKB1, o se podría expresar con
una etiqueta alternativa, tal como myc, HA,
glutationa-S-transferasa, u otra etiqueta.
El fragmento resultante de la reacción en cadena
de la polimerasa se subclonó como un fragmento de
EcoRI-EcoRI en el vector pCDNA3 (Invitrogen) para
codificar la expresión de FLAG-LKB1 en células de
mamífero.
Se subclonó LKB1 (que contiene una etiqueta del
epítopo myc) de ratón en el vector de expresión pYX212 de levadura
(R and D Systems), y se expresó en levadura.
La AMPK (\alpha1\beta1\gamma1) expresada
bacterianamente se purificó mediante cromatografía usando
Ni-NTA agarosa (Qiagen) como se describió
previamente (la purificación se realiza como se explica en Neumann
et al.,2003 Protein Expression and Purification, incorporado
en la presente memoria como referencia). La AMPK se incubó con 100
\muM de ATP, 5 mM de MgCl_{2}, 200 \muM de AMP y 1 mM de DTT
en 50 mM de Hepes, pH 7,4, en presencia o ausencia de quinasa aguas
arriba, durante 30 minutos a 30ºC. Después de una breve
centrifugación, se retiró el sobrenadante que contiene AMPK, y se
midió la actividad usando el ensayo del péptido SAMS (Davies et
al., 1989). La fosforilación de T172 se determinó mediante
transferencia Western, usando un anticuerpo que reconoce
específicamente fosfo-treonina 172 dentro de la
subunidad \alpha de AMPK (Cell Signaling Technologies).
Se analizó el marcador radiactivo de AMPK con
fosfato que contiene ^{32}P, incubando una forma catalíticamente
inactiva de AMPK (que contiene la mutación D157A en la subunidad
\alpha) en presencia de
\gamma-^{32}P-ATP, en presencia
o ausencia de quinasa aguas arriba. En este ejemplo, la quinasa
aguas arriba es LKB1.
El ADN plasmídico, que codifica LKB1 (de ratón)
de tipo natural etiquetada con FLAG, o LKB1 catalíticamente
inactiva (que contiene una mutación D194A) etiquetada con FLAG, se
transfectó en células COS7 usando reactivo de lipofectamina. Las
células se recogieron a las 48 h después de la transfección, y la
proteína LKB1 se inmunoprecipitó con el gel de afinidad para M2
FLAG EZview Red (Sigma) y se usó según fue necesario, tal como en
incubaciones con AMPK.
La AMPK en el sobrenadante se resolvió mediante
SDS-PAGE, seguido de autorradiografía.
Diversas modificaciones y variaciones de los
métodos y sistemas descritos de la presente invención serán
manifiestas para los expertos en la materia, sin apartarse de la
presente invención. Aunque la presente invención se ha descrito en
relación con formas de realización preferidas específicas, se debe
entender que la invención, tal como se reivindica, no deberá estar
excesivamente limitada a tales formas de realización específicas.
De hecho, diversas modificaciones de los modos descritos para llevar
a cabo la invención, que son obvios para los expertos en la
bioquímica, biología/genética molecular y biotecnología o campos
relacionados, pretenden estar dentro del alcance de las siguientes
reivindicaciones.
Claims (23)
1. Método in vitro para evaluar la
actividad de LKB1, que comprende
- (i)
- proporcionar una muestra que comprende LKB1,
- (ii)
- poner en contacto dicha muestra con una quinasa sustrato, en condiciones que permitan la fosforilación, en el que dicha quinasa sustrato es o deriva de AMPK, y
- (iii)
- monitorizar la incorporación de fosfato en dicha quinasa sustrato,
en el que la incorporación de fosfato en dicha
quinasa sustrato indica la actividad de LKB1.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la AMPK comprende AMPK heterotrimérica.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
la AMPK comprende AMPK de ratón o humana.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la incorporación de fosfato en
AMPK se monitoriza evaluando la actividad de AMPK.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
la actividad de AMPK se evalúa a través de la fosforilación del
péptido SAMS.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la incorporación de fosfato en
AMPK se monitoriza evaluando la fosforilación de
T-172 de AMPK, o su equivalente.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende además cuantificar la cantidad
de fosfato incorporada por molde AMPK, en el que dicho nivel de
fosfato indica el nivel de LKB1 presente en dicha muestra.
8. Uso in vitro de LKB1 recombinante o
aislada, como una AMPKK.
9. Uso in vitro según la reivindicación
8, en la fosforilación de AMPK.
10. Uso in vitro según la reivindicación
8 o la reivindicación 9, en la activación de AMPK.
11. Uso de LKB1 en la preparación de un
medicamento para la prevención o tratamiento del síndrome de
Peutz-Jeghers (PJS).
12. Uso in vitro de HSP90, Cdc37, o de la
proteína STRAD en la modulación de la actividad de AMPK.
13. Método in vitro para modular AMPK,
que comprende modular LKB1.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
dicho método comprende incrementar la fosforilación de AMPK en un
sistema, incrementando la actividad de LKB1 en dicho sistema.
15. Método según la reivindicación 13, en el que
dicho método comprende activar AMPK en un sistema, activando LKB1
en dicho sistema.
16. Método según la reivindicación 13, en el que
dicho método comprende fosforilar AMPK poniendo en contacto AMPK
con LKB1 recombinante o aislada.
17. Método según la reivindicación 13, en el que
dicho método comprende activar AMPK poniendo en contacto dicho AMPK
con LKB1 recombinante o aislada.
18. Método in vitro para la
identificación de un modulador o moduladores de LKB1, que
comprende
- (i)
- proporcionar una primera y una segunda muestra de LKB1,
- (ii)
- poner en contacto dicha primera muestra con un modulador candidato de LKB1,
- (iii)
- poner en contacto dichas primera y segunda muestras con una quinasa sustrato en condiciones que permitan la fosforilación, en el que dicha quinasa sustrato es o deriva de AMPK,
- (iv)
- monitorizar la incorporación de fosfato en dicho sustrato, y comparar la incorporación de fosfato en dicho sustrato en dichas primera y segunda muestras,
en el que la incorporación de fosfato en el
sustrato difiere entre dichas primera y segunda muestras, y el
modulador candidato se identifica como un modulador de la actividad
de LKB1.
19. Célula de levadura recombinante que
comprende perturbaciones génicas en por lo menos dos de Pak1, Tos3
y Elm1.
20. Célula de levadura recombinante según la
reivindicación 19, que comprende perturbaciones génicas en Pak1,
Tos3 y Elm1.
21. Célula de levadura recombinante según la
reivindicación 19 ó 20, que comprende además una perturbación
génica en Snf1.
22. Célula de levadura recombinante según
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, que expresa AMPK de
mamífero.
23. Célula de levadura recombinante según la
reivindicación 22, en la que la AMPK de mamífero comprende las
subunidades alfa, beta y gamma.
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