ES2331006T3 - Inhibicion de actividad de quinasa s6 para el tratamiento de resistencia a la insulina. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina, dicho método comprende las etapas de: i) incubar quinasa S6 con un compuesto; ii) detectar la actividad de quinasa S6; y iii) determinar una modulación inducida por compuesto en la actividad de quinasa S6 con relación a cuando dicho compuesto está ausente, en donde una inhibición de la actividad 1 quinasa S6 en la presencia del compuesto es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina.
Description
Inhibición de actividad de quinasa S6 para el
tratamiento de resistencia a la insulina.
La presente invención se relaciona con
resistencia a la insulina y diabetes, en particular con el
tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes con moduladores
de actividad de quinasa S6 (S6K).
La diabetes Tipo II es la forma más común de
diabetes en el mundo Occidental y está fuertemente ligada con la
obesidad - más del 80% de los enfermos son obesos. En pacientes con
diabetes Tipo II, la insulina es menos capaz de promover la
captación de glucosa en el músculo y la grasa, un estado denominado
resistencia a la insulina de. La base molecular por la cual la
obesidad lleva a acción de insulina deteriorada no se conoce
bien.
La insulina actúa normalmente para mantener
homeostasis de glucosa al regular su propia producción y secreción
mediante células beta pancreáticas, y al controlar la utilización de
glucosa en tejidos periféricos. Estudios recientes han implicado la
ruta de transducción de señal de mTOR/quinasa S6 en este proceso. La
quinasa S6 es una quinasa que fosforila la proteína ribosómica, S6.
En particular, los ratones con deficiencia de S6K1 (también
conocida como quinasa S6 p70/p85) son ligeramente intolerantes a la
glucosa (hiperglicémicos) e hipoinsulinémicos, no debido a una
lesión en la sensibilidad a la glucosa o producción de insulina,
sino a una reducción en la masa endocrina pancreática, que se
cuenta mediante una disminución selectiva en la célula beta. Los
ratones con deficiencia de S6K1 mantienen niveles de glucosa en
ayuno normal, lo que sugiere que ellos pueden ser hipersensibles a
la insulina en sus tejidos periféricos (Pende et al., 2000,
Nature, 408, 994-997).
Este fenotipo evoca una forma de diabetes
mellitus tipo 2 preclínica, en donde la hipoinsulinemia inducida
por malnutrición de proteína predispone los individuos a
intolerancia a la glucosa. Un periodo limitado de malnutrición de
proteína en ratas también conduce a intolerancia leve a la glucosa
que surge de una disminución persistente en el tamaño de células
\beta y secreción de insulina, un efecto parcialmente atenuado por
hipersensibilidad leve a la insulina en tejidos periféricos (Swenne
et al., 1992, Diabetologia 35, 939-945;
Swenne et al., J. Endocrinol. 118, 295-302;
Grace et al., 1990, Diabetes Metab. 16,
484-491 (1990).
Los ratones con deficiencia de S6K1 son viables
y fértiles pero exhiben una reducción visible en el tamaño corporal
durante la embriogenia, un efecto superado principalmente por la
adultez. Una comparación de ratones mutantes homocigotos de 3.5
semanas de edad demuestran que los pesos de todos los órganos son
proporcionales a la reducción en el peso corporal. El tamaño
pequeño de los ratones mutantes homocigotos es consistente con un
defecto en la capacidad de traducción (Shima et al., 1998,
EMBO J., 17, 6649-6659). Cuando los ratones con
deficiencia de S6K1 alcanzan la madurez, la diferencia en peso que
ellos presentan al nacer, comparada con los ratones genéticamente
intactos, disminuye de 20% a 15%. Tales ratones pueden acumular
grasa y llegar a ser resistentes a la insulina como una función de
la edad y un incremento en la grasa de la dieta, al igual que los
ratones genéticamente intactos.
El papel de la actividad de quinasa S6 en la
resistencia a la insulina se ha abordado en estudios humanos. Se
tratan Indios Pima no diabéticos sensibles a insulina, y resistentes
a la insulina con insulina durante 2 horas. Aunque los niveles
basales de la actividad de quinasa S6 son similares para ambos
grupos, la quinasa S6 se activa solo tres veces en individuos
resistentes a la insulina comparado con cinco veces en individuos
sensibles a la insulina, lo que sugiere una actividad de quinasa S6
deteriorada en individuos resistentes a la insulina.
La actividad S6K ha estado previamente implicada
en el cáncer y la angiogenia. La WO93/19752 describe el uso de
rapamicina y sus derivados como inhibidores de quinasa S6 p70 y su
uso para inhibir la proliferación o la respuesta inmune de una
célula. La US 2003/0083284 describe compuestos anticodificantes para
la inhibición de la expresión de quinasa S6 p70 (denominada como
las isoformas 85kDa, y 70kDa y nuclear). Se proponen los ácidos
nucleicos anticodificantes por ser potencialmente útiles en el
tratamiento de infecciones, inflamación y formación de tumor, así
como también trastornos metabólicos. La US2003/0143656 propone que
los compuestos capaces de incrementar la actividad de S6K p70 puede
ser útiles en el tratamiento de diabetes u obesidad, o pueden ser
útiles en la inhibición de la apoptosis.
Attoub et al. (2001, Faseb J., 14,
2329-2338) muestra que la rapamicina bloquea la
función de leptina, en particular la invasión inducida por leptina
de células en geles de colágeno (como un modelo de carcinogenia).
Se ha utilizado la terapia de leptina para promover la pérdida de
peso aunque preservando la masa magra en pacientes obesos con
deficiencia de leptina congénita, sugiriendo la leptina en el
tratamiento de obesidad o diabetes.
Subsiste una necesidad de proporcionar nuevos
objetivos y desarrollar nuevos medicamentos para el tratamiento de
resistencia a la insulina, en particular diabetes Tipo II (también
denominada como diabetes mellitus no dependiente de insulina,
NIDDM) y esta invención satisface esta necesidad.
De acuerdo con un primer aspecto de la
invención, se proporciona un método para identificar un agente
efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina, el método
comprende las etapas de: i) incubar quinasa S6 con un compuesto;
ii) detectar actividad de quinasa S6; y iii) determinar una
inhibición inducida por compuesto en la actividad de quinasa S6 con
relación a cuando el compuesto está ausente, en donde una inhibición
de la actividad de quinasa S6 en la presencia del compuesto es
indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a
la insulina. La inhibición inducida por compuesto es preferiblemente
independiente de un efecto de la actividad de Objetivo mamífero de
Rapamicina (mTOR). En una realización, la modulación es la
inhibición de la actividad de quinasa 1 S6. Se puede ensayar de
forma conveniente la actividad de quinasa S6 utilizando S6 como un
sustrato y es fácilmente susceptible para ensayos de alto
rendimiento.
También se proporciona por la invención métodos
de detección de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia
a la insulina, que comprenden poner en contacto los componentes
celulares activos transcripcionalmente con un ácido nucleico que
codifica un gen S6K ligado operablemente a una secuencia promotora o
una secuencia promotora S6K ligada operablemente a un gen indicador
en la presencia de por lo menos un compuesto; y detectar un efecto
del compuesto sobre la expresión o actividad promotora de quinasa S6
de quinasa S6, en donde la detección de una disminución en la
expresión o actividad promotora de quinasa S6 es indicadora de un
agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina.
Tales ensayos pueden ser ensayos basados en células, en donde los
componentes celulares activos transcripcionalmente y el ácido
nucleico están presentes en una célula. En realizaciones
preferidas, la quinasa S6 es quinasa 1 S6.
Así, también se proporcionan inhibidores
específicos de quinasa S6 para la fabricación de un medicamento para
el tratamiento o tratamiento profiláctico de resistencia a la
insulina de acuerdo con la reivindicación 8.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método para diagnosticar una predisposición a
resistencia a la insulina o diabetes, que comprende: en una muestra
de un mamífero, detectar el nivel de actividad de quinasa S6, y
correlacionar un cambio en la actividad de quinasa S6 en la muestra
cuando se compara con un valor de control normal o rango de valores
con una predisposición a resistencia a la insulina o diabetes, en
donde un incremento en la actividad de quinasa 1 S6 cuando se
compara con un valor de control normal o rango de valores es
indicadora de una predisposición a resistencia a la insulina o
diabetes.
Subsiste una necesidad de más terapias efectivas
para tratar resistencia a la insulina y diabetes Tipo II en
individuos, particularmente en individuos obesos. Los presentes
inventores han descubierto que en contraste con estudios publicados
previamente, la activación de S6K1 resulta en resistencia a la
insulina que proporciona por lo tanto el S6K1 como un objetivo
farmacéutico para tratar diabetes y enfermedades relacionadas a
través de la inhibición de la actividad S6K1. Aunque se puede
objetivar el mTOR (objetivo mamífero de rapamicina, que fosforila y
activa la quinasa S6) para modular la actividad S6K1, la
objetivación directa de S6K1 evita más efectos colaterales
generales de la inhibición de actividad mTOR y proporciona más
especificidad para el tratamiento de pacientes con resistencia a la
insulina. En particular, el mTOR se conoce por activar el S6K1 y
S6K2, aunque los presentes inventores han encontrado que es deseable
la inhibición selectiva de S6K1.
De acuerdo con lo anterior, la presente
invención proporciona un método para identificar un agente efectivo
en el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes (en
particular dieta alta en grasa u afecciones inducidas por
obesidad), basado en la modulación de actividad de quinasa S6, en
particular la actividad de quinasa 1 S6. Típicamente tal un método
comprenderá las etapas de incubar quinasa S6 con un compuesto;
detectar la actividad de quinasa S6; y determinar la modulación
inducida por compuesto en la actividad de quinasa S6 con relación a
cuando el compuesto está ausente. Una inhibición de la actividad de
quinasa S6 en la presencia del compuesto es indicadora de un agente
efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes.
Un ensayo de control en la ausencia del compuesto se puede correr en
paralelo.
A menos que no sea claro en el contexto,
"S6K" o "quinasa S6" se utiliza aquí para abarcar el S6K1
y S6K2 (ver, por ejemplo, Genebank Acceso No. M57428, AJ007938,
AB019245, NM003952 y secuencias relacionadas), aunque se prefiere
el S6K1. Los equivalentes funcionales de ejemplo (variantes) o
derivados de S6K incluyen moléculas en donde S6K se modifica
covalentemente mediante sustitución, química, enzimática, u otros
medios apropiados con un grupo funcional diferente del aminoácido
de ocurrencia natural.
Generalmente hablando, tales variantes serán
sustancialmente homólogas al "tipo natural" u otra secuencia
especificada aquí es decir compartirá similitud o identidad de
secuencia con ella. La similitud o identidad puede estar en el
nivel de secuencia de nucleótido y/o secuencia de aminoácido
codificada, y preferiblemente, será de por lo menos aproximadamente
50%, 60%, o 70%, o 80%, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Se pueden hacer las
comparaciones de secuencia utilizando FASTA y FASTP (ver Pearson
& Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183:
63-98). Preferiblemente se establecen los
parámetros, utilizando la matriz por defecto, como sigue: Gapopen
(penalidad para el primer residuo en un espacio): -12 para
proteínas/-16 para ADN; Gapext (penalidad para residuos adicionales
en un espacio): -2 para proteínas/-4 para ADN; longitud de palabra
KTUP: 2 para proteínas/6 para ADN. Se puede llevar a cabo análisis
para similitud utilizando hibridación. Una fórmula común para
calcular las condiciones de restricción requeridas para alcanzar la
hibridación entre las moléculas de ácido nucleico de una homología
de secuencia específica es: Tm = 81.5oC + 16.6Log [Na+] + 0.41 (%
G+C) - 0.63 (% de formamida) - 600/#bp en dúplex (Molecular Cloning:
a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989,
Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Las variantes que retienen rasgos estructurales
comunes pueden ser fragmentos de S6K, en particular los fragmentos
que mantienen actividad catalítica o rasgos específicos de isoforma.
Por ejemplo, las secuencias de terminal carboxi de S6K1 y S6K2
exhiben solo aproximadamente 20% de identidad y por lo tanto pueden
ser útiles para incluir tales rasgos específicos a isoformas en los
fragmentos cuando se desean ensayos específicos de isoforma. En
forma similar, el S6K1 se puede fosforilar en T447, que está ausente
en S6K2 proporcionando un rasgo específico de isoforma alternativo
o adicional. Preferiblemente, los fragmentos estarán entre 50 y 350
aminoácidos en longitud.
Las variantes de S6K también comprenden mutantes
de las mismas, que pueden contener eliminaciones, adiciones o
sustituciones de aminoácido, sometidas al requerimiento para
mantener por lo menos un rasgo característico de S6K,
preferiblemente la actividad catalítica y/o los rasgos específicos a
isoforma como se describió anteriormente. Así, se pueden hacer
sustituciones de aminoácido conservadoras sin alterar
sustancialmente la naturaleza del S6K, como pueden ser las
truncaciones. Las adiciones y sustituciones pueden más aún ser
hechas de los fragmentos de S6K utilizados en los métodos de
detección de la invención, en particular aquellos que mejoran la
actividad catalítica S6K o proporcionan algunas otras propiedades
deseables. Por ejemplo, los T389, T229 y S371 en ratones S6K1
(también conocidos como p70S6K) son homólogos a T389, T238 y S380 en
Drosophila p70S6K. El T389 se indica particularmente para la
mutación a un residuo de aminoácido acídico con el fin de producir
una quinasa constitutivamente activa. También pueden ser deseables
las proteínas de fusión con los fragmentos S6K o S6K referidos
anteriormente.
Los ensayos de detección de la invención no se
limitan a cualquier método particular para determinar la actividad
de quinasa S6. Los ensayos de quinasa S6 se conocen bien en la
técnica (ver por ejemplo USPN 6,372,467, que se incorpora aquí como
referencia en su totalidad). En resumen, la quinasa S6 se incubará
con un sustrato adecuado, tal como S6, en un amortiguador que
permite la fosforilación del S6. La fosforilación del sustrato se
puede detectar utilizando un grupo fosfato etiquetado, tal como el
uso de la etiqueta radioactiva 32P presente como la fuente ATP en
el amortiguador. Alternativamente, se pueden utilizar los
anticuerpos específicos para los productos fosforilados de
actividad catalítica S6K para detectar actividad. Como será evidente
para aquellos medianamente versados en la técnica, los ensayos son
fácilmente susceptibles a tecnologías de alto rendimiento
utilizando procesos robóticos y automatizados.
Alternativamente, se puede ensayar la actividad
de quinasa S6 utilizando un sustrato sintético, tal como aquellos
que comprenden
Arg-(Arg)-Arg-X-X-Ser-X
(por ejemplo, KRRRLASLAA o KRRRLSSLRASTSKSESSQK) (Flowtow and Thomas
(1992) J. Biol. Chem. 267: 3074-3078.
También se puede ensayar la actividad S6K al
detectar objetivos con dirección 3' de la quinasa. Por ejemplo, la
S6K se conoce por afectar la trascripción y traducción de objetivos
específicos, tal como genes con tractos de polipirimidina (5'TOPs)
y genes ribosómicos. (Fumagalli S, Thomas G. (1999) Ribosmal Protein
S6 Fosforylation and Signal Transduction. En: Translational
Control. Eds. Hershey, J, Mathews, M, Sonenberg, N. Cold Spring
Harbor Press. pp 695-717).
Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la
invención, se proporciona un método para detectar un agente
efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina, al
identificar compuestos que disminuyen la expresión de un gen S6K o
un gen expresado bajo el control de secuencias reguladoras S6K.
Tales métodos comprenden poner en contacto
componentes celulares activos transcripcionalmente, preferiblemente
en una célula, con un ácido nucleico que codifica un gen S6K ligado
operablemente a una secuencia promotora o una secuencia promotora
S6K (u otras regiones reguladoras S6K que permiten la expresión del
gen indicador) ligada operablemente a un gen indicador en la
presencia de por lo menos un compuesto; y detectar un efecto del
compuesto sobre la expresión de la región de codificación, sea la
expresión de quinasa S6 o expresión de gen indicador. Se puede
detectar la expresión de quinasa S6 en el nivel transcrito (por
ejemplo, mediante hibridación utilizando sondas específicas o PCR)
o en el nivel de proteína (por ejemplo, utilizando un anticuerpo).
Una disminución en la expresión o actividad promotora de quinasa S6
es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de
resistencia a la insulina. Tales ensayos pueden ser ensayos basados
en células, en donde los componentes celulares activos
transcripcionalmente y el ácido nucleico están presentes en una
célula, aunque los ensayos de trascripción in vitro son
también conocidos en la técnica. En realizaciones preferidas, la
quinasa S6 es quinasa 1 S6.
El gen indicador codifica cualquier molécula
capaz de proporcionar un cambio detectable. Tales moléculas
indicadoras incluyen grupos funcionales fluorescentes (por ejemplo,
proteínas fluorescentes, tales como, proteína fluorescente cian,
CFP; proteína fluorescente amarilla, YFP; proteína fluorescente
azul, BFP; o proteína fluorescente verde, GFP; todas comercialmente
disponibles, Clontech Living Colors User Manual), antígenos, enzimas
indicadoras y similares. Las enzimas indicadoras incluyen, pero no
se limitan a, las siguientes: beta-galactosidasa,
glucosidasas, cloramfenicol acetiltransferasa (CAT),
glucoronidasas, luciferasa, peroxidasas, fosfatasas,
oxidoreductasas, deshidrogenasas, transferasas, isomerasas,
quinasas, reductasas, desaminasas, catalasas y ureasa. En la
selección de una molécula indicadora a ser utilizada en el método
actualmente reivindicado, la molécula indicadora en si misma no
puede estar inactiva por ningún agente putativo u otro componente
presente en el ensayo de detección, que incluye la inactivación
mediante cualquier actividad de proteasa presente en la mezcla de
ensayo. La selección de una molécula indicadora apropiada será
fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica.
Se proporcionará típicamente el ácido nucleico
en un vector que permite la replicación en una o más células
anfitrionas seleccionadas, según se conoce bien para una variedad de
bacterias, levadura, y células de mamífero. Por ejemplo, varios
orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles
para clonare los vectores en células de mamífero. El vector puede,
por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula
vírica, fago, o cualquier otro vector o construcción adecuada que se
pueda tomar por una célula y utilizar para expresar la secuencia de
interés o gen indicador.
Los vectores de expresión contienen usualmente
un promotor ligado operablemente a la secuencia de ácido nucleico
que codifica la proteína de interés, con el fin de dirigir la
síntesis de mARN. Son bien conocidos los promotores reconocidos por
una variedad de células anfitrionas potenciales, como son los
promotores S6K1 y S6K2 (secuencias reguladoras con dirección 5').
"Ligado operablemente" significa unido como parte de la misma
molécula de ácido nucleico, posicionado adecuadamente y orientado
para la transcripción a ser iniciada a partir del promotor. El ADN
ligado operablemente a un promotor está "bajo control
transcripcional" del promotor. Se controla la transcripción de
los vectores en células anfitrionas de mamífero, por ejemplo,
mediante los promotores obtenidos de los genomas de virus tales
como virus de polioma, virus de viruela, adenovirus (tal como
Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar,
citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis-B
y Virus 40 de Simio (SV40), de promotores mamíferos heterólogos,
por ejemplo el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, y
de promotores de choque térmico, tales promotores proporcionados son
compatibles con los sistemas de célula anfitriona. Los vectores de
expresión de la invención también pueden contener uno o más genes de
selección, tal como genes que confieren resistencia a antibióticos
u otras toxinas.
Los métodos de la invención pueden por lo tanto
incluir adicionalmente la introducción del ácido nucleico en una
célula anfitriona. La introducción, que puede ser (particularmente
para introducción in vitro) generalmente referida sin
limitación como "transformación", puede emplear cualquier
técnica disponible. Para las células eucarióticas, las técnicas
adecuadas pueden incluir transfección de fosfato de calcio,
DEAE-Dextrano, electroporación, transfección
mediada por liposoma y transducción utilizando retrovirus u otro
virus, por ejemplo vaccinia, como se conoce bien en la técnica.
Ver, por ejemplo, Keown et al., Methods in Enzymology, 185:
527 537 (1990) and Mansour et al., Nature 336:
348-352 (1988).
Las células anfitrionas transfectadas o
transformadas con los vectores de expresión o clonación descritos
aquí se pueden cultivar en medio convencional de nutrientes. Las
condiciones de cultivo tales como el medio, temperatura, pH y
similares, se pueden seleccionar por el experto sin experimentación
indebida. En general, los principios, protocolos, y técnicas
prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares
se puede encontrar en "Mammalian Cell Biotechnology: a Practical
Approach", M. Butler, ed. JRL Press, (1991) and Sambrook et
al, supra.
También se pueden diseñar ensayos específicos
para S6K1 al detectar la unión de proteínas específicas, tales como
nerabin al dominio de terminal C de S6K1, como se conoce bien en la
técnica (Burnett PE, Blackshaw S, Lai MM, Qureshi IA, Burnett AF,
Sabatini DM, Snyder SH. Neurabin is a synaptic protein linking p70
S6 kinase and the neuronal cytoskeleton. Proc Natl Acad Sci U S A.
1998 Jul 7; 95 (14): 8351-6).
Así, en otra realización de la invención se
evalúa la inhibición de la interacción de S6K1 con un socio de
unión. Esto puede comprender (i) poner en contacto el S6K1 con un
socio de unión del mismo en la presencia y ausencia de una
sustancia de prueba; y (ii) determinar si la presencia de una
sustancia de prueba inhibe la interacción entre el S6K1 y su socio
de unión.
Los métodos para evaluar la interacción entre un
polipéptido y un socio de unión puede ser cualquiera de los métodos
conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen aquí.
Se puede utilizar cualquiera de estos métodos para evaluar si una
sustancia de prueba inhibe la interacción entre un polipéptido (en
este caso S6K1) y un socio de unión.
En una realización, los ensayos son aquellos
basados en S6K1 y su interacción con neurabin y comprenden la etapa
de determinar si la sustancia de prueba inhibe la interacción entre
S6K1 y neurabin. Esto se puede lograr al detectar la asociación
física entre S6K1 y su socio de unión a través de etiquetar una con
una etiqueta detectable y ponerla en contacto con la otra que se ha
inmovilizado en un soporte sólido. Las etiquetas detectables
adecuadas incluyen metionina 35S que se puede incorporar en el S6K1
producido recombinantemente y/o el socio de unión del mismo. El
S6K1 producido recombinantemente y/o socio de unión también se puede
expresar como una proteína de fusión que contiene un epítopo que se
puede etiquetar con un anticuerpo. Alternativamente, se puede
utilizar etiquetado doble como se conoce bien en la técnica, por
ejemplo, utilizando una etiqueta radioactiva y un
centellante.
centellante.
Generalmente, una proteína que se inmoviliza en
un soporte sólido se puede inmovilizar utilizando un anticuerpo
contra tal proteína unida a un soporte sólido por vía de otras
tecnologías que se conocen per se. Una interacción in
vitro preferida puede utilizar una proteína de fusión que
incluye una etiqueta, tal como
glutationa-S-transferasa (GST) o
His6. La etiqueta se puede inmovilizar mediante interacción de
afinidad, por ejemplo en glóbulos de glutationa agarosa o matrices
Ni, respectivamente.
En un formato de ensayo in vitro del tipo
descrito anteriormente se puede ensayar el compuesto inhibidor
putativo al determinar su capacidad para modular la cantidad de
S6K1 etiquetado o socio de unión que se une al socio de unión
inmovilizado, por ejemplo, como puede ser el caso de
GST-socio de unión o GST-S6K1. Esto
se puede determinar al fraccionar los glóbulos de
glutationa-agarosa mediante electrólisis de gel de
de poliacrilamida SDS. Alternativamente, los glóbulos se pueden
enjuagar para remover la proteína no unida y se puede determinar la
cantidad de proteína que se ha unido al contar la cantidad de
etiqueta presente en, por ejemplo, un contador de centelleo
adecuado.
Alternativamente un anticuerpo adherido a un
soporte sólido y dirigido contra uno de S6K1 o el socio de unión se
pueden utilizar en lugar de GST para adherir la molécula al soporte
sólido. Los anticuerpos contra S6K1 y sus socios de unión se pueden
obtener en una variedad de formas conocidas como tales en la
técnica. En un modo alternativo, uno de S6K1 y su socio de unión se
puede etiquetar como un grupo funcional donante fluorescente el
otro se etiqueta con un aceptor, que es capaz de reducir la emisión
del donante. Esto permite que se conduzca un ensayo de acuerdo con
la invención mediante transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia (FRET). En este modo, la señal de fluorescencia del
donante se alterará cuando interactúan el S6K1 y su socio de unión.
La presencia de un inhibidor candidato que modula la interacción
incrementará la cantidad de la señal de fluorescencia del
donante.
El FRET es una técnica conocida per se en
el arte y así las moléculas de donante y aceptoras precisas y los
medios mediante las cuales se ligan a S6K1 y su socio de unión se
pueden lograr con referencia a la bibliografía.
Los grupos funcionales donantes adecuados son
aquellos capaces de transferir energía fluorogénica a otra molécula
o parte fluorogénica de un compuesto e incluyen, pero no se limitan
a, coumarinas y tintes relacionados tales como fluoresceínas,
rodols y rodaminas, resorufinas, tintes de cianina, bimanos,
acridinas, isoindoles, tintes de dansilo, hidracinas aminoeftálicas
tales como derivados de luminol e isoluminol, aminoftalimidas,
aminonaftalimidas, aminobenzofuranos, aminoquinolinas,
dicianohidroquinoneas, y complejos de europio y terbio y compuestos
relacionados.
Los aceptores adecuados incluyen, pero no se
limitan a, coumarinas y fluoróforos relacionados, xantenos tales
como fluoresceínas, rodols y rodaminas, resorufinas, cianinas,
difluoroboradiazaindacenos, y ftalocianinas.
Un donante preferido es fluoresceína y los
aceptores preferidos incluyen rodamina y carbocianina. Los derivados
de isotiocianato de esta fluoresceína y rodamina, disponibles de
Aldrich Chemical Company Ltd, Gillingham, Dorset, UK, se pueden
utilizar para etiquetar el S6K1 etiqueta y su socio de unión. Para
adhesión de la carbocianina, ver por ejemplo Guo et al, J.
Biol. Chem., 270; 27562-8, 1995.
Los ensayos de la invención también se pueden
desarrollar in vivo. Se puede desarrollar tal un ensayo en
una célula anfitriona adecuada, por ejemplo una célula anfitriona
de insecto o de mamífero, levadura, bacterias. Son particularmente
adecuadas las células anfitrionas de mamífero y levadura. Para
desarrollar tal un ensayo in vivo, se pueden introducir las
construcciones capaces de expresar S6K1 y su socio de unión y una
construcción de gen indicador en las células. Esto se puede lograr
mediante cualquier técnica adecuada, por ejemplo precipitación con
fosfato de calcio o electroporación. Se pueden expresar las
construcciones transitoriamente o como episomas estables, o
integradas en el genoma de la célula anfitriona.
Los ensayos in vivo también pueden tomar
la forma de dos ensayos híbridos. Los dos ensayos híbridos pueden
estar de acuerdo con aquellos descritos por Fields and Song, 1989,
Nature 340; 245-246. En tal un ensayo el dominio de
unión de ADN (DBD) y el dominio de activación transcripcional (TAD)
del factor de transcripción GAL4 de levadura se fusiona con la
primera y segunda moléculas respectivamente cuya interacción está
por ser investigada. Un factor de transcripción GAL4 funcional se
restaura solo cuando interactúan dos moléculas de interés. Así, la
interacción de las moléculas se puede medir por el uso de un gen
indicador ligado operablemente a un sitio de unión de ADN GAL 4,
que es capaz de activar la transcripción de dicho gen indicador. Se
pueden utilizar otros dominios de activador transcripcional en
lugar del GAL4 TAD, por ejemplo el dominio de activación VP16
vírico.
Independiente de la forma de ensayo utilizada,
ellos típicamente correrán con controles adecuados de rutina para
aquellos expertos en la técnica y se utilizan preferiblemente para
detectar compuestos que pueden estar presentes en colecciones de
molécula pequeña, colecciones de péptidos, colecciones de exhibición
de fago o colecciones de productos naturales. Los inhibidores
actuales o putativos u otros moduladores se pueden proporcionar de
cualquier fuente que se desea detectar, y pueden o no pueden ser de
ocurrencia natural o sintéticos, y pueden o no pueden ser péptidos
o polipéptidos (por ejemplo anticuerpos) o ácidos nucleicos (por
ejemplo siARN). Los inhibidores preferidos más adecuados para
aplicaciones terapéuticas serán las moléculas pequeñas por ejemplo
de una colección combinatoria tal como se conocen bien ahora en la
técnica (ver por ejemplo Newton (1997) Expert Opinion Therapeutic
Patents, 7(10): 1183-1194). Las sustancias de
candidato preferidas pueden incluir moléculas pequeñas tales como
inhibidores PKC.
Una modulación inducida por compuesto de la
actividad S6K significa que existe un cambio en la actividad S6K
(actividad enzimática, actividad de señalización para objetivos en
dirección 3', actividad promotora o expresión) en la presencia del
compuesto con relación a cuando el compuesto está ausente. En
particular una inhibición inducida por compuesto de la actividad
S6K se refleja mediante una disminución en la actividad S6K con
relación a cuando el compuesto está ausente. Por el contrario, una
activación inducida por compuesto de la actividad S6 se refleja por
un incremento en la actividad S6K.
Los activadores e inhibidores se denominan aquí
colectivamente como moduladores y preferiblemente influencian la
actividad quinasa de S6K directamente. Se llevan a cabo ensayos
utilizando componentes reconstituidos que se pueden diseñar
fácilmente para lograr la inhibición directa del S6K (es decir,
inhibición específica de actividad catalítica S6K y sin inhibición
de la formación de quinasa activa, por ejemplo, a través de la
acción de mTOR). Típicamente, la actividad de quinasa 1 S6 será
inhibida selectivamente (es decir, preferencialmente durante la
actividad de quinasa 2 S6 y otras quinasas y enzimas.), en
particular cuando se desea la inhibición de la señalización de
quinasa 1 S6 y tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes.
Alternativamente, la actividad de quinasa 2 S6 se activará
específicamente para el mismo propósito.
Los inhibidores S6K son compuestos que reducen
la actividad S6K, por ejemplo, actividad S6K1 o S6K2. Por ejemplo,
los compuestos que inhiben la actividad enzimática S6K típicamente
unen a un sitio de unió ATP en S6K o unen a un dominio catalítico
de S6K. El compuesto inhibe preferencialmente S6K1 en comparación
con S6K2 u otras isoformas S6K, dada la diferencia en los fenotipos
observados entre los ratones trasgénicos S6K1 y S6K2. Así, aunque
pueden ser útiles los compuestos que inhiben S6K2 o S6K1 y S6K2 (tal
como rapamicina, sus derivados u otros inhibidores mTOR), la
inhibición selectiva de S6K1 es deseable para el tratamiento de
resistencia a la insulina o diabetes. Por lo tanto, los inhibidores
S6K1 típicamente reducirán la actividad S6K1 por lo menos 10%, más
preferiblemente 20%, 50%, 100% y 200% en comparación con el nivel de
reducción de actividad S6K2. Los ensayos de control pueden por lo
tanto ser llevados a cabo, por ejemplo con S6K2 inmunoprecipitado y
en comparación con S6K1 inmunoprecipitado para establecer la
selectividad de un modulador.
Los métodos de detección de la invención pueden
comprender opcionalmente un ensayo funcional, que comprende
detectar un efecto en la resistencia a la insulina. Los métodos
adecuados se establecen en los Ejemplos adelante.
Los métodos de detección pueden incluir
opcionalmente la etapa de administrar un modulador potencial a un
animal no humano que tiene un gen de quinasa S6 y determinar si la
resistencia a la insulina se afecta con relación a cuando el
compuesto está ausente, por ejemplo, un efecto en la sensibilidad a
la insulina de la alimentación alta en grasa del animal. Los
animales no humanos serán típicamente mamíferos de laboratorio
tales como ratones o ratas y se pueden administrar varias dosis
oralmente mezcladas con el alimento o mediante cualesquier otros
medios adecuados, que se pueden escoger dependiendo de las
propiedades del compuesto, tales como estabilidad y suministro
objetivo. El gen de quinasa S6 puede ser de una especie diferente
según el mamífero de laboratorio, por ejemplo, el uso de un ratón
que comprende un gen S6K humano, que reemplaza el gen S6K de ratón,
será particularmente útil para determinar los efectos de los agentes
en S6K humano sin utilizar sujetos humanos.
La potencia y la eficacia de los compuestos para
inhibición de S6K1 también se puede evaluar utilizando un modelo de
animal para resistencia a la insulina y se compara con animales
transgénicos S6K1.
Los equipos útiles para detectar tales
compuestos también se pueden preparar de acuerdo con la invención,
y comprenderán esencialmente S6K o un fragmento del mismo útil para
detección, y las instrucciones. Típicamente el polipéptido S6K será
proporcionado junto con medios para detectar la actividad S6K y por
lo menos un compuesto (agente putativo) u otra sustancia descrita
aquí útil para llevar a cabo los métodos de detección.
El S6K para uso en los equipos de acuerdo con la
invención se puede proporcionar en la forma de una proteína, por
ejemplo en solución, suspensión o liofilizada, o en la forma de una
secuencia de ácido nucleico que permite la producción de S6K o un
fragmento del mismo en un sistema de expresión, opcionalmente in
situ.
Los compuestos (por ejemplo, agentes putativos)
pueden ser inorgánicos u orgánicos, por ejemplo, un antibiótico,
anticuerpo, polipéptido o péptido, y se aíslan o purifican
típicamente. Una composición "aislada" o "purificada" es
sustancialmente libre de material celular u otras proteínas
contaminantes de la fuente de tejido o célula de la que se deriva,
o sustancialmente libres de precursores químicos u otros químicos
cuando se sintetizan químicamente. Un polipéptido que es
sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones del
polipéptido en el que el polipéptido se separa de los componentes
de las células de las que éste se aísla, por ejemplo, el
polipéptido se produce recombinantemente. Preferiblemente, una
preparación de un compuesto terapéutico, por ejemplo, un inhibidor
S6K, es por lo menos 75%, más preferiblemente 80%, más
preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente
95%, más preferiblemente 98%, y más preferiblemente 99 o 100% del
peso seco de la preparación. Las mezclas de los compuestos también
se pueden probar durante etapas de detección iniciales.
Los compuestos pueden por lo tanto incluir
anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales, que son
específicos para S6K, en particular S6K1, en el sentido de ser
capaces de distinguir entre el polipéptido que es capaz de unirse y
otros polipéptidos de la misma especie para los que no tienen o
sustancialmente no tienen afinidad de unión (por ejemplo una
afinidad de unión de por lo menos aproximadamente 1000x peor). Los
anticuerpos específicos se unen a un epítopo en la molécula que no
está presente o no es accesible en otras moléculas. Por ejemplo,
para la inhibición específica de isoforma (inhibición selectiva de
actividad S6K1 sobre actividad S6K2), el anticuerpo puede
interferir con el dominio de terminal C de S6K, que no se conserva
altamente entre S6K1 y S6K2. Se pueden obtener los anticuerpos
utilizando técnicas que son estándar en el arte. Por ejemplo, se
pueden obtener los anticuerpos de animales inmunizados utilizando
cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en el arte, y
detectar, preferiblemente utilizando unión de anticuerpo al antígeno
de interés. Por ejemplo, se puede utilizar técnicas de
inmunotransferencia Western o inmunoprecipitación (Armitage et
al, Nature, 357:80-82, 1992).
Como una alternativa o complemento para
inmunizar un mamífero con un péptido, se puede obtener un anticuerpo
específico de una proteína de una colección producida
recombinantemente de dominios variables de inmunoglobulina
expresados, por ejemplo utilizando bacteriófago lambda o
bacteriófago filamentoso que exhiben dominios de unión de
inmunoglobulina funcionales en sus superficies; por ejemplo ver
WO92/01047.
Se pueden modificar los anticuerpos en un número
de formas e incluyen fragmentos de anticuerpo, derivados,
equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, que incluyen
moléculas sintéticas y moléculas cuya forma imita aquella de un
anticuerpo que le permite unirse a un antígeno o epítopo. Los
fragmentos de anticuerpo de ejemplo, capaces de unir un antígeno u
otro socio de unión son el fragmento Fab que consiste de los
dominios VL, VH, CI y CH1; el fragmento Fd que consiste de los
dominios VH y CH1; el fragmento Fv que consiste de los dominios VL
y VH de un único brazo de un anticuerpo; el fragmento dAb que
consiste de un dominio VH; regiones CDR aisladas y fragmentos
F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos
Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de pivote.
También se incluyen fragmentos Fv.
Los anticuerpos humanizados en los que los CDR
de una fuente no humana se injertan en regiones de estructura
humana, típicamente con la alteración de algunos de los residuos de
aminoácidos de la estructura, para proporcionar anticuerpos que son
menos inmunogénicos que los anticuerpos no humanos progenitores,
también se incluyen dentro de la presente invención.
Como es evidente para un experto en la técnica,
se puede someter un anticuerpo monoclonal a las técnicas de
tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o
moléculas quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo
original. Tales técnicas pueden involucrar introducir ADN que
codifica la región variable de inmunoglobulina, o las regiones de
determinación de complementariedad (CDR), de un anticuerpo a las
regiones constantes o regiones constantes más regiones de
estructura, de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo,
EP-A-184187,
GB-A-2188638 o
EP-A-0239400. La clonación y
expresión de los anticuerpos quiméricos se describe en la
EP-A-0120694 y
EP-A-0125023.
También se pueden utilizar péptidos como
inhibidores de la actividad S6K, tal como un péptido sintético que
contiene un dominio autoinhibidor putativo (residuos quinasa 1 S6
400-432; Flowtow and Thomas, 1992) o de hecho los
sustratos sintéticos referidos anteriormente (por ejemplo, S6
230-249, Ala 235), que se pueden utilizar
adicionalmente para modelar nuevos inhibidores.
Alternativamente, se puede reducir la actividad
S6K en una célula utilizando ácidos nucleicos, por ejemplo mediante
silenciamiento pre- o post-transcripcional. Así, las
secuencias S6K (en particular secuencias específicas para el S6K1)
se pueden insertar en los vectores como se describió anteriormente
en una orientación anticodificante con el fin de proporcionar la
producción de ARN anticodificante o ribozimas.
Las secuencias de ácido nucleico selectivas para
S6K1 sobre S6K2 incluyen aquellas que codifican los aminoácidos
33-77 y aminoácidos 454-525 (la
numeración se refiere a aquella de la SEQ ID NO:3 en la
US2003/0083284, que se incorpora aquí como referencia) o porciones
de la misma, que son típicamente de por lo menos 15, 18 o más
nucleótidos de longitud. Se pueden hacer comparaciones de secuencias
esencialmente como se describió anteriormente utilizando FASTA y
FASTP (ver Pearson & Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183:
63-98) para establecer la especificidad de las
secuencias.
Una alternativa al anticodificante es utilizar
ARN bicatenario (dsARN), que se ha encontrado por ser aún más
efectivo en el silenciamiento de gen que el anticodificante solo
(Fire A. et al Nature, Vol 391, (1998)). El silenciamiento
mediado por dsARN es específico a gen y es frecuentemente denominado
ARN de interferencia (ARNi) (Ver también Fire (1999) Trends Genet.
15: 358-363, Sharp (2001) Genes Dev. 15:
485-490, Hammond et al. (2001) Nature Rev.
Genes 2: 1110-1119 and Tuschl (2001) Chem. Biochem.
2: 239-245).
El ARN de interferencia es un proceso de dos
etapas. Primero, se divide el dsARN dentro de la célula para
producir los ARN de interferencia corta (siARN) de aproximadamente
21-23 nucleótidos de longitud con el fosfato
terminal 5' y 3' que sobresale poco (-2 de nucleótidos). Los siARN
objetivan la secuencia de ARN correspondiente específicamente para
destrucción (Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9,
746-750, (2001). Así en una realización, la
inhibición se logra utilizando ARN bicatenario que comprende una
secuencia que codifica S6K, en particular una secuencia selectiva
para S6K1, que puede por ejemplo ser un ARN bicatenario (que será
procesado a siARN, por ejemplo, como se describió anteriormente).
Los mecanismos de defensa celular, tal como la ruta PKR necesitarán
típicamente ser circunvenidos, por ejemplo utilizando siARN dirigido
contra los componentes individuales. Estos productos ARN se pueden
sintetizar in vitro, por ejemplo, mediante métodos de
síntesis química convencionales.
Sin embargo, para evitar la ruta PKR, se
utilizan preferiblemente los dúplex de siARN sintetizado
químicamente de aproximadamente 21-23 nucleótidos
de longitud con extremos que sobresalen 3 (Zamore PD et al
Cell, 101, 25-33, (2000)). Se han mostrado los
dúplex de siARN sintético para suprimir específicamente la expresión
de genes endógenos y heterólogos en un amplio rango de estirpes
celulares de mamíferos (Elbashir SM. et al. Nature, 411,
494-498, (2001)).
Así, los dúplex de siARN que contienen entre 20
y 25 bps, más preferiblemente entre 21 y 23 bps, de la secuencia
S6K, en particular las secuencias selectivas para S6K1 sobre S6K2,
incluyen formar de un aspecto de la invención por ejemplo cuando se
produce sintéticamente, opcionalmente en forma protegida para
prevenir degradación.
Alternativamente se puede producir siARN a
partir de un vector, in vitro (para recuperación y uso) o
in vivo. De acuerdo con lo anterior, el vector puede
comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica S6K (que
incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante o
fragmento de la misma), adecuada para introducir un siARN en la
célula en cualquiera de las formas conocidas en la técnica, por
ejemplo, como se describe en cualquiera de las referencias citadas
aquí, tales referencias se incorporan específicamente aquí como
referencia.
En una realización, el vector puede comprender
una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención en la
orientación codificante y anticodificante, tal que cuando se expresa
como ARN las secciones codificantes y anticodificantes se asociarán
para formar un ARN bicatenario. Este puede por ejemplo ser un ARN
bicatenario largo (por ejemplo, más de 23 nucleótidos), que se
puede procesar in vitro con Dicer para producir los siARN
(ver por ejemplo Myers (2003) Nature Biotechnology
21:324-328) o siARN, estructuras de horquillas.
Alternativamente, las secuencias codificantes y anticodificantes se
proporcionan en diferentes vectores. Estos vectores y productos de
ARN son útiles, por ejemplo, para inhibir la producción de
novo del polipéptido S6K en una célula. Se pueden introducir
tales ácidos nucleicos y vectores en una célula anfitriona a un
mamífero en una forma adecuada.
Así, se pueden administrar los ácidos nucleicos,
tal como siARN para inhibir la actividad S6K1. Se puede aplicar
rutinariamente la tecnología SiARN basada en secuencias específicas
para S6K1, tal como AGTGTTTGACA
TAGACCTG o preferiblemente AAGGGGGCTATGGAAAGGTTT. Se puede alcanzar la expresión objetivo de los siARN utilizando promotores específicos para tejidos, tal como promotores específicos para tejido adiposo, de músculo, de hígado u otros tejidos que median la resistencia a la insulina y homeostasis de glucosa.
TAGACCTG o preferiblemente AAGGGGGCTATGGAAAGGTTT. Se puede alcanzar la expresión objetivo de los siARN utilizando promotores específicos para tejidos, tal como promotores específicos para tejido adiposo, de músculo, de hígado u otros tejidos que median la resistencia a la insulina y homeostasis de glucosa.
Para la fácil administración, sin embargo, el
compuesto es preferiblemente una molécula pequeña, que se puede
unir al sitio catalítico o sitio de unión ATP. Para la inhibición
específica de isoforma, el compuesto puede interferir con el
dominio de terminal C de S6K, que no se conserva altamente entre
S6K1 y S6K2.
Con el fin de mejorar potencialmente los
moduladores S6K, se puede utilizar el S6K aislado para establecer
la estructura secundaria y terciaria de la proteína completa o por
lo menos de las áreas responsables de la actividad enzimática. Los
métodos convencionales para la identificación de la estructura
tridimensional son, por ejemplo, estudios de rayos X o estudios de
RMN. Los datos obtenidos con estos o con otros métodos comparables
se pueden utilizar directa o indirectamente para la identificación o
mejora de los moduladores de S6K, tal como para proporcionar
selectividad entre S6K1 y S6K2. Un método comúnmente utilizado a
este respecto es, por ejemplo, diseño de fármaco o modelamiento
molecular asistido por computador.
Se pueden identificar los compuestos de acuerdo
con la invención mediante detección utilizando las técnicas
descritas aquí anteriormente, y preparar mediante la extracción de
fuentes naturales o modificadas genéticamente de acuerdo con
procedimientos establecidos, o mediante síntesis, especialmente en
el caso de compuestos químicos de bajo peso molecular. Se pueden
preparar los compuestos proteináceos mediante expresión en sistemas
de expresión recombinante, por ejemplo un sistema de baculovirus, o
en un sistema bacteriano. Los compuestos proteináceos son
principalmente útiles para la investigación de la función de rutas
de señalización, aunque pueden tener una aplicación terapéutica,
tal como anticuerpos inhibidores humanizados dirigidos contra
quinasa 1 S6.
Por otra parte, los compuestos de bajo peso
molecular, se producen preferiblemente mediante síntesis química de
acuerdo con los procedimientos establecidos. Ellos se indican
principalmente como agentes terapéuticos. Los inhibidores PKC, o
derivados o modificaciones de los mismos, se pueden utilizar como
agentes potenciales efectivos para inhibir selectivamente el S6K1 y
en el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes. Los
compuestos de bajo peso molecular y compuestos orgánicos en general
pueden ser útiles como agentes para uso en el tratamiento de
resistencia a la insulina o diabetes.
La presente invención también proporciona un
método para reducir resistencia a la insulina que comprende poner
en contacto una célula, in vitro en particular miocitos,
adipocitos y/o hepatocitos con una cantidad efectiva de un
inhibidor de quinasa 1 S6 de acuerdo con la reivindicación 7. Así,
también se proporcionan por la invención compuestos que modulan
directamente la actividad de quinasa S6 para uso en el tratamiento
de resistencia a la insulina y diabetes. En particular, se
proporcionan compuestos que inhiben selectivamente la actividad de
quinasa 1 S6 sobre la actividad S6K2 (por ejemplo, un inhibidor de
mTOR, que no resultaría en la inhibición de S6K2, que
preferiblemente se evita) para uso en el tratamiento de individuos
que sufren de o en riesgo de desarrollar resistencia a la insulina
o
diabetes.
diabetes.
Diabetes como se utiliza aquí se refiere a
diabetes Tipo II que resulta, por ejemplo, de obesidad o afecciones
de sobrepeso que resultan de la acumulación de grasa, o de ácidos
grasos de alta circulación. Por lo tanto, la resistencia a la
insulina o diabetes que resulta de las dietas altas en grasa a
diferencia de las afecciones se pretende que resulten en reducción
de células beta pancreáticas.
Los moduladores S6K (por ejemplo, inhibidores)
para uso en el tratamiento de resistencia a la insulina o diabetes
se pueden formular como medicamentos de acuerdo con metodologías
convencionales, dependiendo de la naturaleza exacta del modulador y
comprenderán típicamente el modulador o un precursor del mismo en
asociación con un portador biológicamente aceptable. En
consideración a varias terapias, se entiende que tales terapias se
pueden objetivar a tejidos demostrados para expresar S6K1, en
particular a un tejido adiposo, de hígado y de músculo.
Se administran los compuestos en una dosis que
es terapéuticamente efectiva. El término "cantidad
terapéuticamente efectiva" como se utiliza aquí significa que la
cantidad de un compuesto o composición farmacéutica provoca una
respuesta biológica o médica benéfica en un tejido, sistema, animal
o humano. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un
compuesto inhibidor S6K1 es una dosis que lleva a mejora detectable
clínicamente en la resistencia a la insulina o diabetes.
El tratamiento incluye el manejo y cuidado de un
individuo con el propósito de aliviar un síntoma de la resistencia
a la insulina. El tratamiento incluye la administración de un
compuesto para prevenir el inicio de los síntomas o complicaciones
del trastorno, aliviar los síntomas o complicaciones, o eliminar la
afección o trastorno.
El suministro del modulador a las células y
tejidos afectados se puede alcanzar utilizando sistemas de empaque
o administración. Por ejemplo, se puede formular el modulador para
uso terapéutico con agentes aceptables para la administración
farmacéutica y suministro al sujeto mediante rutas aceptables para
la administración farmacéutica para producir un efecto fisiológico
deseable. Una cantidad efectiva es aquella cantidad que produce el
efecto fisiológico deseado, tal como, resistencia a la insulina
reducida y diabetes Tipo II.
En un aspecto adicional de la invención, la
invención también proporciona un modulador (por ejemplo, inhibidor
selectivo de quinasa 1 S6) para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento o tratamiento profiláctico de resistencia a la
insulina o diabetes de acuerdo con la reivindicación 8.
Las composiciones pueden incluir, en adición a
los constituyentes anteriores, excipientes farmacéuticamente
aceptables, agentes de conservación, solubilizadores, sustancias que
incrementan la viscosidad, agentes de estabilización, agentes de
humectación, agentes de emulsificación, agentes endulzantes, agentes
colorantes, agentes saborizantes, sales para variar la presión
osmótica, amortiguadores, o agentes de recubrimiento. Tales
materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la
eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador
u otro material puede depender de la ruta de administración.
Ejemplos de técnicas y protocolos se pueden encontrar en
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 16th edition, Osol, A.
(ed.), 1980.
Cuando la composición se formula en una
composición farmacéutica, la administración de la misma se puede
efectuar parentalmente tal como oralmente, nasalmente (por ejemplo
en la forma de aerosoles nasales) o rectalmente (por ejemplo en la
forma de supositorios). Sin embargo, también se puede efectuar la
administración parenteralmente tal como intramuscularmente,
intravenosamente, cutáneamente, subcutáneamente, o
intraperitonealmente (por ejemplo en la forma de soluciones de
inyección).
Así, por ejemplo, cuando la composición
farmacéutica está en la forma de un comprimido, este puede incluir
un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Para la
fabricación de comprimidos, comprimidos recubiertos, grajeas y
cápsulas de gelatina dura, los compuestos activos y sus sales de
adición de ácido farmacéuticamente aceptables se pueden procesar
con excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente inertes.
Se puede utilizar lactosa, maíz, almidón o derivados de los mismos,
talco, ácido esteárico o sus sales etc., por ejemplo, tal como
excipientes para comprimidos, grajeas y cápsulas de gelatina dura.
Los excipientes adecuados para cápsulas de gelatina blanda son, por
ejemplo, aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos y
líquidos etc. Cuando la composición está en la forma de una
formulación farmacéutica líquida, generalmente incluirá un portador
líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales,
aceite mineral o aceite sintético. También se puede incluir
solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o
glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o
polietilenglicol. Otros excipientes adecuados para la fabricación de
soluciones y jarabes son, por ejemplo, agua, polioles, sacarosa,
azúcar invertido, glucosa, trehalosa, etc. Excipientes adecuados
para soluciones para inyección son, por ejemplo, agua, alcoholes,
polioles, glicerol, aceites vegetales, etc. Para inyección
intravenosa, cutánea o subcutánea, o infusión intracatéter en el
cerebro, el ingrediente activo estará en la forma de una solución
acuosa parenteralmente aceptable que es libre de pirógenos y tiene
pH, isotonicidad y estabilidad adecuada. Aquellos expertos en la
técnica serán capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando,
por ejemplo, vehículos isotónicos como Inyección de Cloruro de
Sodio, Inyección de Ringer, Inyección Ringer de Lactada. Se pueden
incluir, según se requiera conservantes, estabilizadores,
amortiguadores y/o otros aditivos.
Los presentes inventores han mostrado que los
ratones genéticamente intactos alimentados con dieta alta en grasa
tienen actividad S6K1 sorprendentemente elevada (ver Ejemplo 9). La
invención por lo tanto también proporciona un método para
diagnosticar una predisposición a resistencia a la insulina o
diabetes, que comprende: en una muestra de mamífero detectar el
nivel de quinasa S6, preferiblemente quinasa 1 S6, en la muestra y
correlacionar un cambio en la cantidad de quinasa S6 en la muestra
cuando se compara con un valor de control normal o rango de valores
con una predisposición a resistencia a la insulina o diabetes de
acuerdo con la reivindicación 9. La presencia de quinasa S6 se
puede determinar fácilmente utilizando anticuerpos o utilizando
ensayos de actividad como se describió anteriormente. La expresión
S6K también se puede detectar en el nivel transcrito, por ejemplo,
utilizando técnicas PCR. Cuando se detectan los niveles de proteína,
los anticuerpos específicos para S6K2 se pueden utilizar como un
control cuando se desean mediciones específicas de S6K1. En general,
un incremento en la actividad de quinasa 1 S6 de por lo menos 10%,
preferiblemente por lo menos 20%, 30%, 40% o 50% cuando se compara
con un valor de control normal o rango de valores es indicadora de
una predisposición a resistencia a la insulina o diabetes. Más
preferiblemente, el incremento en la actividad es por lo menos 2
veces diferente de un valor de control. La muestra puede ser
cualquier muestra de tejido o fluido corporal, pero es
preferiblemente tejido adiposo, de músculo o de hígado.
Para determinar la actividad de la quinasa S6K 1
(independiente de las otras isoformas S6K tales como S6K2), se
obtiene una muestra de un sujeto de prueba. Se pueden lisar las
células presentes en la muestra y se extraen las proteínas.
Opcionalmente, se pueden llevar a cabo etapas de purificación
adicional. Luego se puede someter la muestra a inmunoprecipitación
utilizando un anticuerpo específico S6K1, que se conoce en la
técnica. Luego de la inmunoprecipitación de S6K1, se desarrolla un
ensayo de quinasa estándar como se describió anteriormente.
La invención se describe adicionalmente, solo
para el propósito de ilustración, en los siguientes ejemplos.
Métodos de genética molecular, bioquímica e
inmunología de péptidos y proteínas se refieren a pero no se
describen explícitamente en esta descripción y se reportan ejemplos
en la bibliografía científica y se conocen bien por aquellos
expertos en la técnica. Por ejemplo, se llevan a cabo métodos
estándar en ingeniería genética esencialmente como se describe en
Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY,
1989.
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Ejemplo
1
Se muestran previamente ratones con deficiencia
de S6K1 por tener una reducción en el tamaño corporal durante
embriogenia pero el efecto se considera que se supera principalmente
en la adultez, disminuyendo de 20 a 15% por 11 semanas de edad.
Este Ejemplo demuestra que cuando ellos envejecen, los ratones con
deficiencia de S6K1 mantienen un peso corporal más bajo en relación
con ratones genéticamente intactos. Los ratones macho en una dieta
de concentrado normal (NCD, 4% de calorías totales derivadas de
grasa, 3035 kcal kg-1, KLIBA-NAFAG,
Suiza) se siguen durante un periodo de diecisiete semanas de diez
semanas de edad.
Se generan ratones con deficiencia de S6K1 como
se describe por Shima et al. (1998, EMBO J., 17,
6649-6659). Los ratones se mantienen en un
antecedente híbrido derivado de las cepas de ratón C57BI/6 y 129Oia,
alojados en grupos de 12 (en jaulas de 3) y mantenidos en un ciclo
de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad (luces en 06:00 GMT). Se
registra el peso corporal semanalmente en los ratones genéticamente
intactos (p) y ratones con deficiencia de S6K1 alimentados con
dieta de concentrado regular. Inesperadamente, los resultados
muestran que la velocidad en que los ratones S6K1-/- ganan peso es
mucho más lenta que la de los tipo natural, de tal manera que la
diferencia en el peso a las veintisiete semanas, cuando se compara
con diez semanas, se ha aumentado al 25%. Se debe notar que los
ratones S6K1-/- exhiben poca variación en el peso cuando se comparan
con los ratones genéticamente intactos (p).
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Ejemplo
2
Se disectan ratones para determinar el origen
del bajo peso corporal exhibido por los ratones con deficiencia de
S6K1 descritos en el Ejemplo 1. Se muestran ratones con deficiencia
de S6K1 que tienen menos almohadillas adiposas intrabdominales.
Cada masa adiposa y masa de órgano se pesa del tejido removido de
ratones macho de 6 meses de edad. La disección de los ratones S6K1
revela una reducción severa de la grasa del tejido adiposo blanco
epididímico con relación a los ratones genéticamente intactos (0.8%
+/- 0.1% comparado con 3.4% +/- 0.1%; los valores son valores
promediados +/- error estándar de la media; E.E.M). El porcentaje de
peso corporal de tejido adiposo marrón también se reduce en ratones
con deficiencia de S6K1 (0.5% +/- 0.05% comparado con 1.0 +/-
0.1%), mientras que el tamaño del órgano no se afecta esencialmente.
Se encuentran resultados similares también en ratones hembra. La
reducción en la grasa no se asocia con una reducción selectiva en la
deposición de grasa en el hígado o los músculos.
Los resultados establecen que los ratones S6K1
-/- tienen grasa blanca y grasa marrón corporal reducida con
relación a los ratones genéticamente intactos.
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Ejemplo
3
Para establecer porqué los ratones con
deficiencia de S6K1 exhiben menos grasa, se tiñen secciones de
tejido adiposo con hematoxilina y eosina y se visualizan mediante
magnificación 20 veces utilizando un microscopio de histología. El
tejido adiposo blanco epididímico (WAT) y el tejido adiposo marrón
de los ratones con deficiencia de S6K1 exhiben tamaño celular más
pequeño cuando se compara con los del tipo intacto.
El análisis del tamaño de las células adiposas
en almohadillas adiposas epididímicas mediante microscopía de
electrón de exploración o mediante teñido de hematoxilineeosina
muestra una reducción sorprendente en el tamaño celular, con
cuantificación que revela que los adipocitos de los ratones S6K1-/-
es 71% más pequeña que aquellos de los ratones genéticamente
intactos (peso: 3129 \pm 904, n=3; S6K1-/-: 918 \pm 189 mm2,
n=3, P< 0.05), con muchos adipocitos que exhiben un fenotipo
multilocular. Estos estudios también revelan que la distribución
del tamaño celular, similar al peso corporal, es mucho más homogéneo
en los ratones S6K1-/- cuando se compara con los ratones
genéticamente intactos y un cálculo amplio de áreas de superficie
celular versus la masa total sugiere que existe poco efecto
en el número de células. En resumen, los resultados de la
microscopía de electrón, histología y análisis de tamaño/densidad
celular establece que la reducción en la grasa en animales
deficientes de S6K1 se debe a una reducción en el tamaño de células
adiposas.
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Ejemplo
4
Para establecer sí los ratones S6K1 exhiben
diferencias en la dieta sobre los ratones genéticamente intactos,
que pudieran explicar la reducción en la grasa en los ratones S6K1,
se mide la toma de alimento por ratón cada día durante 15 días
utilizando concentrado normal o alto en grasa. Independiente de si
se coloca en dieta normal o alta en grasa, los ratones con
deficiencia de S6K1 comen la misma cantidad total de alimento como
los de tipo genéticamente intacto (aproximadamente 4.6 +/- 0.1 g de
alimento/ratón/día), pero comparado con el peso corporal, ellos
comen mucho más (aproximadamente 17% o más, o 0.18 comparado con
0.15 g alimento/g de peso corporal/día).
Adicionalmente, a pesar de su delgadez evidente,
los ratones no parecen tener inanición cuando la homeostasis de
glucosa parece normal (Tabla I adelante), consistente con el hecho
de que no hay incremento en la formación de cetona en el cuerpo
(valores de
D-\beta-hidroxibutirato 1.3 mg/dl
\pm 0.05 para los ratones genéticamente intactos, n=8; 1.4 mg/dl
\pm 0.1 para los ratones S6K1-/-, n=7; P= 0.8).
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Ejemplo
5
La toma de alimento incrementada, combinada con
WAT reducido, eleva la posibilidad de actividad metabólica
mejorada. La velocidad metabólica de ratones deficientes de S6K1 y
los ratones genéticamente intactos se examina mediante calorimetría
indirecta para monitorear el consumo de oxígeno y producción de
dióxido de carbono cada 15 min durante un periodo de ayuno de ocho
horas empleando un Oxymax (Columbus Instruments, Columbus, OH).
Los resultados muestran un sorprendente
incremento del 27% en la velocidad del consumo de oxígeno en los
ratones S6K1-/- versus los ratones genéticamente intactos a
través del experimento. El cálculo de la proporción de intercambio
respiratorio (RER = proporción de CO2 producido a O2 consumido) da
los valores de 0.713 \pm 0.004 para los ratones genéticamente
intactos y 0.709 \pm 0.003 para los ratones S6K1-/-; P< 0.01),
argumentando que ambos animales utilizan mucho los ácidos grasos
como una fuente de energía.
Se llevan a cabo ensayos de metabolito como
sigue. Se recolecta sangre del seno retroorbital después de ayuno
durante la noche o 1 hr después del inicio de la comida seguido por
ayuno durante la noche. Se determinan los ácidos grasos no
esterificados, y triglicéridos mediante ensayos enzimáticos
(Boehringer-Mannheim, Alemania). Se mide la leptina
en el plasma utilizando el equipo RIA para Leptina de Rata (Linco
Research, St Louis, MO.). Los resultados se muestran en la Tabla I.
Se reducen significativamente los niveles de leptina en el plasma
en los ratones S6K1-/- (Tabla I) al mantener el consumo incrementado
de los ratones de alimento con relación al peso corporal.
Aunque no se desea estar limitado por la teoría,
dada la masa de tejido adiposo reducida, velocidad metabólica
incrementada, y el hecho que cuando se corrige para peso corporal,
los triglicéridos en el plasma y ácidos grasos libres son similares
entre genotipos (Tabla I), se razona que en la ausencia de S6K1, los
triglicéridos en el tejido adiposo se utilizan rápidamente o que
los ácidos grasos libres nunca alcanzan tejido adiposo para
almacenamiento, pero se toman inmediatamente por el músculo y se
oxidan.
Aunque el WAT no es normalmente un tejido que
consume energía, no existe diferencia entre los niveles basales de
ácidos grasos circulantes en los ratones S6K1-/-, cuando se compara
con los ratones genéticamente intactos (Tabla I), lo que sugiere
que los ácidos grasos libres se pueden oxidar directamente en WAT.
Consistente con esta hipótesis, las micrografías de electrón
revelan la presencia de muchos adipocitos multiloculares, que
exhiben un incremento dramático en el tamaño y número de
mitocondria, fenotipos completamente ausentes en adipocitos de los
ratones genéticamente intactos. Otros han mostrado que la
sobreexpresión de UCP1 en WAT induce un fenotipo similar, y los
niveles UCP1, medidos por PCR cuantitativo en tiempo real, se
sobreregulan dramáticamente en WAT de los ratones S6K1-/- cuando se
compara con WAT de los ratones genéticamente intactos.
Ejemplo
6
La degradación de los triglicéridos en el tejido
adiposo (lipólisis) se mide al monitorear la liberación de ácidos
grasos o glicerol de adipositos maduros. Se preparan adipocitos
primarios de las almohadillas adiposas epididímicas mediante
digestión de colagenasa como se describió previamente (Marette et
al., 1991). Se incuban células durante 30 min a 37ºC con o sin
norepinefrina (Sigma-Aldrich SARL,
St-Quentin Fallavier, Francia) en diferentes
concentraciones (10^{-8} a 10^{-5}M). La norepineferina es un
agonista beta-adrenérgico y estimula la
degradación de triglicérido de adipocito a glicerol y ácidos grasos
libres (lipólisis) e incrementa la velocidad metabólica basal
(termogenia). A pesar de la reducción en el tamaño celular de
adipocitos epididímicos (ver Ejemplo 3), los resultados muestran
que la velocidad basal de liberación de ácido graso es
aproximadamente 5 veces mayor en adipocitos de ratones S6K1-/-
cuando se compara con los ratones genéticamente intactos. La
velocidad de liberación de ácido graso incrementado en ambos
genotipos en una forma dependiente de dosis luego de la adición de
norepinefrina, alcanza valores máximos similares, con el incremento
en más etapas en los ratones genéticamente intactos. Se obtienen
resultados similares para la liberación de glicerol. Por lo tanto,
los ratones S6K1-/- se protegen contra la acumulación de grasa
debido parcialmente a una forma incrementada en la lipólisis
basal.
Ejemplo
7
Durante el aislamiento de adipocitos maduros
para los estudios de lipólisis, llega a ser evidente que existen
pocos preadipocitos presentes en el WAT epididímico de los ratones
S6K1-/-. Esto, junto con la incapacidad de los adipocitos para
almacenar triglicéridos, experimentos realizados para comparar la
capacidad de fibroblastos embriónicos de ratones (MEF) de embriones
S6K1-/- y de los tipo genéticamente intactos para diferenciar los
adipocitos utilizando una mezcla de diferenciación de adipocito.
Brevemente, se induce diferenciación de
adipocito esencialmente como se describió previamente (Hansen et
al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 2386-2393)
utilizando fibroblastos embriónicos de ratones genéticamente
intactos o ratones deficientes de S6K1 (MEF). El número de pasaje
de los MEF está dentro de un pasaje. Para diferenciación, se tratan
células postconfluentes de 2 días (día 0) con medio de crecimiento
que contiene dexametasona 1 M (Sigma), 0.5 mM de
metulisobutilxantina (Aldrich), 5 \mug/ml de insulina (Boehringer
Mannheim), y Ciglitazona (tiazolinodiona, agonista PPAR: BIOMOL,
GR-205, 0.5 \muM) durante 2 días. Del día 2, el
medio que contiene 5 \mug/ml de insulina y Ciglitazona y renovado
cada día. Reñido aceite O rojo: se filtra solución de teñido aceite
O rojo (0.5% de aceite O rojo en solución de alcohol
isorpropílico-agua destilada (60:40). Las células
se lavan con PBS y se tiñen durante 30 min y luego se lavan con agua
destilada dos veces. Las células deficientes de S6K1 muestran mucho
menos teñido. Por lo tanto, los MEF que carecen de S6K1 tienen un
potencial adipogénico reducido, cuando se evalúa por el teñido
lípido de aceite O Rojo reducido, consistente con niveles inferiores
de aP2 mARN. Tomados juntos los resultados sugieren que lo ratones
S6K1-/- tienen WAT reducido debido a la adipogenia deteriorada y
una incapacidad para almacenar grasa.
Ejemplo
8
La falla de los ratones S6K1-/- para acumular
grasa con la edad combinada con su incremento general en la
velocidad metabólica sugiere que ellos se pueden proteger contra
obesidad inducida por dieta. En este ejemplo, el peso corporal se
registra semanalmente en los ratones genéticamente intactos y
ratones deficientes de S6K1 alimentados con dieta alta en grasas
(HFD, 60% de calorías total derivadas de grasa, 4057 kcal
kg-1, Research diets, USA). Cuando los ratones S6K1
se colocan en una dieta alta en grasa, la ganancia de peso corporal
absoluto de ratones con deficiencia de S6K1 es aproximadamente 10.5
g durante el periodo de alimentación de dieta alta en grasa (de la
semana 7 a 27 de edad) comparado con aproximadamente 14.4 g en los
ratones genéticamente intactos. Similar a la situación en el NCD
(Ejemplo 1), los ratones S6K1-/- exhiben poca variación en el peso
en un HFD cuando se compara con los ratones genéticamente intactos.
Dado el tamaño corporal más pequeño de los transgénicos, la
ganancia de peso relativa es similar entre los genotipos (58.9% de
incremento del peso corporal en ratones con deficiencia de S6K1
comparado con 58.0% de incremento del peso corporal en los tipo
genéticamente intacto después de alimentación con dieta alta en
grasa durante 5 meses. Aunque el porcentaje relativo de la ganancia
de peso corporal en ratones con deficiencia de S6K1 es similar a los
del tipo genéticamente intacto, ellos fallan en acumular grasa al
mismo grado que los ratones genéticamente intactos. Durante un
periodo de tres meses, los ratones genéticamente intactos ganan 0.1
g/g comparado con 0.02 g/g grasa/peso corporal por ratones con
deficiencia de S6K1.
Los ratones de ambos genotipos consumen menos
alimento en un HFD que en un NCD, probablemente debido a la mayor
densidad calórica del HFD según se compara con el NCD. Aunque en
términos absolutos, los ratones S6K1-/- consumen la misma cantidad
de alimento como los ratones genéticamente intactos, cuando se
normaliza el peso corporal ellos consume 44% más alimento. Así,
aunque los ratones S6K1 comen más, ellos no acumulan grasa al mismo
grado que los ratones genéticamente intactos.
Se conduce mediciones de calorimetría indirecta
durante un periodo de ayuno de ocho horas en ratones HFD y NCD. En
ambos genotipos se incrementa el consumo de oxígeno en el HFD,
cuando se compara con el NCD, pero el efecto es más pronunciado
para los ratones S6K1-/-, de tal manera que la diferencia entre los
ratones S6K1-/- y los ratones genéticamente intactos se incrementa
de 25% a 30%. Los datos muestran adicionalmente que el RER
permanece sin cambio en los ratones S6K1-/- en un HFD versus
un NCD, 0.708 \pm 0.002 vs 0.709 \pm 0.004, respectivamente,
mientras que en los ratones genéticamente intactos el RER se
incrementa de 0.713 \pm 0.004 en NCD a 0.729 \pm 0.002 (n=6,
P< 0.01) en una dieta HFD, indicador de un incremento en
carbohidrato con relación a la oxidación del ácido graso. A pesar
del hecho que los ratones S6K1-/- en dieta exhiben una alta
velocidad metabólica, en un HFD ellos exhiben un incremento de tres
veces en los niveles de grasas libres circulantes, mientras que en
los ratones genéticamente intactos no existe cambio significativo en
los niveles de ácidos grasos libres (Tabla I). Por lo tanto, los
ratones S6K1-/- fallan en acumular grasa en una velocidad
apreciable cuando se exponen con un HFD.
Ejemplo
9
Para examinar si el S6K1 se afecta en el tejido
adiposo de modelos genéticos normales y obesos, se detecta la
fosforilación de S6K1. Esto se puede llevar a cabo fácilmente
utilizando anticuerpos fosfoespecíficos. Se determina el nivel de
la fosforilación de S6K1 T389 y S6 S240/S244 en el tejido adiposo de
los ratones genéticamente intactos en ayuno durante un periodo
corto. Luego de la estimulación del factor de crecimiento, el S6 se
fosforila múltiples veces en el terminal carboxi en cinco residuos
serina en una forma ordenada empezado con Ser236, seguido
secuencialmente por > Ser235 > Ser240 > Ser244 y Ser247.
Los valores basales de la fosforilación de S6K1 T389 y S6 S240/S244
son bajos en ratones en ayuno durante un corto periodo después de
ser mantenidos en un NCD. En contraste, los mismos ratones
mantenidos en un HFD y tratados bajo condiciones idénticas,
mantienen niveles muy elevados de fosforilación de S6K1 T389 y S6
S240/S244.
Los presentes inventores también examinan la
actividad S6K1 en ratones ob/ob, un modelo genético para la
obesidad. Los resultados muestran que los ratones ob/ob que
mantienen el NCD han elevado la fosrilación de S6K1 T389 y S6
S240/S244 cuando se compara con los ratones genéticamente intactos
en un NCD. Los datos humanos preliminares son consistentes con
estos datos y proporcionan soporte adicional para S6K1 como un
objetivo de fármaco promisorio en el tratamiento de pacientes que
sufren de obesidad y como un marcador diagnóstico potencial.
Ejemplo
10
Se ha sugerido previamente que los ratones con
deficiencia de S6K1 son hipersensibles a la insulina en sus tejidos
periféricos, debido a que ellos mantienen los niveles de glucosa en
ayuno normales, a pesar de su hipoinsulinemia innata y tolerancia
leve a la glucosa (Pende et al., 2000).
Se desarrollan pruebas de tolerancia a la
glucosa y secreción de insulina in vivo como se describió
previamente (Pende et al., 2000). Se desarrollan pruebas de
tolerancia a la insulina mediante inyección intraperitoneal de
insulina 0.75 U/kg de peso corporal después de 3 horas de ayuno. Se
recolecta sangre antes de inyección y 15, 30, 60 y 90 min después
de inyección.
En una Dieta de Concentrado Normal, más ratones
maduros con deficiencia en S6K1 exhiben una ligera tendencia hacia
la sensibilidad de insulina incrementada versus los ratones
genéticamente intactos, como se indica por la velocidad de
moderadamente, más rápida de la depuración de glucosa luego de la
prueba de tolerancia a la insulina. Sin embargo, el efecto es
pequeño. Esto aumenta la probabilidad de que el alimento para
ratones con deficiencia de S6K1 en una Dieta alta en grasa sería
similar a los ratones genéticamente intactos que llegan a ser
resistentes a la insulina si se alimentan con en dieta alta en
grasa.
Inesperadamente, los resultados de tal un
análisis muestran, que a pesar de una forma incrementada en los
ácidos grasos libres (Tabla 1), que se implica en la etiología de la
resistencia a la insulina, los ratones con deficiencia de S6K1
permanecen sensibles a la insulina, mientras que los ratones
genéticamente intactos exhiben fuerte resistencia a la insulina
como se espera en una dieta alta en grasa. Consistente con esto los
ratones genéticamente intactos llegan a ser intolerantes a la
glucosa en una dieta alta en grasa cuando se compara con un
conjunto de emparejamiento de ratones en una dieta de concentrado
normal. Sin embargo, los ratones con deficiencia de S6K1 en dieta
alta en grasa permanecen tolerantes a la glucosa, a pesar de una
reducción significativa adicional en los niveles de insulina
circulantes postprandiales (1 h) (Tabla 1).
Ejemplo
11
Este Ejemplo aborda cómo los ratones con
deficiencia de S6K1 permanecen hipersensibles a la insulina en sus
tejidos periféricos en una dieta alta en grasa.
Después de un ayuno de 6 horas, los ratones se
anestesian y 0.7 5Ukg-1 de insulina (Eli Lilly) o un
volumen igual del vehículo se administra mediante inyección i.v. Se
recolectan el hígado, tejido adiposo (almohadillas adiposas
epididímicas) y músculo (Gastrocnemio) en nitrógeno líquido 5
minutos después de inyección. Se mide la fosforilación de tirosina
del receptor de insulina en el hígado. Los extractos de proteína (1
mg) de las muestras del tejido se preparan para inmunoprecipitación
y se analizan como se describe (Hirosumi, 2002). Se compran
anticuerpos de Santa Cruz (receptor \beta
anti-insulina), Upstate Biotechnology
(anti-fosfotirosina) y señalización celular
(anti-PKB, anti-fosfo
PKB-Ser473,
anti-fosfoS6K-Thr 389,
anti-fosfo S6 240/244, y Upstate Biotechnology
(anti-fosfotirosina).
El examen de la actividad PKB en tejido adiposo
luego de inyección de insulina, como un indicador para la ruta de
señalización de insulina, revela que la activación de la quinasa se
suprime en los ratones genéticamente intactos mantenidos en una
dieta alta en grasa versus los ratones que surgen en dieta de
concentrado normal. Sin embargo, en contraste con los ratones
genéticamente intactos, no existe diferencia significativa en la
activación de PKB en ratones con deficiencia de S6K1, independiente
de la dieta. La ausencia de un efecto de dieta alta en grasa en la
activación PKB en ratones transgénicos S6K1 también es verdadera
para el hígado y el músculo.
El examen de la autofosforilación del receptor
de insulina muestra que esto también se suprime fuertemente por
dieta alta en grasa en el hígado de los ratones genéticamente
intactos, pero no en los ratones S6K1-/-, elevando la posibilidad
de que el receptor de insulina pueda ser el objetivo del bucle de
retroalimentación objetivo.
Dados estos hallazgos, surge la posibilidad de
que en una dieta alta en grasa, se eleve la actividad S6K1 y que
esta actividad mejorada es responsable de inducir la resistencia a
la insulina. Para probar esta posibilidad los presentes inventores
examinan el nivel de fosforilación S6K1 T389 y fosforilación S6 en
grasa y músculo, cinco minutos luego de una administración
intravenosa de insulina. Los resultados muestran que los valores
basales de la fosforilación S6K1 T389 son bajos en animales de dieta
de concentrado alto en grasa y dieta de concentrado normal, pero en
contraste a la fosforilación PKB Ser 473, la insulina estimula estos
niveles aún más, suprimiendo potencialmente la señalización de
insulina adicional.
Estos hallazgos elevan la posibilidad que un
mecanismo potencial por el que humanos obesos llegan a ser
resistentes a insulina es a través de la activación S6K1 que induce
el nutriente, suprimiendo la señalización de insulina a través de
un buque de retroalimentación negativo. Para probar esta posibilidad
los presentes inventores examinan la actividad S6K1 en pacientes,
que son clínicamente magros, obesos u obesos y diabéticos luego de
un periodo de ayuno de seis horas. Los resultados muestran que los
pacientes obesos y obesos/diabéticos han elevado los niveles S6K1
cuando se compara con pacientes magros, consistente con el bucle de
retroalimentación en el que el S6K1 es un efector negativo
principal en la señalización de insulina.
Los resultados tomados juntos sugieren
fuertemente que el S6K1 puede ser un objetivo potencial para la
intervención de fármaco en el tratamiento de pacientes que sufren
de diabetes inducida por obesidad o pacientes que sufren de
resistencia a la insulina en sus tejidos periféricos.
Claims (9)
1. Un método para identificar un agente efectivo
en el tratamiento de resistencia a la insulina, dicho método
comprende las etapas de:
- i)
- incubar quinasa S6 con un compuesto;
- ii)
- detectar la actividad de quinasa S6; y
- iii)
- determinar una modulación inducida por compuesto en la actividad de quinasa S6 con relación a cuando dicho compuesto está ausente,
en donde una inhibición de la actividad 1
quinasa S6 en la presencia del compuesto es indicadora de un agente
efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina.
2. El método de la reivindicación 1, que
comprende determinar la actividad de quinasa S6 utilizando S6 como
un sustrato,
3. El método de la reivindicación 1, que
comprende determinar la actividad de quinasa S6 utilizando un
péptido como un sustrato.
4. Un método para detección de un agente
efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina, el método
comprende
- (a)
- poner en contacto componentes celulares activos transcripcionalmente in vitro con un ácido nucleico que codifica un gen de quinasa 1 S6 ligado operablemente a una secuencia promotora o una secuencia promotora quinasa 1 S6 ligada operablemente a un gen indicador en la presencia de por lo menos un compuesto; y
- (b)
- detectar un efecto de dicho compuesto sobre la expresión de quinasa 1 S6 o actividad promotora de quinasa 1 S6, en donde la detección de una disminución en la expresión o actividad promotora de quinasa 1 S6 es indicadora de un agente efectivo en el tratamiento de resistencia a la insulina.
5. El método de la reivindicación 4, en donde
dichos componentes celulares activos transcripcionalmente y dicho
ácido nucleico están presentes en una célula.
6. El método de la reivindicación 4 o 5, que
comprende adicionalmente detectar un efecto de dicho agente sobre
la resistencia a la insulina.
7. Un método para reducir la resistencia a la
insulina, dicho método comprende poner en contacto in vitro
un adipocito, miocito o hepatocito con una cantidad efectiva de un
inhibidor de quinasa 1 S6, seleccionado del grupo que consiste de
anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para quinasa 1 S6, y
anticodificante, ribozima o siARN que reduce preferencialmente la
expresión de quinasa 1 S6 comparada con quinasa 2 S6.
8. Uso de una sustancia para la fabricación de
un medicamento para tratar o evitar el desarrollo de resistencia a
la insulina o diabetes, en donde dicha sustancia es un inhibidor de
quinasa S6 seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo o
fragmento de anticuerpo específico para quinasa 1 S6, y
anticodificante, ribozima o siARN que reduce preferencialmente la
expresión de quinasa 1 S6 comparado con la quinasa 2 S6.
9. Un método para diagnosticar la resistencia a
la insulina o una predisposición a resistencia a la insulina, que
comprende:
- (a)
- detectar el nivel de actividad de quinasa S6 en una muestra de un mamífero; y
- (b)
- correlacionar un cambio en la actividad de quinasa S6 cuando se compara con el valor de control normal o rango de valores con resistencia a la insulina o una predisposición a resistencia a la insulina, en donde un incremento en el nivel de actividad S6K1 comparada con un control normal indica que dicho mamífero que sufre de o tiene una predisposición a desarrollar resistencia a la insulina.
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