JP4476805B2 - 精製PKBSer473キナーゼおよびその用途 - Google Patents
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Description
可逆タンパク質リン酸化は、代謝、成長および分化を含む、真核生物での多くの基本的細胞機能の同調調節についての主要な機構である。特異的標的タンパク質のリン酸化状態、および結局活性は、タンパク質キナーゼとタンパク質ホスファターゼの対峙する作用によって調節される。一般に、いくつかの二重特異性キナーゼおよびホスファターゼも、記載されているが、これらの酵素は、セリン/トレオニンか、またはチロシンホスホアクセプターに特異的である。リン酸化カスケードの重要性は、それらが関与する多くのキナーゼ、ホスファターゼ、およびシグナル伝達経路が進化の過程において高度に保存されているという知見によって反映される。
ヒトPKB Ser473キナーゼは、細胞培養物から5,000倍を超える純度まで精製された。それぞれ、PKB Ser473キナーゼ活性を含む分画と同時精製する48kDaおよび58kDaの2つのホスホプロテインは、精製分画に存在し、単離された。
(1)PKB Ser473キナーゼ、たとえば、HEK293細胞の適切な源から細胞抽出物を作製し;
(2)細胞成分分画により原形質膜を単離し;および
(3)原形質膜分画を、トリトン(TRITON)X−100のような洗剤、好ましくは非イオン性洗剤を包含する緩衝液、および/またはたとえば、0.5M NaClを包含する高イオン強度の緩衝液で処理すること
を包含する。
図1は、5〜40%ショ糖浮遊勾配でのSer473キナーゼ活性(棒)の概略図である。
図2は、Superdex 200カラムでのゲル濾過にかけた0.5M NaClで抽出された原形質膜分画の模式図である。標準は、矢印によって示される。
タンパク質キナーゼBの全活性化(PKB/Akt)は、残基Thr308とSer473でのリン酸化を必要とする。現在まで、Ser473キナーゼの同定は、不明なままである。本発明者らは、PKBと3−ホスホイノシチド依存性キナーゼ−1(PDK−1)の細胞質ゲルの分布と異なった、浮揚性の洗剤不溶性原形質膜ラフト中で富化された、構造的に活性なPKB Ser473キナーゼ活性を単離、精製および特徴付けした。このSer473キナーゼ活性は、高塩によって膜から放出され、ゲル濾過分析は、原因であるキナーゼが、約500kDaの大型複合体中に存在することを示す。48kDaと58kDaの2つの主要なホスホプロテインを、部分的に精製されたPKB Ser473キナーゼ製剤で検出した。先の観察と対照的に、本発明者らは、インテグリン連結キナーゼ(ILK)免疫沈澱物が、Ser473キナーゼ活性を保持しないことを証明できた。したがって、本発明者らは、PKBシグナル伝達に役割を果し、ILKと異なるラフト結合PKB Ser473を同定した。
(1)PKB Ser473キナーゼの適切な源、たとえば、HEK293細胞から細胞抽出物を作製し;
(2)細胞成分分画により原形質膜を単離し;および
(3)原形質膜分画を、洗剤、好ましくはTRITON X−100のような非イオン性洗剤を包含する緩衝液および/または高イオン強度、たとえば、0.5M NaClを含む緩衝液で処理することを包含する。
発現構築物、トランスフェクション、および細胞の処理
HAタグ付PKBについての発現構築物は、先に記載されている(HillおよびHemmings、2002年を参照)。インテグリン結合キナーゼを、公表された配列(NIDg2648173/U40282、Hanniganら、Nature、1996年、379巻:91〜96頁)に基づいてポリメラーゼ連鎖反応によりヒト胎盤cDNAライブラリーからクローン化させ、pCMV5ベクターにサブクローニングした。修飾リン酸カルシウム法を使用したHEK293細胞の培養およびトランスフェクションは、先に記載されている(Andjelkovicら、Mol Cell Biol、1999年、19巻:5061〜5072頁)。分析的実験のために、細胞を処置の前に一夜飢餓状態にさせた。ペルバナデートを用いた作製および細胞処理を、先に記載される通り行い、総細胞溶解物を、NP−40溶解緩衝液中に収集した(Andjelkovicら、Proc Natl Acad Sci USA、1996年、93巻:5599〜5704頁;Andjelkovicら、Mol Cell Biol、1999年、19巻:5061〜5072頁)。
PKB Ser473キナーゼを特徴付および精製するために、我々は、キナーゼが原形質膜(PM)で構造的に活性でなければならないと判断した。この目的のために、PMが富化された分画を生じるための細胞成分分画プロトコールを開発した。この方法の効率を決定するために、2つのPKB構築物の産物の分画行動を試験した:ヘマグルチニン(HA)タグ付PKBα(HA−PKBα)、およびミリストイル化/パルミチル化シグナルを含むHA−PKBα(m/p−HA−PKBα)。
4℃で、Triton X−100への不溶性に加えて、脂質ラフトも、ショ糖密度勾配でのそれらの浮揚性によって特徴づけられる(SimonsおよびToomre、Nature Rev.、2000年、1巻:31〜39頁)。PKB Ser473キナーゼの脂質ラフト結合をさらに確認するために、原形質膜のTriton X−100不溶性分画を、5%〜35%段階ショ糖勾配にかけ、その後、PKB Ser473キナーゼ活性について分析した。簡潔には、Triton X−100不溶性タンパク質を、40%(w/v)ショ糖を含む1.5mlの緩衝液A(50mMトリス−HCl(pH7.4)、150mM NaCl)中で再懸濁させ、13.2ml超遠心管に入れた。段階勾配は、35%、30%、25%、20%、15%、10%および5%のショ糖を含む緩衝液1.5mlの連続的重層による充填の上に形成された。残りの体積を、緩衝液Aで充填した。18時間、250,000gの遠心分離(Beckman Sw41ローターで39,000rpm)の後、1ml分画を、管の頂部から収集し、基本的に上に記載される通りキナーゼ活性についてアッセイを行った。
実施例2は、PKB Ser473キナーゼ活性が、原形質膜の洗剤不溶性の浮揚密度分画で富化されており、膜とのこのキナーゼの結合は、高イオン強度により破壊され得ることを証明する。この相互作用の特性をさらに調査するために、Superdex−200カラムを使用したゲル濾過分析による原形質膜のNaCl抽出分画を分析した。FPLCシステム(Amersham Pharmacia Biotech)に付属したSuperdex−200HR10/30カラムを用いて、ゲル濾過を行った。簡潔には、カラムを、緩衝液B(20mMトリス−HCl(pH7.4)、0.5M NaCl、1mM DTTおよび1mMベンズアミジン)で平衡化した。0.5M NaCl処理から得られた上清(0.5ml)を、カラムにかけた。緩衝液Bを、流速0.5ml/分でポンプ輸送し、分画を、毎分ごとに収集した。ゲル濾過クロマトグラフィー用の分子量マーカーは、Sigmaから得て、ブルー・デキストラン(2000kDa)、アポフェリチン(443kDa)およびベータ−アミラーゼ(200kDa)を含んだ。
Superdex−200Ser−473キナーゼ分画をさらに単離するためのモノQ FPLCを使用したイオン交換クロマトグラフィー。Superdex 2000カラムから得た分画を、緩衝液A(20mMトリス/HCL、pH7.5、1mM DTT、1mM EDTA、5%グリセロール、1mMベンズアミジン、および1mM PMSF)中で希釈(10回)させ、緩衝液Aで平衡化したMONO Q HR5/5カラムにかけた。カラムを、緩衝液Aで洗浄し、緩衝液A中の0から0.6M NaClまでの30ml直線状勾配で展開させた。カラムから溶出する0.5mlの分画を収集し、上に記載される通りSer473キナーゼ活性についてアッセイした。
全長PKBα、PKBβおよびPKBγ、ならびにPKBαのキナーゼ不活性(K179A)およびリン酸化部位突然変異体(T308AおよびS473A)をリン酸化する、部分的に精製されたPKB Ser473キナーゼの能力を試験した。HAタグ付きPKB構築物をHEK293細胞で発現させ、HAタグ付きPKBタンパク質を、プロテイン(Protein)A−セファロース(Sepharose)に予め結合された12CA5抗体(Roche Biochemicals)を使用して、NP−40溶解緩衝液中の溶解物から免疫沈降した。2時間、4℃でインキュベートした後、0.5M NaClで補足された溶解緩衝液中で1回、溶解緩衝液で1回、およびその後最終的に50mMトリス−HCl(pH7.4)で、ビーズを洗浄した。キナーゼ反応の前に、γ−ホスファターゼ(Cell Signaling Technologies)を用いた脱リン酸化を、製造業者の指示によって、30℃で、30分間行った。先に記載された通りに、ビーズを洗浄し、その後、30℃で、60分間、貯蔵Superdex−200分画を用いて/用いないで、キナーゼ反応緩衝液でインキュベートした。対照として、Superdex−200カラムから得られる貯蔵されたピーク活性分画を加えることなく、免疫沈降PKBタンパク質の半分を、キナーゼ反応緩衝液中でインキュベートした。キナーゼ反応の後、NP−40溶解緩衝液中で2回、ビーズを洗浄し、その後、SDS−PAGEサンプル緩衝液中で95℃に加熱してから、SDS−PAGEおよび免疫ブロッティングにより分析した。PKB Ser473リン酸化を、ホスホ−Ser473特異的抗体を用いた免疫ブロッティングによって検出した。
Ser473上でのインスリン刺激リン酸化が、スタウロスポリン非感受性キナーゼを介して起こることが、先に示されている(Hillら、J Biol Chem、2001年、276巻:25643〜25646頁)。したがって、部分的に精製されたキナーゼのスタウロスポリン感受性を決定することに興味があった。Superdex−200カラムから得られるピーク活性分画を貯蔵し、その後、種々の濃度のスタウロスポリン(0、0.001、0.01、0.1、1、10および100マイクロM)の存在下で、基本的に上に記載される通りにFSYペプチドを使用してPKB Ser473キナーゼ活性についてアッセイした。このアッセイは、部分的に精製された分画中で2つの別個のキナーゼ活性の存在を示した:一方は、スタウロスポリンに対して急性に感受性があり、阻害は、1nMで観察される一方で、他方は、100μMまでのスタウロスポリンに非感受性である。我々の先の結果は、後者の活性のみが、PKB Ser473キナーゼに対応することを示唆する。
ILKは、ショ糖勾配分画およびゲル濾過カラムのピーク分画で検出されたので、ILKの役割を、原形質膜結合PKB Ser473キナーゼ活性で直接的に評価した。ILKを、NaClで抽出された原形質膜分画から免疫沈降させ、その後、免疫沈降と上清の両方を、PKB Ser473キナーゼ活性についてアッセイした。簡潔には、NaClで抽出した原形質膜分画(50mMトリス−HCl、pH7.4、0.5M NaCl中で)を、4℃で、1時間、Sepharose 4Bを使用して前もって浄化し、その後、4℃で2時間、プロテインA−セファロースに予め結合させたILK抗体(UBI)を使用して免疫沈降させた。上清を、アッセイのために回収した。免疫沈降物を、50mMトリス−HCl、pH7.4、0.5M NaCl中で2回、50mMトリス−HCl(pH7.4)で1回洗浄してから、キナーゼアッセイを、基本的に上に記載される通り行った。
Claims (11)
- 細胞タンパク質に結合したときに、PKB Ser473キナーゼ活性を示し、450〜650kDaの見かけの分子量を示し、ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞の粗膜抽出物と比較して少なくとも20,000倍増大した純度を有する、HEK293細胞由来のPKB Ser473キナーゼを含む組成物であって、SDSゲル電気泳動によって概算される場合、48kDaまたは58kDaの分子量を有するタンパク質を含む、組成物。
- 少なくとも50,000倍増大した純度を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、SDSゲル電気泳動によって概算される場合、58kDaの分子量を有するタンパク質を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- PKBペプチド基質を32P標識ホスフェートでリン酸化するキナーゼアッセイで検出する場合、0.2μgのタンパク質中で測定可能なPKB Ser473キナーゼ活性を有し、前記キナーゼが、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画される場合、450〜650kDaの見かけの分子量で溶出し、そしてSDSゲル電気泳動によって概算される場合、48kDaまたは58kDaの分子量を有する、HEK293細胞由来の精製細胞抽出物。
- 前記キナーゼがゲル濾過クロマトグラフィーにより分画される場合、550kDaの見かけの分子量で溶出する、請求項4に記載の精製細胞抽出物。
- 前記キナーゼは、ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞の粗抽出物と比較して、少なくとも50,000倍富化されている、請求項4または5に記載の精製細胞抽出物。
- (i)動物(ヒトを除く)に、免疫原性的に有効な量の、請求項1に記載の組成物または請求項4に記載の精製細胞抽出物であるPKB Ser473キナーゼ免疫原を投与し;
(ii)前記動物に、免疫原に対する抗体を産生させ;そして
(iii)前記動物から、またはそこから誘導される細胞培養物から抗体を得る
段階を含む、精製PKB Ser473キナーゼタンパク質に選択的に結合する抗体を産生する方法。 - 請求項7に記載の方法により得られるPKB Ser473キナーゼ特異的抗体。
- i)請求項1に記載の組成物または請求項4に記載の抽出物である精製PKB Ser473キナーゼタンパク質を、化合物とインキュベートし;
ii)PKB Ser473キナーゼ活性を測定し;
iii)前記化合物が不在である場合と比較して、化合物の存在下で、PKB Ser473キナーゼ活性における改変を検出する段階を含み、該改変が、PKB Ser473キナーゼ活性の潜在的モジュレーターを示す、
PKB Ser473キナーゼ活性の潜在的モジュレーターをスクリーニングをする方法。 - PKB Ser473キナーゼ活性における前記改変がPKB Ser473キナーゼ活性における減少であり、前記減少がPKB Ser473キナーゼの潜在的阻害剤を示す、請求項9に記載の方法。
- PKB Ser473キナーゼ活性における前記改変がPKB Ser473キナーゼ活性における増大であり、前記増大がPKB Ser473キナーゼの潜在的アクチベーターを示す、請求項9に記載の方法。
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